专利名称：富含糖苷配基异黄酮植物蛋白浓缩物及其制备方法
此发明涉及糖苷配基异黄酮富含植物蛋白浓缩物的生产。通过洗涤植物蛋白物质产生植物蛋白浓缩物，利用一种或几种β-葡糖苷酶大多数葡糖苷配基异黄酮转化成可保留在富含蛋白浓缩物中的糖苷配基异黄酮。此项专利申请是1993.10.12提交的美国专利申请序号No.08/135,194，的部分继续申请。
异黄酮存在于包括植物蛋白物质例如大豆的各种豆科植物中，这些化合物包括黄豆苷，6″-OAc黄豆苷，6″-OMal黄豆苷，黄豆苷原，染料木苷，6″-OAc染料木苷，6″-OMal染料木苷，染料木苷原，大豆异黄酮，6″-OAc大豆异黄酮，6″-OMal大豆异黄酮，大豆异黄酮原，鹰嘴豆芽素A7-羟基-4’-甲氧异黄酮和拟雌内酯。通常上述化合物天然存在于苦味的大豆，及商业产品的生产过程中(如分离或浓缩)。问题焦点是除去这些物质。例如在传统的制备大豆蛋白分离方法中，豆片在碱性水溶液介质中被萃取，大部分异黄酮溶于萃取液，而其余溶于乳清中，乳清经蛋白酸沉淀形成分离体。留在于酸性蛋白沉淀分离体中的残余异黄酮经彻底冲洗而分离。
近期发现在植物蛋白(如大豆)中的异黄酮可抑制人体癌细胞的生长，例如胸腺及前列腺的癌细胞，其记载在如下文献中＂Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells，Independencefrom Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene＂ by Peterson andBarnes，Biochemical and Biophysical Research. Communications，Vol.179，No.1，pp. 661-667，August 30.1991；＂Genistein and Biochanin A Inhibit theGrowth of Human Prostate Cancer Cells but not Epidermal Growth FactorReceptor Tvrosine Auto-phosphorylation＂ bv Peterson and Barnes，The Prostate，Vol.22，pp.335-345(1993)；and ＂Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Modelsof Breast Cancer＂ by Barnes，et al. Mutagens and Carcinogens in the Diet，pp.239-253(1990).
上述异黄酮是以在下式7位上连带有葡萄糖分子的葡糖苷或葡糖苷配基形式存在的。一些葡糖苷配基，如6″-OAc染料木苷含一个与葡萄糖分子六位相连的乙酸酯基。而包括葡糖苷所有异黄酮苷令人感觉趣之处是其医药价值，最有价值的异黄酮是不带葡萄糖分子的糖苷配基。这些异黄酮的水溶性与葡糖苷配基或葡糖苷不同。从分类上看这些异黄酮是黄豆苷原，染料木苷原，大豆异黄酮原。这些糖苷配基具有如下通式 其中R1，R2，R3和R4选自H，OH和OCH3。因此本发明涉及的是含有这些物质的糖苷配基物和植物蛋白浓缩物。
在本领域中已有许多将葡糖苷配基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮的方法，例如日本专利申请258,669，Obata et al中记载的。该方法仅能达到中等转化，因而不十分理想，特别是在大规模商业生产中。另外，许多已知方法(如669中请)只讲到了如何从蛋白物质中除去异黄酮类物质，而未描述如何制备糖苷配基异黄酮富含蛋白浓缩物。因此需要一种方法使绝大多数葡糖苷配基异黄酮并优选实质上将所有葡糖苷配基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮，并生产一糖苷配基异黄酮富含植物蛋白浓缩物。
因此发明的目的在于提供一种糖苷配基异黄酮富含植物蛋白浓缩物及其生产过程。本发明其它的目的如下详述。
本发明提供了一种富含糖苷配基异黄酮植物蛋白浓缩物及其生产方法。该方法包括用在植物蛋白等电位点的PH水溶液中洗涤含有葡糖苷配基的植物蛋白物质，从而产生植物蛋白浓缩物。该浓缩物与足够量的一种或多种β-葡糖苷酶，在足够的时间、温度、PH值下反应，使浓缩物中的至少大部分葡糖苷配糖基转化为糖苷配基异黄酮，从而产生一种富含糖苷配基异黄酮蛋白浓缩物。本发明也提供了生产该浓缩物的方法，其中在洗涤或浓缩中补加β-葡糖苷酶。所得富含糖苷配基浓缩物然后可分离并脱水。另外，本发明也提供了以相对高的比例从植物蛋白物质回收蛋白浓缩物中异黄酮类物质的方法。
虽然本发明是针对大豆产品且方法具体适用于生产富含糖苷配基异黄酮浓缩大豆物料，但是对于含有异黄酮的各类植物蛋白资源都可利用此方法。例如适宜的蛋白材料是豆类物质，大豆物质或含大豆的植物蛋白物质。术语“大豆物质”在这里指大豆类及大豆类衍生物。
按优选具体实施的浓缩物，起始物是大豆片，其油已通过萃取去掉。豆蛋白浓缩物典型是用PH44至46这一蛋白等电位点的水溶性溶剂洗涤大豆片而制备的。一种可食酸加入水中提供豆蛋白物质的等电位洗涤。等电位洗涤去除了大量溶于水的碳水化合物及其它成份，但不去除蛋白质，由此得到了蛋白浓缩物，其通常是干品重量时的60-75％。在植物蛋白或豆类物质中的葡糖苷异黄酮通过等电位洗涤而去除。但在PH值相对较低时，所除去的量少于高PH值萃取时的量。因此从优选实施方案和最大限度回收异黄酮目的出发，优选等电点洗涤限定在一步或最多加一步额外洗涤。还优选洗涤蛋白物质的水性溶剂与蛋白物质的重量比大约是5∶1至10∶1。
所得浓缩物以约10-约15重量％的固体浓度悬浮于水中，然后与一种或多种β-葡糖苷酶反应，使浓缩物中至少大部分并优选实质上全部葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮。β-葡糖苷酶的最佳PH值范围依赖于具体使用的β-葡糖苷酶，通常为4至8这间。萃取时的PH一般被调节到这样的PH范围，即在与酶反应前，所用的具体酶活性最大。该PH一般通过加可食用酸来调节，如醋酸、硫酸、磷酸，盐酸或任何其它适用的试剂。
β-葡糖苷酶可天然存在于大豆类物质或微生物生长过程中，这里称为“残留”酶，或被加到浓缩物之中。加入的酶，在这指“补充酶”。一般情况下如果浓缩物中“残留”酶的量不足以使异黄酮的葡糖苷配糖基转化成糖苷配基。则应加入补充酶。异黄酮转化所需酶的量是由多种因素决定的，其包括酶的种类、酶浓度分布、PH值系统及酶的活性。只要足够浓度的酶存在，无论是“残留酶”还是“补充酶”或二者兼有，浓缩物在足够时间、温度及PH条件下与β-葡糖苷酶反应都可使大多数并优选实质上全部葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮。
较好的“补充酶”(β-葡糖苷酶类)包括生物果胶酶00L和300L，生物果胶酶OK70L，乳糖酶F，Lactozyme。乳糖酶F可由Amano Intemational Enzyme Co.，Inc，P.O.Box1000，Troy，UA 22974提供，其最佳的PH范围为4-6；内酯酶(Lctozyme)苛由Novo Industries，Enzyme division，NovoAlle，DK-2880 Bagsvaerd.，Denmart提供，其最佳的PH为7左右。生物果胶酶100L和300L以及OK70L可由Quest InternationalSarasota Florda提供。补充酶的足量加入可使大部分并优选实质上全部葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷异黄酮。因此加入“补充酶”是十分必要的，其加入量应为干品蛋白浓缩物重量的0.5％至5％。
另一类可作为“补充酶”的是酯酶，这些酯酶适于这里所述的优选实施方法，它通过从异黄酮共轭体中除去乙酸酯基和丙二酸酯基团使乙酸酯和丙二酸酯的共轭体转变为葡糖苷配糖基异黄酮。大多数优选具体实施方案中，使用这两种酶，即β-葡糖苷酶和酯酶。
较好的具体方法是一步法并具有非常高的转化率(从葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮)，且用时短并操作容易，经济易行。术语“一步”在此表示在反应过程中的参数保持不变，这些参数包括PH值和温度。
非常高的转化率是指蛋白浓缩物中至少大部分并优选实质上全部的葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮。术语“大部分”指转化率至少为50％，术语“实质上全部”指至少为80％，最好的指至少90％。
虽然不洗涤可能受到特殊理论的束缚，但它确实表明这里所述的令人惊奇且出人意料的高转化率来自一步反应过程中所用的参数组合。优选反应系统的PH值保持稳定且大约从4至8。最优选的PH值是在一步法中，与异黄酮共轭体反应前，酶最具活性时PH值。优选在一步法中反应系统的温度保持稳定，大约从40度到60度，最佳温度为60度。一般通过一步法将实质上所有葡糖苷配基异黄酮转成糖苷配基物所需的反应时间大约从2小时到24小时。
提供富含糖苷配基浓缩物的另一替代步骤是将等电点洗涤和与β-葡糖苷酶的反应结合到单一步骤中，其中豆类起始物质悬浮于等电点洗涤液中，并将在该等电点具有最佳PH的一种或几种β-葡糖苷酶如乳糖酶下直接加入到浆液中。然后反应按上述反应条件进行，从而将至少大部分和优选实质上全部葡糖苷配基异黄酮转化为糖苷配基物。这一步骤代表了优选且简单的方法，并不必首先在等电点洗涤物质以去除可溶性碳水化合物，从而避免了通过洗涤使异黄酮损失的可能性。
蛋白浓缩物可利用常规的方法脱水、包括离心与干燥技术从而得到染料木苷原浓度为1.0至2.0毫克/克(干品)，黄豆苷原为0.7至1.5毫克/克(干品)的浓缩物。
本发明还提供了以非常高比例，从植物蛋白材料如大豆材料回收蛋白浓缩物中黄酮的方法。基于植物蛋白起始物中各类异黄酮总量，通过这里所述方法得到的回收率至少为50％，较好为65％，最好为80％。虽然不希望受具体理论的束缚，但确信由这里所述反应得到的高回收率与所述各种加工手段有关。在具体阶段，通过将相对可溶的葡糖苷配糖基异黄酮转化为不溶的糖苷配基异黄酮，可从进料物质中将高百分比异黄酮回收在所得产物中。
下列实例将进一步论述，但其对于本发明具有非限制性。
实例取15克大豆粉加入150克水混合，调节PH为7。往该混合物中加入1.5g生物果胶酶100L。混合物在60℃培养2小时同时调节PH至4.5。加入1.0g生物果胶酶100L，再培养2小时。养完毕后，回收所得富含糖苷配基异黄酮蛋白/纤维浓缩物。蛋白/纤维浓缩物中的异黄酮回收率如表1所示
表1<
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这些数据表明在“残留”酶与“补充酯”的共同作用下得到的转化率。异黄酮共轭体发生了向转糖苷配基物的明显转化，特别是染料木苷原和黄豆苷原。各类异黄酮的含量是基于异黄酮类的所有形式的总量。
在另一系列实验中研究了来自大豆的蛋白浓缩物中的染料木苷原和黄豆苷原的回收百分比。通过测定分离物中染料木苷原(或黄豆苷原)的量得到回收百分比，其以所含大豆起始物中染料木苷原(或黄豆苷原)的所有形式的总量的百分比来表示。100g去脂豆粉加到1600克用盐酸调节PH至4.5的水中，所得浆状物，被加热到50℃，加入2％凝乳状，具有β-葡糖苷酶活性的乳糖酶F。该浆状物在50℃反应16小时，以保证葡糖苷配糖基异黄酮完全转化成糖苷配基异黄酮。蛋白浓缩物通过离心从水溶性溶剂中分离，并形成富含糖苷配基浓缩体，略去了洗涤步骤。分离体中染料木苷原的含量为起始大豆物料(脱脂豆粉)中染料木苷原和染料木苷所有形式的总量的82％。类似地，分离液中黄豆苷原回收率为64％。
定量分析豆类产物中异黄酮的方法如下通过将0.75g样品(喷雾干燥或碾成细粉)与50ml 80/20甲醇/水溶剂混合提取异黄酮，在室温下用轨道振荡器振摇2小时，进行萃取。2小时后，余下未溶的物料用Whatman No.42滤纸过滤除去。5ml滤液用4ml水和1ml甲醇稀释。
通过高效液相色谱用Beckman C18反相柱对异黄酮类化合物进行分离。将异黄酮注射到该柱上，用溶剂，梯度洗脱，起始甲醇88％，水10％，冰乙酸2％结束甲醇98％，冰乙酸2％。流速0.4毫升/分钟，紫外吸收峰为262nm，清楚地拆分出黄豆苷，6-氧-乙酰黄豆苷，6-氧-丙二酰黄豆苷，黄豆苷原，染料木苷，6-氧-乙酰染料本苷，6-氧-丙二酰染料木苷，染料木苷原，大豆异黄酮及其衍生物和大豆异黄酮原。峰的鉴定由质谱完成。
定量分析由标准品与样品对照完成。标准品(染料木苷，染料木苷原，黄豆苷，黄豆苷原)由InaofineChemical.Company，Sommerville，NJ.购买。计算每个上述化合物的响应因子(积分面积/浓度)，并用于未知样品的定量，对于无标准品提供的共轭体型化合物，其响应因子是由其母体分子的响应因子并根据共轭体的分子量修正而得出的。如大豆异黄酮的响应因子是由染料木苷的响应因子与大豆异黄酮的分子量修正而得出。
此方法提供了每个异黄酮类物质的定量方法。为计算方便，如果所有的共轭形式转化为其对应的非共轭形式，一般依据上述数据和这些化合的聚集重量，分别计算得出染料木苷原，黄豆苷原，大豆异黄酮原的总含量，其总含量也可直接用酸水解转化成共轭形式的方法计算。
当然前述仅是本发明的具体优选方案且在不背离该发明所附权利要求书的精神和范围下可做各种变化与替代。该权利要求书遵循专利法的原则包括相应的条例逐一论述。
权利要求
1.从植物蛋白物质生产富含糖苷配基异黄酮蛋白浓缩物的方法，其包括(a)用具有植物蛋白物质等电位总的PH值的水性溶剂洗涤含有葡糖苷配糖基异黄酮的植物蛋白物质，产生含有葡糖苷配糖基异黄酮的植物蛋白浓缩物；和(b)葡糖苷配糖基异黄酮与足量的酶在足够的时间，温度和PH下反应，该酶至少是一种β-葡糖苷酶和酯酶，从而将浓缩物中的至少大部分葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮，从而生成富含糖苷配基异黄酮的蛋白浓缩物。
2.权利要求1的方法，其中所述的时间范围为大约2小时至24小时。
3.权利要求2的方法，其中所述的时间范围大约24小时。
4.权利标1的方法，其中所述的温度为大约40℃至60℃。
5.权利要求4的方法，其中所述的温度为60℃。
6.权利要求1的方法，其中所述的PH值大约从4至8。
7.权利要求6的方法，其中所述的PH值大约是4.5。
8.权利要求1的方法，其中所述的时间范围大约为24小时，温度为大约60℃，PH值大约为4.5。
9.权利要求1的方法，其中所述的洗涤植物蛋白物质和葡糖苷配糖基异黄酮与β-葡糖苷酶的反应步骤是一次操作完成的。
10.由权利要求1方法制备富含糖苷配基异黄酮蛋白浓缩物。
11.权利要求1的方法，其中所述的糖苷配基异黄酮蛋白浓缩物是由大豆制备的。
12.权利要求1的方法，其中所述的植物蛋白物质包括大豆类物质。
13.权利要求1的方法，其中实质上上所有葡糖苷配糖基异黄酮类物质转化为糖苷配基异黄酮。
14.从植物蛋白物质制备富含糖苷配基异黄酮蛋白浓缩物的方法，其包括(a)用具有植物蛋白物质等电点的PH值的水性溶剂洗涤含有葡糖苷配糖基异黄酮类物质和足量残留酶的植物蛋白物质，残留酶为至少一种β-葡糖苷酶或酯酶，从而生成含葡糖苷配糖基异黄酮的植物蛋白浓缩物；和(b)葡糖苷配糖基异黄酮与残留酶在足够的时间，温度和PH下反应，将浓缩物至少大部分葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮，从而制备出富含糖苷配基异黄酮蛋白浓缩物。
15.权利要求14的方法，其中所述时间范围大约是2小时至24小时。
16.权利要求15的方法，其中所述时间范围是24小时左右。
17.权利要求14的方法，其中所述温度为大约40℃至60℃。
18.权利要求17的方法，其中所述温度为大约60℃。
19.权利要求14的方法，其中所述PH值范围是大约4至8。
20.权利要求19的方法，其中所述PH值范围是大约4.5。
21.权利要求14的方法，其中所述时间范围是24小时左右，温度为大约60℃。PH值大约4.5。
22.权利要求14的方法，其中所述植物蛋白物质的洗涤和葡糖苷配糖基异黄酮与β-葡糖苷酶的反应步骤是一次操作完成的。
23.由权利要求14所述方法生产的富含糖苷配基异黄酮蛋白浓缩物。
24.权利要求14的方法，其中所述浓缩物是由大豆制备的。
25.权利要求14的方法，其中所述植物蛋白物质包括大豆类物质。
26.权利要求14的方法，其中大体上所有葡糖苷配糖基异黄酮类物质被转化为糖苷配基异黄酮。
27.从植物蛋白物质制备富含糖苷配基异黄酮蛋白浓缩物的方法，其包括(a)用具有植物蛋白物质等电位点PH值的水性溶剂洗涤含有葡糖苷配糖基异黄酮的植物蛋白物质，生成含有葡糖苷配糖基异黄酮的植物蛋白浓缩物；(b)加入“补充酶”至浓缩物，该酶为至少一种β-葡糖苷酶和酯酶，使浓缩物中酶的总含量充足，以便浓缩物中至少大部分葡糖苷配糖基异黄酮被转化为糖苷配基物；和(c)葡糖苷配糖基异黄酮与酶在足够时间，温度和PH下反应，使浓缩物中的至少大部分葡糖苷配糖基异黄酮转化为糖苷配基异黄酮，从而制备出富含糖配基异黄酮浓缩物。
28.权利要求27的方法，其中所述时间范围是大约2小时至24小时。
29.权利要求28的方法，其中所述时间范围是大约24小时。
30.权利要求27的方法，其中所述温度是大约40℃至60℃。
31.权利要求30的方法，其中所述温度是大约60℃。
32.权利要求27的方法，其中所述PH值是大约4至8。
33.权利要求32的方法，其中所述PH值大约4.5。
34.权利要求27的方法，其中所述时间范围是大约24小时，温度是大约60℃，PH值大约4.5。
35.权利要求27的方法，其中所述植物蛋白物质的洗涤和葡糖苷配糖基异黄酮与β-葡糖苷酶的反应步骤是一次操作完成的。
36.由权利要求27所述方法生产富含糖苷配基异黄酮蛋白浓缩物。
37.权利要求27的方法，其中所述浓缩物由大豆制备。
38.权利要求27的方法，其中所述植物蛋白物质包括大豆类物质。
39.权利要求27的方法，其中所述大体上所有葡糖苷配糖基异黄酮类物质转化为糖苷配基异黄酮。
40.富含糖苷配基异黄酮强化浓物中染料木苷原的干品含量是1.0至2.0毫克/克，黄豆苷原的含量是0.7至1.5毫克/克。
41.权利要求1的方法，其中所述的PH值是使酶先与异黄酮类物质反应前具有最强活性的PH值。
42.权利要求14的方法，其中所述的PH值是使“残留”酶先与异黄酮类物质反应前具有最强活性的PH值。
43.权利要求27的方法，其中所述的PH值是使“补充酶”与异黄酮类物质反应前具有最强活性的PH值。
44.回收蛋白浓缩物中至少植物蛋白材料中50％异黄酮的方法。其包括(a)用具有植物蛋白物质等电位点PH值的水性溶剂洗涤含有异黄酮类物质的植物蛋白物质，并制备出含有异黄酮类物质的植物蛋白浓缩物，(b)在足够的时间，温度和PH下，异黄酮与足量的酶充分反应，使浓缩物中至少大部分异黄酮类物质转化为水解性较弱的异黄酮类物质，从而制备出富含异黄酮蛋白浓缩物，其中异黄酮的含量应至少为植物蛋白物质中异黄酮含量的50％。
45.权利要求44的方法，其中所述浓缩物中异黄酮的含量应至少为植物蛋白物质中异黄酮含量的65％。
46.权利要求44的方法，其中所述浓缩物中异黄酮的含量应至少为植物蛋白物质中异黄酮含量的80％。
47.浓缩物由权利要求44的方法制备。
48.浓缩物由权利要求45的方法制备。
49.浓缩物由权利要求46的方法制备。
50.权利要求44所述植物蛋白物质包括大豆类作物。
51.权利要求44的方法，其中所述的酶选自β-葡糖苷酶和酯酶类。
全文摘要
本文揭示了富含糖苷配基异黄酮强化蛋白浓缩物及其生产方法和其回收，该方法包括等电位下洗涤植物蛋白物质使之形成蛋白浓缩物，将其匀浆并与足量的β-葡糖苷酶或酯酶在足够时间范围、温度、pH值下充分反应，使浓缩物中至少大部分葡糖苷配糖基异黄酮转化为糖苷配基异黄酮。
文档编号A23J3/14GK1135222SQ94194200
公开日1996年11月6日 申请日期1994年9月21日 优先权日1993年10月12日
发明者J·L·申, B·A·布里安 申请人:蛋白质技术国际公司