一种重组羊痘病毒转移载体及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种重组羊痘病毒转移载体，是在含有抗性基因和质粒复制子序列，并能用HindⅢ和AvrⅡ酶切的载体，如pVAX1载体，通过引入HindⅢ和AvrⅡ酶切位点插入DNA片段；所述DNA片段包含带有双向痘病毒启动子和羊痘病毒TK基因的同源臂的基因序列。本发明还提供含有上述重组羊痘病毒转移载体的重组羊痘病毒以及其在外源抗原转运中的应用。本发明提供的重组羊痘病毒转移载体可方便插入外源基因；并根据重组结果进行了改良，最后达到了较好的重组效率，为此类重组疫苗的研制奠定了良好的基础。
【专利说明】一种重组羊痘病毒转移载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种重组羊痘病毒转移载体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]利用病毒作为外源抗原的转运系统是一种成熟、有效的疫苗设计研发策略，如腺病毒活载体、痘病毒活载体、疱疹病毒活载体、小RNA病毒活载体等作为新型疫苗均取得了良好的免疫效果。其中，痘病毒由于其大而复杂的基因组，作为活载体具有容量大、有大量的复制非必需片段可用作插入外源基因的位点等优势，因此成为此类疫苗研究的理想载体。目前已构建的痘病毒载体，有痘苗病毒、鸡痘病毒、猪痘病毒、羊痘病毒以及兔痘病毒活载体。
[0003]痘病毒基因组庞大，不便在体外进行直接操作，而且基因组DNA没有感染性，外源基因不能直接插入到病毒基因组中，因此，重组痘病毒的构建必须分两步进行。第一步是构建一个重组质粒，又叫转移载体质粒。此质粒应带痘病毒的启动子，其下游接外源基因，在它们的两侧为痘病毒特异的DNA序列。第二步是将此质粒导入痘病毒感染的细胞中，痘病毒DNA与质粒中的同源序列 在细胞内可发生同源重组，由此将外源基因组装到痘病毒基因组的特定部位，构建出重组的痘病毒。
[0004]由于重组效率相对较低(10-4-10-3)，筛选、纯化重组成功的痘病毒成为痘病毒活载体研究中的另一个重要环节。在较早的研究中，利用病毒本身的胸苷激酶(TK)基因作为选择标记，是较常用的方法。但此筛选系统具有很大的局限，即只能用TK基因作为非必需片段构建重组病毒；另外，需要一株适合病毒生长并能产生蚀斑的TK-细胞系。另一类筛选系统利用细菌β-半乳糖苷酶(LacZ)基因，新霉素磷酸转移酶(Neo)基因等作为标记基因，在构建转移载体时插入到复制非必需区。最近的筛选系统进行了优化，利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作为标记基因，同时加入了大肠杆菌鸟嘌呤-次黄嘌呤憐酸核糖转移酶(guanine-hypoxanthine phosphoribosyl transferase, gpt)的基因作为压力筛选基因，筛选效果显著提高。
[0005]经过众多学者的不断探索，重组痘病毒作为活载体的研究日趋完善，羊痘病毒作为其中一员也成为此类活载体的重要工具。如前所述，在重组羊痘病毒时，同样需要构建一个携带同源臂的转移载体。在以往的研究中，载体构建主要是利用羊痘病毒基因组DNA复制非必需区中自然存在的酶切位点，插入外源DNA，如TK基因中的Kpn I。这类操作有一定的局限性，在需要替换外源DNA时，必须重新构建并鉴定用于重组的载体，增加了很大的工作量。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种重组羊痘病毒转移载体，该重组载体可方便插入外源基因。并根据重组结果进行了改良，最后达到了较好的重组效率，为此类重组疫苗的研制奠定了良好的基础。
[0007]本发明提供一种重组羊痘病毒转移载体，所述重组羊痘病毒转移载体是在含有抗性基因和质粒复制子序列，并能用Hind III和Avr II酶切的载体，如pVAXI载体，通过引入Hind III和Avr II酶切位点插入DNA片段；所述DNA片段包含带有双向痘病毒启动子和羊痘病毒TK基因的同源臂基因序列。
[0008]本发明的重组载体是利用含有抗性基因和质粒复制子序列，并能用Hind III和Avr II酶切的载体构建的，只要含有上述基因和酶切位点，均能构建方便插入外源基因的重组载体。如，我们可以选择商业载体PVAXl载体，其含有pUC ori序列和卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistance gene),并具有 Hind III和 Avr II 的酶切位点。
[0009]作为优选，所述痘病毒启动子为pll和p7.5。
[0010]更优选地，所述重组羊痘病毒转移载体的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.1。
[0011]作为优选，所述羊痘病毒TK基因的同源臂长度为1400_1600bp，优选1500bp。
[0012]在该范围内重组效率均较高。
[0013]作为优选，所述DNA片段中还包括报告基因和压力筛选基因；作为优选，所述报告基因为绿色荧光蛋白GFP，所述压力筛选基因选用表达鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶的基因gpt。
[0014]作为优选，所述重组羊痘病毒转移载体的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.2。
[0015]本发明还提供一种重组羊痘病毒转移载体的构建方法，步骤如下:
[0016]1)以pVAXI载体为模板，利用PCR方法扩增含有pUC ori序列和卡那霉素抗性基因的DNA目的片段，得到目的片段KarZ-ori ；
[0017]2)将双向痘病毒启动子、羊痘病毒TK基因的同源臂和多克隆位点进行DNA合成，得到如图2所示的载体片段，两端分别加入内切酶Avr II和Hind III序列，并连接于载体上；
[0018]3)将步骤(1)得到的目的片段和步骤(2)得到的重组质粒分别双酶切，酶切产物连接环化，得到重组载体ptkpp ；
[0019]4)提取羊痘病毒弱毒株AV41基因组DNA，利用PCR方法扩增含有TK基因的同源臂序列(约1500bp),替换质粒ptkpp中的TK基因同源臂,得到重组载体pftkpp ；
[0020]5)将报告基因和压力筛选基因插入到质粒pftkpp的多克隆位点，置于pll启动子后，构建成重组质粒pftkpgigp。
[0021]本发明的第三个目的是要求保护含有上述任一所述的重组羊痘病毒转移载体的
重组羊痘病毒。
[0022]作为优选，所述重组羊痘病毒是将权利要求1-6任一所述的重组羊痘病毒转移载体导入羊痘病毒感染的细胞中，两者的同源序列在细胞内同源重组后得到的。
[0023]本发明还提供上述的重组羊痘病毒转移载体、重组羊痘病毒在外源抗原转运中的应用。
[0024]本发明的设计思路如下:
[0025]1.同源重组及同源臂的设计
[0026]运用病毒作为活载体研制疫苗已成为一种重要的疫苗生产手段。在痘病毒活载体疫苗的研究中，将外源基因插入到痘病毒基因组的复制非必需区是一种可靠、高效的方法，其生物学基础是DNA的重组。生物体内DNA的重组主要有两种:同源重组和位点特异性重组。在体外DNA同源重组中，设计一个包含与靶基因上下游侧翼序列一致的DNA序列的基因工程载体是关键环节。基因工程载体能够找到靶基因并在与之相同的DNA序列处发生同
源重组。
[0027]细胞发生同源重组后，新的DNA片段即目标序列被插入了基因组中。其中只是靶基因及其上下游的一些侧翼序列被载体中同源的部分所取代，基因组的其他部分并不受到影响。在载体与靶基因发生重组后，最初的靶基因序列被交换到了载体上。由于载体不能够在细胞核中独立地进行复制，因此随着细胞的分裂很快就丢失了。而被替代后的基因组则忠实地进行自我复制，此时新插入的目标序列也就得以复制了。
[0028]痘病毒活载体疫苗 的方法学基础是DNA同源重组。如上所述，对于此类体外DNA重组操作而言，合理的同源臂设计是关键环节。相关研究表明，羊痘病毒的重组都是利用胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因，这个复制非必需基因作为载体的同源臂进行重组的。本研究最初也是利用TK基因作为重组的同源臂，但试验结果显示，重组效率很低，得不到重组病毒。考虑到病毒重组的效率与插入片段的大小、同源臂的长度有密切关系，同源臂长度和插入片段大小之间可能具有一定的比例关系，所以后续研究加长了同源臂序列。从重组效率看，这样的设计优于TK基因同源臂。另外，左、右同源臂的长度比例该怎样设计，鲜见此类研究，在今后的研究中应该关注这个问题。
[0029]2.载体设计与构建策略
[0030]有关重组痘病毒的诸多研究显示，利用TK基因中自然存在的内切酶位点(如Kpn I )，将外源DNA插入，并利用TK基因作为同源臂进行重组，是一种广泛采用的设计策略。本申请参考以往的设计方法，设计并构建了可方便应用于羊痘病毒重组的基因工程载体。该载体包含与羊痘病毒基因组DNA序列一致的同源臂，同源臂包含TK基因，所有目标序列位于TK基因内部，主要元件有:双向启动子、报告基因、筛选基因、多克隆位点、内核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)序列等，可方便外源抗原基因的插入。另外，在制备得到本发明的重组载体后，可以根据需要更换其中的报告基因和抗性基因:如不具备荧光显微镜，可以将报告基因换为LacZ，方便检测；抗性基因换为Neo，利用G418筛选等。
[0031]本申请设计并构建的载体，以绿色突光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作为报告基因，GFP广泛应用于此类基因工程载体中，具有直观、方便检测等优点。压力筛选基因选用表达鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(guanine-hypoxanthine phosphoribosyltransferase, gpt)的基因，gpt基因可由大肠杆菌方便获得，其筛选效率优于常规抗生素类基因。
[0032]载体设计中，加长同源臂序列能显著提高重组效率，同源臂长度和目标DNA大小之间应该存在相应的比例关系。从理论上推测，同源臂越长越好，但太长的同源臂对于载体构建是一个不小的障碍，因此，需要在两者之间探索一个相对平衡的状态，既有利于重组，又方便载体的构建。本发明中将同源臂序列加长到约1500bp，与以往研究中TK基因本身作为同源臂相比较，长度是后者的约3-4倍，这样的设计具有明显的优势。根据相关资料，同源臂大于75bp，即可以产生重组。但我们的实验中，378bp、451bp的同源臂重组效率极低，没有筛选到重组子；后来同源臂延长至1400-1600bp时，重组效率明显提高，很容易筛选代重组病毒。[0033]3.启动子功能的验证
[0034]在载体设计时,本研究选择了痘苗病毒启动子p7.5和pll,这两个启动子在重组痘病毒的研究中被广泛采用。由于本实验室没有含P7.5和pll的载体，因此我们根据NCBI提供的核酸序列，合成了这两个启动子，根据报告基因的表达情况看，这样的设计是正确的。其中，P?.5属于早/晚期启动子,其启动的报告基因表达相对较早,并持续较长时间，Pll则属于晚期启动子，报告基因的表达也相应较晚，本实验的结果与预期一致。
[0035]结论:
[0036]本申请成功构建了用于山羊痘病毒重组的基因工程转移载体ptkpp、pftkpgigp,通过一系列实验验证，最终形成了携带外源基因的重组山羊痘病毒。在实际应用中，还可根据需要替换同源臂序列以及启动子、报告基因、抗性基因等载体元件:如果有更成熟的非必需区作为同源臂，可以通过酶切位点进行替换；鉴定了功能更强的启动子，也可以替换；报告基因、抗性基因同上；拓宽了此类载体的应用范围。本发明提供的重组羊痘病毒转移载体可方便插入外源基因 。并根据重组结果进行了改良，最后达到了较好的重组效率，很容易筛选到重组病毒，为此类重组疫苗的研制奠定了良好的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]以下结合附图和具体实施方法对本发明进行进一步的阐述。
[0038]图1为本发明的重组羊痘病毒转移载体设计图；
[0039]图2为DNA合成片段示意图；
[0040]图3为重组载体构建示意图；其中，A为ptkpp, B为pftkpp, C为pftkpgigp ；
[0041]图4为用于重组的最终载体示意图；其中,A为pftkpgigp-VPl,B为pftkpgigp-H ;
[0042]图5为验证启动子载体示意图；
[0043]图6为目的片段PCR产物电泳图；
[0044]图7为质粒ptkpp及pftkpp酶切鉴定图；其中,A为质粒ptkpp Avr I1、Hind III双酶切鉴定图；B为质粒ptkpgigp Sal 1、Sac 1、Xho I三酶切鉴定图；C为质粒ptkpp-ftkRAsc 1、Hind III双酶切鉴定图；D为质粒pftkpp-ftkL Avr I1、Sac I双酶切鉴定图。M为Trans2K plus II DNA Marker ;泳道 I 为 Kana-ori PCR产物，2 为 pUC19_tkpp 酶切产物，3 为Ptkpp酶切产物；4为gpt，5为cGFP-1RES，6为ptkpp酶切产物，7为ptkpgigp酶切产物；8 为 ftkR，9 为 ptkpp 酶切产物，10 为 ptkpp-ftkR 酶切产物；11 为 ftkL, 12 为 ptkpp-ftkR酶切产物，13为ptkpp-ftkL即pftkpp酶切产物；
[0045]图8为质粒pftkpgigp Sal 1、Sac I双酶切鉴定图；其中，M为Trans2Kplus II DNA Marker ;泳道 I 为 ptkpgigp 酶切产物，2 为 pftkpp 对照，3 为 pftkpgigp 酶切产物；
[0046]图9为质粒pftkpgigp-VPl、pftkpgigp-H酶切鉴定图；其中，A为质粒pftkpgigp-VPlNhe 1、Not I 双酶切鉴定图；B 为质粒 pftkpgigp-H Nhe 1、Not I 双酶切鉴定图。M 为 Trans2K plus II DNA Marker ;泳道 1、4 为 VP1、H 的 PCR 产物，泳道 2、5 为pftkpgigp 对照，泳道 3、6 为 pftkpgigp-VPl、pftkpgigp-H 酶切产物；
[0047]图10为质粒ptkpp-GFP、ptkpp-H-1-GFP的酶切鉴定图；其中,A为质粒ptkpp-GFPNhe 1、BamH I 双酶切鉴定图；B 为质粒 ptkpp-H-1_GFP Nhe 1、BamH 1、Not I 三酶切鉴定图。M 为 Trans2K plus II DNA Marker ;泳道 1、4 为 ptkpp 对照，2 为 ptkpp-GFP 酶切产物；3为H的PCR产物，5为ptkpp-H-1-GFP酶切产物。
[0048]图11 为质粒 pftkpgigp、ptkpp-GFP、ptkpp-H-1-GFP 转染 LT 细胞后的绿色突光；
[0049]图12为rCPV/PPRV-H形成的绿色荧光蚀斑；
[0050]图13为rCPV/PPRV-H形成的大量荧光蚀斑；
[0051]图14为重组病毒基因组PCR鉴定电泳图；其中，A为rCPV/FMDV-VPl基因组PCR鉴定电泳图,B为rCPV/PPRV-H基因组PCR鉴定电泳图；M为Trans2K plus II DNA Marker ;泳道1、4为质粒pftkpgigp-VPl、pftkpgigp-H阳性对照，泳道2、5为CPV阴性对照，泳道3、6分别为 rCPV/FMDV-VP1、rCPV/PPRV-H 的 PCR 产物； [0052]图15为重组病毒RT-PCR电泳图；其中，A为rCPV/FMDV-VPlRT-PCR鉴定图，B为rCPV/PPRV-H RT-PCR 鉴定图；M 为 Trans2K plus II DNA Marker ;泳道 1、4 为 LT 细胞对照，泳道 2、5 为 CPV+LT 对照，泳道 3、6 分别为 rCPV/FMDV-VP 1、rCPV/PPRV-H 感染 LT 细胞 RT-PCR产物；
[0053]图16为间接免疫荧光鉴定图；
图17为重组载体pftkpgigp示意图。
【具体实施方式】
[0054]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0055]I材料与试剂
[0056]大肠杆菌DH5 α菌株，Trans2K plus II DNA Marker,购自北京全式金生物技术公司有限公司；DS15000DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司；限制性内切酶HindII1、Avr I1、Sal 1、Sac 1、Xho 1、Nhe 1、Not 1、Sac I1、Sbf 1、Spe 1、Asc 1、BamH I，
T4DNA Iigase,为 NEB 产品；PrimcSTARs HS DNA Polymerase 为 TaKaRa 产品；AxyPrep?Plasmid Miniprep Kit>AxyPrep? DNA Gel Extraction Kit 为 AxyGEN产品；载体pVAXI 为Invitrogen 产品;pIRES2_AcGFPl 为 Clontech 产品；盖羊睾丸细胞(Lamb testis cells)根据参考文献方法制备；LipofectamineTM2000Transfection Reagent 购自 Invitrogen 公司;Dulbecco，s modified Eagle’s medium (DMEM)购自 HyClone 公司;胎牛血清为 Gibco公司产品；AxyPr印基因组DNA小量制备试剂盒为Axygen产品；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。羊痘病毒弱毒株AV41购自中国兽医药品监察所。
[0057]2重组质粒的设计
[0058]根据载体设计原则，结合本发明的需要，设计用于病毒重组的质粒，该质粒包含羊痘病毒TK基因的同源臂、痘苗病毒启动子序列P7.5和pll、多克隆位点，如图1所示。
[0059]由于启动子p7.5、pll序列没有模板，难以通过PCR方法获得；载体中的多克隆位点也需要通过基因合成获得；因此，把这部分关键元件利用DNA合成的方法串连起来，得到如图2所示的载体片段，两端分别加入内切酶Avr II和Hind III序列，并连接于pUC19载体上形成pUC19_tkpp。DNA合成由Invitrogen公司完成。
[0060]3重组质粒的构建
[0061](I)抗性基因和复制子的扩增及与合成片段的环化[0062]以pVAXI载体为模板，利用PCR方法扩增含有pUC ori序列和卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistance gene)的DNA目的片段。引物序列如下，下划线部分为酶切位点:
[0063]Kanr-or1-Hind II1: 5’ -GCTAAGCTTCTTCTACTGGGCGG-3’
[0064]Kanr-or1-Avr I1:5’-ATGCCTAGGGTCAATAATCAATGTC-3’
[0065]PCR 反应条件:95°C 3min,94°C 15s,52°C 15s,72°C 2minl0s
[0066]将PCR扩增获得的目的片段回收，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果参见图6中泳道1，PCR扩增的目的片段Karf-ori的大小约2015bp，与预期大小一致。
[0067]将上述验证正确的目的片段Karf-ori与含有DNA合成片段的质粒pUC19_tkpp,分别用内切酶Avr II和Hind III双酶切，酶切产物回收，并用T4DNA Iigase连接环化，连接反应条件:10X ligase bufferl μ L, DNA 片段各 3 μ L，T41igase0.5 μ L, ddH202.5 μ L, 16°C连接过夜，转化大肠杆菌DH5a，鉴定阳性克隆并测序，最后形成如图3A所示的重组载体骨架ptkpp。
[0068](2) TK基因同源臂的延长
[0069]按照AxyPr印基因组DNA小量制备试剂盒说明提取羊痘病毒弱毒株AV41 (CPVAV41)基因组DNA利用PC R方法扩增含有TK基因的同源臂序列(约1500bp)，用于替换质粒Ptkpp中的TK基因同源臂，引物如下，下划线部分为酶切位点:
[0070]ftkL-Avr I1:5’-GCGCCTAGGTATGATTAATAATACTTC-3’
[0071]ftkL-Sac 1:5’-ACCGAGCTCATCTTTAAAAAATTGC-3’
[0072]ftkR-Asc 1:5’-ATTAGGCGCGCCATTGTACCTTTTTCTG-3’
[0073]ftkR-Hind II1:5’-CCGAAGCTTAATCTTTTACCCATTGATC-3’
[0074]PCR 反应条件:95°C 3min，94°C 15s，50。。15s，72。。lmin30s
[0075]将扩增获得的同源臂序列利用酶切位点插入替换质粒ptkpp中的tk I^Ptk R，得到含有TK基因及其侧翼序列同源臂的重组质粒pftkpp，如图3B所示。
[0076](3)报告基因和压力筛选基因的连接
[0077]以载体PIRES2-AcGFPl为模板，利用PCR方法扩增含有GFP和IRES的片段；以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增gpt基因。引物序列如下，下划线部分为酶切位点:
[0078]G-1-Sac 1:5’ GCAGAGCTCTCACTTGTACAGCTCATC3’
[0079]G-1-Xho 1:5，ATTCTCGAGGCCCCTCTCCCTCCC3，
[0080]PCR 反应条件:95°C 3min,94°C 15s,55°C 15s,72°C lmin30s ；
[0081]gpt-Xho 1:5’ TCTCTCGAGTTAGCGACCGGAGATTG3'
[0082]gpt-Sal 1:5’ CCTGTCGACATGAGCGAAAAATACATC3’
[0083]PCR 反应条件:95°C 3min, 94°C 15s, 52°C 15s, 72°C 40s
[0084]将扩增得到的GFP-1RES片段和gpt基因，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果分别参见图6中泳道2和3，PCR扩增的目的片段cGFP-1RES的大小为1326bp，gpt的大小为459bp,与预期大小一致。
[0085]将电泳验证正确的GFP-1RES片段和gpt基因插入到质粒pftkpp的多克隆位点(MCS A),置于pll启动子后，形成pll-gpt-1RES-GFP表达盒,构建成重组质粒pftkpgigp,如图3C和图17所示。
[0086](4)外源抗原基因的插入[0087]以FMDV P12A3C为模板扩增FMDV-VP1基因、以PPRV cDNA为模板PPRV-H基因。弓丨物序列如下:
[0088]VPl-Nhe 1:5’ ATAGCTAGCATGTGACCACTTCGACG3’
[0089]VPl-Not 1:5’ ATAGCGGCCGCTCACAAGGACTGCTTTAC3’
[0090]PCR 反应条件:95V 3min, 94。。15s, 52V 15s, 72V 45s ；
[0091]PPRV-H-Nhe 1:5，TAAG CTAGCGCCACCATGGCCGCACAAAG3，
[0092]PPRV-H-Not 1:5’ TGGAGCGGCCGCTCAGACTGGATTACATG3’
[0093]PCR 反应条件:95°C 3min, 94°C 15s, 52V 15s, 72V 2min
[0094]将扩增得到的FMDV-VPl基因和PPRV-H基因，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果分别参见图6中泳道4和5，PCR扩增的目的片段FMDV-VPl的大小约645bp，PPRV-H的大小约1830bp，与预期大小一致。
[0095]将验证正确的目的片段FMDV-VPl、PPRV-H分别插入质粒pftkpgigp中，构建成用于病毒重组的质粒pftkpgigp-VPl、pftkpgigp-H。如图4所示。
[0096]4启动子pll和p7.5功能的验证
[0097](I)载体构建
[0098]分别在启动子pll和p7.5后面插入报告基因，用以验证载体设计的正确性。pll表达盒已在2.3中构建完成，即质粒pftkpgigp。在p7.5后插入小反刍兽疫病毒基因H和IRES-GFP片段，形成p7.5-H-1RES-GFP表达盒；另外，单独插入GFP构建p7.5-GFP表达盒，均用以验证P7.5的功能。相关引物如下:
[0099]GFP-Nhe 1:5，-TAAGCTAGCCATGGTGAGCAAGGGC-3，
[0100]GFP-BamH 1:5’-TCCGGGATCCTCACTTGTACAGCTC-3’
[0101]PCR 反应条件:95V 3min，94°C 15s，55。。15s，72。。50s。
[0102]PPRV-H-Nhe 1:5，-TAAGCTAGCCGCCACCATGGCCGCACAAAG-3，
[0103]PPRV-H-BamH 1:5’-CCGGGATCCTCAGACTGGATTACATG-3’
[0104]PCR 反应条件:95°C 3min,94°C 15s,52°C 15s,72°C 2min。
[0105]GFP 连接至 ptkpp，构成 ptkpp-GFP ； IRES-GFP 片段直接从载体 pIRES2_AcGFPl 上用BamH I ,Not I切下，连接至ptkpp的多克隆位点(MCS B)，然后连接PPRV-H，最后形成质粒 ptkpp-H-1-GFP，如图 5 所示。
[0106](2)质粒转染LT细胞
[0107]LT细胞铺至6孔板，待细胞生长至单层，接CPV弱毒AV41孵育2h。按脂质体转染操作程序，将构建好的质粒pftkpgigp、ptkpp-GFP、ptkpp-H-1-GFP转染至LT细胞，并于48h后观察结果，结果参见图11。
[0108]5重组CPV的形成、筛选与鉴定
[0109](I)重组质粒的制备
[0110]试验3中构建的重组质粒pftkpgigp-VPl和pftkpgigp-H按照QIAGEN公司EndoFree Plasmid Kit说明书的操作程序,制备用于转染的质粒,并测定质粒浓度。
[0111](2)重组质粒与CPV共转染LT细胞
[0112]6孔板上铺LT细胞，待细胞长成单层后，CPV弱毒AV41感染6孔板上LT细胞，37°C吸附2h,重组质粒用脂质体转染方法，按Lipofectamine?2000Transfection Reagent试剂盒说明进行操作，转染48h后在荧光显微镜下观察是否有荧光，同时观察细胞病变，参见图12。当90%细胞发生病变且有荧光出现时(参见图13)，收毒CPV于-70°C保存:将发生病变的细胞培养板置于_70°C保存。
[0113](3)重组CPV的筛选
[0114]96孔板上铺LT细胞，待细胞长成单层后，换选择培养液(2.5%FBS, MPA25 μ g/mL,Xanthine250 μ g/mL, Hypoxanthinel5 μ g/mL)鮮育 16_24h。将上述病毒原液稀释 100 倍后接种于96孔板的LT细胞，37°C吸附2h，换选择培养液继续培养。观察细胞病变及荧光，当出现带有绿色荧光的病毒蚀斑时，选择此孔中的病毒悬液作为下一步筛选的病毒库。重复上述过程，直至获得含有多量荧光病毒蚀斑的病毒悬液，此时将该病毒悬液稀释后接种于6孔板上扩大培养，收取病毒悬液。
[0115](4)重组CPV的鉴定
[0116]①rCPV基因组DNA检测:上述试验获得的重组病毒悬液，提取所得重组病毒rCPV/FMDV-VP 1、rCPV/PPRV-H基因组，利用下列引物进行PCR检测，以确定CPV发生重组的情况。
[0117]ρ7.5: 5，-TCTCTATAATCTCGCGCAACC-3’
[0118]tkR:5’-AAACGTGCTATCTAGTGCAGC-3’
[0119]PCR 反应条件:95V 3min，94°C 15s，52。。15s，72。。2minl0s
[0120]②RT-PCR检测外源基因:PCR鉴定阳性的病毒悬液接种于LT细胞中，当细胞出现中等程度病变时收集细胞，用TRIzoI提取RNA，进行RT-PCR进一步鉴定重组病毒中外源基因的转录。鉴定时加入羊的β-actin基因扩增作为内参。
[0121]③rCPV外源蛋白的表达:将鉴定为阳性的rCPV接种于LT细胞(96孔板或24孔板)，当细胞出现轻度病变时，进行间接免疫荧光试验，以鉴定rCPV中插入外源基因的表达情况。
[0122]二、结果
[0123]I目的片段PCR结果
[0124]PCR 扩增的目的片段有 Kanr-ori (2015bp)、cGFP-1RES (1326bp)、gpt (459bp)、FMDV-VPl (645bp)、PPRV-H (1830bp)，本 申请人:对其均进行了电泳检测，检测结果参见图6，以上目的片段的PCR产物均与预期大小一致。
[0125]2重组质粒酶切鉴定结果
[0126]依据重组载体的构建过程，本 申请人:对制备方法步骤3和4中获得的所有质粒均进行了酶切验证，结果参见图7-10 ;酶切鉴定结果均与预期相符。
[0127]3重组质粒测序结果
[0128]所有重组质粒均进行了 DNA测序，测序由华大基因科技服务有限公司及上海生工生物工程技术服务有限公司完成。所有结果与预期一致，可以进行下一步实验。
[0129]4重组质粒 启动子功能验证结果
[0130]为了验证载体中启动子pll和ρ7.5的功能，质粒pftkpgigp、ptkpp-GFP、ptkpp-H-1-GFP分别转染LT细胞。结果显示，转染后24h开始即可观察到绿色荧光，不同启动子下报告基因的表达时间也存在差异，p7.5的启动稍早,且突光相对较强；反之，pll下的GFP则表达稍晚，荧光强度较低。图11所示即为验证启动子功能的荧光照片。[0131]5重组CPV的筛选结果
[0132]在MPA选择培养基下，重组rCPV会在LT细胞上形成绿色荧光病毒蚀斑，未发生重组的病毒由于其核酸合成受到抑制而逐渐减少，经过几轮筛选，获得了滴度较高的rCPV。如图12和13所示。
[0133]6重组CPV的鉴定结果
[0134]①rCPV基因组DNA中外源基因检测结果:提取所得重组病毒rCPV/FMDV-VPl、rCPV/PPRV-H基因组，用引物对p7.5、tkR能够扩增得到插入到重组转移载体MCS中的外源基因，得到的PCR产物比外源基因长约150-200bp。如图14所示。
[0135]②重组病毒RT-PCR鉴定外源基因结果如图15所示。
[0136]③rCPV外源基因表达产物的鉴定结果如图16所示。
[0137]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例 所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种重组羊痘病毒转移载体，其特征在于:所述重组羊痘病毒转移载体是在含有抗性基因和质粒复制子序列，并能用III和Jkt II酶切的载体，如pVAXI载体，通过引入Hiη? III和Jkt II酶切位点插入DNA片段；所述DNA片段包含带有双向痘病毒启动子和羊痘病毒TK基因的同源臂的基因序列。
2.根据权利要求1所述的重组羊痘病毒转移载体，其特征在于:所述痘病毒启动子为pll 和 ρ7.5。
3.根据权利要求2所述的重组羊痘病毒转移载体，其特征在于:所述重组羊痘病毒转移载体的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.1。
4.根据权利要求1所述的重组羊痘病毒转移载体，其特征在于:所述羊痘病毒TK基因的同源臂长度为1400bp_1600bp,优选1500bp。
5.根据权利要求1所述的重组羊痘病毒转移载体，其特征在于:所述DNA片段中还包括报告基因和压力筛选基因；作为优选，所述报告基因为绿色荧光蛋白GFP，所述压力筛选基因选用表达鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶的基因gpt。
6.根据权利要求5所述的重组羊痘病毒转移载体，其特征在于:所述重组羊痘病毒转移载体的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.2。
7.—种重组羊痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于:步骤如下: (1)以pVAXI载体为模板，利用PCR方法扩增含有pUCori序列和卡那霉素抗性基因的DNA目的片段，得到目的片段Karf-ori ； (2)将双向痘病毒启动子、羊痘病毒TK基因的同源臂和多克隆位点进行DNA合成，得到如图2所示的载体片段，两端分别加入内切酶Jkt II和//i/7dIII序列，并连接于载体上； (3)将步骤(1)得到的目的片段和步骤(2)得到的重组质粒分别双酶切，酶切产物连接环化，得到重组载体ptkpp ； (4)提取羊痘病毒弱毒株AV41基因组DNA，利用PCR方法扩增含有TK基因的同源臂序列(约1500bp),替换质粒ptkpp中的TK基因同源臂,得到重组载体pftkpp ； (5)将报告基因和压力筛选基因插入到质粒pftkpp的多克隆位点，置于pll启动子后，构建成重组质粒pftkpgigp。
8.含有权利要求1-6任一所述的重组羊痘病毒转移载体的重组羊痘病毒。
9.根据权利要求8所述的重组羊痘病毒，其特征在于:所述重组羊痘病毒是将权利要求1-6任一所述的重组羊痘病毒转移载体导入羊痘病毒感染的细胞中，两者的同源序列在细胞内同源重组后得到的。
10.权利要求1-6任一所述的重组羊痘病毒转移载体、权利要求8或9所述的重组羊痘病毒在外源抗原转运中的应用。
【文档编号】C12N7/01GK103966262SQ201410140376
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】李继东, 才学鹏, 窦永喜, 朱学亮, 蒙学莲, 骆学农 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所, 宁夏大学