一种大竹蛏微卫星标记的4重pcr检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，包括：（1）样品采集和DNA制备；（2）微卫星引物的合成；（3）PCR扩增；（4）产物检测。本发明建立了进行大竹蛏家系和亲子鉴定的4重PCR反应体系，实现了在一个PCR反应中同时检测4个微卫星位点，因此与原有的PCR方法相比效率提高了4倍；本发明具有高效、经济、简便易行等特点，可以在大竹蛏种群遗传结构分析、亲缘关系比较、种质鉴定、家系培育与管理以及良种选育中进行推广应用。
【专利说明】—种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于大竹蛏微卫星标记的检测领域，特别涉及一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]大竹蛏，贝壳长达14厘米，一般壳长为壳高的4~5倍，亮口缘与腹缘平行，只在腹缘中部稍向内凹，壳顶位于壳的最前端，壳前缘截形，后端圆，两壳合抱呈竹筒状，前后两端开口，壳质薄脆，壳表光滑，被黄褐色壳皮，有时有淡红色彩带，生长线明显，沿后缘及腹缘方向排列，壳内面白色或稍带紫色，可见淡红色彩带，铰合部小，两壳各具主齿一枚。大竹蛏个体肥大，足部肌肉特别发达，味极鲜美，入药有滋补、通乳功效，是我国重要的经济贝类。
[0003]微卫星标记(microsatellite)由于其分布广泛、符合孟德尔共显性遗传、多态性高、突变快、引物具有通用性强、便于检测等优点，被广泛应用于群体遗传学、家系分析与遗传育种等多个领域。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，该方法实现了在一个PCR反应中同时检测4个微卫星位点，因此与原有的PCR方法相比效率提高了 4倍。
[0005]本发明的一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，包括:
[0006](I)样品米集和DNA制备:
[0007]剪取大竹蛏的腹足，采用传统的酚氯仿法提取基因组DNA ；
[0008](2)微卫星引物的合成:
[0009]通过磁珠富集法构建大竹蛏微卫星富集文库，克隆测序其中的微卫星序列，用Primer5软件设计大竹経不同位点的微卫星正反向引物并合成；
[0010]所述的正反向引物如下:
[0011 ] SgSSR1017-F:ATAAAATGGTGAGGGTTG ；
[0012]SgSSR1017-R:AACTTCACACAAAATAACTGCTA ；
[0013]SgSSR0804-F:TCATCTACCATCCCACCC ；
[0014]SgSSR0804-R: CTTTATTCAGTTTTCCTACGCT ；
[0015]SgSSRl123-F:TCAACCTATGTTACCCTTATAC ；
[0016]SgSSRl123-R:CTTCAGTTAGATTAGGAGCA ；
[0017]SgSSRl103-F:TTTCAGTAATAAAGCGACC ；
[0018]SgSSRl103-R:AACTCTGGTAAGAAGGATTG ；
[0019](3) PCR 扩增:
[0020]运用优化好的PCR扩增体系和扩增程序对不同大竹蛏个体进行4重PCR扩增；[0021](4)产物检测:
[0022]PCR扩增产物先用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统中依据条带的亮度判断扩增产物的有无或扩增量的多少，然后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行不同个体的基因分型，明确判断不同个体在每个位点扩增等位基因的大小。
[0023]步骤(3)中所述的PCR 扩增体系为 10XBuffer5 μ L, MgCl23 μ L25mM, dNTPl.0yL各含10mM，模板lyLlOOng，SgSSR1017正反向引物各2 μ L，SgSSR0804正反向引物各1.5yL, SgSSRl 123正反向引物各I μ L，SgSSRl 103正反向引物各I μ L，Taq DNA聚合酶
0.4 μ L5U/ μ L, ddH203.6 μ L。
[0024]所述的10XBuffer5yL 中含有 200mM Tris-HCl ρΗ8.8、25 °C, IOOmM KCl,IOOmM(NH4)2SO4,1.0%Triton X-1OO0
[0025]步骤(3)中所述的扩增程序为94°C变性5min后进行下面程序:94°C变性40S，45°〇退火4(^，651:延伸lmin20S，进行30个循环，最后65°C延伸7min。
[0026]本发明中所涉及的4个微卫星位点(SgSSR1017、SgSSR0804、SgSSRl 123、SgSSRl 103)的序列如 SEQ ID NO:1_4 所示。
[0027]组合这四对引物，通过调整PCR反应体系，获得了这四对引物可以在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数，这些参数是:10XBuffer5y L(200mMTris - HCl (pH8.8at25 °C ) , IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 1.0%Triton X-100),MgCl23yL(25mM), dNTPl.0yL(各含 IOmM)，模板 I μ L(IOOng)，SgSSR1017 正反向引物各2 μ L，SgSSR0804正反向引物各1.5 μ L，SgSSRl 123正反向引物各I μ L，SgSSRl 103正反向弓丨物各I μ L，Taq DNA聚合酶0.4 μ L (5U/μ L)，ddH203.6 μ L。反应的扩增程序为:94°C变性5min后进行下面程序:94°C变性40S，45°C退火40S，65°C延伸lmin20S，进行30个循环，最后65°C延伸7min。
[0028]有益.效果
[0029](I)本发明建立了进行大竹蛏家系和亲子鉴定的4重PCR反应体系，实现了在一个PCR反应中同时检测4个微卫星位点，因此与原有的PCR方法相比效率提高了 4倍。
[0030](2)本发明具有高效、经济、简便易行等特点，可以在大竹蛏种群遗传结构分析、亲缘关系比较、种质鉴定、家系培育与管理以及良种选育中进行推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0031 ] 图1为大竹蛏4重PCR扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0033]实施例1
[0034](I)样品采集和DNA制备剪取大竹蛏腹足0.lg，用滤纸吸干、剪刀剪碎后放入
1.5mL 的离心管，加入 450 μ L STE (150mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris, lmmol/L EDTA)缓冲液，25 μ L的10%SDS，10 μ L蛋白酶K (20mg/mL)混匀，55°C消化过夜，用苯酚、氯仿及酚/氯仿各抽提一次，等体积的异丙醇沉淀，12，000r/min离心30min，沉淀用70%的乙醇洗2次，再用50 μ L双蒸水溶解，在0.8%的琼脂糖凝胶上检测DNA的质量和浓度。
[0035](2)微卫星引物的合成根据生物素(biotin)与链亲和素(streptavidin)的强亲和性原理，用平端限制性内切酶MboI消化大竹蛏基因组DNA，回收纯化300-1000bp的片段，连接上接头，与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)16退火结合，用链亲和素磁珠(streptavidin magnetic beads)亲和捕捉,获得含有微卫星序列的单链目的片段,经PCR扩增形成双链，然后克隆到PMD18-T载体上，转化到DH5 α中，构建大竹蛏微卫星富集文库，克隆测序其中的微卫星序列，用Primer5软件设计大竹蛏不同位点的微卫星正反向引物，将序列送生物公司合成。
[0036](3) PCR扩增运用以上优化好的PCR扩增体系和扩增程序对不同大竹蛏个体进行4重PCR扩增。
[0037](4)产物检测PCR扩增产物先用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统中依据条带的亮度判断扩增产物的有无或扩增量的多少，然后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行不同个体的基因分型，明确判断不同个体在每个位点扩增等位基因的大小。
[0038]图1为大竹蛏4重PCR扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中第一泳道为分子内标Marker,记为M,第二到十泳道为9个不同大竹経个体4重PCR扩增产物，分别记为:1，2，3，4，5，6，7，8，9 ;图中同时标示出了 4个微卫星位点在不同个体扩增的区间。虽然体系中SgSSR1017引物浓度最高，但其扩增效率却最低，在电泳图谱中隐约可见;其次为SgSSR0804,电泳图谱相对较清晰；SgSSR1123和SgSSR1103扩增效率最高，每个位点的等位基因均清晰可见。同时，我们也可以看出SgSSR1103仅检测到2个等位基因，不同个体间没表现出多态性，而其他 3个位点在不同个体中都检测到了数量不等的等位基因。
【权利要求】
1.一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，包括: (1)样品米集和DNA制备: 剪取大竹蛏的腹足，采用传统的酚氯仿法提取基因组DNA ； (2)微卫星引物的合成: 通过磁珠富集法构建大竹蛏微卫星富集文库，克隆测序其中的微卫星序列，用Primer5软件设计大竹蛏不同位点的微卫星正反向引物并合成； 所述的正反向引物如下:
SgSSR1017-F:ATAAAATGGTGAGGGTTG ；
SgSSR1017-R:AACTTCACACAAAATAACTGCTA ；
SgSSR0804-F:TCATCTACCATCCCACCC ；
SgSSR0804-R:CTTTATTCAGTTTTCCTACGCT ；
SgSSRl123-F:TCAACCTATGTTACCCTTATAC ；
SgSSRl123-R:CTTCAGTTAGATTAGGAGCA ；
SgSSRl103-F:TTTCAGTAATAAAGCGACC ；
SgSSRl103-R:AACTCTGGTAAGAAGGATTG ； (3)PCR 扩增: 运用优化好的PCR扩增体系和扩增程序对不同大竹蛏个体进行4重PCR扩增； (4)产物检测: PCR扩增产物先用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统中依据条带的亮度判断扩增产物的有无或扩增量的多少，然后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行不同个体的基因分型，明确判断不同个体在每个位点扩增等位基因的大小。
2.根据权利要求1所述的一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，其特征在于:步骤(3)中所述的 PCR 扩增体系为 10XBuffer5y L，MgCl23 μ L25mM, dNTPl.Ομ L 各含10mM，模板lyLlOOng，SgSSR1017正反向引物各2 μ L，SgSSR0804正反向引物各1.5yL,SgSSRl 123正反向引物各I μ L，SgSSRl 103正反向引物各I μ L，Taq DNA聚合酶0.4 μ L5U/μ L, ddH203.6 μ L。
3.根据权利要求2所述的一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，其特征在于:所述的 10XBuffer5y L 中含有 200mM Tris-HCl pH8.8,25°C, IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,1.0%Triton X-100。
4.根据权利要求1所述的一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，其特征在于:步骤(3)中所述的扩增程序为94°C变性5min后进行下面程序:94°C变性40S，45°C退火40S，65°C延伸lmin20S，进行30个循环，最后65°C延伸7min。
【文档编号】C12Q1/68GK103898214SQ201410103315
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】张志伟, 陈爱华, 张朝晖, 张志勇, 姚国兴, 蔡永祥, 吴杨平, 张雨, 曹奕, 高波 申请人:江苏省海洋水产研究所