一种a12-脂肪酸脱氢酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种从深黄被孢霉M6-22中分离的△12-脂肪酸脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQIDN0：1所示，编码如SEQIDN0：2所示的氨基酸序列；通过构建重组载体并在酿酒酵母中表达，表达产物具有△12-脂肪酸脱氢酶功能，能催化油酸转化成亚油酸。
【专利说明】-种Δ12-脂肪酸脱氢酶基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】和遗传工程领域，涉及从一种丝状真菌一深黄被孢霉 (iforiiereBa )Μ6-22中克隆的△ 12_脂肪酸脱氢酶基因，具体讲是深黄被孢霉 △12_脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列及其应用；将该基因直接或与不同载体连接，转入细菌、 酵母、植物或动物中，利用其编码Λ 12_脂肪酸脱氢酶产生不饱和脂肪酸的方法和应用。
【背景技术】
[0002] Δ 12-脂肪酸脱氢酶（Δ 12-fatty acid desaturases)又称油酸脱氢酶（oleate desaturases)。Δ12-脂肪酸脱氢酶的主要作用是在单不饱和脂肪酸油酸（oleic acid) 的第12和13位碳原子之间插入一个双键，形成含有2个双键的多不饱和脂肪酸-亚油酸 (linoleic acid)。Λ 12-脂肪酸脱氢酶是油酸脱氢形成亚油酸的关键酶，是n-3和n-6类 多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid)合成途径的限速酶，控制着细胞中大多 数不饱和脂肪的合成。Λ 12_脂肪酸脱氢酶只存在于植物、藻类和低等真核生物等中，但在 人和哺乳动物细胞中缺乏，因此，亚油酸是一种人体必须脂肪酸，必须从食物中摄取。膳食 性摄入亚油酸，经其它相关脱氢酶和延伸酶的交替催化下可进一步转化成其它长链多不饱 和脂肪酸[Horrobin DF，1992, Prog Lipid Res，31:163-194]，这些多不饱和脂肪酸在人体 中具有重要的生理功能。此外，多不饱和脂肪酸是细胞生物膜的重要组成成分，起到维持 细胞正常功能和增加机体抗逆性的作用[Napier JA et al，1999，Curr. Opin. Plant Biol, 2:123-127]，因此包括亚油酸在内的多不饱和脂肪酸在保健和医疗方面有很广阔的应用前 景。研究多不饱和脂肪酸的合成和它的生理作用成为当前的热点。
[0003] Λ12-脂肪酸脱氢酶属于一类膜整合酶，由于分离和鉴定膜结合蛋白的难度 很大[MaKeon，1981，酶学方法，12141-12147 ;wang等，1988,植物生理学生物化学， 26:777-792]，因此常规的生物化学方法很难得到包括Λ 12-脂肪酸脱氢酶在内的各种膜 结合蛋白性质脱氢酶高级机构，而只能通过对酶的核苷酸序列进行初步研究，对于脂肪酸 脱氢酶的生物学功能验证，许多实验室采用了从各种生物体中克隆相关的基因并转入各 种受体细胞中，然后在受体细胞中观察其脂肪酸改变的方法。序列对比的结果表明，编码 Λ 12_脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列具有共同的机构特性：存在三个组氨酸保守区，形成四次 跨膜的结构[Kyte et al，1982，J. Mol. Biol. 157:105-132]，这些都是维持脱氢酶活性所必 须的。
[0004] 由于脂肪酸脱氢酶和各种多不饱和脂肪酸在人体健康等方面的重要性，已经引起 人们极大的研究兴趣。目前，通过文库筛选、基因组测序、PCR等技术已从动物、植物、藻类 和低等真核生物等不同来源中分离到许多Λ 12-脂肪酸脱氢酶基因的同源序列，并且证明 具有相应的生物学功能。然而，尽管获得了很多Λ12-脂肪酸脱氢酶的基因序列，但是在酶 的纯化方面存在的技术困难，目前仍没有从酶水平揭示其在自然环境中的生化特性。因此， 只能借助于发掘更多的不同来源的Λ 12-脂肪酸脱氢酶基因序列，通过基因序列分析来更 深入揭示Λ12-脂肪酸脱氢酶的生物学功能，并为将来酶的纯化和生化特性的揭示以及进 一步的应用打下基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种Λ12-脂肪酸脱氢酶基因，这是从深黄被孢霉 2?<9#/&3)Μ6-22中分离得到，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0:1所不或 该核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO :1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1173bp (碱 基)，其中1-1173为编码Λ12-脂肪酸脱氢酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸 序列如SEQ ID NO :2所示的多肽或其片段。
[0006] 本发明另一目的是提供一种含有Λ 12-脂肪酸脱氢酶基因的重组表达载体，是将 SEQ ID NO :1所示基因直接与不同表达载体(质粒、病毒或运载体)连接所构建的重组载体。
[0007] 可用本领域的技术人员熟知的方法来构建含编码从深黄被孢霉M6-22 △ 12_脂肪 酸脱氢酶的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重 组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等[Sambroook，et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]。所述的编码黏 红酵母YM25079 Λ 12-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列可有效连接到表达载体的恰当启动子上， 以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的Iac或trp启动子；λ噬菌体 的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启 动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒 中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体 中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式 作用因子，通常大约有10_300bp，作用于启动子以增强基因的转录，如腺病毒增强子。
[0008] 本发明另一目的是提供一种含有Λ 12-脂肪酸脱氢酶基因或上述重组表达载体的 宿主细胞，该细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代，宿 主细胞的代表性例子有：大肠杆菌；真菌细胞或酵母；植物细胞如油菜、烟草、大豆；昆虫细 胞如果蝇S2或Sf9 ;动物细胞如CH0、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
[0009] 用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体优化宿主细胞可用本 领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态 细胞可在指数生长期手机菌体，用CaCl 2、电穿孔等方法进行。当宿主是真核生物，可选用 DNA转染法。显微注射、电穿孔、脂质体包装等方法。
[0010] 本发明的核苷酸序列是DNA形式的，DNA形式包括CDNA、基因组DNA或人工合成的 DNA，DNA可以是单链的或是双链的，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID N0:2所示 的编码区序列相同或是简并的变异体。
[0011] 本发明还包括编码从深黄被孢霉M6-22获得的Λ 12-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列 的片段。如本发明所用，术语"片段"是指能编码基本上保持本发明天然的相同的生物学功 能或活性的多肽的核苷酸序列。通过本文的阐述，这样的片段、被认为在本领域技术人员的 知识范围之内。
[0012] 本发明中的多肽和核苷酸序列优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
[0013] 本发明中特异核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分 离核苷酸序列。这些技术包括但不局限于：（1)用探针与基因组或CDNA文库杂交以检出同 源的核苷酸序列；和（2)表达文库的抗性筛选以检出具有共同结构特征的克隆的核苷酸序 列片段。
[0014] 本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：（1)从基因组DNA分离双链DNA序 列；（2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。
[0015] 上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成法是经常 选用的方法。更经常选用的方法是DNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从 高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA 的方法已有多种成熟的技术，用试剂盒也可从商业途径获得。而构建cDNA文库也是通常的 方法。当结合聚合酶链式反应技术（PCR)时，即使极少的表达产物也能克隆。
[0016] 本发明另一目的是将λ 12-脂肪酸脱氢酶基因应用在生产不饱和脂肪酸中。
[0017] 本发明提供的核苷酸序列是一种高效的特异性的脂肪酸脱氢酶，可以将其与载体 连接后转化至微生物细胞体内生产不饱和脂肪酸，具有产物特异性高、生产周期短、生产不 受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发功能油脂等优点，可以用于 商业化生产，直接改善油脂品质，更加具有实际应用价值。本发明应用基因工程技术构建特 异性生产多不饱和脂肪酸的转基因酵母细胞生产不饱和脂肪酸，具有操作简单、成本低、可 行性商等优点，为新一代转基因脂肪酸广品的品质改良奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为本发明的深黄被孢霉Μ6-22 Λ 12-脂肪酸脱氢酶和卷枝毛霉(ifocor Λ12-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列同源性比较示意图； 图2为本发明所构建的酿酒酵母表达载体pY3CID12-2结构示意图； 图3为本发明含pYES3/CT空载体的转基因酵母的气相色谱图； 图4为本发明含重组质粒pY3MID12-2的转基因酵母的气相色谱图。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本 实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂 或按常规方法配置的试剂。
[0020] 实施例1 :从深黄被孢霉M6-22中分离△ 12_脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列 将深黄被孢霉M6-22接种到PDA液体培养基中，28 °C培养48h，收集菌丝体，用液氮研磨 成菌丝粉，然后采用真核细胞总RNA提取试剂盒（Promega公司产品)提取深黄被孢霉M6-22 的总RNA，再利用反转录试剂盒（fermentas公司产品）反转录合成第一条cDNA,以该cDNA 为模板，利用特异性引物(引物1和引物2)进行PCR反应，反应所用组份和扩增条件如下： 引物 I :MID12-2Fl:5'-ATGGCAACCAGACGAAACATTGGCTCA-3' 引物 2 :CID12-2Rl:5'-CTAGTTTTTCCAGAACACAACATCTCCT-3' ; PCR扩增体系（25 μυ组成如下： IOXEx Taq Buffer 2. 5 M-L dNTP (2.5 Mmol/L) 2 μ? 模板 3 μ? MID12-2F1 (10 Mmol/L) 2 μ? CID12-2R1 (10 Mmol/L) 2 μ? Ex Taq DNA polymerase (5U/M-L) 2 M-L 无菌ddH20 补足至25 PL 扩增条件：94°C变性 4min，再用 94°C lmin、58°C I. 5min、72°C 2min 进行 30 个循环， 最后72°C IOmin ;琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增得到大小约1200bp的片段，用多功 能DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）（北京百泰克生物技术有限公司）回收，把回收片段亚 克隆到PMD-18T (TaKaRa公司产品冲，连接产物转化到用CaCl2法处理的大肠杆菌DH5 α， 在含氨苄青霉素（l〇〇ug/ml)的LB固体平板上过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，通过 菌落PCR验证阳性克隆。将验证阳性的克隆子接入LB液体培养基(含lOOug/ml氨苄青霉 素）中过夜培养，用高纯质粒小量制备试剂盒(离心柱型）（北京百泰克生物技术有限公司） 提取质粒，经测序(北京三博志远北京三博远志生物技术有限责任公司），结果显示所扩增 得到的片段大小为1173bp，如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0021] 实施例2 :所分离核苷酸序列的同源性搜索 将推测的Λ 12_脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列在Genbank上进行同源相似性搜 索，所得同源序列大部分为编码Λ 12_脂肪酸脱氢酶的序列，其中与卷枝毛霉Ofomr circifleWoiofes) Δ12-脂肪酸脱氢酶氨基酸同源性最高，相同性为68% (图1)。图1显 示本发明的深黄被孢霉M6-22中分离Λ12-脂肪酸脱氢酶和卷枝毛霉Λ12-脂肪酸脱氢 酶（GenBank: BAB69056. 1)的氨基酸序列同源性比较图，MID12-2为本发明的深黄被孢霉 M6-22 Λ 12-脂肪酸脱氢酶，MCD12为卷枝毛霉Λ 12-脂肪酸脱氢酶，Consensus :两序列之间 相同的氨基酸序列，这说明本发明新的核苷酸序列所编码的酶具有潜在的Λ12-脂肪酸脱 氢酶的功能。
[0022] 实施例3:酿酒酵母重组表达载体的构建 根据SEQ ID N0:1所示编码区序列，设计出一对基因特异性扩增引物（引物3和引物4) 分离其潜在的开放阅读框序列： 引物 3 ：MID12-2F2:5'-ATTGAATTCATGGCAACCAGACGAAACATT-3' 引物 4 ：CID12-2R2:5' -TAGAATTCCTAGTTTTTCCAGAACACAACATCT-3' 此两个引物的5 '端下划线部分分别含有/Ziz7i/ III和通〇 I酶切位点，所用的扩增条件 和反应组分和以cDNA为模板的PCR反应相同，扩增产物的测序结果显示和SEQ ID N0:1所 示l-1173bp的序列一致。然后取25ulPCR产物和10ulpYES3/CT分别进行双酶切，回收酶 切大片段，并用T4连接酶在16度连接4h，连接产物转化大肠杆菌HD5 α，通过质粒提取和 PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定。质粒构建结果见图2,所构建的含有Λ 12-脂肪酸脱氢 酶基因的酵母表达命名为PY3MID12-2 ;该质粒是由pYES3/CT (Invitrogen公司)和引物3、 引物4的PCR产物构建而成。质粒和PCR产物分别经fee I和feoR I双酶切后，电泳回收 纯化，经T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选鉴定出重组质粒，命名为 PY3MID12-2。
[0023] 实施例4 :重组表达载体转化酿酒酵母细胞 挑取酿酒酵母菌株INVSCl单菌落于5ml YEH)液体培养基中，30°C摇床过夜培养，按1% 的接种量转接于IOOml的YEH)液体培养基中，30°C摇床摇至0D600于1. 3-1. 5之间。4°C、 4000g离心5min收集沉淀细胞，用IOOml预冷的无菌CldH2O洗涤细胞，4°C、4000g离心5min 收集沉淀细胞，再用50ml预冷的无菌ddH20洗涤细胞，4°C、4000g离心5min收集沉淀细胞， 用20ml预冷的IM山梨醇洗涤细胞，4°C、4000g离心5min收集沉淀细胞，细胞用0. 5ml的预 冷的IM山梨醇悬浮，每80ul分装于I. 5ml预冷的离心管中。取Iug线性化的重组表达载 体PY3MID12-2加入80ul的感受态细胞中，混匀后转至0. 2cm的点转杯中，冰上孵育5min， 转入电转仪中电击（电击条件：电压I. 5kV，电容25uF，电阻200 Ω，电击时间为4-10ms)。电 击完毕后立即加入Iml IM预冷的山梨醇并吹匀，30°C孵育2h后涂布于SC-Trp (无色氨酸） 选择培养基上，置30°C培养3-4天。
[0024] 实施例5 :酵母工程菌的诱导表达 挑取SC-Trp(无色氨酸)选择培养基平板上出现的阳性转化子，接种于15ml SC-Trp(无 色氨酸）选择培养基(含2%葡萄糖)，30°C摇菌培养24h，转接于IOOml的SC-Trp (含2%的 半乳糖和1%的棉子糖）中使其初始0D600为0. 4,30°C继续培养72h，4000g离心收集菌体， 用去离子水洗涤三次，50°C烘干，研碎，取IOOmg加入5ml 5%的KOH-CH3OH溶液中，70°C反应 3h，反应结束后冷却至室温，用6M的盐酸调节溶液的pH值到2. 0,加入4ml 14%BF3-CH30H， 70°C反应I. 5h，合成脂肪酸甲酯；再加入IOml饱和的NaCl溶液，剧烈震荡混匀，转移至分 液漏斗中，用8ml 1:4的氯仿：环己烷抽提两次，合并两次的提取液，加入适量的无水Na2SO4 干燥提取液，静置lh，去掉Na2SO4，把含有脂肪酸甲酯的上清用氮气吹干，用200ul的正己烷 回溶样品，最后用〇. 45um微孔滤膜过滤。
[0025] 实施例6:脂肪酸气相色谱分析 采用气相色谱分析仪器分析转基因酵母工程菌的诱导表达情况，气相色谱分析仪器为 岛津GC-7A，柱子：弹性石英毛细管柱，0.32 X 30m，固相支持物：聚二乙二醇丁二酸酯镀膜 物：聚酰亚胺。载气：N2,线速10cm/s。分流比：100:1，气化室温度：250°C，柱温：180°C，尾 吹：50ml/min，检测器：氢火焰离子化检测器。把上述制备的脂肪酸甲酯化样品进行GC分 析，上样量为Iul;分析软件：Anstar。
[0026] 色谱分析结果见图3、4,图3显示含pYES3/CT空载体的转基因酵母，图4显示含重 组质粒PY3MID12-2的转基因酵母；与图3相比，图4中保留时间为13. 7min对应的峰与亚 油酸甲酯标准品一致，即为深黄被孢霉M6-22 Λ 12-脂肪酸脱氢酶催化油酸产生的亚油酸。
【权利要求】
1. 一种Λ12-脂肪酸脱氢酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，编 码如SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列。
2. -种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求1所述的Λ 12-脂肪酸脱氢酶基因。
3. 权利要求1所述Λ 12-脂肪酸脱氢酶基因在生产不饱和脂肪酸中的应用。
【文档编号】C12R1/645GK104212819SQ201410360401
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】张琦, 杨昭杰, 许振宁, 杨晓霞, 魏云林, 林连兵, 季秀玲 申请人:昆明理工大学