脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法，涉及生物工程【技术领域】。本发明克服了传统发酵技术产酶量少、产酶活性低、酶寿命短等缺点，实现了脂肪酶的高效发酵生产和提取分离，本发明操作简单、成本低廉、易于放大，酶产量高、活性高、纯度高、稳定性好、寿命长。本发明具有重要的应用价值，可以用于油脂奶酪加工、面包烘焙、医药催化合成、饲料加工、合成生物柴油、污水处理、纺织脱脂等领域。
【专利说明】脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】，具体涉及一种脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(EC3.1.1.3，Lipase)，又称甘油酯水解酶，是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统，即只在油水界面上作用，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时，月旨肪酶对底物水解才有显著的催化作用。脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中而微生物脂肪酶种类最多，广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，最易获得和大规模生产，且具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性，因此是工业用脂肪酶的重要来源。
[0003]脂肪酶的生产和使用成本是制约其工业化应用的关键因素之一。由于野生菌产脂肪酶的能力低，酶系复杂，较难分离纯化，一般无法直接用于大规模生产。通过基因工程技术构建合适的表达系统不仅能够提高脂肪酶的表达量，而且可以简化后续蛋白质的分离纯化工艺，从而降低生产成本。另外，制备纯化的立体选择性酶对于立体选择性反应是非常重要的，能够避免其他非立体选择性酶的影响。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。主要优点有:(1)具有强有力的醇氧化酶(Alochol Oxidase,A0X1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；(2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；(3)营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产；(4)可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上；(5)表达量高，许多蛋白可达到g/L以上水平；(6)表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；(7)糖基化程度低，所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。
[0004]长期以来，我国的脂肪酶市场都被国外公司所垄断，且价格昂贵，因此开发我国自主创新的脂肪酶及其制剂对于推动我国科技进步和实现国家繁荣富强具有重要的进步意义。国内关于脂肪酶的微生物发酵和提取技术尚不成熟，脂肪酶制剂在我国现有的酶制剂生产企业中还没有一家成规模的生产企业，其产品还存在着催化活性低、稳定性差、使用寿命短等问题。因此，积极研究开发脂肪酶及其制剂，有利于打破国外技术垄断，实现脂肪酶向产业化转变和带动相关产业的发展，实现我国的繁荣富强。
【发明内容】
[0005]针对我国现有技术的上述不足，本发明提供了一种脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法，本发明的技术方案如下:
一种脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法，其方法如下:
(I)发酵菌种以基因工程菌毕赤酵母GS115 /pPIC9K-proRCL作为发酵生产菌种；
(2)培养液
a、摇瓶培养液
酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L, K2HPO4 3g/L, H2PO4 IL 8g/L，加水 890mL/L，121°C灭菌20 min，然后待温度降至60°C以下在超净台上加入10XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L(4Xl(T4 g/L)，甘油 10mL/L ；
b、发酵培养液
85% H3PO4 26.7mL/L, CaSO4.2H20 0.93g /L, K2S04 18.2g /L, MgSO4.2H20 14.9g/L,KOH 4.13 g/L，甘油40g/L, PTM1 4.0mL/L (其中甘油、PTM1待实消结束后再加入)；
c、PTM1
CuSO4.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L, MnSO4.H2O 3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO30.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L, ZnCl2 20.0g/L, FeSO4.7H20 65.0g/L，生物素 0.2 g/L，浓H2SO4 5 mL/L ；
d、补料培养液
50% 甘油(W/V，含 12mL/L PTM1)补料液；
e、BMMY培养液
酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L,K2HPO4 3g/L,KH2PO4 IL 8g/L，加水 895mL/L，121°C灭菌20 min，然后待温度降至60°C以下在超净台上加入100XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L (4X10-4 g/L)，甲醇 5m/L ；
f、甲醇诱导培养液
100% 甲醇(含 12mL/L PTM1)；
(3)菌种发酵生产
a、挑选一单菌落，置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，于28_30°C/250-300 rpm培养 16-18 h ；
b、配制发酵培养液(甘油、PTM1暂不加入)并加入发酵罐内，标定pH电极与DO电极并插入罐体，密封发酵罐，接通蒸汽，对发酵罐的空气系统及罐体实施灭菌，待罐压升至
0.12MPa，温度121°C时，保压、保温灭菌20min，待实消结束，接通冷冻循环水将温度冷却至28-30 0C ；
C、在接种口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开接种口，将摇瓶培养液按5-10%接种量迅速接种于发酵罐内，并补加已经过滤除菌的甘油AOgA^PTM1 4.0mL/L，设定好温度、搅拌转速、通气量等参数，进行发酵，发酵20 h左右，发酵培养液中的甘油被消耗殆尽，此时DO迅速上升到100%，开始流加补料培养液，补料培养液的流加时间为6-24 h，在发酵过程中，保持罐内温度28-30°C，罐内溶氧D0>20%，罐内pH值5_7，通过调节通气量和搅拌转速来控制溶氧的高低，自动流加质量浓度25%的无菌氨水来控制发酵培养液的pH值大小;
d、待补料培养液流加结束，停止补料，维持细胞饥饿0.5-1 h，然后流加BMMY培养液
0.5-1 h让酵母菌适应甲醇环境，当DO再次上升到100%时开始流加甲醇诱导培养液，控制体系中甲醇的质量浓度在O-1h内为1.0-2.0%,在2-4h内为3.0-5.0%,在4_8h内为
2.0-3.0%，在8h后为0.5-1.0%，在诱导期间，温度控制在20-28°C，pH值控制在5.5-6.5，溶氧 D0>20% ；
e、甲醇诱导培养36-72h后，开始放罐，将发酵液转移至冷冻离心机中于4°C /1500_3000g离心5-10min,收集离心上清液；
(4)脂肪酶提取分离
a、硫酸铵沉淀
将硫酸铵粉末边搅拌边加入到离心上清液中，使硫酸铵终浓度为2%，放于4°C冰箱静置0.5-1 h，然后于4°C /3000-5000g离心5-10min，收集离心上清液，以同样的方式再次将硫酸铵粉末加入到离心上清液中，使硫酸铵终浓度为60%，放于4°C冰箱静置0.5-1 h，然后于4°C /3000-5000g离心5-10min，收集离心沉淀，将离心沉淀用中性磷酸盐缓冲液溶解，得到粗酶液；
b、凝胶过滤层析
用分离分子量在16-200KD范围附近的凝胶颗粒填充层析柱，以中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将得到的粗酶液上样到层析柱上，以中性磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集活性峰所对应的洗脱液，将所得的洗脱液进行超滤浓缩，得到凝胶过滤粗酶液；
C、离子交换层析
用阴离子交换树脂填充离子交换柱，以中性磷酸盐缓冲液平衡离子交换柱，将凝胶过滤粗酶液上样到离子交换柱上，以去离子水冲洗离子交换柱，再以中性磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集活性峰所对应的洗脱液，将所得的洗脱液进行超滤浓缩，得到离子交换粗酶液；
d、亲和层析
用Sephar0Se4B填充亲和层析柱，将脂肪酶抑制剂作为配体通过共价键偶联到Sepharose4B上，以中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将离子交换粗酶液上样到层析柱上，以去离子水冲洗层析柱，再以0.1M PH3-5柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，将所得的洗脱液立即用弱碱性磷酸盐缓冲液中和至中性，进行超滤浓缩并除盐，得到纯酶液；
e、聚乙二醇沉淀
在得到的纯酶液中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀下来，然后于4°C /3000-5000g离心5-10min，收集离心沉淀，将离心沉淀放入冷冻干燥机内干燥，得到脂肪酶冻干粉。
[0006]本发明的有益效果:
1、本发明克服了传统发酵技术产酶量少、产酶活性低、酶寿命短等缺点，实现了脂肪酶的高效发酵生产和提取分离，本发明操作简单、成本低廉、易于放大，酶产量高、活性高、纯度高、稳定性好、寿命长。
[0007]2、本发明具有重要的应用价值，可以用于油脂奶酪加工、面包烘焙、医药催化合成、饲料加工、合成生物柴油、污水处理、纺织脱脂等领域。
【具体实施方式】
[0008]下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，凡是其他在不脱离本发明核心的情况下做出的简单的变形或修改均落入本发明的保护范围。
[0009]实施例:
(O发酵菌种
以基因工程菌毕赤酵母GS115 /pPIC9K-proRCL作为发酵生产菌种； (2)培养液
a、摇瓶培养液
酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L, K2HPO4 3g/L，H2PO4 IL 8g/L，加水 890mL/L，121°C灭菌20 min，然后待温度降至60°C以下在超净台上加入10XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L(4Xl(T4 g/L)，甘油 10mL/L ；
b、发酵培养液
85% H3PO4 26.7mL/L, CaSO4.2H20 0.93g /L, K2S04 18.2g /L, MgSO4.2H20 14.9g/L,KOH 4.13 g/L，甘油40g/L, PTM1 4.0mL/L (其中甘油、PTM1待实消结束后再加入)；
c、PTM1
CuSO4.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L, MnSO4.H2O 3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO30.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L, ZnCl2 20.0g/L, FeSO4.7H20 65.0g/L，生物素 0.2 g/L，浓H2SO4 5 mL/L ；
d、补料培养液
50% 甘油(W/V，含 12mL/L PTM1)补料液；
e、BMMY培养液
酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L,K2HPO4 3g/L,KH2PO4 IL 8g/L，加水 895mL/L，121°C灭菌20 min，然后待温度降至60°C以下在超净台上加入100XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L (4X10-4 g/L)，甲醇 5m/L ；
f、甲醇诱导培养液
100% 甲醇(含 12mL/L PTM1)；
(3)菌种发酵生产
a、挑选一单菌落，置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，于28°C/280rpm培养18
h ；
b、配制发酵培养液(甘油、PTM1暂不加入)并加入发酵罐内，标定pH电极与DO电极并插入罐体，密封发酵罐，接通蒸汽，对发酵罐的空气系统及罐体实施灭菌，待罐压升至
0.12MPa，温度121°C时，保压、保温灭菌20min，待实消结束，接通冷冻循环水将温度冷却至30 0C ；
C、在接种口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开接种口，将摇瓶培养液按10%接种量迅速接种于发酵罐内，并补加已经过滤除菌的甘油AOgA^PTM1 4.0mL/L，设定好温度、搅拌转速、通气量等参数，进行发酵，发酵20 h左右，发酵培养液中的甘油被消耗殆尽，此时DO迅速上升到100%，开始流加补料培养液，补料培养液的流加时间为12 h，在发酵过程中，保持罐内温度28°C，罐内溶氧D0>20%，罐内pH值5，通过调节通气量和搅拌转速来控制溶氧的高低，自动流加质量浓度25%的无菌氨水来控制发酵培养液的pH值大小；
d、待补料培养液流加结束，停止补料，维持细胞饥饿0.5h，然后流加BMMY培养液0.5h让酵母菌适应甲醇环境，当DO再次上升到100%时开始流加甲醇诱导培养液，控制体系中甲醇的质量浓度在O-1h内为1.0%,在2-4h内为4.0%,在4_8h内为2.5%,在8h后为0.6%,在诱导期间，温度控制在25°C，pH值控制在6，溶氧D0>20% ；
e、甲醇诱导培养60h后，开始放罐，将发酵液转移至冷冻离心机中于4°C/3000g离心5min,收集离心上清液； (4)脂肪酶提取分离
a、硫酸铵沉淀
将硫酸铵粉末边搅拌边加入到离心上清液中，使硫酸铵终浓度为2%，放于4°C冰箱静置I h，然后于4°C /5000g离心5min，收集离心上清液，以同样的方式再次将硫酸铵粉末加入到离心上清液中，使硫酸铵终浓度为60%，放于4°C冰箱静置I h，然后于4°C /5000g离心5min,收集离心沉淀，将离心沉淀用中性磷酸盐缓冲液溶解，得到粗酶液；
b、凝胶过滤层析
用分离分子量在16-200KD范围附近的凝胶颗粒填充层析柱，以中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将得到的粗酶液上样到层析柱上，以中性磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集活性峰所对应的洗脱液，将所得的洗脱液进行超滤浓缩，得到凝胶过滤粗酶液；
C、离子交换层析
用阴离子交换树脂填充离子交换柱，以中性磷酸盐缓冲液平衡离子交换柱，将凝胶过滤粗酶液上样到离子交换柱上，以去离子水冲洗离子交换柱，再以中性磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集活性峰所对应的洗脱液，将所得的洗脱液进行超滤浓缩，得到离子交换粗酶液；
d、亲和层析
用Sephar0Se4B填充亲和层析柱，将脂肪酶抑制剂作为配体通过共价键偶联到Sepharose4B上，以中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将离子交换粗酶液上样到层析柱上，以去离子水冲洗层析柱，再以0.1M pH4.5柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，将所得的洗脱液立即用弱碱性磷酸盐缓冲液中和至中性，进行超滤浓缩并除盐，得到纯酶液；
e、聚乙二醇沉淀
在得到的纯酶液中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀下来，然后于4°C/5000g离心5min，收集离心沉淀，将离心沉淀放入冷冻干燥机内干燥，得到脂肪酶冻干粉。
【权利要求】
1.一种脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法，其特征在于，其方法如下: .(O发酵菌种 以基因工程菌毕赤酵母GS115 /pPIC9K-proRCL作为发酵生产菌种； .(2)培养液 a、摇瓶培养液 酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L, K2HPO4 3g/L, H2PO4 IL 8g/L，加水 890mL/L，121°C灭菌20 min，然后待温度降至60°C以下在超净台上加入10XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L(4Xl(T4 g/L)，甘油 10mL/L ； b、发酵培养液85% H3PO4 26.7mL/L, CaSO4.2H20 0.93g /L, K2S04 18.2g /L, MgSO4.2H20 14.9g/L,KOH 4.13 g/L，甘油40g/L, PTM1 4.0mL/L (其中甘油、PTM1待实消结束后再加入)；
c、PTM1
CuSO4.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L, MnSO4.H2O 3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO30.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L, ZnCl2 20.0g/L, FeSO4.7H20 65.0g/L，生物素 0.2 g/L，浓H2SO4 5 mL/L ； d、补料培养液50% 甘油(W/V，含 12mL/L PTM1)补料液； e、BMMY培养液 酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L,K2HPO4 3g/L,KH2PO4 IL 8g/L，加水 895mL/L，121°C灭菌20 min，然后待温度降至60°C以下在超净台上加入100XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L (4X10-4 g/L)，甲醇 5m/L ； f、甲醇诱导培养液100% 甲醇(含 12mL/L PTM1)； .(3)菌种发酵生产 a、挑选一单菌落，置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，于28_30°C/250-300 rpm培养 16-18 h ； b、配制发酵培养液(甘油、PTM1暂不加入)并加入发酵罐内，标定pH电极与DO电极并插入罐体，密封发酵罐，接通蒸汽，对发酵罐的空气系统及罐体实施灭菌，待罐压升至0.12MPa，温度121°C时，保压、保温灭菌20min，待实消结束，接通冷冻循环水将温度冷却至28-30 0C ； C、在接种口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开接种口，将摇瓶培养液按5-10%接种量迅速接种于发酵罐内，并补加已经过滤除菌的甘油AOgA^PTM1 4.0mL/L，设定好温度、搅拌转速、通气量等参数，进行发酵，发酵20 h左右，发酵培养液中的甘油被消耗殆尽，此时DO迅速上升到100%，开始流加补料培养液，补料培养液的流加时间为6-24 h，在发酵过程中，保持罐内温度28-30°C，罐内溶氧D0>20%，罐内pH值5_7，通过调节通气量和搅拌转速来控制溶氧的高低，自动流加质量浓度25%的无菌氨水来控制发酵培养液的pH值大小; d、待补料培养液流加结束，停止补料，维持细胞饥饿0.5-1 h，然后流加BMMY培养液0.5-1 h让酵母菌适应甲醇环境，当DO再次上升到100%时开始流加甲醇诱导培养液，控制体系中甲醇的质量浓度在O-1h内为1.0-2.0%,在2-4h内为3.0-5.0%,在4_8h内为2.0-3.0%，在8h后为0.5-1.0%，在诱导期间，温度控制在20-28°C，pH值控制在5.5-6.5，溶氧 D0>20% ； e、甲醇诱导培养36-72h后，开始放罐，将发酵液转移至冷冻离心机中于4°C /1500-3000g离心5-10min,收集离心上清液； .(4)脂肪酶提取分离 a、硫酸铵沉淀 将硫酸铵粉末边搅拌边加入到离心上清液中，使硫酸铵终浓度为2%，放于4°C冰箱静置0.5-1 h，然后于4°C /3000-5000g离心5-10min，收集离心上清液，以同样的方式再次将硫酸铵粉末加入到离心上清液中，使硫酸铵终浓度为60%，放于4°C冰箱静置0.5-1 h，然后于4°C /3000-5000g离心5-10min，收集离心沉淀，将离心沉淀用中性磷酸盐缓冲液溶解，得到粗酶液； b、凝胶过滤层析 用分离分子量在16-200KD范围附近的凝胶颗粒填充层析柱，以中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将得到的粗酶液上样到层析柱上，以中性磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集活性峰所对应的洗脱液，将所得的洗脱液进行超滤浓缩，得到凝胶过滤粗酶液； C、离子交换层析 用阴离子交换树脂填充离子交换柱，以中性磷酸盐缓冲液平衡离子交换柱，将凝胶过滤粗酶液上样到离子交换柱上，以去离子水冲洗离子交换柱，再以中性磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集活性峰所对应的洗脱液，将所得的洗脱液进行超滤浓缩，得到离子交换粗酶液； d、亲和层析 用Sephar0Se4B填充亲和层析柱，将脂肪酶抑制剂作为配体通过共价键偶联到Sepharose4B上，以中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将离子交换粗酶液上样到层析柱上，以去离子水冲洗层析柱，再以0.1M PH3-5柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，将所得的洗脱液立即用弱碱性磷酸盐缓冲液中和至中性，进行超滤浓缩并除盐，得到纯酶液； e、聚乙二醇沉淀 在得到的纯酶液中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀下来，然后于4°C /3000-5000g离心5-10min，收集离心沉淀，将离心沉淀放入冷冻干燥机内干燥，得到脂肪酶冻干粉。
【文档编号】C12R1/84GK104388404SQ201410644517
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】王幼鹏 申请人:安徽华亿农牧科技发展有限公司