一种复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂的制作方法

本发明涉及高等真菌的生物发酵和保健食品加工，主要涉及黑脉羊肚菌菌丝体多糖和尖顶羊肚菌多糖复方颗粒剂，属于食品与保健食品领域。

背景技术：

动物、植物和真菌中的多糖往往具有某些特殊功能，是现代功能食品研究的一个重要领域。其中，真菌多糖的功效尤其显著，例如众所周知的香菇多糖。真菌多糖的来源一个是有子实体提取，这会消耗大量的食用菌，另一个较好的方法是由菌丝体提取，这样较为经济高效，但不是每一种食用菌都能够培养其菌丝体。

羊肚菌是一种野生名贵食药用真菌，营养丰富，富含蛋白质、多糖、维生素、氨基酸和多种矿物质以及丰富的脂肪酸，风味鲜美，深受人们的喜爱。有研究报道，羊肚菌有降血脂、调节免疫、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤等作用。由于受羊肚菌栽培技术的限制，羊肚菌野生资源有限，使得羊肚菌价格居高不下。有研究表明，液体发酵培养的羊肚菌菌丝体营养成分与子实体相似，于是，可以通过液体发酵大规模生产菌丝体做成不同羊肚菌产品来满足人们对羊肚菌保健功效的渴求。

羊肚菌多糖具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、增强机体功能等生物活性，因此，从羊肚菌中提取多糖受到学者们关注。常规方法是以溶剂提取多糖居多，该法提取的多糖会有溶剂残留现象，从而影响多糖质量与食用安全。

颗粒剂是一种产品的物理形态，一些食品、保健食品和药品的生产常常采用颗粒剂的表现形式。在生产技术上，通常将各种物料混合，拌合成半干物料，加入到摇摆式挤压造粒机中挤压造粒，再将湿颗粒干燥而成。该方法所得产品颗粒紧密，加水溶解时较为难溶，原料中含有多糖或蛋白质等大分子胶体物质时更难溶解。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷而提供一种能够大规模地进行工业化生产，并且能够以较低成本生产出效用较高的羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂；本发明研究发现利用液体发酵技术培养的黑肚羊肚菌和尖顶羊肚菌菌丝体均生长旺盛，产量高，若将两种羊肚菌多糖进行组合配比可以更好地发挥两者菌多糖的生理活性。用胶体磨匀浆方法来提高菌丝体多糖的溶出率，解决了溶剂提取多糖溶剂残留问题，同时，充分利用菌丝体中其他的营养成分，生产营养丰富的颗粒剂；在生产技术上，利用真空对浆料实现拉比容操作，所得颗粒内部产生许多孔隙，比容减小，溶解时有利于水分快速渗透以促进溶解，方便食用。

本发明复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂由以下重量份的组成物制得：黑脉羊肚菌多糖液2-5份、尖顶羊肚菌多糖液3-6份、糊精3-5份、低聚果糖2-4份；在生产技术上，利用真空对浆料进行拉比容操作干燥，所得颗粒内部产生许多孔隙，比容减小，溶解时有利于水分快速渗透以促进溶解，方便食用。

其中黑脉羊肚菌多糖液和尖顶羊肚菌多糖液通过将黑脉羊肚菌菌种和尖顶羊肚菌菌种分别活化，经液体深层发酵得菌丝体；菌丝体经洗涤、胶体磨匀浆而制得。

本发明是通过以下步骤实现的：

（1）配制液体深层发酵培养基：麦麸30g/l-50g/l、可溶性淀粉15g/l-25g/l、黄豆粉8g/l-12g/l、蔗糖8g/l-12g/l，其中麦麸用一定量的蒸馏水熬煮，过滤得麦麸汁，在麦麸汁中加入可溶性淀粉、黄豆粉、蔗糖，混合，补足水量，搅拌均匀，分装，250ml锥形瓶装液量160ml，121℃灭菌30min；

（2）菌种活化：将保藏的黑脉羊肚菌菌种和尖顶羊肚菌菌种分别接种于pda培养基，25℃恒温培养箱中培养3-5d，备用；

（3）发酵培养：将活化后的菌种接种于液体深层发酵培养基中，在发酵温度21℃-29℃、发酵转速150r/min-180r/min下培养4d-12d；

（4）发酵液处理：取步骤（3）得到的发酵液，用两层纱布过滤，菌丝体用蒸馏水反复洗涤3-5次，菌丝体用胶体磨匀浆，得菌丝体浆，即为黑脉羊肚菌多糖液和尖顶羊肚菌多糖液；

（5）羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂的制备：按重量份计，取黑脉羊肚菌多糖液2-5份、尖顶羊肚菌多糖液3-6份、糊精3-5份、低聚果糖2-4份，混合得浆料，将浆料混匀并加热至80-90℃保持3-5分钟杀菌，冷却至常温，充分搅拌混入空气，装盘，放入真空干燥箱中于55-65℃抽真空4-6分钟，使其产生气泡并蒸发部分水分，提高浆料粘度，解除真空，再次对浆料进行搅拌混入空气，然后放入干燥箱中于55-65℃进行真空干燥，浆料再次膨胀形成内部多孔结构并完成干燥，干燥后粉碎、包装，即得复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂产品。

本发明中黑脉羊肚菌菌种和尖顶羊肚菌菌种为常规市售菌种。

本发明的有益效果是：

（1）采用本发明方法，使羊肚菌菌丝体多糖产品可以工业化生产，开发和提升了羊肚菌菌丝体的利用价值；

（2）采用胶体磨匀浆，菌丝体细胞内多糖充分释放出来，生物学功效更显著；

（3）本发明的研究表明，尖顶羊肚菌和黑脉羊肚菌的菌丝体人工培养生物量（产量）高于其他种的羊肚菌，因此具有工业化开发价值；

（4）将两种羊肚菌组合，使得多糖产品中多糖成分更多，含量更高，功效更好；本发明的研究证明：尖顶羊肚菌菌丝体中含有不同分子量的多糖，采用凝胶过滤法测定其中含量较高的两种纯多糖pa-1和pa-2的分子量，pa-1分子量为24.38kd、pa-2分子量为87.03kd；黑麦羊肚菌菌丝体中分离出含量较高的两种多糖pb-1和pb-2，采用凝胶过滤法测定pb-1分子量为13.00kd、pb-2分子量为39.54kd；同时进一步测定了pa-1和pa-2、pb-1和pb-2四种纯多糖的单糖组成；测定结果表明：pa-1中含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木聚糖、阿拉伯糖、岩藻糖等6种单糖，pa-2含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖等7种单糖，pb-1和pb-2都含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖这五种单糖；

（5）多糖产品中，不但含有多种成分的羊肚菌多糖，还含有蛋白质和氨基酸等营养成分，是一种具有保健功能的营养食品；

（6）利用真空对浆料进行拉比容操作，所得颗粒内部产生许多孔隙，比容减小，溶解时有利于水分快速渗透以促进溶解，方便食用；

本发明复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂产品，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳等生物活性；因含有蛋白质、氨基酸等其他物质，丰富了颗粒剂的营养，是一种营养保健食品。

附图说明

图1是尖顶羊肚菌中多糖pa-1的hplc测定图谱；

图2是尖顶羊肚菌中多糖pa-2的hplc测定图谱；

图3是黑脉羊肚菌中多糖pb-1的hplc测定图谱；

图4是黑脉羊肚菌中多糖pb-2的hplc测定图谱。

具体实施方式

下面给出本发明具体的实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于所述内容。

实施例1：本复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂由以下组成物制得：黑脉羊肚菌多糖液2g、尖顶羊肚菌多糖液3g、糊精3g、低聚果糖2g。

（1）配制液体深层发酵培养基：麦麸30g、可溶性淀粉15g，黄豆粉8g、蔗糖8g；其中30g麦麸用500ml的蒸馏水熬煮，过滤得麦麸汁，在麦麸汁中加入可溶性淀粉、黄豆粉、蔗糖，混合，补足水量至1000ml，搅拌均匀，分装，250ml锥形瓶装液量160ml，121℃灭菌30min；

（2）菌种活化：将保藏的黑脉羊肚菌菌种和尖顶羊肚菌菌种分别接种于pda培养基，25℃恒温培养箱中培养3d，备用；

（3）发酵培养：将活化后的两个菌种分别接种于液体深层发酵培养基中，其中黑脉羊肚菌的发酵条件为：发酵温度23℃，发酵转速160r/min，培养8d，ph7；尖顶羊肚菌的发酵条件为：发酵温度23℃，发酵转速180r/min，培养12d，ph9；

（4）发酵液处理：取步骤(3)得到的发酵液，用两层纱布过滤，菌丝体用蒸馏水反复洗涤3次，菌丝体用胶体磨匀浆，得菌丝体多糖液；

（5）复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂的制备：取黑脉羊肚菌多糖液2g、尖顶羊肚菌多糖液3g、糊精3g、低聚果糖2g，混合均匀并加热至80℃保持3分钟杀菌，冷却至常温，充分搅拌混入空气，装盘，放入真空干燥箱中于60℃抽真空5分钟，使其产生气泡并蒸发部分水分，提高料浆粘度，解除真空，再次对浆料进行搅拌混入空气，然后放入干燥箱中于60℃进行真空干燥，料浆再次膨胀形成内部多孔结构并完成干燥，干燥后粉碎、包装即得复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂产品。经测定，每100g该产品含有的多糖量为227mg。

实施例2：本复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂由以下组成物制得：黑脉羊肚菌多糖液5g、尖顶羊肚菌多糖液4g、糊精5g、低聚果糖3g。

（1）配制液体深层发酵培养基：麦麸40g，可溶性淀粉20g，黄豆粉10g，蔗糖10g；其中称量后的40g麦麸用500ml蒸馏水熬煮，过滤得麦麸汁，在麦麸汁中加入可溶性淀粉、黄豆粉、蔗糖，混合，补足水量至1000ml，搅拌均匀，分装，250ml锥形瓶装液量160ml，121℃灭菌30min；

（2）菌种活化：将保藏的黑脉羊肚菌菌种和尖顶羊肚菌菌种分别接种于pda培养基，25℃恒温培养箱中培养4d，备用；

（3）发酵培养：将活化后的菌种接种于液体深层发酵培养基中，其中黑脉羊肚菌的发酵条件为：发酵温度27℃，发酵转速180r/min，培养8d，ph9；尖顶羊肚菌的发酵条件为：发酵温度23℃，发酵转速180r/min，培养10d，ph8；

（4）发酵液处理：取步骤(3)得到的发酵液，用两层纱布过滤，菌丝体用蒸馏水反复洗涤4次，菌丝体用胶体磨匀浆，得菌丝体多糖液；

（5）复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂的制备：按重量计，取黑脉羊肚菌多糖液4g、尖顶羊肚菌多糖液4g、糊精5g、低聚果糖3g，混合均匀并加热至85℃保持4分钟杀菌，冷却至常温，充分搅拌混入空气，装盘，放入真空干燥箱中于55℃抽真空4分钟，使其产生气泡并蒸发部分水分，提高料浆粘度，解除真空，再次对浆料进行搅拌混入空气，然后放入干燥箱中于55℃进行真空干燥，料浆再次膨胀形成内部多孔结构并完成干燥，干燥后粉碎、包装即得复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂产品。经测定，每100g该产品含有的多糖量为192mg。

实施例3：本复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂由以下组成物制得：黑脉羊肚菌多糖液3g、尖顶羊肚菌多糖液6g、糊精4g、低聚果糖4g。

（1）配制液体深层发酵培养基：麦麸50g、可溶性淀粉25g、黄豆粉12g、蔗糖12g；称量后的麦麸用500ml的蒸馏水熬煮，过滤得麦麸汁，在麦麸汁中加入可溶性淀粉、黄豆粉、蔗糖，混合，补足水量至1000ml，搅拌均匀，分装，250ml锥形瓶装液量160ml，121℃灭菌30min；

（2）菌种活化：将保藏的黑脉羊肚菌菌种和尖顶羊肚菌菌种分别接种于pda培养基，25℃恒温培养箱中培养5d，备用；

（3）发酵培养：将活化后的菌种接种于液体深层发酵培养基中，其中黑脉羊肚菌的发酵条件为：发酵温度23℃，发酵转速180r/min，培养10d，ph8；尖顶羊肚菌的发酵条件为：发酵温度25℃，发酵转速160r/min，培养8d，ph8；

（4）发酵液处理：取步骤(3)得到的发酵液，用两层纱布过滤，菌丝体用蒸馏水反复洗涤5次，菌丝体用胶体磨匀浆，得菌丝体多糖液；

（5）复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂的制备：按重量计，取黑脉羊肚菌多糖液3g、尖顶羊肚菌多糖液6g、糊精4g、低聚果糖4g，混合均匀并加热至90℃保持5分钟杀菌，冷却至常温，充分搅拌混入空气，装盘，放入真空干燥箱中于65℃抽真空6分钟，使其产生气泡并蒸发部分水分，提高料浆粘度，解除真空，再次对浆料进行搅拌混入空气，然后放入干燥箱中于65℃进行真空干燥，料浆再次膨胀形成内部多孔结构并完成干燥，干燥后粉碎、包装即得复方羊肚菌菌丝体多糖颗粒剂产品。经测定，每100g该产品含有的多糖量为208mg。

上述实施例中羊肚菌多糖的单糖组成测定方法及结果：

1、测定方法

单糖标品的衍生（pmp衍生法）：分别称取10mg单糖标品，溶于5ml纯净水中，分别稀释10倍，向其中加入1ml0.5mol/lpmp剂（1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮）、1ml0.3mol/lnaoh溶液，于70℃烘箱中衍生30min，冷却至室温，加入1ml0.3mol/lhcl溶液中和。然后，分别加入3ml三氯甲烷振摇，静置，弃去氯仿相，再加入同体积的三氯甲烷反复萃取三次至上层水相无色，将水相用0.45μm有机滤膜过滤后，供hplc进样分析。

样品的衍生（pmp衍生法）：分别精确称取纯化后的多糖10mg于安培瓶中，加入2mol/l的三氟乙酸2ml，混匀后用酒精喷灯封管，在110℃烘箱中水解4h，取出后冷却，用0.3mol/lnaoh溶液调ph至中性，定容至10ml，在5000r/min离心10min，分别取1ml上清液加入0.5mol/lpmp剂（1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮）和0.3mol/lhcl各1ml中和。然后，分别加入3ml三氯甲烷振摇，静置，弃去氯仿相，再加入同体积的三氯甲烷反复萃取三次至上层水相无色，将水相用0.45μm有机滤膜过滤后，供hplc进样分析。

色谱条件：流动相，溶剂a（15%乙腈+85%磷酸缓冲液（0.05mol/l的kh2po4-naoh，ph6.9）），溶剂b（40%乙腈+60%磷酸缓冲液（0.05mol/l的kh2po4-naoh，ph6.9））；色谱柱，sephaxc18-h；梯度模式，0→35min，相应浓度梯度为0%→40%的溶剂b；流速，1ml/min；检测波长，250nm；进样量，20µl；柱温，25℃。

检测结果见图1、2、3、4；图1中表明pa-1的单糖组成为甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木聚糖、阿拉伯糖、岩藻糖，其组成比例为12.59:103.69:13.58:12.41:10:137.76；图2中pa-2的单糖组成为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖，其组成比例为55:10:19.6:44.7:18.2:34.2:25.3；图3中pb-1含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖这五种单糖，其摩尔比为0.80:0.20:1.36:0.21:1.00；图4中pb-2含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖这五种单糖，其摩尔比为1.61:0.45:1.00:0.43:1.16。