一种链霉菌菌株及由它制备的具抗植物病原真菌的化合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种链霉菌FTY2菌株及由它制备的环己酰亚胺类化合物及其应用。本发明的生产菌株为链霉菌(Streptomycessp.)FTY2,该菌株已于2014年5月8日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.9133，菌种由16SrDNA鉴定。与现有的抗植物病原真菌农药相比，本发明具有对环境无污染、成本低、抗植物病原真菌效果较好的优点。首次发现天然产物的环己酰亚胺类化合物(cycloheximide)具抗真菌，能作为制备抗植物病原真菌药制剂和前体物质的应用。还提供了所'述的链霉菌FTY2菌株和环己酰亚胺化合物在制?备抗植物病原真菌的农药中的应用。
【专利说明】一种链霉菌菌株及由它制备的具抗植物病原真菌的化合物 及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属生物农药【技术领域】，涉及一种链霉菌（Streptomyces sp. )FTY2菌株，及 由其制备的具有抑制植物病原真菌的化合物及其制备方法和应用。
【背景技术】：
[0002] 农作物病虫草鼠害是农业生产上的重要生物灾害，是制约农业生产高产、优质、高 效和持续发展的重要因素之一。我国农作物病虫草鼠等生物灾害种类多，粮食作物的主要 病虫害有近200种（胡伯海.2002)。众多病虫害发生重、范围广，给农业生产造成巨大损 失，约为农业总产值的20%?25% (王长燕等，2006)，因而严重影响我国的粮食生产和品 质安全。植物保护作为防治农业病虫害的重要措施，对促进我国粮食生产安全和保障粮食 安全的可持续发展有着十分重要的意义。因此，研究开发高效低毒的生物病虫害制剂已成 为农业可持续发展的重要问题。现有技术中未见有一种链霉菌（Streptomyces sp.)FTY2 菌株制备两个环己酰亚胺化合物（cycloheximide)以及它们抗植物病原真菌活性的报道。
【发明内容】
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[0003] 本发明的目的在于提供一类来源于榧树的内生链霉菌的链霉菌（Streptomyces sp. )FTY2菌株，由其制备的具有抑制植物病原真菌的化合物及其制备方法和应用。该 化合物具有抗病原真菌（小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis)、棉红腐病菌 (Fusarinum moniliforme)、三七丝核病菌（Verticillium cinnabarium)以及水稻稻癌病 菌（Phyricularia oryzae))的活性。
[0004] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0005] -种分离自榧树的内生链霉菌（Streptomyces sp.)菌株，编号为FTY2,由16S rDNA鉴定菌株，保藏号为CGMCC No. 9133。
[0006] 如所述的链霉菌FTY2菌株，其DNA由下述方法制备而得：
[0007] (1)将FTY2接种于液体淀粉培养基中，25°C，200rpm培养14天，过滤收集菌丝体；
[0008] (2)选取适量菌丝体放入I. 5mL离心管（EP管）中，同时在离心管中加入少量的石 英砂和少量的PVP (聚乙烯吡咯烷酮）；
[0009] (3)在离心管（内有研磨好的材料粉末）中加入750 μ L 65°C水浴预热的4X CTAB 提取液，充分研磨后，放入65°C水浴锅中温浴2-4h，期间每30min摇匀一次；
[0010] (4)将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入等体积（750 μ L)的苯 酚-氯仿-异戊醇混合液（25:24:1)，摇勻3?5min，12000rpm室温离心IOmin ;
[0011] (5)将上清液转移至一新的I. 5mL的离心管中，再加入等体积的氯仿-异戊醇 (500-550 μ L)混合液（若颜色较深可前两次使用苯酚-氯仿-异戊醇混合液，最后一次使 用氯仿-异戊醇），摇勻3?5min，12000rpm，室温离心IOmin ;(
[0012] (6)将上清液转移至一新的1.5mL的离心管中，加入2/3体积（约35〇μυ 的-20°C预冷的异丙醇（凝固点低，沉降DNA)，沉降DNA，充分混匀后（一定要充分摇匀，否 则会冰冻），于_20°C冰箱中静置保存2h ;
[0013] (7)将冷冻保存的离心管取出后置于室温中，待温度至室温后12000rpm室温离心 15min。可见底部沉降DNA;
[0014] (8)弃去上清液，用500 μ L的70 %的乙醇和无水乙醇各冲洗1-2次，每次 12000rpm室温离心Imin后弃上清液（直接倒掉上清液即可，注意不要将DNA倒掉，倒的过 程中可轻轻旋转使DNA贴在壁上），然后将离心管置于37°C恒温箱中约20?30min使乙醇 充分挥发（也可以开盖使其自然干燥），干燥后加入灭菌的蒸馏水；
[0015] (9)置于-20°C冰箱中保存备用。
[0016] 如所述的链霉菌FTY2菌株，其来源于榧树的内生链霉菌。
[0017] 所述的链霉菌FTY2菌株的制备方法，采自海拔2190m的云南省迪庆州维西县云 南榧Torreya yunnanensis的新鲜枝条置于冰盒保存，带回实验室后，将新鲜枝叶用自来 水冲洗15min，晾干后置于超净工作台上进行表面消毒，先用75%乙醇浸泡约lmin，用无菌 水涮洗3次，接着用15%的NaClO浸泡15min，用无菌水涮洗3次。取消毒后的3g叶片置 于无菌研钵中加5mL无菌水研磨呈匀浆状，用三角涂布棒将200 μ L研磨液均匀涂布于含有 重铬酸钾（50mg/L)的高氏1号固体培养基（可溶性淀粉20g/L，KN03lg/L，K 2HPO4O. 5g/L， MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，FeSO4 · 7H20 0· 01g/L，琼脂 20g/L，pH 7· 2 ?7· 4)上， 在25°C条件下培养20天，一个链霉菌菌落在平板上长出，挑取单一菌落，用划线法纯化后， 菌株编号为FTY2。
[0018] 从所述的链霉菌FTY2菌株的固体发酵产物的乙酸乙酯部分分离得到的如下结构 式所示的两个环己酰亚胺化合物，
[0019]
【权利要求】
1. 一种分离自植树的内生链霉菌Streptomyces sp.菌株，编号为FTY2,由16S rDNA 鉴定菌株，保藏号为CGMCC No. 9133。
2. 如权利要求1所述的链霉菌FTY2菌株，其特征在于其DNA由下述方法制备而得： (1) 将FTY2接种于液体淀粉培养基中，25°C，200rpm培养14天，过滤收集菌丝体； (2) 选取适量菌丝体放入I. 5mL离心管即EP管中，同时在离心管中加入少量的石英砂 和少量的PVP聚乙烯吡咯烷酮； ⑶在内有研磨好的材料粉末的离心管中加入750 μ L 65°C水浴预热的4XCTAB提取 液，充分研磨后，放入65°C水浴锅中温浴2-4h，期间每30min摇勻一次； (4) 将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入等体积750 μ L的25:24:1的 苯酚-氯仿-异戊醇混合液，摇勻3?5min，12000rpm室温离心IOmin ; (5) 将上清液转移至一新的I. 5mL的离心管中，再加入等体积500-550 μ L的氯仿-异 戊醇混合液，当颜色较深时，前两次使用苯酚-氯仿-异戊醇混合液，最后一次使用氯 仿-异戊醇，摇勻3?5min，12000rpm，室温离心IOmin ; (6) 将上清液转移至一新的I. 5mL的离心管中，加入2/3体积的-20°C预冷的异丙醇， 沉降DNA，充分混匀后，于-20°C冰箱中静置保存2h ; (7) 将冷冻保存的离心管取出后置于室温中，待温度至室温后12000rpm室温离心 15min，底部沉降DNA ; (8) 弃去上清液，用50(^1^的70%的乙醇和无水乙醇各冲洗1-2次，每次12000印111室 温离心Imin后弃上清液，直接倒掉上清液，倒的过程中轻轻旋转使DNA贴在壁上，然后将离 心管置于37°C恒温箱中20?30min使乙醇充分挥发或开盖使其自然干燥，干燥后加入灭菌 的蒸馏水； (9) 置于-20°C冰箱中保存备用。
3. 如权利要求1所述的链霉菌FTY2菌株，其特征在于其来源于榧树的内生链霉菌。
4. 权利要求1所述的链霉菌FTY2菌株的制备方法，取云南榧Torreya yunnanensis 的新鲜枝条置于冰盒保存，带回实验室后，将新鲜枝叶用自来水冲洗15_20min，晾干后置于 超净工作台上进行表面消毒，先用75%乙醇浸泡l-2min，用无菌水涮洗3次，接着用15% 的NaClO浸泡15-20min，用无菌水涮洗3次，取消毒后的3g叶片置于无菌研钵中加5mL无 菌水研磨呈匀浆状，用三角涂布棒将200 μ L研磨液均匀涂布于含有50mg/L的重铬酸钾的 高氏1号固体培养基上，所述培养基组成为：可溶性淀粉20g/L，KN0 3lg/L，K2HPO4O. 5g/L， MgSO4 ·7Η200· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，FeS04 ·7Η20 0· 01g/L，琼脂 20g/L，pH 7· 2 ?7· 4,在 25°C 条件下培养20天，一个链霉菌菌落在平板上长出， 挑取单一菌落，用划线法纯化后，菌株编号为FTY2。
5. 从权利要求1所述的链霉菌FTY2菌株的固体发酵产物的乙酸乙酯部分分离得到的 如下结构式所示的两个环己酰亚胺化合物，
6. 制备权利要求5所述化合物1-2的方法，将链霉菌FTY2用固体平板的方式用燕麦培 养基进行发酵培养，所述燕麦培养基为：燕麦粉20. Og，微量兀素母液ImL,蒸馈水IOOOmL, pH 7. 2 ;所述微量元素母液配方为：FeSO4 · 7H20 0· lg，MnCl2 · 4H20 0· lg，ZnS04 · 7H20 〇. lg，蒸馏水IOOmL ;121°C灭菌20min ;在26°C发酵培养21d，发酵20L ;固体发酵物切割后 用80% :15% :5%的乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸冷浸提取三次，提取液过滤减压浓缩除去有 机相后溶于水中，加入相等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并经旋转蒸发仪浓缩后得粗提物； 浸膏经200?300目硅胶柱色谱，以10:1 - 6:4的石油醚-乙酸乙酯及10:1 - 0:100的 氯仿-甲醇梯度洗脱得10个组分Fr. I-Fr. 10 ;组分Fr. 8经200?300目硅胶，用100:15 的石油醚-丙酮进行洗脱得到5个亚组分；Fr. 8. 3为白色粉末状，经S印hadex LH-20氯 仿-甲醇1: 1，得到Fr. 8. 3. 1和Fr. 8. 3. 2 ;Fr. 8. 3. 2经半制备HPLC得到化合物1及2,具 体条件为：环境温度下，使用250mmX IOmm的RP-C18,流动相为水-甲醇溶液，水从60%降 至〇%，流速为3mL/min，检测波长为254nm。
7. 权利要求1所述的链霉菌FTY2菌株在制备抗植物病原真菌的农药中的应用。
8. 权利要求5所述的环己酰亚胺化合物在制备抗植物病原真菌的农药中的应用。
【文档编号】C12R1/465GK104212742SQ201410418250
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】赵沛基, 周晓雪, 李靖, 杨银河, 曾英 申请人:中国科学院昆明植物研究所