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背景技术：
：糖类诸如蔗糖、果糖和葡萄糖用于为饮料、食品、药品和口腔卫生产品/美容产品提供令人愉悦的口感。尤其是蔗糖赋予消费者偏爱的口感。虽然蔗糖提供优良的甜味特征，但是它是含热量的。已引入无热量或低热量的甜味剂来满足消费者的需求，并且期望具有有利味道特征的这些类型的甜味剂。甜菊是属于向日葵家族(菊科)的大约240种草本和灌木的属，原产自从北美洲西部到南美洲的亚热带和热带地区。甜叶菊(steviarebaudiana)(通常称为甜叶、糖叶或简称甜菊)这个种被广泛种植以用于获取其甜叶。基于甜菊的甜味剂可以通过从叶子中提取一种或多种甜味化合物而获得。这些化合物中的许多是甜菊醇糖苷，它们是甜菊醇(一种二萜化合物)的糖苷。这些二萜糖苷比糖甜约150至450倍。甜菊醇糖苷的实例在wo2013/096420(参见例如图1中的列表)以及在ohta等人“characterizationofnovelsteviolglycosidesfromleavesofsteviarebaudianamorita，”j.appl.glycosi.，57，199-209(2010)(参见例如第204页的表4)中进行了描述。在结构上，二萜糖苷的特征在于单一基础结构即甜菊醇，并且差别在于在c13和c19位存在碳水化合物残基，如图2a-2k中所展示。另见pct专利公布wo20013/096420。通常，基于干重，在甜菊的叶子中发现的四种主要甜菊醇糖苷是杜尔可苷a(0.3％)、莱苞迪苷c(0.6-1.0％)、莱苞迪苷a(3.8％)和甜菊苷(9.1％)。甜菊提取物中鉴定的其他糖苷包括莱苞迪苷b、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、甜菊醇二糖苷和甜茶苷中的一种或多种。虽然主要的甜菊醇糖苷reba通常在饮料应用中用作甜味剂，但是它具有异味问题。最近，人们一直关注某些具有更好的味道特性的次要甜菊醇糖苷。例如，莱苞迪苷m具有较高的甜味强度，并且比其他甜菊醇糖苷更有效(例如参见prakash，i.等人(2013)nat.prod.commun.，8:1523–1526和wo2013/096420)。莱苞迪苷d的味道比蔗糖甜约200-220倍，在感官评价中它具有缓慢发生的甜度，并且非常纯正(例如参见prakash，i.等人(2012)int.j.mol.sci.，13:15126-15136)。已经使用分子技术来制备能够经由发酵来合成甜菊醇糖苷的重组生物。例如，具有多个编码甜菊醇糖苷合成中涉及到的酶的转基因的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的重组菌株已被用于产生莱苞迪苷m和莱苞迪苷d(参见例如wo2014/222227)。酿酒酵母通常在培养基中存在>1-2g/l葡萄糖的情况下发酵(反巴士德效应)。当这种效应发生时，乙醇作为发酵产物而产生。乙醇的产生减少生物质和期望的生物产物(例如甜菊醇糖苷)。将葡萄糖保持为限制性的和/或使用不刺激反巴士德效应的底物的一种方法可以是使用可支持甜菊醇糖苷产生的非发酵底物。另一种限制葡萄糖释放并使葡萄糖水平低于刺激酵母发酵的水平的方法是应用同步糖化和发酵(ssf)。技术实现要素：公开了通过使酵母在非发酵底物上生长来产生甜菊醇糖苷的方法。还公开了通过同步糖化和发酵使酵母生长来产生甜菊醇糖苷的方法。根据一个方面，用于产生甜菊醇糖苷的方法包括：使能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母在葡萄糖限制性培养基中生长，该培养基包含可由该工程化酵母发酵的碳水化合物。可发酵碳水化合物的低于50重量％(wt％)、优选<20wt％、更优选<10wt％或<5wt％为葡萄糖和/或果糖，即葡萄糖、果糖或葡萄糖和果糖。在一些方面，葡萄糖和/或果糖可占可发酵碳水化合物的低于2wt％、优选<1wt％，并且在一个有用的方面，葡萄糖限制性培养基基本上不含葡萄糖。可发酵碳水化合物的至少50wt％、优选至少60wt％、至少70wt％、至少80wt％、至少90wt％或至少95wt％选自棉子糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖、麦芽糖、甘油及其组合，优选地选自棉子糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖及其组合，更优选地选自棉子糖、甘露糖、海藻糖及其组合。另一方面，用于产生甜菊醇糖苷的方法包括：(a)提供能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母和具有一种或多种多糖和/或一种或多种寡糖的碳源；(b)将所述一种或多种多糖和/或一种或多种寡糖的至少一部分转化成一种或多种单糖；以及(c)使所述工程化酵母在所述一种或多种单糖上生长以产生一种或多种甜菊醇糖苷。具体实施方式本文描述的本公开的实施方案无意为穷尽性的或将本发明限制于以下详细描述中所公开的精确形式。相反，所选和所述的实施方案的目的是使得可便于本领域的技术人员认识和理解本发明的原理和实践。本公开的发酵方法使用能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母。能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母可以包含编码促进细胞中一种或多种甜菊醇糖苷形成的酶的一种或多种外源核酸。如本文所用，术语“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷。示例性甜菊醇糖苷包括但不限于莱苞迪苷a、莱苞迪苷b、莱苞迪苷c、莱苞迪苷d、莱苞迪苷e、莱苞迪苷f、莱苞迪苷g、莱苞迪苷h、莱苞迪苷i、莱苞迪苷j、莱苞迪苷k、莱苞迪苷l、莱苞迪苷m、莱苞迪苷n、莱苞迪苷o、甜菊苷、甜菊醇二糖苷、杜尔可苷a和甜茶苷。工程化酵母可以产生与自然界中发现的(“天然存在的”)甜菊醇糖苷相同的甜菊醇糖苷以及不知道存在于甜叶菊叶子中的甜菊醇糖苷。甜菊醇糖苷可以通过酶促过程在工程化酵母中形成。在结构上，根据下面所示基础结构上的原子编号，甜菊醇糖苷具有中心分子部分(其为单一甜菊醇基础结构)以及附连至甜菊醇基础结构的c13和/或c19原子的吡喃葡萄糖基残基。也就是说，吡喃葡萄糖基残基代表下式中的基团r2和r1：根据本公开，甜菊醇糖苷是在具有至少两个阶段的过程中产生的：第一阶段和第二阶段，其中将含有葡萄糖的补料组合物在各阶段以不同的补料模式提供给培养基，诸如可变补料然后恒定补料。如本文所述的两阶段补料过程可导致第二阶段比第一阶段的生长速率更慢，并因此增加甜菊醇糖苷产生速率、减少发酵时间并降低生物质浓度。工程化酵母可以具有提供合成甜菊醇糖苷的途径的一组酶。例如，该过程可以产生甜菊醇糖苷，诸如rebm和rebd。本公开的方法可以使用经工程改造以提供一种或多种甜菊醇糖苷的途径的各种酵母宿主细胞。此类细胞可以用编码用于甜菊醇糖苷合成的酶的一种或多种dna构建体转化。可用于编码甜菊醇糖苷途径酶的外源dna构建体的宿主的示例性酵母包括但不限于念珠菌属(candida)、克勒克酵母属(kloeckera)(汉逊酵母属(hanseniaspora))、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、油脂酵母属(lipomyces)、毕赤酵母属(pichia)(汉森酵母属(hansenula))、红酵母属(rhodotorula)、酵母菌(saccharomycete)、酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、球拟酵母属(torulopsis)、有孢圆酵母属(torulaspora)、耶氏酵母属(yarrowia)和接合酵母属(zygosaccharomyces)的种。示例性的种是白色念珠菌(candidaalbicans)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)和解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)。此外，宿主细胞还可以包括不同于甜菊醇糖苷途径的遗传修饰，其可以在发酵期间提供改善的性能。“工程化酵母”是指具有引入细胞中，被整合到细胞基因组中或存在于染色体外构建体诸如质粒或附加体上的至少一个外源dna序列的酵母细胞。术语“外源”是指引入宿主酵母中的分子，诸如核酸或活性，诸如酶活性。外源核酸可以通过熟知的技术引入酵母宿主中，并且可以保持在宿主染色体物质的外部(例如保持在非整合载体上)，或者可以整合到酵母的染色体中，诸如通过重组事件。通常，工程化酵母的基因组通过稳定引入一个或多个重组基因而得到增强。外源核酸可以编码与酵母同源或异源的酶或其部分。外源核酸可以是“重组基因或dna构建体”的形式，这指的是通过分子技术以一种或多种方式操纵成非天然存在的形式的核酸。术语“异源”(例如“非天然”)是指来自与参考分子或生物不同的来源的分子或活性。因此，与参考生物异源的基因或蛋白质是不存在于该生物中的基因或蛋白质。在本公开的上下文中，“异源糖基转移酶”是指不同于对宿主生物而言可能是天然的任何糖基转移酶多肽的糖基转移酶多肽。例如，在第一物种中发现的并且外源性引入不同于第一物种的宿主酵母生物中的特定糖基转移酶基因是该宿主酵母“异源的”。工程化酵母可以使用适于选择具有编码甜菊醇糖苷途径酶的核酸的转化体的营养缺陷型标记。宿主酵母可以包括在控制营养缺陷型的一个或多个基因中的修饰(缺失等)，所述基因例如为lys2、leu2、his3、ura3、ura5和trp1。使用具有期望的遗传背景的宿主细胞来引入一个或多个外源基因，将一个或多个基因构建体引入细胞中以整合到基因组中或稳定地维持并允许表达。将基因构建体引入宿主细胞的方法包括转化、转导、转染、共转染和电穿孔。具体地讲，可以使用乙酸锂方法、原生质体方法等进行酵母转化。待引入的基因构建体可以以质粒的形式并入染色体中，或通过插入宿主基因中或通过与宿主基因的同源重组而并入染色体中。可以用选择性标记(例如，如上所提及的营养缺陷型标记)来选择已引入了基因构建体的转化酵母。通过测量所表达的蛋白质的活性或生物产物诸如甜菊醇糖苷的产生可以作出进一步的确认。包括甜菊醇途径基因的外源核酸序列的转化可以使用本领域熟知的方法来确认。此类方法包括例如核酸分析，诸如northern印迹或mrna的聚合酶链式反应(pcr)扩增，或用于基因产物的表达的免疫印迹，或用于测试引入的核酸序列或其相应基因产物的表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员将理解的是，外源核酸以足以产生期望产物的量表达，并且应进一步理解，可以使用本领域熟知且如本文所公开的方法对表达水平进行优化以获得足够的表达。萜类化合物异戊烯基二磷酸(ipp)和二甲基烯丙基二磷酸(dmapp)可以作为工程化酵母中甜菊醇糖苷的化学前体。一些生物(包括植物、昆虫和一些微生物物种)具有甲羟戊酸(mva)途径，其通过一系列化学中间体将乙酰-coa转化为ipp和dmapp。一些生物通过非甲羟戊酸途径(也称为甲基d-赤藓糖醇-4-磷酸或mep途径)以甘油醛-3-磷酸(g3p)和丙酮酸(pyr)开始产生ipp和dmapp。酿酒酵母自然表达甲羟戊酸途径的基因。甲羟戊酸途径基因包括：(a1)乙酰乙酰coa硫解酶(ec2.3.1.9)、(b1)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)合酶(ec4.1.3.5)、(c1)hmg-coa还原酶(ec1.1.1.34)、(d1)甲羟戊酸激酶(ec2.7.1.36)、(e1)磷酸甲羟戊酸激酶(ec2.7.4.2)和(f1)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(ec4.1.1.33)。甲羟戊酸途径的酶如下将乙酰-coa转化为ipp：乙酰-coa→乙酰乙酰-coa→3-羟基-3-甲基戊二酰-coa→甲羟戊酸→甲羟戊酸-5-磷酸→甲羟戊酸-5-焦磷酸→ipp。在一些实施方案中，工程化酵母可以包含一种或多种修饰以增加从乙酰-coa到ipp和/或dmapp的通量，从而提供用于通向甜菊醇的途径中的增加的ipp和/或dmapp库。这些修饰可以包括例如增加一种或多种甲羟戊酸途径酶(a1)–(f1)的表达或活性，诸如通过将编码与酵母细胞同源或异源的酶的核酸置于提供增加的表达的启动子的控制下，使用多个核酸拷贝，和/或使用异源酶、变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸置换的酶)或与天然酶相比提供更高水平的酶活性的变体异源酶。或者，可使用非甲羟戊酸(mep)途径来提供ipp和dmapp作为甜菊醇糖苷产生的前体。酿酒酵母不天然地表达mep途径的基因，但可以任选地被工程化以提供mep途径基因。从理论上讲，mep途径更积极有效，一般是因为与mva途径相比，以co2的形式丧失的碳更少(mep途径：1co2/ipp；mva途径：4co2/ipp；糖作为碳源)。具体地讲，在非甲羟戊酸(mep)途径中，化合物异戊烯基二磷酸(ipp)、二甲基烯丙基二磷酸(dmapp)通过一系列由甘油醛-3-磷酸(g3p)和丙酮酸(pyr)得到的中间体产生，并且多种酶负责该转化。从g3p和pyr到ipp和dmapp的生物合成途径中涉及到的酶包括(a2)1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶(dxs)、(b2)1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(ispc)-、(c2)4-二磷酸胞苷-2c-甲基-d-赤藓糖醇合酶(ispd)、(d2)4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤藓糖醇激酶(ispe)、(e2)2c-甲基-d-赤藓糖醇-2，4-环二磷酸合酶(ispf)、(f2)1-羟基-2-甲基-2-(e)-丁烯基-4-二磷酸合酶(ispg)、(g2)4-羟基-3-甲基-2-(e)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(isph)和(h2)异戊烯基二磷酸异构酶(idi)。用于通过发酵产生甜菊醇糖苷的本公开的方法可以使用具有一个或多个遗传修饰的工程化酵母，以增加从g3p和pyr到ipp和/或dmapp的通量，从而提供用于通向甜菊醇的途径中的增加的ipp和/或dmapp库。这些修饰可以包括例如增加一种或多种酶(a2)–(h2)的表达或活性，诸如通过将编码与酵母细胞同源的酶的核酸置于提供增加的表达的启动子的控制下，使用多个核酸拷贝，和/或使用异源酶、变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸置换的酶)或提供高水平酶活性的变体异源酶。通过发酵产生甜菊醇糖苷的本公开的方法可以使用工程化酵母，也可以包括将ipp和/或dmapp转化成甜菊醇的途径。例如，在一些方面，工程化酵母可以包括表达以下酶的外源核酸：(a3)香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)、(b3)柯巴基二磷酸合酶(cps)、(c3)贝壳杉烯合酶(ks)、(d3)贝壳杉烯氧化酶(ko)和(e3)贝壳杉烯酸13-羟化酶(kah)。甲羟戊酸途径的酶如下将ipp和/或dmapp转化成甜菊醇：ipp/dmapp→香叶基香叶基二磷酸→柯巴基二磷酸→贝壳杉烯→贝壳杉烯酸→甜菊醇。编码与酵母细胞异源的酶(a3)–(e3)的外源核酸可以被置于提供增加的表达的启动子的控制下，使用多个核酸拷贝，和/或使用变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸置换的酶)或提供高水平酶活性的变体异源酶。通过发酵产生甜菊醇糖苷的本公开的方法可以使用具有将甜菊醇转化成甜菊醇糖苷的任何途径的工程化酵母。如果工程化酵母中存在多于一种甜菊醇糖苷途径酶，则该酵母可能能够产生不同的甜菊醇糖苷。例如，酵母可能能够产生两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或超过十种不同的甜菊醇糖苷物质。甜菊醇糖苷途径可以包括介导糖基残基从活化的核苷酸糖转移至受体分子的一种或多种尿苷二磷酸(udp)糖基转移酶(ugt)。在甜菊醇糖苷途径的情况下，可以将单糖单元转移到甜菊醇或甜菊醇糖苷分子上的羟基或羧基部分，或转移到附接至甜菊醇基础结构的葡萄糖基团上的羟基上。根据序列同源性将ugt分为家族和亚家族。参见li等人，2001，j.biol.chem.276:4338-4343。在模型植物拟南芥(arabidopsisthaliana)中已鉴定了超过100个编码ugt的基因的超家族，每个含有42个氨基酸的共有序列，并且编码ugt的基因也已经在若干其他高等植物物种中鉴定出。示例性udp-葡糖基转移酶可以是能够向甜菊醇和/或甜菊醇糖苷底物添加至少一个葡萄糖单元以提供目标甜菊醇糖苷的任何udp-葡萄糖基转移酶。在一个实施方案中，工程化酵母可以包含选自ugt74g1、ugt85c2、ugt76g1、ugt91d2的一种或多种udp-葡糖基转移酶，以及与这些多肽具有实质性(>85％)同一性的ugt。工程化酵母可以包含编码这些ugt的一个或多个外源核酸分子。工程化酵母还可以包含一种或多种ugt和udp-葡萄糖循环酶。能够将至少一个葡萄糖单元添加到甜茶苷中以形成甜菊苷的示例性udp-葡萄糖基转移酶是ugt91d2。能够将至少一个葡萄糖单元添加到甜菊苷以形成莱苞迪苷a的示例性udp-葡萄糖基转移酶是ugt76g1。能够将至少一个葡萄糖单元添加到莱苞迪苷a以形成莱苞迪苷d的示例性udp-葡萄糖基转移酶是ugt91d2。能够将至少一个葡萄糖单元添加到莱苞迪苷d以形成莱苞迪苷m的示例性udp-葡糖基转移酶是ugt76g1。描述用于产生甜菊醇糖苷的工程化微生物和甜菊醇糖苷途径酶的示例性公布包括例如us2014/0357588、wo2014/193934、wo2014/193888和wo2014/222227，它们每一者的全部内容以引用方式并入本文。在一个实施方案中，用于产生甜菊醇糖苷的工程化酵母表达下列酶：香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)、ent-柯巴基二磷酸合酶(cdps)、贝壳杉烯氧化酶(ko)、贝壳杉烯合酶(ks)、甜菊醇合酶(kah)、细胞色素p450还原酶(cpr)、ugt74g1、ugt76g1、ugt91d2和eugt11。wo2014/122227描述了表达这些酶的工程化酵母菌株。ugt74g1酶起着尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇19-cooh转移酶和尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-o-葡糖苷19-cooh转移酶的作用。ugt76g1酶是催化甜菊醇主链上的若干糖基化反应的甜菊尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶。ugt76g1酶可以在19-o位或13-o位催化甜菊醇和甜菊醇糖苷的糖基化。ugt91d2和eugt11酶可以起到尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-o-葡糖苷转移酶(也称为甜菊醇-13-单葡糖苷1，2-转葡糖基酶)的作用，从而将葡萄糖部分转移到受体分子甜菊醇-13-o-葡萄糖苷的13-o-葡萄糖的c-2'，或起到尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜茶苷转移酶的作用，从而将葡萄糖部分转移到受体分子甜茶苷的13-o-葡萄糖的c-2'，以产生甜菊苷。eugt11酶也可以将葡萄糖部分转移到受体分子甜茶苷的19-o-葡萄糖的c-2'以产生19-o-1，2-二糖基化的甜茶苷。术语“培养基”是指一种液体组合物，工程化酵母或真菌可以在其中保持、可以在其中生长、可以在其中发酵或其组合。“培养基”也可以被称为“肉汤”或“细胞培养物”，并且诸如“生长”、“分裂”、“呼吸”和“发酵”的术语可用来更具体地定义在培养基中发生的细胞活动的类型。培养基可以相对于培养基中存在的组分及其量来定义，诸如碳源，包括(a)碳水化合物，诸如葡萄糖和淀粉产物，诸如麦芽糖糊精；(b)氮源，诸如酵母氮源基础、氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其任何组合；(c)盐，诸如磷酸钾(磷酸二氢钾、磷酸氢二钾)、硫酸镁、氯化钠和氯化钙；(d)维生素，诸如生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酸、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素和螯合剂柠檬酸；(e)微量金属，诸如硼酸、硫酸铜、氯化钴、氯化钙、碘化钾、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化锰、钼酸钠和硫酸锌。培养基中的组分可以基于干重来定义。此外，培养基是水基或“水性”组合物。培养基也可以相对于其ph值以及用于控制培养基中的ph的生物相容性酸、碱和缓冲剂来定义。在一个实现方式中，葡萄糖限制性培养基中的葡萄糖含量保持在约0g/l至约5g/l、或0g/l至约2g/l、或小于1g/l的范围内。在示例性方面，培养基中氮源诸如酵母氮源基础、氢氧化铵、尿素、硫酸铵的浓度(总量)保持在约5g/l至约40g/l的范围内。在示例性方面，第二培养基中的盐的浓度(总量)，诸如盐包括在约0g/l至约12g/l范围内的硫酸镁和在约0g/l至约22g/l范围内的磷酸钾。在示例性方面，第二培养基中微量金属的浓度(总量)保持在约0g/l至约0.4g/l、或0g/l至约0.2g/l的范围内。可以将组合物(“补料组合物”)添加到包含工程化酵母的培养基中以增加培养基的体积，并且随着工程化酵母在培养基中生长，增加生物质的量。补料组合物可以包含用于酵母生长和发酵的组分以形成期望的培养基。补料组合物可以包含碳水化合物、氮源(诸如氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其任何组合)、盐、维生素和微量金属。补料组合物中组分的浓度可以大于培养基中组分的浓度，以使得当添加补料组合物时，其在适于工程化酵母发酵的培养基中提供所需量的组分。工程化酵母的发酵可以使用源自任何植物和植物部分(诸如块茎、根、茎、叶和种子)的含淀粉和/或含糖的植物材料进行。可以从谷物诸如大麦、小麦、玉米、黑麦、高粱、小米、大麦、马铃薯、木薯或大米及其任何组合获得含淀粉和/或含糖的植物材料。含淀粉和/或含糖的植物材料可以例如通过诸如碾磨、制麦芽(malting)或部分制麦芽的方法进行加工。在一些实施方案中，用于生长和/或发酵的培养基可以包含经处理过的淀粉，例如部分水解的淀粉。部分水解的淀粉可以包含高分子量糊精和高分子量麦芽糖糊精。可以使用部分水解的淀粉产品，其淀粉和淀粉降解产物的量在有益于甜菊醇糖苷产生的期望范围内。任选地，可以将淀粉降解酶添加到包含淀粉材料的培养基中以便增加在发酵期中可由工程化酵母利用的单体糖诸如葡萄糖的浓度。示例性淀粉降解酶包括淀粉分解酶，诸如葡萄糖淀粉酶(glycoamylase)和淀粉酶。在一个有用的实现方式中，培养基是含有可由工程化酵母发酵的碳水化合物的葡萄糖限制性培养基，并且葡萄糖和/或果糖(即葡萄糖、果糖或葡萄糖和果糖)的浓度是限制性的。在葡萄糖限制性培养基中，可发酵的碳水化合物为低于50重量％(wt％)、优选低于20wt％、更优选低于10wt％或低于5wt％的葡萄糖和/或果糖。葡萄糖限制性培养基可以基本上不含葡萄糖、基本上不含果糖、或者基本上不含葡萄糖和果糖两者。葡萄糖限制性培养基包含乙醇限制性底物，其可以是用于发酵的主要碳源。乙醇限制性底物选自棉子糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖、麦芽糖、甘油及其组合。在一个优选的实现方式中，乙醇限制性底物选自棉子糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖及其组合。在另一个优选的实现方式中，乙醇限制性底物选自棉子糖、甘露糖、海藻糖及其组合。在某些有用的实施方案中，乙醇限制性底物是至少95wt％的棉子糖、甘露糖或海藻糖。乙醇限制性底物占葡萄糖限制性培养基中的可发酵碳水化合物的至少50wt％。乙醇限制性底物有利地占葡萄糖限制性培养基中的可发酵碳水化合物的至少60wt％或至少70wt％，例如至少80wt％、至少90wt％或至少95wt％。如果需要的话，葡萄糖限制性培养基中的可发酵碳水化合物可以包含除葡萄糖、果糖、棉子糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖、麦芽糖和甘油以外的碳水化合物。取决于所使用的原料，这些糖可以包括例如木糖、阿拉伯糖、纤维二糖或水苏糖。在一些任选的实践模式中，发酵可以在包含含甜菊醇的化合物的培养基中进行。此类化合物可以直接由工程化酵母中的葡糖基转移酶利用。例如，任选地，发酵可以在含有甜菊醇-13-o-葡糖苷或甜菊醇-19-o-葡糖苷的培养基中进行。使用该培养基，微生物可以含有和表达编码功能性eugt11、功能性ugt74g1、功能性ugt85c2、功能性ugt76g1和功能性ugt91d2的基因。诸如莱苞迪苷a、莱苞迪苷d和莱苞迪苷m的化合物可以从发酵培养基中获得。作为另一种选择，发酵可以在含有甜茶苷的培养基中进行。使用该培养基，微生物可以含有和表达编码功能性eugt11、功能性ugt76g1和功能性ugt91d2的基因。诸如莱苞迪苷a、d和m的化合物可以在发酵后从培养基中获得。在一些情况下，发酵在工业产能发酵罐中进行，以实现商业规模的经济效益和控制。在一个实施方案中，发酵在容量为约10,000升或更大的发酵罐中进行。术语“第一阶段”和“第二阶段”(以及任选地，“前期阶段”、“第三阶段”、“第四阶段”、“第五阶段”等等，如果必要的话)可用于描述产生甜菊醇糖苷的方法关于培养基的各方面。术语“期”也可以用于“阶段”。该过程包括两个或更多个阶段，其中在每个阶段对培养基进行不同的处理，诸如通过在该过程的第二个稍后的阶段以与在第一个较早的阶段添加补料组合物的模式不同的模式向培养基添加补料组合物。添加模式的差异影响工程化酵母的生长和在此过程中甜菊醇糖苷的产生。在第一阶段(其中通过第一种添加模式控制细胞生长)之前，可以根据“前期阶段”培养细胞。前期阶段可以是其中细胞在培养基中生长以变得适应培养基组分(碳水化合物、氮源、盐、维生素、微量金属)的“种子/初始生长阶段”。在前期阶段，对细胞的碳水化合物供应不像在第一阶段和第二阶段期间那样受到调节，因此细胞可以以其最大生物学速率生长。例如，前期阶段的细胞可以分批补料。随着细胞变得适应于培养基，细胞将进入生长阶段并增加细胞数量。在前期阶段期间，工程化酵母可以而通过出芽生殖(budding)而繁殖，称为酵母分裂。例如，在前期阶段期间，包含碳水化合物、氮源(诸如酵母氮源基础、氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其任何组合)、盐、维生素和微量金属的生长组合物可以在分批过程中加入包含工程化酵母的培养基中。在一些实践模式中，添加组合物以提供具有氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其组合作为唯一氮源的培养基。在随后的第一阶段，可以使用相同的组合物作为补料组合物，其中通过向培养基中添加补料组合物的模式来控制细胞生长。在以细胞快速生长和生物质增加为特征的前期阶段之后，可以通过根据第一添加模式调节含葡萄糖的组合物的添加来开始第一阶段(例如步骤a)。第一阶段可以用不同的方式描述，诸如通过以下方式：如何将补料溶液添加到培养基中，以及细胞如何响应这种添加而生长。添加模式可影响工程化酵母的加倍时间。第一阶段的倍增时间可能比前期阶段的倍增时间要长(生长较慢)。在第一阶段期间，培养基的生物质可以增加，但是其增加速率可能低于前期阶段中所见的增加速率。第一阶段还可以根据与第二阶段相比细胞如何生长进行描述，在第二阶段中以与第一模式不同的第二模式将补料溶液添加到培养基中。例如，在第一阶段，可以在一定条件下使酵母在培养基中生长，以达到一种或多种生长速率(稀释速率)，该生长速率在比第二阶段中的生长更大的第一范围内。例如，在种子/生长阶段中，生长速率可以是约0.06l/h或更大，诸如约0.06l/h至约0.17l/h，或约0.09l/h至约0.15l/h。任选地，第一阶段可以根据培养基中的葡萄糖浓度进行描述。例如，在一些实践模式中，第一阶段在培养基中葡萄糖低于3g/l时开始。例如，可以监测在前期阶段期间在培养基中的葡萄糖的量，当浓度降至3g/l以下时，可以开始第一阶段补料。第一阶段中期望的生长速率可以通过根据第一模式将包含葡萄糖的组合物添加到培养基中来实现。“补料模式”是指将含有葡萄糖的补料组合物添加到具有工程化酵母的培养基中的方式。补料模式包括恒定速率补料、非恒定速率补料、连续添加补料组合物、大量添加补料组合物等。在一些补料模式中，在第一阶段期间将补料组合物以非恒定补料速率添加到培养基中。例如，非恒定补料速率可以是可变补料速率。可变补料速率是指在向培养基中添加补料溶液的周期内以两种或更多种不同的速率向培养基中添加补料溶液。在一些实践模式中，在可变速率补料期间，速率在一段时间内下降。例如，在该过程的生长阶段，补料可以从较早生长阶段的较高补料速率改变为较晚生长阶段的较低补料速率。这可以通过不断降低补料速率来进行，或者可以通过一系列小的递减步骤来进行。在任选的实践模式中，可变补料速率可以包括增加补料速率，然后降低补料速率。可变速率补料可以使用可变速率添加系统来实现。此类系统的实例包括变速泵或可操作地连接到泵的计量阀(诸如节流阀)，该泵或阀可以用来随时间的推移而改变引入到发酵培养基中的补料组合物的量。第一阶段还可以参考与培养基相关的一个或多个参数来解释，例如第一阶段的时间段、培养基的温度、生长的生物质的量和培养基的ph。在一些实践模式中，具有可变补料速率的第一阶段可以进行约两小时或更长且最多约40小时的时间段。例如，第一阶段可以为约10小时或更长，诸如约10小时至约30小时、或约10小时至约24小时范围内的时间段。第一阶段可能涵盖工程化酵母的全部或部分生长停滞期以及全部或部分对数(指数)生长期。在这段时间之后，然后可以改变向培养基中添加包含葡萄糖的补料组合物的模式(例如，改变成第二阶段中的恒定补料速率)。在示例性实践模式中，在第一阶段，将培养基保持在约25-35℃或28-32℃范围内最优选地约30℃的温度下。另外，工程化酵母的生长可以在曝气和搅拌下进行。曝气条件可对溶解在培养基中的氧气的量具有影响，并因而对工程化酵母可利用的氧气具有影响。工程化酵母的氧气摄取量可以通过氧气供应速率来控制，在培养基中形成小的氧气泡，这可以通过搅拌和/或鼓泡来实现。在培养基中并且在第一阶段期间，可以进行曝气。曝气可以根据向培养基的溶解氧转移速率来描述，单位为mgmin-1l-1。曝气也可以根据溶解氧(％)来描述。(例如，参见anderlei，t.和büchs，j.(2000)biochem.engin.j.3478:1-6)。可以进行促进细小气泡形成的鼓泡技术以提供期望的曝气。在一些实践模式中，在第一阶段期间，诸如以逐步方式增加搅拌和曝气。使用两阶段补料过程的本公开的方法还可以减少培养基中的曝气需求，同时仍然提供期望的甜菊醇糖苷产生。在一些实践模式中，溶解氧维持在大于15％。如本文所用，“生物质”是指工程化酵母的重量，其可以以每升培养基的干燥细胞重量的克数(dcw/l)测量。作为另一个示例性参数，在一些实践模式中，具有可变补料速率的第一阶段产生至少约5dcw/l的生物质的量。优选地，所产生的生物质的量在约5gdcw/l至约60gdcw/l、约20gdcw/l至约60gdcw/l、或约20gdcw/l至约40gdcw/l的范围内。作为另一个实例，在一些实践模式中，具有可变补料速率的第一阶段在低于6.0或更低、低于约5.5并且优选低于5.2的ph下进行，诸如在约4.0至约5.2的范围内。在第一阶段期间，可以监测ph以使其保持在期望的较低ph范围内，诸如在约4.0至5.2的范围内。在补料期间可以将酸或碱添加到培养基中以将ph保持在期望的范围内。在第一阶段之后，工程化酵母可以进入第二阶段，诸如其中提供补料组合物的模式不同于第一阶段的“发酵阶段”。在第二阶段，工程化酵母的生长至少减慢并积极同化碳水化合物且产生甜菊醇糖苷。如本文所用，“发酵”用于描述甜菊醇糖苷的显著产生阶段，其可以在完全需氧、部分需氧或厌氧条件下发生。在部分需氧条件下，发酵途径和呼吸途径均可以活跃，并且可能发生一些细胞生长。在部分需氧条件下，消耗的氧气量可能少于在种子/生长阶段期间的量。在第二阶段，可以以与第一阶段不同的模式向培养基中添加具有葡萄糖的补料组合物。在一些实践模式中，第一阶段和第二阶段在同一容器中进行，其中在第一阶段期间，将包含葡萄糖的补料溶液以可变速率添加到容器中的培养基中，然后在第二阶段将补料溶液以恒定速率添加到同一容器中的培养基中。在一些实践模式中，在第二阶段，以恒定补料速率将补料组合物添加到培养基中。例如，恒定补料速率不大于10g葡萄糖/l培养基/h，并且优选以2g葡萄糖/l培养基/h至10g葡萄糖/l培养基/h范围内的恒定补料速率。例如，在包括甜菊醇糖苷的发酵和产生的第二阶段，酵母可以在一定的条件下在培养基中生长，以达到一个或多个在某一范围内的生长速率。例如，在第二阶段，生长速率可以为约0.09l/h或更小，诸如在约0.015l/h至约0.09l/h、或约0.015l/h至约0.06l/h范围内的速率。在一些实施方案中，步骤(b)中的生长速率(稀释速率)在步骤(a)中的最大生长速率(稀释速率)的50-90％的范围内。在一些实施方案中，步骤(b)中的生长速率(稀释速率)在步骤(a)中的最大生长速率(稀释速率)的50-100％的范围内。在一些实践模式中，可以在第二阶段以恒定速率进行一段时间以提供期望的甜菊醇糖苷产生。例如，第二阶段可以在从步骤(a)开始起约30小时或更晚的时间开始，然后可以从步骤(a)开始起进行长达130小时。第二阶段可涵盖产生大部分甜菊醇糖苷的全部或部分发酵阶段。优选地，大部分甜菊醇糖苷(即大于50％)在第二阶段期间由工程化酵母产生。包括两阶段补料的本公开的方法提供了关于发酵的益处，与对照过程(例如，单阶段发酵)相比，允许高达约25％或甚至高达40％的发酵时间缩短。此外，在一些实践模式中，可以控制第二阶段的恒定补料速率，以使工程化酵母不生长至大于180gdcw/l的生物量。包括两阶段补料的本公开方法提供了关于生物质产生的益处，与具有单阶段发酵的对照过程相比，允许高达25％的所产生生物质的量的降低。此外，在一些实践模式中，在第二阶段期间，培养基可以具有比在第一阶段期间在培养基中的ph高的ph。例如，在第二阶段开始时或在第二阶段期间，可以将碱添加到培养基中以将ph从较低ph提高到较高ph。碱可以存在于补料组合物中，或可以与第二阶段的补料组合物分开加入。例如，在第二阶段，可将ph调节至约ph5.8或更高，或约ph6.0或更高，诸如约ph5.8至约ph7.5或更高、或约ph6.0至约ph7.0的范围内。在第二阶段期间，可以监测ph(例如，定期地或连续地)，并且如果ph值落在期望的范围之外，则可以对培养基进行调节。例如，如果ph值降低到6.0或5.8以下，则可以将氢氧化铵添加到第二培养基中，从而将ph调节到约6.0或更高。在示例性实践模式中，第二培养基中的发酵和任选的生长在约25-35℃或28-32℃的范围内并且最优选约30℃的温度下进行。另外，工程化酵母在第二培养基中的发酵和任选的生长可以在曝气和搅拌下进行。使用两阶段补料过程的本公开的方法还可以减少培养基中的曝气需求，同时仍然提供期望的甜菊醇糖苷产生。在发酵期间，可以监测培养基的甜菊醇糖苷产生。可以在具有期望的甜菊醇糖苷总量和分布的点处停止发酵。“总甜菊醇糖苷”是指在发酵一段时间后存在于培养基中的所有甜菊醇糖苷，其包括在液体培养基中和可以从工程化酵母获得的甜菊醇糖苷的量。甜菊醇糖苷含量可以关于培养基中的总甜菊醇糖苷量或者培养基中一种或多种但不是全部甜菊醇糖苷的量来表示。组合物中甜菊醇糖苷的量可以相对于彼此表示，或者相对于甜菊醇糖苷的总量来表示，例如以甜菊醇糖苷的总量的重量百分比表示，或者以表示为重量百分比或摩尔百分比的比率或比率范围表示。甜菊醇糖苷的量也可以相对于对照样品来表示，诸如通过不包括第一和第二阶段补料的过程制备的对照样品。在一些实践模式中，本公开的方法提供某些甜菊醇糖苷诸如莱苞迪苷d和莱苞迪苷m的产生的提高。本公开的方法可以提供发酵期间甜菊醇糖苷产生速率的提高。例如，在如本文所述的第一和第二阶段方法中生长和发酵的工程化酵母，相对于在对照过程中生长和发酵的甜菊醇糖苷产生工程化酵母菌株的甜菊醇糖苷产生速率，可表现出约1％或更高、约2％或更高、约3％或更高且高达约15％或约12％的速率增加。根据本公开的分阶段补料可以产生rebd和rebm并提高产生速率、缩短发酵时间和降低生物质浓度。在发酵产生甜菊醇糖苷的第二阶段之后，可以使用各种技术从培养基中获得包含一种或多种甜菊醇糖苷的组合物。在一些实施方案中，可将诸如透化剂的化合物添加到培养基中以增强从细胞中移除甜菊醇糖苷并进入培养基。培养基然后可以离心或过滤以移除工程化细胞。可以任选地处理培养基，以移除低分子量组分(葡萄糖、基本营养物质和盐)，诸如通过膜透析。根据期望的用途，可以使用包含一种或多种甜菊醇糖苷化合物的组合物。在发酵之后，可以任选地使用热处理方法处理工程化酵母以增加甜菊醇糖苷的回收。在发酵之后，但在任何热处理之前，培养基可能含有次优量的甜菊醇糖苷，而大部分所需的甜菊醇糖苷在工程化酵母中。为了提高甜菊醇糖苷的回收率，在一些实践模式中，将组合物(诸如工程化酵母已经发酵的较高ph下的培养基)加热至50℃至95℃或70℃至95℃范围内的温度持续5分钟至48小时范围内的时间段。如果希望提供具有富集或纯化形式的甜菊醇糖苷的组合物，或者在某些甜菊醇糖苷彼此分离的情况下，可以进行进一步的纯化。甜菊醇糖苷组分的这种富集或纯化可以在发生发酵的培养基上进行，或者可以在纯化之前干燥培养基。例如，可以使用冻干法干燥培养基以形成包含甜菊醇糖苷的干组合物(例如粉末或薄片)，其可以随后进行处理。如本文所用，术语“总甜菊醇糖苷”(tsg)以干燥(无水)状态下组合物中所有甜菊醇糖苷的含量的总和来计算。在一些实践模式中，使用富含甜菊醇糖苷的干燥发酵肉汤作为纯化的起始材料。例如，可以将溶剂或溶剂组合添加到干燥的发酵肉汤中以溶解或悬浮包含甜菊醇糖苷的材料。用于溶解甜菊醇糖苷的示例性组合是水和醇(例如50:50乙醇:水)的混合物。为了便于溶解或悬浮，可将干燥的肉汤材料在高于室温的温度下加热，诸如在40℃-60℃的范围内。还可以诸如通过超声处理来进行干燥的肉汤材料的机械破碎。可以在进一步纯化之前，诸如通过制备型色谱，使用微米或亚微米对溶解或悬浮的肉汤材料过滤。可使富含甜菊醇糖苷化合物的干燥的发酵肉汤进行纯化，诸如通过反相液相色谱法。可以使用合适的树脂在柱中保留甜菊醇糖苷化合物，而移除亲水性化合物，其用诸如水的液体从柱子中洗出。从柱中洗脱甜菊醇糖苷可以通过合适的溶剂或溶剂组合诸如乙腈或甲醇来完成。从反相柱洗脱柱甜菊醇糖苷可产生可用于多种目的中的任一种的组合物。例如，纯化的甜菊醇糖苷组合物可以用作用于口服或经口使用的甜味剂组合物。组合物可以关于组合物中的甜菊醇糖苷来定义。产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株使用如wo2011/153378、wo2013/022989、wo2014/122227和wo2014/122328中所述的方法构建，它们每一者整体以引用方式并入本文。以下序列用于构建亲本菌株(efsc3841)：编码聚球藻属物种(synechococcussp)ggpps多肽(seqidno:1)的重组基因、编码截短的玉米(zeamays)cdps多肽(seqidno:2)的重组基因、编码拟南芥(a.thaliana)ks多肽(seqidno:3)的重组基因、编码重组甜叶菊(s.rebaudiana)ko多肽(seqidno:4、seqidno:5)的重组基因、编码拟南芥atr2多肽(seqidno:6、seqidno:7)的重组基因、编码水稻(o.sativa)eugt11多肽(seqidno:8)的重组基因、编码srkahe1多肽(seqidno:9、seqidno:10)的重组基因、编码甜叶菊cpr8多肽(seqidno:11、seqidno:12)的重组基因、编码甜叶菊ugt85c2多肽(seqidno:13)的重组基因、编码甜叶菊ugt74g1多肽(seqidno:14)的重组基因、编码甜叶菊ugt76g1多肽(seqidno:15)的重组基因和编码产生甜菊醇糖苷的甜叶菊ugt91d2变体(或功能同源物)ugt91d2e-b(seqidno:16)多肽的重组基因。ugt91d2(来自pct/us2012/050021的seqidno:5)的ugt91d2e-b变体包括在位置211甲硫氨酸对亮氨酸的置换和在位置286丙氨酸对缬氨酸的置换。(也可以使用在pct/us2012/050021的表12和实施例11中描述的除了t144s、m152l、l213f、s364p和g384c变体外的另外变体)。编码具有氨基酸修饰l211m和v286a的甜叶菊ugt91d2e-b的geneart密码子优化的序列(seqidno:16针对氨基酸序列；密码子优化的核苷酸序列在seqidno:17中示出)。菌株efsc4240来源于上述亲本菌株并且还包含来自甜叶菊的密码子优化的cpr1(对应于氨基酸序列seqidno:19的seqidno:18)。在一些实施方案中，本公开的合适方法在下文列出的各种实施方案中说明和示例性示出：本发明整体涉及用于使用工程化酵母产生甜菊醇糖苷的方法，以及发酵组合物，和包含一种或多种甜菊醇糖苷的发酵产物。本公开的发酵条件可以促进以下一项或多项：来自工程化酵母的增加的甜菊醇糖苷滴度、包括增加的甜菊醇糖苷产生速率的增加的细胞活性、缩短的发酵时间和降低的生物质浓度。在示例性实施方案中，所述方法可以用于产生甜菊醇糖苷，诸如莱苞迪苷m、莱苞迪苷d、莱苞迪苷a、莱苞迪苷b等。本发明的一个实施方案提供了用于产生甜菊醇糖苷的方法，其至少包括涉及工程化酵母的生长和发酵的步骤(a)和(b)。在步骤(a)(即第一阶段)中，能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母在培养基中以第一范围内的一种或多种生长速率(稀释速率)生长。同样在步骤(a)中，根据导致酵母在第一范围内生长的第一模式，将包含葡萄糖的组合物添加到培养基中。在步骤(b)(即第二阶段)中，将工程化酵母发酵以产生一种或多种甜菊醇糖苷，其中根据不同于第一模式的第二模式将包含葡萄糖的组合物添加到培养基中。在步骤b)期间，根据第二模式的添加导致酵母以小于第一范围的第二范围内的一种或多种生长速率(稀释速率)生长。在示例性方法中，步骤(a)中酵母的生长速率在约0.06l/h至约0.15l/h的范围内，并且步骤(b)中的生长速率在约0.015l/h至约0.09l/h的范围内。从步骤(a)到步骤(b)的生长速率的改变可以由添加“模式”的改变引起，诸如通过改变将包含葡萄糖的组合物添加到培养基中的速率，或改变将包含葡萄糖的组合物添加到培养基中的方式，诸如在步骤(a)中提供非恒定速率补料，然后在步骤(b)中提供恒定速率补料。在另一个示例性方法中，工程化酵母在步骤(a)中生长至5gdcw/l至60gdcw/l范围内的生物量，然后在步骤(b)中生长至不超过150gdcw/l的生物量。本发明还提供了包含根据本公开的方法获得的甜菊醇糖苷的发酵培养基，以及从该发酵培养基获得的甜菊醇糖苷组合物。以下带编号和陈述的本发明的另外的实施方案包括：1.一种用于产生甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母在培养基中生长，其中所述工程化酵母以第一范围内的一种或多种生长速率(稀释速率)生长；并且其中根据第一模式向所述培养基添加包含葡萄糖的组合物；(b)发酵所述工程化酵母以产生所述一种或多种甜菊醇糖苷，其中在发酵期间，根据不同于所述第一模式的第二模式将包含葡萄糖的组合物添加到所述培养基中，并且在发酵期间，所述酵母以第二范围内的一种或多种生长速率(稀释速率)生长，其中所述第二范围小于所述第一范围。2.实施方案1的方法，其中在步骤(a)中生长速率(稀释速率)为0.06l/h或更大。3.实施方案2的方法，其中在步骤(a)中第一范围是0.06l/h至0.17l/h。4.实施方案3的方法，其中在步骤(a)中第一范围是0.09l/h至0.15l/h。5.实施方案1的方法，其中在步骤(b)中生长速率(稀释速率)为0.09l/h或更小。6.实施方案5的方法，其中在步骤(b)中第二范围是0.015l/h至0.09l/h。7.实施方案6的方法，其中在步骤(b)中第二范围是0.015l/h至0.06l/h。8.实施方案1的方法，其中步骤(b)中的生长速率(稀释速率)在步骤(a)中的最大生长速率(稀释速率)的50-100％的范围内。9.实施方案1的方法，其中在步骤(a)中根据作为非恒定速率补料的第一模式将包含葡萄糖的组合物添加到培养基中。10.实施方案1的方法，其中在步骤(b)中根据作为恒定速率补料的第二模式将包含葡萄糖的组合物添加到培养基中。11.实施方案10的方法，其中恒定补料速率不大于10g葡萄糖/l培养基/h。12.实施方案11的方法，其中恒定补料速率在2g葡萄糖/l培养基/h至10g葡萄糖/l培养基/h的范围内。13.实施方案1的方法，其中在步骤(a)中包括改变添加葡萄糖的第一模式以降低工程化酵母的生长速率的一个或多个子步骤。14.实施方案1的方法，其中在步骤(b)中添加碱以提供具有比步骤(a)中的培养基的ph更高的ph的培养基。15.实施方案14的方法，其中在步骤(b)中培养基的ph为6.0或更高。16.实施方案1的方法，其中步骤(a)在培养基中葡萄糖少于3g/l时开始。17.实施方案16的方法，其中步骤(a)从步骤(a)开始的时间起进行长达40小时。18.实施方案16的方法，其中步骤(b)在从步骤(a)开始起30小时或更晚的时间进行。19.实施方案1的方法，其中步骤(b)从工程化酵母的最初培养起进行长达130小时。20.实施方案1的方法，其中在步骤(a)中工程化酵母生长至至少5gdcw/l的生物量。21.实施方案20的方法，其中在步骤(a)中工程化酵母生长至20gdcw/l至60gdcw/l范围内的生物量。22.实施方案1的方法，其中在步骤(b)中工程化酵母不生长至大于180gdcw/l的生物量。23.前述实施方案中任一个的方法，还包括提供包含工程化酵母的种子培养基的步骤，其中种子培养基用于形成步骤(a)的第一培养基。24.前述实施方案中任一个的方法，其中在步骤(b)中，第二培养基包含葡萄糖、氮源、钾源、镁源、磷酸盐源、镁源、微量金属、维生素和消泡剂。25.前述实施方案中任一个的方法，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷包括莱苞迪苷m、莱苞迪苷d或莱苞迪苷m和莱苞迪苷d两者。26.前述实施方案中任一个的方法，其中工程化酵母选自念珠菌属、克勒克酵母属(汉逊酵母属)、克鲁维酵母属、油脂酵母属、毕赤酵母属(汉森酵母属)、红酵母属、酵母菌、酵母属、裂殖酵母属、球拟酵母属、有孢圆酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属的种。27.实施方案26的方法，其中工程化酵母是酿酒酵母。28.前述实施方案中任一个的方法，其中工程化酵母表达编码一种或多种以下酵母异源蛋白质的一种或多种外源核酸：ggpps多肽、ent-柯巴基二磷酸合酶(cdps)多肽、贝壳杉烯氧化酶(ko)多肽、贝壳杉烯合酶(ks)多肽；甜菊醇合酶(kah)多肽、细胞色素p450还原酶(cpr)多肽、ugt74g1多肽、ugt76g1多肽、ugt91d2多肽和eugt11多肽29.前述实施方案中任一个的方法，其中工程化酵母表达编码一种或多种以下酵母异源蛋白质的一种或多种外源核酸：ggpps多肽、截短的玉米cdps多肽、拟南芥ks多肽、甜叶菊ko多肽、拟南芥atr2多肽、水稻eugt11多肽、srkahe1多肽、甜叶菊cpr8多肽、甜叶菊ugt85c2多肽、甜叶菊ugt74g1多肽、甜叶菊ugt76g1多肽、甜叶菊ugt91d2变体或功能同源物和ugt91d2e-b多肽。30.一种包含甜菊醇糖苷的发酵培养基，其根据前述实施方案中任一个的方法获得。31.一种甜菊醇糖苷组合物，其根据实施方案1-29中任一个的方法获得。32.实施方案1的方法，其中在步骤(a)期间，培养基中葡萄糖的浓度不大于5g/l。33.实施方案32的方法，其中在步骤(a)期间，培养基中葡萄糖的浓度不大于5g/l。34.实施方案1的方法，其中在步骤(b)期间，培养基中葡萄糖的浓度不大于5g/l。35.实施方案34的方法，其中在步骤(b)期间，培养基中葡萄糖的浓度不大于5g/l。还公开了使用同步糖化和发酵(ssf)产生甜菊醇糖苷的方法，以限制葡萄糖释放并使葡萄糖水平保持在低于刺激诸如酵母属的酵母发酵的那些水平。该方法通常使用聚合形式的糖(例如淀粉、糊精、纤维素、木聚糖)作为发酵底物。在一些实施方案中，碳源是多糖(例如多于10个单体、寡糖(例如少于10个单体)或其组合。由于酵母通常不能有效地消耗聚合物糖，因此可以添加酶以将聚合物分解成葡萄糖单体。正如名称ssf所暗示，糖分解成单体(即糖化)和单体发酵同时发生，且通常在同一反应容器中发生。在一个实施方案中，ssf可以使用淀粉和葡糖淀粉酶(ec3.2.1.3)。在其他实施方案中，使用纤维素水解产物和纤维素酶。其他实施方案包括异麦芽糖、麦芽糖、潘糖、麦芽三糖。实例显示了使用麦芽糖糊精(4-7个葡萄糖分子的葡萄糖链，sigma419699)和α-淀粉酶(产品编号和ec编号3.2.1.1)来产生ssf系统。尽管在工业乙醇生产中是常见的，但这种方法通常不用于产生酵母细胞团和生物质衍产生物。此外，在能够产生乙醇的酵母中所需的酶的剂量明显不同于在能够产生甜菊醇糖苷诸如rebd和rebm的酵母中的剂量。该过程可以通过添加酶或通过将葡糖淀粉酶工程化到能够产生甜菊醇糖苷的酵母中而进行。在一些实施方案中，可以提供纤维素水解产物和纤维素酶。糖化酶在lynd，l.r.等人(microbiol.mol.biol.rev.，66:506-577，2002)中进行了综述。可以使用至少一种酶，并且通常可以使用包含一种或多种糖苷酶的糖化聚生体(enzymeconsortium)。糖苷酶水解二糖、寡糖和多糖的醚键，并见于一般组的酶分类ec3.2.1.x(enzymenomenclature1992，academicpress，sandiego，ca与增刊1(1993)、增刊2(1994)、增刊3(1995、增刊4(1997)和增刊5[分别见于eur.j.biochem.，223:1-5，1994；eur.j.biochem.，232:1-6，1995；eur.j.biochem.，237:1-5，1996；eur.j.biochem.，250:1-6，1997和eur.j.biochem.，264:610-6501999])在一些实施方案中，所公开的ssf在特定的生长时间段内可以基本上不产生乙醇。在其他实施方案中，所公开的ssf在整个生长时间段内可以基本上不产生乙醇。在其他实施方案中，在特定的生长时间段内，由ssf过程产生的乙醇少于10g/l的乙醇。在其他实施方案中，在生长时间段中的任何点，ssf过程产生的乙醇均少于10g/l的乙醇。还公开了使用非发酵碳源(即，非葡萄糖碳源)产生甜菊醇糖苷的方法。非发酵碳源是不会触发或将减少反巴士德效应的来源。例如，如果酵母在较高的葡萄糖浓度下生长，即使在高度曝气的条件下，酵母也可从需氧代谢途径转变成产乙醇的厌氧代谢。如果目的是产生大量的酵母细胞来产生期望的产物，则当繁殖酵母时这种转变通常是不可取的。即使在高曝气条件下，如果繁殖培养基中的葡萄糖浓度超过例如约5g/l，酵母(例如酿酒酵母)有时也会开始制造乙醇(发酵途径)。这称为“反巴士德”效应(因高葡萄糖而抑制呼吸)。当没有足够的氧气存在时，代谢也可能转变成发酵途径。为了帮助避免或减少反巴士德效应，酵母供应商常常使酵母(例如酿酒酵母)在充分曝气的酵母繁殖罐中生长，同时严格监测葡萄糖补料(通常，将糖蜜原料用于分批补料过程)以帮助确保葡萄糖水平保持足够低，以使得保持需氧代谢。示例性非发酵碳源包括海藻糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、甘油和棉子糖及其组合。在一些实施方案中，非发酵碳源上的生长增加甜菊醇糖苷的细胞外释放。在其他实施方案中，海藻糖碳源上的生长增加甜菊醇糖苷的细胞外释放。实施例1在两阶段补料过程中产生rebd和rebm对于接种物制备，将酵母菌株efsc4240在1升摇瓶中的150ml种子摇瓶培养基中在250rpm和30℃下培养20-24小时。表1种子摇瓶培养基组分式浓度单位biospringer0251酵母提取物7.5g/l葡萄糖一水合物c6h12o6*h2o22.0g/l对于发酵，将75ml种子培养物转移到初始发酵培养基中，如表2所示，初始体积为0.75升(罐体水平的38.5％)。在2lnewbrunswickbioflo310发酵罐中进行分批补料发酵。用12％nh4oh将发酵控制在ph5.0，并且温度始终维持在30℃。在整个发酵过程中，空气流速为1.75slpm，搅拌速度为1200rpm。通过控制发酵补料培养基的流速将葡萄糖浓度保持为限制性的。两阶段补料策略包括以生长速率u＝0.12l/h或更高在12小时开始的初始指数期(补料阶段i)，而补料阶段ii在35-39小时的范围内以恒定流速开始。阶段ii补料包括在14.4至22.96g葡萄糖/l肉汤/h的范围内的恒定补料。继续补料直到递送了1.0升的发酵补料培养基。将消泡剂ivanhoe1163b以1.3g/l添加到补料培养基中，并根据需要进行5wt％消泡剂溶液的额外大剂量添加(bolusaddition)。该培养基基于verduyn等人(verduync，postmae，schefferswa和vandijkenjp.yeast.1992年7月；8(7)：501-17)，一些修改如表2和3中所述。表2初始发酵培养基组分式浓度单位葡萄糖-水合物c6h12o6*h2o22.0g/l硫酸铵(nh4)2so45.0g/l磷酸二氢钾kh2po43.0g/l七水硫酸镁mgso4*7h2o0.5g/l微量金属储备液10.0ml/l维生素储备液12.0ml/l微量金属储备溶液组分式浓度单位依地酸二钠c10h14n2na2o8*2h2o15g/l七水硫酸锌znso4*7h2o4.5g/l四水氯化拄(ii)mncl2*4h2o1.026g/l六水氯化钴(ii)cocl2*6h2o0.32g/l七水硫酸铜(ii)cu5o4*5h2o0.3g/l二水钼酸钠na2moo4*2h2o0.4g/l二水氯化钙cacl2*2h2o3g/l七水硫酸亚铁(ii)feso4*7h2o3g/l硼酸h3bo31g/l碘化钾ki0.1g/l维生素储备溶液组分式浓度单位d-生物素c10h16n2o3s50mg/l泛酸钙c18h32can2o101000mg/l烟酸c6h5no21000mg/l盐酸硫胺素c12h17cln4os·hcl1000mg/l盐酸吡哆醇c8h11no3·hcl1000mg/l对氨基苯甲酸c7h7no2200mg/l肌醇c6h12o625000mg/l表3发酵补料培养基组分式浓度单位葡萄糖-水合物c5h12o6*h2o660g/l消泡剂1.3g/l硫酸钾k2so44.2g/l硫酸钠na2so40.336g/l七水硫酸镁mgso4*7h2o6.12g/l磷酸二氢钾kh2po410.8g/l微量金属储备液14.4ml/l维生素储备液14.4ml/l表4在两阶段补料方案的两个阶段中增加的葡萄糖培养基补料速率实施例2使用不同碳源产生rebd和rebm使用表5中的配方制备基础培养基组合物。使用基础培养基进一步制备仅麦芽糖培养基、仅海藻糖培养基、仅葡萄糖培养基、仅半乳糖培养基、仅甘露糖培养基、仅甘油培养基以及仅棉子糖培养基。每种糖底物的浓度为100g/l。将每种培养基调节至ph5.6，并通过0.2um过滤器除菌过滤。每个250ml摇瓶使用20ml培养基。用koh或h2so4调节ph值。表5.用于种子摇瓶和生产摇瓶的基础培养基组合物*mes＝2-(n-吗啉代)乙磺酸微量金属储备溶液组分式浓度单位依地酸二钠c10h14n2na2o8*2h2o15g/l七水硫酸锌znso4*7h2o4.5g/l四水氯化锰(ii)mncl2*4h2o1.026g/l六水氯化钴(ii)cocl2*6h2o0.32g/l七水硫酸铜(ii)cuso4*5h2o0.3g/l二水钼酸钠na2moo4*2h2o0.4g/l二水氯化钙cacl2*2h2o3g/l七水硫酸亚铁(ii)feso4*7h2o3g/l硼酸h3bo31g/l碘化钾ki0.1g/l维生素储备溶液组分式浓度单位d-生物素c10h16n2o3s50mg/l泛酸钙c18h32can2o101000mg/l烟酸c6h5no21000mg/l盐酸硫胺素c12h17cln4os·hcl1000mg/l盐酸吡哆醇c8h11no3·hcl1000mg/l对氨基苯甲酸c7h7no2200mg/l肌醇c6h12o625000mg/l表6用于生产摇瓶的碳源(各100g/l)海藻糖麦芽糖半乳糖甘露糖甘油棉子糖葡萄糖如实施例1中所用的酵母培养物(4240)从甘油储备培养物(20％v/v甘油)开始。将该储备液用于接种含有上述仅葡萄糖培养基的摇瓶。孵育在30℃、250rpm下进行，其中250ml摇瓶中具有50ml培养基。24小时后，该种子摇瓶达到2g/l的细胞密度，且残留有葡萄糖。将该培养物在离心机(4000rpm，5分钟)中离心以沉淀细胞。滗析出肉汤，将细胞用无菌butterfields磷酸盐缓冲液(ph7.2)洗涤一次，重复离心和滗析以移除残留的葡萄糖。在无菌butterfields磷酸盐缓冲液(ph7.2)中将细胞悬浮至4g/l的细胞密度。使用1ml该细胞悬液接种生产摇瓶(5％接种物)。将生产摇瓶在加湿到80％的摇床中在30℃、250rpm下孵育。当在培养物中达到至少为10的od600(genesys20spec)时，收获摇瓶以进行rebd和rebm分析。使用为本说明书确定的已知的od至细胞干重转换因子，这相当于约7.5g/l细胞。如果在120小时内未达到该od，则在120h时停止摇瓶并在此时进行分析。表7在各种碳源上的rebd和rebm以及细胞产生表7显示了归一化的rebd和rebm产量和速率。归一化产量通过将实验条件下的rebd和rebm除以100g/l的葡萄糖条件来计算。这些数据表明，在rebd和rebm的产生中，含有乙醇限制性底物(即在这些实施例中甘露糖、棉子糖、麦芽糖、半乳糖、海藻糖或甘油)的葡萄糖限制性培养基比葡萄糖表现更好。甘露糖、棉子糖、半乳糖和海藻糖的体积产量最高。甘露糖、棉子糖、海藻糖和甘油的比产量最高。甘露糖、棉子糖和海藻糖特别令人印象深刻，比产生速率(分别)是葡萄糖的5、7.2和9.6倍。实施例3使用不同碳源产生rebd和rebm如在先前的实施例中那样，使用表5中的配方制备基础培养基组合物。使用该基础培养基进一步制备仅葡萄糖培养基、仅麦芽糖培养基、仅果糖培养基、仅棉子糖培养基、仅半乳糖培养基和仅甘露糖培养基。每种糖底物的浓度为100g/l。将每种培养基调节至ph5.6，并通过0.2um过滤器除菌过滤。每个250ml摇瓶使用20ml培养基。用koh或h2so4调节ph值。不同的产甜菊醇的酿酒酵母(4466)的酵母培养物从甘油储备培养物(20％v/v甘油)开始。将该储备液用于接种含有上述仅葡萄糖培养基的摇瓶。孵育在30℃、250rpm下进行，其中250ml摇瓶中具有50ml培养基。24小时后，该种子摇瓶达到1g/l的细胞密度，且残留有葡萄糖。将该培养物在离心机(4000rpm，5分钟)中离心以沉淀细胞。滗析出肉汤，将细胞用无菌butterfields磷酸盐缓冲液(ph7.2)洗涤一次，重复离心和滗析以移除残留的葡萄糖。在无菌butterfields磷酸盐缓冲液(ph7.2)中将细胞悬浮至4g/l的细胞密度。使用0.5ml该细胞悬液接种生产摇瓶(2.5％接种物)。将生产摇瓶在加湿到80％的摇床中在30℃、250rpm下孵育。在118h时收获摇瓶用于rebd和rebm。还在118h时测量了od600(genesys20spec)。使用已知的od至细胞干重转换因子，每个od单位转化为0.75g/l细胞。对全细胞肉汤、无细胞上清液和经洗涤的细胞进行rebd和rebm分析。对于无细胞样品，将100ul全肉汤与1.4ml纯化水混合，并在微量离心机中以10,000rpm离心3分钟。在分析前重复该洗涤3次。将所得的经洗涤的细胞用于经洗涤的细胞分析。将来自第一次离心的上清液用于无细胞上清液的分析，其作为细胞外分析在下文列出。表3-1示出了全肉汤、细胞外无细胞上清液和经洗涤的细胞沉淀物中rebd、rebm的含量以及rebd和rebm之和(下文中的“rebd+m)，单位g/l。该数据是每个条件的平行摇瓶的平均值。通过将g/l细胞外除以g/l全肉汤来计算细胞外％。表3-2示出了以mg/l/h表示的归一化rebd和rebm产量，而表3-3示出了以mg/g/h表示的归一化rebd和rebm产量。表3-1在118h时在各种碳源上的细胞内、细胞外和全肉汤rebdm产量表3-2在118h时在各种碳源上的细胞内、细胞外和全肉汤rebdm生产率表3-3在118h时在各种碳源上的细胞内、细胞外和全肉汤rebdm比生产率与表7中所示的结果一致，在甘露糖、棉子糖和半乳糖上，rebd和rebm的总产量最高。棉子糖在产量上令人惊讶，rebd和rebm的总产量是葡萄糖的10倍以上。这证实甚至超过了表7中所示的棉子糖8.1的极高归一化产量。甘露糖也令人印象深刻，rebd和rebm的总产量是葡萄糖的2.5倍以上。细胞外rebd和rebm的百分比在麦芽糖、棉子糖和甘露糖底物上显著增加；棉子糖和甘露糖均具有超过60％的总细胞外rebd和rebm。在商业上，纯化细胞外甜菊醇糖苷明显更容易，而不是裂解细胞并且不得不从所有其他细胞内组分中分离甜菊醇糖苷。生产商可以选择将细胞内甜菊醇糖苷留在细胞中，以明显更低的利润作为补料组分来销售生物质。因此，将rebd加rebm的百分比从葡萄糖的46.9％提高到棉子糖的61.3％和甘露糖的63.9％，使棉子糖的有效收率提高30％(61.3/46.9)以上，甘露糖的有效收率提高36％(63.9/46.9)以上。这与棉子糖和甘露糖的更高总产量相结合，导致棉子糖的细胞外rebd+rebm产量是葡萄糖的14倍，且甘露糖的细胞外rebd+rebm产量是葡萄糖的3.4倍。实施例4利用同步糖化和发酵产生rebd和rebm使用表8中的配方与来自表5的微量元素和维生素制备培养基。麦芽糖糊精需要对培养基温和加热以获得增溶(60℃)。将冷却至室温的培养基调节至ph5.6，在培养基冷却后进行维生素和微量元素添加，然后通过0.2um过滤器除菌过滤。每个250ml摇瓶使用20ml培养基。用koh或h2so4调节ph值。酵母培养物(4240)酵母从甘油储备培养物(20％v/v甘油)开始。将该储备液用于接种容纳含有20g/l右旋糖的表5所述的培养基的摇瓶。孵育在30℃、250rpm下进行，其中250ml摇瓶中具有20ml培养基。24小时后，该种子摇瓶达到2g/l的细胞密度，且残留有葡萄糖。将1ml该细胞悬液用于接种生产摇瓶(5％接种物)。紧临接种之前，将α-淀粉酶以表9中详述的剂量添加到培养基中。将具有接种物的摇瓶在加湿至80％的摇床中在30℃、250rpm下孵育。在120h时收获具有培养物的摇瓶以用于rebd和rebm分析。通过将实验样品中的rebd和rebm除以具有200g/l右旋糖(g当量糖)的未添加酶的样品来计算归一化产量。这些数据显示，与只使用葡萄糖相比，使用ssf过程的rebd和rebm的产量高6-13倍。表8用于种子和生产摇瓶ssf的培养基组合物组分浓度[g/l]nh4so45.0尿素30kh2po415mgso4*7h2o2.5葡萄糖一水合物11微量金属储备液10维生素储备液12麦芽糖糊精200g/lmes*38.2去离子水达到1l最终容积*mes＝2-(n-吗啉代)乙磺酸表9.rebd和rebm产量对比酶剂量的归一化实施例5培养基：每个摇瓶含有2％酵母提取物和2％碳源、1x微量矿物质和1x盐。用naoh将培养基的ph调节至5.1，并在121℃下高压灭菌30分钟。种子摇瓶：将1小瓶甘油储备液用于接种含有100ml葡萄糖培养基的500ml带挡板的摇瓶。在剧烈混合(250rpm)下使摇瓶在30℃下生长24小时。使用10ml种子培养物接种容纳50ml含有各种碳水化合物的基础培养基的300ml带挡板摇瓶。在转移到生产摇瓶之前，种子培养物具有以下特征：600nm处的o.d.＝27.2，0g/l葡萄糖、9g/l乙醇、2.4g/l甘油和0.25g/l乙酸盐。生产摇瓶：每个条件都一式两份地运行。将生产摇瓶在设定为250rpm的30℃培养摇床中孵育。在24小时、46小时和110小时后取出5ml样品。在用去离子水按1:200稀释肉汤之后，通过600nm处的光密度来估计细胞密度。肉汤通过0.45um过滤器过滤并用于hplc分析。将肉汤与等量的80％v/vdmso混合然后在密封的玻璃小瓶中在80℃加热30分钟后，测定总甜菊醇糖苷。在hplc分析前，用0.45um过滤器过滤掉细胞碎片。使用octopusuplc方法测量总的或细胞外的甜菊醇糖苷浓度。细胞在葡萄糖和果糖培养基中生长良好，但在甘油和海藻糖培养基中生长较差。在110小时结束时，细胞完全消耗了海藻糖，而甘油则没有完全消耗。由于有大量的蒸发，所以不清楚使用了多少甘油。对于葡萄糖和果糖处理而言，摇瓶的光密度在24小时内达到约65-70nm。o.d.的随后增加最有可能是因蒸发所致。可以合理地假设，海藻糖处理也在结束时达到类似的o.d。在任何时间点的任何摇瓶中都没有可测定量的乙醇。所发现的主要代谢产物为～0.3g/l的琥珀酸盐和～0.2g/l的甘油。测定所有三个时间点的rebd、rebm和reba总浓度，结果如下所示。对于甘油和海藻糖样品，在肉汤中具有相似浓度的rebd和rebm以及浓度低得多的reba。然而，在葡萄糖和果糖样品中，rebm浓度最高，其次是reba，然后是rebd。只在最后一个样品点测定了细胞外甜菊醇糖苷浓度，并且细胞外和总甜菊醇糖苷的比率在下面列出。值得注意的是，根据本发明的优选方面的海藻糖处理(即，使用采用乙醇限制性底物的葡萄糖限制性培养基的那些处理)显示出与其他处理(～20％)相比最高的甜菊醇糖苷分泌量(～50％)。为了考虑到变化的蒸发水平，将总甜菊醇糖苷的浓度针对细胞密度(o.d.)归一化并示于下表中。与在葡萄糖和果糖上生长的细胞相比，甘油和海藻糖生长的细胞具有高得多的单位细胞生产率，并且该生产率在整个时间过程中持续增加。当前第1页12