一种以玉米浆为唯一氮源高产l-乳酸的枯草芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明为一种以玉米浆为唯一氮源高产L-乳酸的枯草芽孢杆菌，解决采用发酵法生产L-乳酸生产成本较高的问题。可利用作为碳源的葡萄糖或乳糖或蔗糖和作为唯一氮源的玉米深加工工业中废弃物玉米浆，发酵生产L-乳酸。属于枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ），菌株保藏号：CGMCC No.10040。经42小时发酵实验，最高产L-乳酸量可达66g/L。
CGMCCNo.10040
20141121
【专利说明】一种以玉米浆为唯一氮源高产L-乳酸的枯草芽孢杆菌
[0001]
【技术领域】： 本发明属于生物【技术领域】，涉及泡菜中一种以玉米浆为唯一氮源高产L-乳酸的枯草 芽孢杆菌。
[0002]
【背景技术】： 乳酸是一种常见的结构简单的羟基羧酸，广泛存在于人体、动物体、植物和微生物中。 乳酸按其旋光性可分为D(-)乳酸，L(+)乳酸和DL-乳酸三种，人体只能代谢利用其中的 L-乳酸。因此，世界卫生组织提倡使用L-乳酸作为食品添加剂和内服药，取代目前普遍使 用的DL-乳酸。此外，L-乳酸、L-乳酸盐及其聚合物还广泛应用于医药、农业和化学工业。 尤其近几年，人们利用L-乳酸聚合生成的聚L-乳酸制造生物降解塑料，绿色包装材料及 家用薄膜，用以解决日益严重的环境污染问题，引起了世界的广泛关注，应用前景非常广 阔。
[0003] 当前，全世界L 一乳酸市场处于供不应求状态，世界市场总需求量约70万吨，且每 年以10%的速度递增，而生产量只有30万吨，缺口很大，是迅速发展L 一乳酸生产的最佳时 期。各国纷纷规划扩大L一乳酸生产能力。
[0004] 国内目前主要采用发酵法和合成法生产乳酸，其中使用发酵法生产的乳酸占80% 以上。工业化发酵主要采用玉米和木薯淀粉为原料，生产成本较高。另一方面作为玉米加 工废弃物的玉米浆，产量大而价格低，且富含多种氨基酸、生物素、维生素类、微量元素等， 还含有磷酸盐类，因此是理想的低成本发酵材料。
[0005]
【发明内容】
： 本发明的目的是提供一种可以利用价格低廉的玉米浆为唯一氮源发酵生产高浓度 L-乳酸的枯草芽孢杆菌。
[0006] 一种以玉米浆为唯一氮源高产L-乳酸的枯草芽孢杆菌，该菌株分离于四川家制 泡菜中，可利用作为碳源的葡萄糖或乳糖或蔗糖和作为唯一氮源的玉米深加工工业中废弃 物玉米衆，发酵生产L-乳酸，属于枯草芽孢杆菌（ifeciBys syki/is)，菌株保藏号：CGMCC No.10040。
[0007] 枯草芽孢杆菌发酵生产乳酸的方法，将枯草芽孢杆菌（CGMCC No. 10040)先接种至 LB培养基35°C培养18小时后，再接种至液体发酵培养基中，接种量按体积百分比为10%(V/ V)，液体发酵培养基其碳源成分选择葡萄糖或蔗糖或乳糖，加入量为15% (W/V)，采用玉米 深加工工业中废弃物玉米浆为唯一氮源，其用量为3-10% (W/V)，其他成分为水，pH调节至 6. 5,发酵时间42小时。
[0008] 本发明枯草芽孢杆菌的获得：取回实验室的四川家制自然发酵泡菜水用无菌生理 盐水稀释到合适梯度，取lmL稀释液于无菌培养皿中，倾倒至LB固体培养基混匀，培养至出 现大量单菌落，挑取菌落，反复划线培养，进行纯化。
[0009] 本发明提供的枯草芽孢杆菌自编号：RS-1，保藏编号为CGMCC No. 10040, 2014年 11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所。
[0010] 本发明枯草芽孢杆菌具有产L 一乳酸的能力：可利用作为碳源的葡萄糖或乳糖或 蔗糖和作为唯一氮源的玉米深加工工业中废弃物玉米浆，发酵生产L-乳酸。经42小时发 酵，最高产酸量可达66g/L。
[0011] 本发明生产L-乳酸的枯草芽孢杆菌具有良好稳定性，连续15次培养，性状稳定， 仍具有高产L-乳酸能力。
[0012] 本发明的枯草芽孢杆菌RS-1分离自四川家制自然发酵泡菜水，未经过人工诱变 处理，属于公认安全（Generally Recognized As Safe，GRAS)菌种，可用于食品及化工原料 加工。
[0013]
【具体实施方式】： 实施例1 : 本发明一种可以利用价格低廉的氮源材料玉米浆为唯一氮源发酵生产高浓度L-乳酸 的枯草芽孢杆菌。
[0014] 本发明枯草芽孢杆菌（CGMCC No. 10040)的分离方法，采用梯度稀释混菌法从四川 家制自然发酵泡菜水中分离。包括以下步骤：将lmL泡菜水用9mL无菌生理盐水进行梯度 稀释，稀释到泡菜水浓度为l(T 6-l(T8mL/mL，取lmL稀释液于无菌培养皿中，倾倒至LB固体 培养基并混匀，待培养基凝固后，置于35°C培养箱培养24-48小时，出现大量细菌菌落，挑 取具有不同特征的单菌落，在LB固体培养基上划线纯化，并进一步培养，得到纯菌株。纯化 后的菌株先接种至LB培养基35 °C培养18小时后，再接种至液体发酵培养基中，接种量按体 积百分比为10%，35°C发酵培养42小时后，用L 一乳酸测定试剂盒测试。选取产酸量大于 20g/L的菌种进行保存。纯化的菌株采用如下方式保藏，用LB培养基在35°C培养24小时 后，在培养好的LB培养基中添加甘油，使甘油终浓度为20% (w/v)，-20°C冻存，每隔1年转 接一次。
[0015] 本发明枯草芽孢杆菌（CGMCC No. 10040)的形态学特征如下： 本发明的枯草芽孢杆菌菌株接种在LB固体培养基上，35°C培养24小时，观察菌落特 征，菌落呈乳白色半透明状，表面光滑，粘稠，凸起，边缘不整齐，不产色素；革兰氏染色反应 为阳性，菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，可形成内生孢子，芽孢囊不明显膨大，芽孢椭 圆形，中生到次端生。这一形态与产乳酸的枯草芽孢杆菌（CGMCC No. 3242)在菌落形态上 不同。
[0016] 本发明枯草芽孢杆菌（RS-1)的生理生化反应与本实验室鉴定并保存的典型枯草 芽孢杆菌（汉sM)生理生化反应结果如下表所示：
【权利要求】
1. 一种以玉米浆为唯一氮源高产L-乳酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于该菌株分离于 四川家制泡菜中，可利用作为碳源的葡萄糖或乳糖或蔗糖和作为唯一氮源的玉米深加工工 业中废弃物玉米衆，发酵生产L-乳酸，属于枯草芽孢杆菌（ifeciBys syki/is)，菌株保藏 号：CGMCC No. 10040。
2. 根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵生产乳酸的方法，其特征在于将枯草芽孢 杆菌（CGMCC No. 10040)先接种至LB培养基35°C培养18小时后，再接种至液体发酵培养基 中，接种量按体积百分比为10%，液体发酵培养基其碳源成分选择葡萄糖或蔗糖或乳糖，加 入量为15% (W/V)，采用玉米深加工工业中废弃物玉米浆为唯一氮源，其用量为3 -10% (W/ V)，其他成分为水，pH调节至6. 5,发酵时间42小时。
【文档编号】C12R1/125GK104450585SQ201410772347
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】曾晓丹, 朱永清, 贺红宇, 姚英政, 李华佳, 王自鹏, 李治华, 刘培 申请人:四川省农业科学院农产品加工研究所