一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基、制备方法及筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基，配方包括如下组分：酵母提取物、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙、硫酸铵、葡萄糖、氯化血红素、辅酶I、和或琼脂；制备用于筛选高产Hib疫苗菌株培养基的方法包括称量、制备A液、制备B液和混合；通过多次在固体和液体培养基上传代生长筛选具有荚膜的高产菌株。本发明培养基不含有动物血液和动物来源的蛋白成分，避免了潜在的风险，提高了疫苗的安全性；培养基的制备方法具有操作简单、制备方便、成本低的优点；本发明的筛选方法解决了Hib疫苗规模化生产的菌种筛选问题，大大提高了Hib荚膜多糖产量，提高了工作效率、降低了生产成本。
【专利说明】-种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基、制备方法及筛 选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基、 制备方法及筛选方法。
【背景技术】
[0002] B型流感嗜血杆菌（Hib)是流感嗜血杆菌中具有极强侵袭力的一种，在流感嗜血 杆菌引起的严重感染中，几乎90%是由B型引起的，主要引起脑膜炎、肺炎、心包炎、关节 炎、菌血症、会厌炎等疾病，该病使15%至35%的存活者患有终身残疾，典型的病症有精神 发育迟滞或耳聋。B型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎是导致精神发育迟滞或耳聋。B型 流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎是导致婴幼儿死亡的主要原因。多年流行病学研究表明， 使用Hib疫苗是控制Hib侵袭性疾病的有效措施。
[0003] 荚膜是B型流感嗜血杆菌菌株的毒性的主要因素，它是由一系列的核糖基核糖 醇磷酸酯（PRP)的重复单元组成的多糖。B型流感嗜血杆菌群落（Population)常常是 不均质的，有荚膜的细菌与无荚膜的细菌菌株共存。有荚膜的B型流感嗜血杆菌会在自 发地发生遗传突变后丧失了表达该荚膜的能力。根据Hoiseth等人（Infectious and Immunity (1985) ,49:389-395)的研究，在每一细菌代中以0. 1-0. 3%的频率发生荚膜表达 的缺失。以PRP或通过共价健连接于载体蛋白质上的PRP为基础的疫苗用于防止b型流感 嗜血杆菌感染。为了制造这些疫苗，需要在大体积的培养基中生产大量的细菌，从该发酵液 分离，纯化PRP。然而，有荚膜的b型流感嗜血菌株突变到无荚膜形式的容易性可构成了 PRP 产生的难题，因此，如何筛选出高产Hib疫苗菌株成为本领域研究的重点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的 培养基，该培养基不含有动物血液和动物来源的蛋白成分，避免了潜在的风险，提高了疫苗 的安全性；
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基的制备方 法，该方法具有操作简单、制备方便、成本低的优点；
[0006] 本发明的再一目的在于提供一种利用此培养基筛选高产Hib疫苗菌株的方法，该 方法解决了 Hib疫苗规模化生产的菌种筛选问题，大大提高了 Hib荚膜多糖产量，提高了工 作效率、降低了生产成本。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养 基，所述培养基为固体培养基或液体培养基，其中，固体培养基的配方包括如下组分：相对 于溶剂用量为IOOOml的量，还含有酵母提取物10?20g、磷酸氢二钠3?28. 65g、磷酸二 氢钠0? 94?3. 12g、60%乳酸钠溶液0? 5?I. 5ml、氯化镁0? 2?0? 6g、二水氯化钙0? 01? 0? 04g、硫酸铵0? 5?lg、葡萄糖10?20g、氯化血红素10?20mg、辅酶IlO?20mg、琼脂 10?15g，调pH至6. 5?7. 5,所述溶剂为水；
[0008] 液体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量为IOOOml的量，还含有酵母提 取物10?20g、磷酸氢二钠3?28. 65g、磷酸二氢钠0. 94?3. 12g、60%乳酸钠溶液0. 5? I. 5ml、氯化镁0. 2?0. 6g、二水氯化钙0. 01?0. 04g、硫酸铵0. 5?lg、葡萄糖10?20g、 氯化血红素10?20mg、辅酶IlO?20mg，调pH至6. 5?7. 5,所述溶剂为水。
[0009] -种用于筛选高产Hib疫苗菌株培养基的制备方法，所述培养基为固体培养基， 制备方法包括以下步骤：
[0010] SI.称量：按上述固体培养基配方比例称取各组分原料，备用；
[0011] S2.制备 A 液：
[0012] S21.超滤：将酵母提取物、葡萄糖用蒸馏水稀释，用截留分子量为IOKD的膜包进 行超滤，收集超滤液；
[0013] S22.除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0. 2i!m的膜过滤除菌，除 菌后置于2?8°C的温度下保存；
[0014] S3.制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙、 硫酸铵和琼脂混合均匀后高温高压灭菌；
[0015] S4.混合：待B液冷却至55?60°C时加入A液，制得固体培养基；
[0016] 所述培养基为液体培养基，制备方法包括以下步骤：
[0017] (1)称量：按上述液体培养基配方比例称取各组分原料，备用；
[0018] ⑵制备A液：
[0019] A.超滤：将酵母提取物、葡萄糖用蒸馏水稀释后，用截留分子量为IOKD的膜包进 行超滤，收集超滤液；
[0020] B.除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0. 2i!m的膜过滤除菌，除菌 后置于2?8°C的温度下保存；
[0021] (3)制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙 和硫酸铵混合均匀后高温高压灭菌；
[0022] (4)混合：使用前，将制备的A液、B液混合均匀即可。
[0023] 进一步地，所述酵母提取物稀释液的浓度为90?110g/L，葡萄糖稀释液的浓度为 180 ?220g/L。
[0024] 进一步地，所述高温高压灭菌的灭菌温度为118?125 °C，压强为0.09? 0? 12MPa，灭菌时间为28?35min。
[0025] 利用上述培养基筛选高产Hib疫苗菌株的方法，它包括以下步骤：
[0026] SI.将Hib主种子菌种开启，吸取菌液3ml，接种于液体培养基中，36?37°C、 120?240rpm的条件下培养14?20h ;
[0027] S2.将SI的培养基静置26?35min，吸取上清液至液体培养基中，36?37°C、 120?240rpm的条件下培养8?IOh ;
[0028] S3.将S2的培养基静置26?35min，吸取上清液划线接种于固体培养基上，在浓 度为10%的二氧化碳环境下36?37°C培养14?20h ;
[0029] S4.挑取固体培养基上的单颗菌落，分别接种于液体培养基中，36?37°C、120? 240rpm的条件下培养14?20h ;
[0030] S5.选择S4中固体培养基上的零散菌体，再次接种于固体培养基上，在浓度为 10%的二氧化碳环境下36?37°C培养14?20h ;
[0031] S6.采集经S5培养后的固体培养基上的菌苔，悬浮于20?30 %的甘油生理盐水， 悬浮后分装，置于液氮中保存。
[0032] 本发明具有以下优点：本发明的一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基，该培 养基不含有动物血液和动物来源的蛋白成分，避免了潜在的风险，提高了疫苗的安全性；该 培养基的制备方法具有操作简单、制备方便、成本低的优点；无荚膜的Hib菌株在本发明的 培养基中生长后会发生聚集沉淀，有荚膜的菌株在液体培养基中均匀生长，通过传代达到 筛选具有荚膜的高产菌株，此筛选方法解决了 Hib疫苗规模化生产的菌种筛选问题，大大 提高了 Hib荚膜多糖产量，提高了工作效率、降低了生产成本。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
[0034] 实施例1 :制备培养基
[0035] -种用于筛选高产Hib疫苗菌株的固体培养基，配方包括如下组分：相对于溶剂 用量为IOOOml的量，还含有酵母提取物10g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钠0. 94g、60%乳酸钠 溶液0. 5ml、氯化镁0. 2g、二水氯化I丐0. Olg、硫酸铵0. 5g、葡萄糖10g、氯化血红素10mg、辅 酶IlOmg、琼脂10g，调pH至6. 5,所述溶剂为水；
[0036] 上述固体培养基的制备方法包括以下步骤：
[0037] SI.称量：按上述固体培养基配方比例称取各组分原料，备用；
[0038] S2?制备 A 液：
[0039] S21.超滤：将酵母提取物用蒸馏水稀释至浓度为100g/L，葡萄糖用蒸馏水稀释至 浓度为190g/L，用截留分子量为10KD的膜包进行超滤，收集超滤液；
[0040] S22.除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0. 2i!m的膜过滤除菌，除 菌后置于2°C的温度下保存；
[0041] S3.制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙、 硫酸铵和琼脂混合均匀后高温高压灭菌，所述灭菌的温度为118°C，压强为0. IMPa，灭菌 28min ；
[0042] S4.混合：待B液冷却至55°C时加入A液，制得固体培养基；
[0043] 实施例2 :制备培养基
[0044] 一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的固体培养基，配方包括如下组分：相对于溶剂 用量为1000ml的量，还含有酵母提取物20g、磷酸氢二钠28. 65g、磷酸二氢钠3. 12g、60%乳 酸钠溶液I. 5ml、氯化镁0. 6g、二水氯化興0. 04g、硫酸铵lg、葡萄糖20g、氯化血红素20mg、 辅酶I20mg、琼脂15g，调pH至7. 5,所述溶剂为水；
[0045] 上述固体培养基的制备方法包括以下步骤：
[0046] SI.称量：按上述固体培养基配方比例称取各组分原料，备用；
[0047] S2?制备 A 液：
[0048] S21.超滤：将酵母提取物用蒸馏水稀释至浓度为90g/L，葡萄糖用蒸馏水稀释至 浓度为180g/L，用截留分子量为10KD的膜包进行超滤，收集超滤液；
[0049] S22.除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0. 2pm的膜过滤除菌，除 菌后置于8°C的温度下保存；
[0050] S3.制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙、 硫酸铵和琼脂混合均匀后高温高压灭菌，所述灭菌的温度为125°C，压强为0. 09MPa，灭菌 35min ；
[0051] S4.混合：待B液冷却至60°C时加入A液，制得固体培养基；
[0052] 实施例3 :制备培养基
[0053] -种用于筛选高产Hib疫苗菌株的液体培养基，配方包括如下组分：酵母提取物 14g、磷酸氢二钠10g、磷酸二氢钠I. 83g、60%乳酸钠溶液0. 8ml、氯化镁0. 3g、二水氯化钙 0. 02g、硫酸铵0. 72g、葡萄糖14g、氯化血红素12mg、辅酶I13mg，调pH至7,所述溶剂为水。
[0054] 上述液体培养基的制备方法包括以下步骤：
[0055] (1)称量：按上述液体培养基配方比例称取各组分原料，备用；
[0056] (2)制备 A 液：
[0057] A.超滤：将酵母提取物用蒸馏水稀释至浓度为110g/L，葡萄糖用蒸馏水稀释至浓 度为220g/L，用截留分子量为IOKD的膜包进行超滤，收集超滤液；
[0058] B.除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0. 2pm的膜过滤除菌，除菌 后置于4°C的温度下保存；
[0059] (3)制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化 钙和硫酸铵混合均匀后高温高压灭菌，所述灭菌的温度为121°C，压强为0. 12MPa，灭菌 30min ；
[0060] (4)混合：使用前，将制备的A液、B液混合均匀即可。
[0061] 实施例4:制备培养基
[0062] 一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的液体培养基，配方包括如下组分：酵母提取物 18g、磷酸氢二钠22. 3g、磷酸二氢钠2. 58g、60 %乳酸钠溶液lml、氯化镁0. 4g、二水氯化钙 0. 03g、硫酸铵0. 8g、葡萄糖18g、氯化血红素17mg、辅酶I18mg，调pH至7. 0,所述溶剂为水。
[0063] 上述液体培养基的制备方法包括以下步骤：
[0064] (1)称量：按上述液体培养基配方比例称取各组分原料，备用；
[0065] (2)制备 A 液：
[0066] A.超滤：将酵母提取物用蒸馏水稀释至浓度为105g/L，葡萄糖用蒸馏水稀释至浓 度为200g/L，用截留分子量为IOKD的膜包进行超滤，收集超滤液；
[0067] B.除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0. 2pm的膜过滤除菌，除菌 后置于6°C的温度下保存；
[0068] (3)制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化 钙和硫酸铵混合均匀后高温高压灭菌，所述灭菌的温度为118°C，压强为0. llMPa，灭菌 32min ；
[0069] (4)混合：使用前，将制备的A液、B液混合均匀即可。
[0070] 实施例5 :筛选菌株
[0071] 培养基为实施例1-4制备的固体和液体培养基，筛选方法包括以下步骤：
[0072] SI.将Hib主种子菌种开启，吸取菌液3ml，接种于液体培养基中，36°C、120rpm的 条件下培养14h ;
[0073] S2.将SI的培养基静置26min，吸取上清液至液体培养基中，36°C、120rpm的条件 下培养8h ;
[0074] S3.将S2的培养基静置26min，吸取上清液划线接种于固体培养基上，在浓度为 10%的二氧化碳环境下36°C培养14h ;
[0075] S4.挑取固体培养基上的单颗菌落，分别接种于液体培养基中，36°C、120rpm的条 件下培养14h ;
[0076] S5.选择S4中固体培养基上的零散菌体，再次接种于固体培养基上，在浓度为 10%的二氧化碳环境下36°C培养14h ;
[0077] S6.采集经S5培养后的固体培养基上的菌苔，悬浮于20%的甘油生理盐水，悬浮 后分装，置于液氮中保存。
[0078] 实施例6 :筛选菌株
[0079] 培养基为实施例1-4制备的固体和液体培养基，筛选方法包括以下步骤：
[0080] SI.将Hib主种子菌种开启，吸取菌液3ml，接种于液体培养基中，37°C、240rpm的 条件下培养20h ;
[0081] S2.将SI的培养基静置35min，吸取上清液至液体培养基中，37°C、240rpm的条件 下培养IOh ;
[0082] S3.将S2的培养基静置35min，吸取上清液划线接种于固体培养基上，在浓度为 10%的二氧化碳环境下37°C培养20h ;
[0083] S4.挑取固体培养基上的单颗菌落，分别接种于液体培养基中，37°C、240rpm的条 件下培养20h ;
[0084] S5.选择S4中固体培养基上的零散菌体，再次接种于固体培养基上，在浓度为 10%的二氧化碳环境下37°C培养20h ;
[0085] S6.米集经S5培养后的固体培养基上的菌苔，悬浮于30%的甘油生理盐水，悬浮 后分装，置于液氮中保存。
[0086] 实施例7 :筛选菌株
[0087] 培养基为实施例1-4制备的固体和液体培养基，筛选方法包括以下步骤：
[0088] SI.将Hib主种子菌种开启，吸取菌液3ml，接种于液体培养基中，36. 5°C、200rpm 的条件下培养18h ;
[0089] S2?将SI的培养基静置30min，吸取上清液至液体培养基中，36. 5°C、200rpm的条 件下培养9h ;
[0090] S3.将S2的培养基静置30min，吸取上清液划线接种于固体培养基上，在浓度为 10%的二氧化碳环境下36. 5°C培养16h ;
[0091] S4.挑取固体培养基上的单颗菌落，分别接种于液体培养基中，36. 5°C、200rpm的 条件下培养18h ;
[0092] S5.选择S4中固体培养基上的零散菌体，再次接种于固体培养基上，在浓度为 10%的二氧化碳环境下36. 5°C培养18h ;
[0093] S6.米集经S5培养后的固体培养基上的菌苔，悬浮于26%的甘油生理盐水，悬浮 后分装，置于液氮中保存。
[0094] 以下通过实验说明本发明的有益效果：
[0095] 一、制备Hib荚膜多糖
[0096] 将实施例7中筛选的菌落选取10个，分别标记为D1-D10,将Dl-DlO分别开启于固 体培养基，再传到液体培养基，最后接种30L发酵罐中（发酵量为18L)，36?37°C，180rpm， 通气培养8?10小时。加入甲醛0.5 % (v/v)，缓慢搅拌2小时。离心收集上清液，加入 0. 1 %十六烷基三甲基溴化铵，2?8°C，放置5小时，离心收集沉淀，为复合多糖。采用本行 业熟知的技术，通过酒精沉淀去除核酸，苯酚萃取去除蛋白和细菌内毒素。再超滤去除小分 子物质，在0. 3mol/L的NaCl存在下70%乙醇沉淀，离心收集多糖，用无水乙醇和丙酮洗多 糖各三遍。4°C条件下，干燥，得到精制Hib荚膜多糖，结果如表1所示。
[0097] 表I :D1_D10制备的Hib荚膜多糖的量
[0098]
【权利要求】
1. 一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基，其特征在于，所述培养基为固体培养基 或液体培养基，其中，固体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量为l〇〇〇ml的量，含 有酵母提取物10?20g、磷酸氢二钠3?28. 65g、磷酸二氢钠0. 94?3. 12g、60%乳酸钠溶 液0. 5?1. 5ml、氯化镁0. 2?0. 6g、二水氯化钙0. 01?0. 04g、硫酸铵0. 5?lg、葡萄糖 10?20g、氯化血红素10?20mg、辅酶I 10?20mg、琼脂10?15g，调pH至6. 5?7. 5， 所述溶剂为水； 液体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量为1000ml的量，含有酵母提取物 10?20g、磷酸氢二钠3?28. 65g、磷酸二氢钠0· 94?3. 12g、60%乳酸钠溶液0· 5?1. 5ml、 氯化镁0. 2?0. 6g、二水氯化钙0. 01?0. 04g、硫酸铵0. 5?lg、葡萄糖10?20g、氯化 血红素10?20mg、辅酶I 10?20mg，调pH至6. 5?7. 5,所述溶剂为水。
2. 如权利要求1所述的一种用于筛选高产Hib疫苗菌株培养基的制备方法，其特征在 于，所述培养基为固体培养基，制备方法包括以下步骤：
51. 称量：按上述固体培养基配方比例称取各组分原料，备用；
52. 制备A液：
521. 超滤：将酵母提取物、葡萄糖用蒸馏水稀释，用截留分子量为10KD的膜包进行超 滤，收集超滤液；
522. 除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0. 2μπι的膜过滤除菌，除菌 后置于2?8°C的温度下保存；
53. 制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙、硫酸 铵和琼脂混合均匀后高温高压灭菌；
54. 混合：待B液冷却至55?60°C时加入A液，制得固体培养基； 所述培养基为液体培养基，制备方法包括以下步骤： (1) 称量：按上述液体培养基配方比例称取各组分原料，备用； (2) 制备A液： A. 超滤：将酵母提取物、葡萄糖用蒸馏水稀释后，用截留分子量为10KD的膜包进行超 滤，收集超滤液； B. 除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0. 2μπι的膜过滤除菌，除菌后 置于2?8°C的温度下保存； (3) 制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙和硫酸 铵混合均匀后高温高压灭菌； (4) 混合：使用前，将制备的A液、B液混合均匀即可。
3. 如权利要求2所述的一种用于筛选高产Hib疫苗菌株培养基的制备方法，其特征在 于，所述酵母提取物稀释液的浓度为90?110g/L，葡萄糖稀释液的浓度为180?220g/L。
4. 如权利要求2所述的一种用于筛选高产Hib疫苗菌株培养基的制备方法，其特征 在于，所述高温高压灭菌的灭菌温度为118?125°C，压强为0.09?0. 12MPa，灭菌时间为 28 ?35min。
5. 利用如权利要求1所述的培养基筛选高产Hib疫苗菌株的方法，其特征在于，它包括 以下步骤： S1.将Hib主种子菌种开启，吸取菌液3ml，接种于液体培养基中，36?37°C、120? 240rpm的条件下培养14?20h ;
52. 将S1的培养基静置26?35min，吸取上清液至液体培养基中，36?37°C、120? 240rpm的条件下培养8?10h ;
53. 将S2的培养基静置26?35min，吸取上清液划线接种于固体培养基上，在浓度为 10%的二氧化碳环境下36?37°C培养14?20h ;
54. 挑取固体培养基上的单颗菌落，分别接种于液体培养基中，36?37°C、120? 240rpm的条件下培养14?20h ;
55. 选择S4中固体培养基上的零散菌体，再次接种于固体培养基上，在浓度为10%的 二氧化碳环境下36?37°C培养14?20h ;
56. 米集经S5培养后的固体培养基上的菌苔，悬浮于20?30%的甘油生理盐水，悬浮 后分装，置于液氮中保存。
【文档编号】C12R1/21GK104293704SQ201410488008
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】陈道远, 朱冲, 陈元芬 申请人:成都欧林生物科技股份有限公司