用于检测沙眼衣原体的特异性引物、探针和方法
【专利摘要】本发明涉及引物和探针技术，旨在提供一种用于检测沙眼衣原体的特异性引物、探针和方法。本发明中用于检测沙眼衣原体的特异性引物具体包括：上游引物MPF，其序列如SEQ?NO.1所示；下游引物MPR，其序列如SEQ?NO.2所示。本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可以达到1000拷贝/mL，说明其灵敏度良好。引物和探针对不含沙眼衣原体的样本没有检测信号，说明其特异性强，避免假阴性和假阳性结果的出现。通过利用本发明提供的引物和探针进行荧光PCR处理，操作简便、检测迅速、检出率高，与传统分离培养检测技术相比，提高了检出效率、降低了漏检率。能对多种临床样本进行高效可靠的筛查，对临床病情进行监测，指导合理用药。
【专利说明】用于检测沙眼衣原体的特异性引物、探针和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及引物和探针技术，特别涉及用于检测沙眼衣原体核苷酸序列的特异性引物、探针和方法。
【背景技术】
[0002]沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)是一类在细胞内寄生的革兰氏阴性微生物，大小约250-450nm。原体呈球形或类球形，胞浆膜外有刚性细胞壁，壁外有平滑表层。始体的体积较大，形状不甚规则，其包膜富有韧性，无刚性的细胞壁，原体和始体内皆含有DNA与RNA。有较复杂的、能进行一定代谢活动的酶系统，但不能合成带高能键的化合物，须利用宿主细胞的三磷酸盐和中间代谢产物作为能量来源，必须在活细胞内生存。具有独特的发育周期，并以二等分裂方式繁殖，形成包涵体。
[0003]沙眼衣原体具有特殊的染色性状，不同的发育阶段其染色有所不同。成熟的原体以Giemsa染色为紫色，与蓝色的宿主细胞浆呈鲜明对比。始体以Giemsa染色呈蓝色。沙眼衣原体对革兰氏染色虽然一般反应为阴性，但变化不恒定。沙眼包涵体在上皮细胞浆内，很致密，如以Giemsa染色，则呈深紫色，由密集的颗粒组成。其基质内含有糖原，以Lugol液染色呈棕褐色斑块。
[0004]人类是沙眼衣原体的自然宿主。它主要寄生于机体粘膜上皮细胞。猴和猩猩的眼及泌尿系可实验感染各型沙眼衣原体(包括LGV在内)。灵长类外的动物，对LGV之外的其他沙眼衣原体均无致病 性。鸡胚只对大多数沙眼衣原体敏感，但禽类则对各型沙眼衣原均不敏感。小白鼠对LGV衣原体是敏感的，尤其是脑内感染，病死率可达30%。此外，大白鼠、豚鼠和家兔对LGV衣原体的敏感性幼龄高于成年。所有沙眼衣原体都能在鸡胚卵黄囊内生长繁殖，并致死鸡胚。将沙眼衣原体悬液接种6~8天胚龄卵黄囊内，置35°C温箱，一般于6~8天后死亡。剖检时胚体及卵黄囊膜充血。卵黄囊膜涂片可散在衣原体，病理切片则可见卵黄囊膜细胞内包涵体。
[0005]沙眼衣原体可以引起多种疾病，如沙眼，还与人类泌尿生殖道疾病相关，如非淋菌性尿道炎、阴道炎、宫颈炎、子宫内膜炎等；CT还可以通过母婴传播新生儿眼结膜炎、肺炎，并可导致胎膜早破、早产、新生」L死亡等。
[0006]目前临床或实验室诊断沙眼衣原体的检测方法有酶联免疫法和细胞培养法等。酶联免疫法和细胞培养法灵敏度较低，而且耗时耗力，不利于及时指导用药。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种检测沙眼衣原体的特异性引物、探针和方法。
[0008]为解决技术问题，本发明的解决方案是:
[0009]提供一种用于检测沙眼衣原体的特异性引物，该引物具体包括:
[0010]上游引物MPF，其序列为 SEQ N0.1:5’ CCTCTGAAACGACTTTTC3’ ；[0011]下游引物MPR，其序列为 SEQ N0.2:5’ CTGGATTTATCGGAAACC3’。
[0012]本发明还提供了用于检测沙眼衣原体的特异性探针，该探针的两端分别是标记荧光
[0013]报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸；其序列为:
[0014]SEQ N0.3:5’ FAM TCTCTTGACCACAGCGAATCTT BHQ13’。
[0015]本发明进一步提供了检测沙眼衣原体的方法，是利用前述的引物和探针，采用荧光PCR技术对沙眼衣原体的核酸序列进行扩增；通过PCR扩增在加入一对引物的同时加入特异性的突光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个突光报告基团和一个突光淬灭基团；探针完整时，报告基团发射的荧光信号会被淬灭基团吸收；扩增开始时，探针与靶核酸结合；经PCR扩增后，Taq酶的5，端一3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而在荧光监测系统能够接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在；具体的判断依据为:
[0016]如果待检样本中含有沙眼衣原体，则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可以达到1000拷贝/mL，如果待检样本中没有沙眼衣原体，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号。这一结果也提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。
[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0018]1、本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可以达到1000拷贝/mL，说明其灵敏度良好。
[0019]2、本发明提供的引物和探针对不含沙眼衣原体的样本没有检测信号，说明其特异性强。
[0020]3、由于本发明进行了程序和体系优化，避免了假阴性和假阳性结果的出现。
[0021]4、通过利用本发明提供的引物和探针进行荧光PCR处理，操作简便、检测迅速、检出率高，与传统分离培养检测技术相比，提高了检出效率、降低了漏检率。可对多种临床样本进行高效可靠的筛查，以及对临床病情进行监测，指导合理用药。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为利用引物对MPF/MPR和探针检测沙眼衣原体阳性样本的荧光PCR扩增图。
[0023]图中曲线I为沙眼衣原体阳性样本扩曲线；曲线2为内标扩增曲线。
【具体实施方式】
[0024]荧光PCR技术原理是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
[0025] 本发明利用特异性的引物，采用荧光PCR技术对沙眼衣原体的核酸序列进行扩增；通过PCR扩增在加入一对引物的同时加入特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团；探针完整时，报告基团发射的荧光信号会被淬灭基团吸收；扩增开始时，探针与靶核酸结合；经PCR扩增后，Ta,酶的5’端一 3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而在荧光监测系统能够接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在。
[0026]具体实施例子如下:
[0027]1.引物和探针的设计:通过分别对已知的沙眼衣原体的核酸序列进行比较分析，设计多对引物和探针，引物长度一般为20碱基左右。最优引物探针序列组合如下:
[0028]上游引物MPF:5’ CCTCTGAAACGACTTTTC3’ (SEQ N0.1)
[0029]下游引物MPR: 5 ’ CTGGATTTATCGGAAACC3 ’ (SEQ N0.2)
[0030]探针:5’FAM TCTCTTGACCACAGCGAATCTT BHQl3’ (SEQ N0.3)。
[0031]2.反应体系的优化:利用临床分离的沙眼衣原体灭活液作为待检样品，用磁珠裂解法抽提沙眼衣原体核酸，分装后贮存于一 80°C。
[0032]2.1引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将沙眼衣原体引物浓度分别从0.1 μ mol/L至1.6 μ mol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度是0.2ymol/L。
[0033]2.2探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将沙眼衣原体检测用探针浓度分别从0.1 μ mol/L至0.5 μ mol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0.1 6 μ mol/L。
[0034]利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的沙眼衣原体实时荧光PCR反应体系为25 μ L0按照荧光定量PCR试剂盒说明进行反应液的配置。
[0035]3.仪器检测通道的选择
[0036]选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说明书进行设置。
[0037]4.PCR反应条件如下
[0038]500C 2min 进行 UNG 酶反应；95°C 3min, I 个循环；94°C 10s，62°C 40s,40 个循环，在62°C 40s阶段收集荧光。
[0039]5.检测结果分析
[0040]如果待检样本中含有沙眼衣原体，则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可以达到1000拷贝/mL，如果待检样本中没有沙眼衣原体，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。
【权利要求】
1.用于检测沙眼衣原体的特异性引物，其特征在于，该引物具体包括: 上游引物 MPF，其序列为 SEQ N0.1:5’ CCTCTGAAACGACTTTTC3’ ； 下游引物 MPR，其序列为 SEQ N0.2:5’ CTGGATTTATCGGAAACC3’。
2.用于检测沙眼衣原体的特异性探针，其特征在于，该探针的两端分别是标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸；其序列为:
SEQ N0.3:5’ FAM TCTCTTGACCACAGCGAATCTT BHQ13’。
3.—种检测沙眼衣原体的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针，采用荧光PCR技术对沙眼衣原体的核酸序列进行扩增；通过扩增在加入一对引物的同时加入特异性的突光探针；该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个突光报告基团和一个荧光淬灭基团；探针完整时，报告基团发射的荧光信号会被淬灭基团吸收；扩增开始时，探针与靶核酸结合；经PCR扩增后，Taq酶的5’端一 3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而在荧光监测系统能够接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而能通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在；具体的判断依据为: 如果待检样本中含有沙眼衣原体，则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可以达到1000拷贝/mL，如果待检样本中没有沙眼衣原体，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号。
【文档编号】C12Q1/68GK103993085SQ201410223590
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月25日 优先权日:2014年5月25日
【发明者】陈宁清, 乔佳, 叶朝付, 李原, 汪维成 申请人:浙江省医疗器械研究所