一种高产间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程【技术领域】。本发明所提供的基因工程菌是过表达如SEQ ID NO.1所示的碳存储调节因子基因CsrB，并共表达聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子基因marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase。同时，本发明还提供了高产间苯三酚的基因工程菌的构建和应用方法。本发明所提供的基因工程菌首次实现在转录后水平通过全局性调控碳代谢的方式来提高间苯三酚产量，间苯三酚的产量提高了115.6％，具有较高的工业应用价值。
【专利说明】一种高产间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高产间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 间苯三酚是一种重要的精细化工产品，是合成黄酮、异黄酮类药物的中间体，间苯 三酚本身可作为一种优良的平滑肌解痉药物，广泛应用于临床。间苯三酚还能抑制过氧化 物酶活性，具有抗炎抗氧化作用，它可催化H 2O2分解为分子氧和水，是一种重要的抗氧化 酶。此外，间苯三酚还是一种性能优越的抗养护剂、稳定剂、燃料偶合剂、轮胎增粘剂等，具 有广阔的市场需求。目前，间苯三酚的工业化生产方法主要为化学合成法，包括三硝基甲苯 (TNT)法、异丙基苯法、氯代苯法和苯胺法。化学合成法存在多种弊端，如原料来源困难、副 产物较多、分离提纯困难、环境污染严重等。以微生物发酵生产间苯三酚，可以克服化学法 的多种弊端，并且生物法合成间苯三酚周期短，安全环保。
[0003] 异源表达突光假单胞菌聚酮合成酶基因 phlD可以合成间苯三酚（Jihane Achkar, Mo Xian, Huimin Zhao, J. ff. Frost. Biosynthesis of phloroglucinol[J]. Journal of the American Chemical Society, 2005, 127(15):5332-5333. ；Wenjuan Zha, Sheryl B. Rubin-Pitel, Huimin Zhao. Characterization of the substrate specificity of PhlD, a type III polyketide synthase from Pseudomonas fluorescens[J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281 (42) :32036-32047.)。在此基础上表达多重抗性激 活因子marA，增强大肠杆菌对间苯三酚的耐受性，表达大肠杆菌自身的乙酰CoA羧化酶 基因（ACCase)，细胞内丙二酸单酰CoA的水平为原始菌株的3. 6倍（Yujin Cao, Xinglin Jiang, Rubing Zhang, Mo Xian. Improved phloroglucinol production by metabolically engineered Escherichia coli[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2011，91:1545 - 1552.)〇 然而，间苯三酚目前的产量、产率仍然偏低，难以满足工业生产的需求。需要进一步对工程 菌株进行基因改造，以期提高间苯三酚的合成能力。
[0004] 大肠杆菌的代谢网络包含数百种代谢物，这些代谢物通过大量的生化和调节反 应相互关联。代谢流的调控可在基因表达水平，转录后水平，酶活动力学等不同水平通过 多种复杂机制实现。转录后水平的调控是大肠杆菌的一种重要的调节模式。全局调控因 子本身包含复杂的代谢网络，发挥作用时呈现多效性，能够同时调节多种功能不同的操 纵子，因此，全局调控因子对于某些特定代谢物的影响较为复杂。Csr是一种碳存储调节 因子（carbon storage regulator),在转录后水平全局性调控多个操纵子表达。Csr系 统含有多种组分，CsrA作为转录后调节子能够与靶标mRNA结合，抑制翻译的正常进行， CsrB是一种非编码RNA分子，含有CsrA的多个结合位点，拮抗CsrA的作用（M Y Liu，T Romeo. The global regulator CsrA of Escherichia coli is a specific mRNA-binding protein [J] · J. Bacteriol, 1997, 179(14) :4639-4642.)。外源导入重组质粒诱导 CsrB 过 表达，可以提高碳源利用率，乙酸产量从5g/L降低至2g/L(Adrienne E McKeel, Becky J Rutherford, et. ac. Manipulation of the carbon storage regulator system for metabolite remodeling and biofuel production in Escherichia coli[J]. Microbial Cell Factories 2012,11:79)。
[0005] 过表达phlD、ACCase等基因可提高间苯三酚产量，但目前间苯三酚的产量和产率 仍无法满足工业生产的需求。CsrB是大肠杆菌内重要的全局性调控因子，该调节因子对间 苯三酚发酵生产的影响暂无报道，通过全局性调控碳代谢提高间苯三酚合成能力的基因改 造方法也无报道。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种高产间苯三酚的基因工程菌及其构建方法和 应用方法，所采取的技术方案如下：
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种高产间苯三酚的基因工程菌，该基因工程菌是过 表达如SEQ ID NO. 1所示的碳存储调节因子基因 CsrB，并共表达聚酮合成酶基因 phlD、多 重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因 ACCase。
[0008] 所述聚酮合成酶基因 phlD，来源于荧光假单胞菌，Genebank ID :11830552 ;所述 多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌，Genebank ID :6060688 ;所述乙酰CoA羧化酶基 因 ACCase，来源于大肠杆菌，亚基 accA 的 Genebank ID :6062185,亚基 accB 的 Genebank ID :6058890,亚基 accC 的 Genebank ID :6058863,亚基 accD 的 Genebank ID :6059083。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法，该方法的步骤如下： [0010] 1)将T7启动子的序列插入到出发菌株的碳存储调节因子CsrB基因序列前，获得 突变菌株；
[0011] 所述碳存储调节因子CsrB基因序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0012] 2)制备步骤1)所得突变菌株的感受态细胞；
[0013] 3)构建含有聚酮合成酶基因 phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因 ACCase的重组质粒；
[0014] 4)将步骤3)所得的重组质粒导入到步骤2)所得的感受态细胞中，获得重组细胞。
[0015] 步骤1)所述T7启动子来自于表达载体pETDuel，序列如SEQ ID NO. 2所示；所述 出发菌株，是大肠杆菌，优选大肠杆菌E. coliBL21 (DE3)。
[0016] 步骤3)所述聚酮合成酶基因 phlD，来源于突光假单胞菌，Genebank ID : 11830552 ;所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌，Genebank ID :6060688 ;所述乙 醜CoA羧化酶基因 ACCase，来源于大肠杆菌，亚基accA的Genebank ID :6062185,亚基accB 的 Genebank ID :6058890,亚基 accC 的 Genebank ID :6058863,亚基 accD 的 Genebank ID: 6059083。
[0017] 所述方法的具体步骤如下：
[0018] 1)以大肠杆菌E. coliBL21(DE3)作为出发菌株，将T7启动子序列插入到出发菌株 的碳存储调节因子CsrB基因序列前，获得突变菌株E. coliBL21 (DE3) T7-CsrB ;
[0019] 所述碳存储调节因子CsrB基因序列如SEQ ID NO. 1所示，所述T7启动子序列如 SEQ ID NO. 2 所示；
[0020] 2)制备步骤1)所得突变菌株E. coliBL21 (DE3)T7-CsrB的感受态细胞；
[0021] 3)将聚酮合成酶基因 PhlD和多重抗性激活因子marA连接到载体pET30a上，获得 重组质粒pET-phlD-marA ;乙酰CoA羧化酶基因 ACCase连接到载体pACYC上，获得重组质 粒 pACYC-accADBC ;
[0022] 所述聚酮合成酶基因 phlD，来源于荧光假单胞菌，Genebank ID :11830552 ;所述 多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌，Genebank ID :6060688 ;所述乙酰CoA羧化酶基 因 ACCase，来源于大肠杆菌，亚基 accA 的 Genebank ID :6062185,亚基 accB 的 Genebank ID :6058890,亚基 accC 的 Genebank ID :6058863,亚基 accD 的 Genebank ID :6059083 ;
[0023] 4)在将步骤3)所得的重组质粒pET-phlD-marA和pACYC-accADBC导入到步骤2) 所得的感受态细胞中获得重组细胞。
[0024] 所述基因工程菌用于发酵生产间苯三酚。
[0025] 所述应用的步骤如下：
[0026] 1)以大肠杆菌E. coliBL21(DE3)作为出发菌株，将T7启动子序列插入到出发菌株 的碳存储调节因子CsrB基因序列前，获得突变菌株E. coliBL21 (DE3) T7-CsrB ;
[0027] 所述碳存储调节因子CsrB基因序列如SEQ ID NO. 1所示，所述T7启动子序列如 SEQ ID NO. 2 所示；
[0028] 2)制备步骤1)所得突变菌株E. coliBL21 (DE3)T7-CsrB的感受态细胞；
[0029] 3)将聚酮合成酶基因 phlD和多重抗性激活因子marA连接到载体pET30a上，获得 重组质粒pET-phlD-marA ;乙酰CoA羧化酶基因 ACCase连接到载体pACYC上，获得重组质 粒 pACYC-accADBC ;
[0030] 所述聚酮合成酶基因 phlD，来源于荧光假单胞菌，Genebank ID :11830552 ;所述 多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌，Genebank ID :6060688 ;所述乙酰CoA羧化酶基 因 ACCase，来源于大肠杆菌，亚基 accA 的 Genebank ID :6062185,亚基 accB 的 Genebank ID :6058890,亚基 accC 的 Genebank ID :6058863,亚基 accD 的 Genebank ID :6059083 ;
[0031] 4)在将步骤3)所得的重组质粒pET-phlD-marA和pACYC-accADBC导入到步骤2) 所得的感受态细胞中获得重组细胞；
[0032] 5)通过摇瓶培养或发酵罐培养步骤4)所得重组细胞生产间苯三酚。
[0033] 步骤5)所述培养，重组细胞种子液的接种量为培养基体积的1% -5%，培养温度 为371：，搅拌速度为400-800印111，？册.0-8.0，溶氧18%以上的条件下培养至006(|(|为8-12， 然后加入诱导剂IPTG至终浓度100 μ M，利用质量分数50-80 %的葡萄糖储液继续补料发酵 12-24h后结束。
[0034] 本发明取得的有益效果如下：
[0035] 1.本发明提供一种高产间苯三酚的基因工程菌株的构建方法，该构建方法首次实 现在转录后水平通过全局性调控碳代谢的方式，提高间苯三酚产量。
[0036] 2.本发明提供一种提高间苯三酚合成能力的工程菌株，是以大肠埃希氏杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株，以自杀质粒pRE112为媒介，通过同源重组技术 在CsrB前插入T7启动子序列，得到工程菌株E. coliBL21 (DE3)T7-CsrB，通过IPTG诱导 CsrB过量表达，能够提高间苯三酚的合成能力。
[0037] 3.本发明提供的基因改造方法，在摇瓶及发酵罐水平，在含有两种重组质粒 pET-phlD-marA和pACYC-accADBC的基础上，过表达CsrB基因，间苯三酚的产量比对照菌株 提闻了 115. 6%。
[0038] 定义和缩写
[0039] 在本文中使用下列的缩写或简称：
[0040] 间苯三酚（Phloroglucinol) :PG
[0041] 异丙基硫代半乳糖苷：IPTG
[0042] 聚酮合成酶基因：phlD
[0043] 多重抗性激活因子：marA
[0044] 乙酰CoA羧化酶基因 ：ACCase
[0045] 大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli) :E. coli
[0046] "基因敲除"指通过一定途径，将特定基因从基因组中全部或部分删除，从而使特 定基因功能丧失。
[0047] "基因型"指某一生物个体全部基因组合的总称，是该生物的细胞内所包含的、特 有的那组基因。
[0048] "过量表达"或"过表达"指细胞内特定基因受到各种信号调控后，在生物体中超过 原有水平表达，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
[0049] "搭桥PCR"又叫重叠 PCR，指采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从 而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。
【专利附图】
【附图说明】
[0050] 图1为突变菌株ZG-1563构建示意图。
【具体实施方式】
[0051] 下面通过实例来详细阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
[0052] 下述实施例中所涉及的实验方法若无特殊说明，均为常规技术。
[0053] 下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0054] 所用限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自MBI Fermentas公司，质粒提取及胶回 收所用试剂盒购自美国OMEGA公司，操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别 说明均用去离子水配制。
[0055] 培养基配方：
[0056] 1)种子液培养基
[0057] LB培养基：酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，接种时补加卡那霉素50 μ g/ mL，氯霉素 50 μ g/mL。
[0058] M9 培养基：NH4C1 I. Og/L，Na2HPO4 · 12H20 15. 2g/L，ΚΗ2Ρ043· Og/L，NaCl 0· 5g/L，葡 萄糖 20g/L，MgSO4 ·7Η20 0· 4g/L，1000 X 微量元素（(NH4)6Mo7O24 ·4Η20 3. 7g/L ;ZnS04 ·7Η20 2. 9g/L ;Η3Β0324· 7g/L ;CuS04 · 5H20 2. 5g/L ;MnCl2 · 4H20 15. 8g/L)，接种时补加卡那霉素 50 μ g/mL，氯霉素 50 μ g/mL〇
[0059] 2)发酵培养基
[0060] K2HPO4 · 3H20 9. 8g/L，Citric acid · H2O 2. lg/L，柠檬酸铁铵 0· 3g/L， (NH4) 2S043. 0g/L，葡萄糖 20g/L，MgSO4 · 7H20 0· 4g/L，1000 X 微量元素（(NH4)6Mo7O24 · 4H20 3. 7g/L ;ZnS04 · 7H20 2. 9g/L ;Η3Β0324· 7g/L ;CuS04 · 5H20 2. 5g/L ;MnCl2 · 4H20 15. 8g/L)， 卡那霉素50 μ g/mL，氯霉素50 μ g/mL。
[0061] (注=K2HPO4 · 3Η20 9· 8g/L，Citric acid · H2O 2· lg/L，柠檬酸铁铵 0· 3g/L， (NH4)2S043.0g/L混合后调至pH 7.0，121°C，20min高压蒸气灭菌。葡萄糖储液为500g/ 1^，1151：，20111丨11单独灭菌，]\%50 4.7!120储液为20(^/1，1211：，201^11单独灭菌，1000\微 量元素采用0. 22 μ m滤菌膜过滤除菌，转接种子液时分别补加上述单独除菌的葡萄糖、 MgSO4 · 7H20、1000 X微量元素储液及抗生素。
[0062] 实施例1:基因工程菌的构建
[0063] 以大肠埃希氏杆菌E. coliBL21(DE3)为出发菌株，在CsrB前插入T7启动子序列， 通过IPTG诱导CsrB基因过表达，构建工程菌株ZG1563 (图1)，将生产间苯三酚的相关质粒 pET-phlD-mar 和 pACYC-accADBC 导入 ZG1563 和对照菌株 E. coliBL21 (DE3)中进行摇瓶及 发酵罐水平的间苯三酚发酵检测。
[0064] 本领域技术人员应该理解，上述大肠埃希氏杆菌E. coliBL21(DE3)的基因敲除实 验，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。
[0065] I. 1同源臂的构建
[0066] 以大肠埃希氏杆菌E. coliBL21(DE3)野生菌株CsrB基因作为下游同源臂一部分， CsrB上游序列约700bp作为上游同源臂，以此为模板设计引物，并将权利要求1所述T7启 动子序列作为上游和下游同源臂的搭桥序列。PCR扩增CsrB基因的上下游同源臂片段，利 用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
[0067] 扩增引物序列为：
[0068] CsrB-Up-5' ：
[0069] 5,-CAGAGCTCCAGCTCAGCCAGAATAAGCGCG-3，
[0070] CsrB-Up-3'：
[0071] 5'-CTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCGTCGACAGGGAGTCAGACAAC-3'
[0072] CsrB-Down-5'：
[0073] 5'-CGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAAGATAGAATCGTCTTTTTC-3'
[0074] CsrB-Down-3'：
[0075] 5'-ATCTGCGGTACCGTGGCATGAAGAGCATAAAA-3'
[0076] 以回收后的上下游同源臂片段为模板进行搭桥PCR，利用胶回收试剂盒回收同 源臂片段T7-CsrB，限制性内切酶Kpnl、SacI分别双酶切同源臂片段及自杀质粒pRE112， 片段与载体按摩尔比2:1在连接酶的作用下16 °C过夜酶连，酶连产物42 °C热激转化 E. coliCC118感受态，PCR筛选获得阳性克隆，得到重组质粒pRE112-T7-CsrB。
[0077] 1. 2同源重组
[0078] 将重组质粒pRE112-T7-CsrB转化至E. coli X 7213,并作为供体菌与Escherichia coli野生菌株进行两次同源重组，通过PCR验证T7启动子序列插入成功的工程菌株，即 E.coliBL21(DE3)T7-CsrB〇
[0079] 验证引物序列：
[0080] ID-CsrB-5'：
[0081] 5'-TTCCAGCATTAGCTCGCATC-3'
[0082] T7-3'
[0083] 5'-TTGTTATCCGCTCACAATTC-3'
[0084] I. 3表达载体转化宿主细胞
[0085] 按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备野生型对照菌株 E. coliBL21(DE3)及本发明提供的工程菌株ZG1563感受态，将两种重组质粒pET-phlD-mar 和pACYC-accADBC通过热激法转化至感受态细胞。
[0086] 实施例2.工程菌株的发酵实验
[0087] 2. 1摇瓶发酵实验
[0088] 1) 一级种子液的培养，将含有pET-phlD-mar和pACYC-accADBC重组质粒的野生 对照菌株E. coliBL21 (DE3)及工程菌株ZG1563分别接种至3mL LB液体培养基中，并加入 50μ g/mL卡那霉素和50μ g/mL氯霉素，37°C生长8-12h。
[0089] 2)将一级种子液按1%接种量转接至250mL发酵摇瓶中，含50mL发酵培养基，转 接种子液时补加200g/L MgSO4. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量元素50 μ L， 50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素双抗性，每种菌株设定3个平行对照，37°C、180rpm培 养。
[0090] 3)细胞0D_达到0· 6-1. 0间即可加入100 μ M/L IPTG诱导。
[0091] 4) IPTG诱导后，37°C、180rpm继续培养24h后收集菌液，离心取上清，测定间苯三 酚含量。
[0092] 2. 2间苯三酚的分批补料发酵生产
[0093] 1) -级种子液的培养，依据上述2. 1接种方法
[0094] 2)二级种子液的培养，将一级种子液按1%接种量转接至250mL三角瓶中，含50mL M9培养基，转接种子液时补加200g/L MgSO4. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量 元素50 μ L，50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素双抗性，37°C、180rpm培养8-12h。
[0095] 3)将二级种子液按1%接种量转接至5L发酵罐中，含2-3L发酵培养基中进行发 酵，培养温度37°C、搅拌速度400-800rpm、pH 6. 0-8. 0和溶氧18%以上的条件下培养至 〇D_约为8,加入诱导剂IPTG至终浓度lOOuM/L，50 % -80 %葡萄糖储液继续补料发酵24小 时，离心取上清，测定间苯三酚含量。
[0096] 2. 3间苯三酚的含量检测
[0097] 间苯三酚（PG)浓度测定：肉桂醛显色法
[0098] 具体步骤如下：
[0099] 1)配制10mg/L的肉桂醛显色液（肉桂醛直接溶解于体积比1:3的浓盐酸/乙醇 溶液中）。
[0100] 2)向I. 5mL离心管中加入ImL肉桂醛显色液，再加入5μ L发酵液上清，颠倒混匀， 室温放置15min。
[0101] 3)用IOmm光径比色杯读取OD446值，OD446值在2h内稳定；
[0102] 4)绘制间苯三酚标准曲线，根据标准曲线计算间苯三酚含量。
[0103] 根据本实施例操作步骤，在含有两种重组质粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC 的基础上，摇瓶水平，野生对照菌株的PG产量为0. 30g/L，突变菌株ZG1563的PG产量为 0. 61g/L ;在分批补料发酵罐水平，野生对照菌株的PG产量为3. 8g/L，突变菌株ZG1563的 PG产量为7. 9g/L。相同发酵条件下，在含有两种重组质粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC 的基础上，摇瓶及发酵罐水平，本发明提供的工程菌株ZG1563,间苯三酚的产量比对照菌株 Escherichiacoli BL21(DE3)提高了 L 08 倍。
[0104] 实施例3.工程菌株的发酵实验
[0105] 3.1摇瓶发酵实验
[0106] 1) 一级种子液的培养，依据实施例2. 1接种方法。
[0107] 2)将一级种子液按3%接种量转接至250mL发酵摇瓶中，含50mL发酵培养基，转 接种子液时补加200g/L MgSO4. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量元素50 μ L， 50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素双抗性，每种菌株设定3个平行对照，37°C、180rpm培 养。
[0108] 3)细胞0D_达到0. 6-1. 0间即可加入100 μ M/L IPTG诱导。
[0109] 4) IPTG诱导后，37°C、180rpm继续培养24h后收集菌液，离心取上清，测定间苯三 酚含量。
[0110] 3. 2间苯三酚的分批补料发酵生产
[0111] 1) 一级种子液的培养，依据实施例2. 1接种方法
[0112] 2)二级种子液的培养，将一级种子液按3 %接种量转接至250mL三角瓶中，含50mL M9培养基，转接种子液时补加200g/L MgSO4. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量 元素50 μ L，50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素双抗性，37°C、180rpm培养8-12h。
[0113] 3)将二级种子液按3%接种量转接至5L发酵罐中，含2-3L发酵培养基中进行发 酵，培养温度37°C、搅拌速度400-800rpm、pH 6. 0-8. 0和溶氧18%以上的条件下培养至 00600约为10，加入诱导剂1?了6至终浓度1001^/1，50%-80%葡萄糖储液继续补料发酵16 小时，离心取上清，测定间苯三酚含量。
[0114] 3. 3间苯三酚的含量检测
[0115] 间苯三酚的含量测定同实施例2. 3
[0116] 根据本实施例操作步骤，在含有两种重组质粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC 的基础上，摇瓶水平，野生对照菌株的PG产量为0. 33g/L，突变菌株ZG1563的PG产量为 0. 65g/L ;在分批补料发酵罐水平，野生对照菌株的PG产量为3. 5g/L，突变菌株ZG1563的 PG产量为7. 4g/L。相同发酵条件下，在含有两种重组质粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC 的基础上，摇瓶及发酵罐水平，本发明提供的工程菌株ZG1563,间苯三酚的产量比对照菌株 Escherichia coli BL21(DE3)提高了 I. 11 倍。
[0117] 实施例4.工程菌株的发酵实验
[0118] 4.1摇瓶发酵实验
[0119] 1) 一级种子液的培养，依据上述实施例2. 1接种方法。
[0120] 2)将一级种子液按5%接种量转接至250mL发酵摇瓶中，含50mL发酵培养基，转 接种子液时补加200g/L MgSO4. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量元素50 μ L， 50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素双抗性，每种菌株设定3个平行对照，37°C、180rpm培 养。
[0121] 3)细胞00600达到0.6-1.0间即可加入10(^]?/11?丁6诱导。
[0122] 4) IPTG诱导后，37°C、180rpm继续培养24h后收集菌液，离心取上清，测定间苯三 酚含量。
[0123] 4. 2间苯三酚的分批补料发酵生产
[0124] 1) -级种子液的培养，依据上述实施例2. 1接种方法。
[0125] 2)二级种子液的培养，将一级种子液按5 %接种量转接至250mL三角瓶中，含50mL M9培养基，转接种子液时补加200g/L MgSO4. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量 元素50 μ L，50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素双抗性，37°C、180rpm培养8-12h。
[0126] 3)将二级种子液按5%接种量转接至5L发酵罐中，含2-3L发酵培养基中进行发 酵，培养温度37°C、搅拌速度400-800rpm、pH 6. 0-8. 0和溶氧18%以上的条件下培养至 0D600约为12,加入诱导剂IPTG至终浓度100uM/L，50% -80%葡萄糖储液继续补料发酵12 小时，离心取上清，测定间苯三酚含量。
[0127] 4. 3间苯三酚的含量检测
[0128] 间苯三酚的含量测定依据实施例2. 3
[0129] 根据本实施例操作步骤，在含有两种重组质粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC 的基础上，摇瓶水平，野生对照菌株的PG产量为0. 36g/L，突变菌株ZG1563的PG产量为 0. 67g/L ;在分批补料发酵罐水平，野生对照菌株的PG产量为3. 2g/L，突变菌株ZG1563的 PG产量为6. 9g/L。相同发酵条件下，在含有两种重组质粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC 的基础上，摇瓶及发酵罐水平，本发明提供的工程菌株ZG1563,间苯三酚的产量比对照菌株 Escherichia coli BL21(DE3)提高了 L 16 倍。
[0130] 本实施例所列数据为多次重复试验的平均数值。
[0131] 虽然本发明已经公开了示例性示范方案，但是本领域人员应该理解，在不背离由 后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以进行各种形式和细节的变 化，可以进行各种实施方案的任意组合。
【权利要求】
1. 一种高产间苯三酚的基因工程菌，其特征在于，是过表达如SEQ ID NO. 1所示的碳存 储调节因子基因CsrB，并共表达聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子基因marA、乙酰 CoA羧化酶基因ACCase。
2. 权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧 光假单胞菌，Genebank ID :11830552 ;所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌， Genebank ID :6060688 ;所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase，来源于大肠杆菌，其中，亚基accA 的 Genebank ID :6062185,亚基 accB 的 Genebank ID :6058890,亚基 accC 的 Genebank ID : 6058863,亚基 accD 的 Genebank ID :6059083。
3. -种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下： 1) 将17启动子的序列插入到出发菌株的碳存储调节因子CsrB基因序列前，获得突变 菌株； 所述碳存储调节因子CsrB基因序列如SEQ ID NO. 1所示； 2) 制备步骤1)所得突变菌株的感受态细胞； 3) 构建含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因 ACCase的重组质粒； 4) 将步骤3)所得的重组质粒导入到步骤2)所得的感受态细胞中，获得重组细胞。
4. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤1)所述17启动子来自于表达载体pETDuel， 序列如SEQ ID NO. 2所示；所述出发菌株，是大肠杆菌。
5. 权利要求4所述方法，其特征在于，所述大肠杆菌，是大肠杆菌E. coliBL21 (DE3)。
6. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3)所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧 光假单胞菌，Genebank ID :11830552 ;所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌， Genebank ID :6060688 ;所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase,来源于大肠杆菌，其中，亚基accA 的 Genebank ID :6062185,亚基 accB 的 Genebank ID :6058890,亚基 accC 的 Genebank ID: 6058863,亚基 accD 的 Genebank ID :6059083。
7. 权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 以大肠杆菌E. coliBL21(DE3)作为出发菌株，将17启动子序列插入到出发菌株的碳 存储调节因子CsrB基因序列前，获得突变菌株E. coliBL21 (DE3) T7-CsrB ; 所述碳存储调节因子CsrB基因序列如SEQ ID NO. 1所示，所述17启动子序列如SEQ ID NO. 2 所示； 2) 制备步骤1)所得突变菌株E. coliBL21(DE3)T7-CsrB的感受态细胞； 3) 将聚酮合成酶基因phlD和多重抗性激活因子marA连接到载体pET30a上，获得重 组质粒pET-phlD-marA ;乙酰CoA羧化酶基因ACCase连接到载体pACYC上，获得重组质粒 pACYC-accADBC ； 所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧光假单胞菌，Genebank ID :11830552 ;所述多重 抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌，Genebank ID :6060688 ;所述乙酰CoA羧化酶基因 ACCase，来源于大肠杆菌，亚基 accA 的 Genebank ID :6062185,亚基 accB 的 Genebank ID : 6058890,亚基 accC 的 Genebank ID :6058863,亚基 accD 的 Genebank ID :6059083 ; 4) 在将步骤3)所得的重组质粒pET-phlD-marA和pACYC-accADBC导入到步骤2)所得 的感受态细胞中获得重组细胞。
8. 权利要求1所述基因工程菌用于发酵生产间苯三酚。
9. 权利要求8所述应用，其特征在于，步骤如下： 1) 以大肠杆菌E. coliBL21(DE3)作为出发菌株，将17启动子序列插入到出发菌株的碳 存储调节因子CsrB基因序列前，获得突变菌株E. coliBL21 (DE3) T7-CsrB ; 所述碳存储调节因子CsrB基因序列如SEQ ID NO. 1所示，所述17启动子序列如SEQ ID NO. 2 所示； 2) 制备步骤1)所得突变菌株E. coliBL21(DE3)T7-CsrB的感受态细胞； 3) 将聚酮合成酶基因phlD和多重抗性激活因子marA连接到载体pET30a上，获得重 组质粒pET-phlD-marA ;乙酰CoA羧化酶基因ACCase连接到载体pACYC上，获得重组质粒 pACYC-accADBC ； 所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧光假单胞菌，Genebank ID :11830552 ;所述多重 抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌，Genebank ID :6060688 ;所述乙酰CoA羧化酶基因 ACCase，来源于大肠杆菌，accA 的 Genebank ID :6062185, accB 的 Genebank ID :6058890, accC 的 Genebank ID :6058863, accD 的 Genebank ID :6059083 ; 4) 在将步骤3)所得的重组质粒pET-phlD-marA和pACYC-accADBC导入到步骤2)所得 的感受态细胞中获得重组细胞； 5) 通过摇瓶培养或发酵罐培养步骤4)所得重组细胞生产间苯三酚。
10. 权利要求9所述方法，其特征在于，步骤5)所述培养，重组细胞种子液的接种量为 培养基体积的1% -5%，培养温度为37°C，搅拌速度为400-800rpm，pH6. 0-8. 0,溶氧18% 以上的条件下培养至〇D_为8-12,然后加入诱导剂IPTG至终浓度100 y M，利用质量分数 50-80%的葡萄糖储液继续补料发酵12-24h后结束。
【文档编号】C12N1/21GK104388371SQ201410722836
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月2日 优先权日:2014年12月2日
【发明者】咸漠, 赵广, 刘敏, 曹玉锦, 刘长水 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所