碱性纤维素酶及其产生方法

专利名称：碱性纤维素酶及其产生方法
技术领域：
本发明涉及新的纤维素酶组合物。本发明还涉及优选地来源于Bacillus sp.的新的纤维素酶组合物。本发明还涉及该新的纤维素酶在本领域认为其中添加进纤维素酶是有利的组合物中的用途，包括在洗涤组合物中、在含有纤维的纤维素的处理中、在纸浆和纸张处理中以及在用于产生高果糖的玉米糖浆或乙醇的淀粉的处理中用作添加剂。
B.现有技术的状况纤维素酶是一种能够水解纤维素中的1，4-β-D-糖苷键的酶。习惯上已把纤维素分解酶分为三个主要的类别内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases)以及β-葡糖苷酶(Knowles，J.等人，(1987)，TIBTECH 5，255-261)；并且已知可以通过许多细菌，酵母和真菌来产生上述酶。
在已针对纤维素分解酶的应用而研制的申请中主要是那些涉及将(木材)纤维素纸浆降解为用于(生物)乙醇产生的糖、类似于“石洗”和“生物磨光”的织物处理以及在洗涤组合物中的申请。因此已知纤维素酶可以用在洗涤组合物中用于除去污物，即去污。例如英国申请2,075,028、2,095,275和2,097,826表明当洗涤剂中掺入纤维素酶时可以改善去污效能。此外，英国申请1,358,599表明在洗涤剂中纤维素酶的使用可以降低含有纤维的棉布的粗糙度。
在处理织物中纤维素酶的另一个有用的特征为其通过使用过的纤维的颜色更富活力(vibrant)来恢复该纤维的能力。例如，含有纤维的棉布的反复洗涤会给纤维带来灰色的外观，而这被认为是由于由机械作用引起的破坏的和混乱的小纤维，有时称作“起球”造成的。这种带灰色的外观在着色纤维上特别引人注目。因此，纤维素酶除去纤维混乱的顶层并从而改善其整体外观的能力便十分有价值了。
尽管在现有技术中存在涉及许多具有上述的一些或者所有性质的纤维素酶组合物的知识，但仍然继续需要具有改变光谱特性的新的纤维素酶，而该纤维素酶在例如处理织物、用作洗涤组合物的一个成分、处理纸浆和纸张以及在生物质的转变中是十分有用的。申请人已经公开了具有该补充特性以及在纤维素酶的已知应用中有用的某些纤维素酶。
发明概述本发明的一个目的是提供一种具有用于洗涤剂、处理织物和纸浆与纸张产生的有益性质的新的纤维素酶。
按照本发明，纤维素酶或者该纤维素酶的衍生物可以从Bacillus sp.CBS 670.93中得到或者来源于该菌株。CBS 670.93于1993年12月23日保藏在荷兰Baarn的真菌菌种保藏中心(CBS)，其保藏号为CBS 670.93。优选地，该新的纤维素酶含有按照图2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，或者与上述序列具有大于89％的序列相同性，优选地具有至少95％的序列相同性的其衍生物。本发明也涉及一种含有按照图2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的新的纤维素酶或与上述序列具有大于92.5％的序列相似性，优选地具有大于97％的序列相似性的其衍生物。
按照本发明的另一个实施方案则提供了一种含有编码按照图2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)或其衍生物之DNA的组合物，所述衍生物与所述序列具有大于89％的序列相同性、优选地具有大于95％的序列相同性。另一方面，本发明提供了一种含有编码按照图2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)或其衍生物之DNA的组合物，所述衍生物与所述序列具有大于92.5％的序列相似性、优选地具有大于97％的序列相似性。
按照本发明的再一个实施方案提供了一种用编码按照本发明的氨基酸序列的DNA来转化合适的微生物的方法。此外也提供了用按照本发明的DNA转化的微生物。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，纤维素酶为一种从Bacillussp. CBS 670.93中得到的纤维素酶，其计算分子量大约为50kD。该大约50kD的纤维素酶其计算的等电点大约为4，在CMC上的最佳pH值在40℃下大约为6-10、在60℃下大约为7。
附图简要说明

图1表明在40℃和60℃下从CBS 670.93得到的大约50kD的纤维素酶的pH活性概况。
图2表明从CBS670.93得到的50kD纤维素酶的DNA序列(SEQ ID NO1)以及推定的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，其中前导肽序列的下面划有横线，分泌时该前导序列被切割掉生成成熟酶。
发明详述“衍生物”是指从天然蛋白质中衍生出来一种蛋白质，它可以通过在天然蛋白质的C-和N-末端的任一端或者两端添加一个或多个氨基酸、在天然氨基酸序列中的一个或多个不同的位点处取代一个或多个氨基酸、在天然蛋白质的任一端或两端或者在该氨基酸序列的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸、或者在天然氨基酸的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸来实现。酶衍生物的制备优选地是通过修饰编码该天然蛋白质的DNA序列、将该DNA序列转化至一个合适的宿主以及表达该修饰了的DNA序列以生成该衍生酶来实现的。本发明的衍生物包括含有与前体酶的氨基酸序列相比(例如按照本发明的一种野生型或者天然状态的酶)进行了改造的氨基酸序列的肽，这种肽保留了该前体酶特有的酶的性质，但在一些特殊的方面则具有改造了的特性。例如，改造了的纤维素酶可能具有增加的最佳pH值或增加的温度抗性，但是它仍保留其特有的纤维素分解酶的活性。该衍生物也包括在酶分子中化学修饰氨基酸残基。
如果纤维素酶具有与可以从芽孢杆菌670.93得到的纤维素酶的氨基酸序列相对应的氨基酸序列，则该纤维素酶是可以从该生物体得到的。因此来源于不同的芽孢杆菌的与本发明的50kD纤维素酶具有相同氨基域序列的纤维素酶是可以从芽孢杆菌670.93得到的。
按照本发明，“宿主细胞”是指对于重组DNA载体而言具有可以用作宿主和表达载体能力的细胞。在按照本发明的一个优选的实施方案中，“宿主细胞”是指芽孢杆菌属的细胞。
“DNA构建体”或“DNA载体”是指包含编码上述任意一种新的纤维素酶或者纤维素酶衍生物的一个或多个DNA片段的核苷酸序列。
在优选的实施方案中，该纤维素酶可以从荷兰Baarn的真菌菌种保藏中心得到，其微生物保藏号为CBS 670.93(在申请PCT/EP94/04312中有描述)，是遵照布达佩斯条约于1993年12月23日保藏的。正如本文所使用的，保藏的菌种命名为CBS670.93。在一个更为优选的实施方案中，本发明的纤维素酶是一种从CBS670.93得到的大约为50kD的纤维素酶(以成熟蛋白质的氨基酸序列为基础进行计算)(本文中命名为“50kD纤维素酶”)。所述大约为50kD的纤维素酶针对成熟蛋白质的计算的等电点大约为4，在CMC上的最佳pH值在40℃下大约为6-10、在60℃下大约为7。
编码大约为50kD的纤维素酶的氨基酸序列的基因可以通过利用荷兰Nijmegen大学的CAOS/CAMM中心与不同文库(GenBank，瑞士-Prot，EMBL和PIR)中可以得到的序列数据比较而进行分析。为了比较由本发明的DNA序列编码的纤维素酶和由已公开或已知的纤维素酶基因序列所编码的纤维素酶而进行的数据库的检索揭示出在芽孢杆菌N-4的纤维素酶CelA中发现存在最大量的氨基酸的相同性(Fukumori等人，细菌杂志，第168卷，第479-485页(1986))。
采用由Pearson和Lipman在Proc. Nat. Acad. Sci.，第85卷，第2444-2448页(1988)中所描述的TFastA程序进行的分析表明大约为50kD的纤维素酶与最近公开的纤维素酶序列间有89％的序列相同性和92.5％的序列相似性。TFastA数据检索程序可以通过购买序列分析软件包6.0版(基因计算机集团，威斯康星大学生物技术中心，麦迪逊，威斯康星53705)而得到。因此，本发明包括一种具有按照图2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的纤维素酶或其衍生物，该衍生物与该纤维素酶具有大于89％的序列相同性，优选地具有大于95％的序列相同性。本发明还包括一种与按照图2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)具有大于92.5％的序列相似性，优选大于97％的序列相似性的氨基酸序列的纤维素酶。
本发明也公开了一种用于产生该纤维素酶的方法。在一个实施方案中，可以通过在能够产生该纤维素酶的条件下培养如Bacillus sp. CBS670.93这样的合适的生物体来产生该纤维素酶。这些条件优选包括那些被认为是培养芽孢杆菌以使纤维素酶的产生达到最大的条件，并且包括采用一种从底物得到的纤维素作为能源并与必需的盐、离子和其它已熟知的成分组合。一般说来，用于培养该细胞的培养基可以是任意一种适于培育细菌的常规培养基、细胞可以在厌氧条件下、在含有可同化的碳和氮以及其它基本营养物的营养培养基中进行培养。合适的碳源为诸如蔗糖、葡萄糖和淀粉的糖类，或者为含有诸如谷物、麦芽、大米和高粱之类物质的糖类。在培养基中加入的糖类的浓度可以变化很大，例如高达25％并低至1-5％，但通常8-10％是合适的范围，其中的百分数以葡萄糖当量进行计算。在营养培养基中的氮源可以是无机和/或有机来源。合适的无机氮源为硝酸盐和铵盐。在涉及培养细菌的发酵过程中通常使用的有机氮源为大豆粉、棉籽粉、花生粉、酪蛋白、玉米、玉米浸液、酵母提取物、尿素和白蛋白。此外，营养培养基也应当含有一般性的微量物质。
该纤维素酶可以通过常规的方法从培养基中回收，该方法包括从培养基中经离心或过滤分离细胞(如有必要的话在破碎细胞后)，通过盐(例如硫酸铵)沉淀滤液的上清液中的蛋白质成分，随后通过如离子交换色谱、亲和色谱之类的许多色谱方法或者类似的文献记载的方法进行纯化。为了产生本发明的碱性纤维素酶，优选在碱性条件下采用含有一种以纤维素为基础的能源的培养基进行培养。
本发明的纤维素酶优选地是采用基因工程技术通过以编码该纤维素酶的基因转化合适的宿主细胞并且在适于宿主细胞生长和纤维素酶表达的条件下进行表述来产生的。第一步，可以通过Saito和Miura的方法(Saito和Miura，Biochim. Biophys. Acta.，第72卷，第619页(1963))或通过与之类似的方法从供体菌株中得到染色体DNA。如此得到的染色体DNA的限制酶切割提供了含有碱性纤维素酶基因的DNA片段。出于这一目的可以使用任意一种限制酶，而只要该酶不切割所说基因区即可。另一方面也可以使用切割该基因的限制酶，但是应当采用仅仅使得可以部分消化的降低的酶浓度或温育时间。一种优选的限制酶为Sau3A。从所得到的消化混合物中可以分离出合适的片段(2-6kb)并且将该片段以DNA构建体用于转化合适的宿主细胞，例如采用一种包含编码本发明的50kD纤维素酶的大约为1.9kb的DNA片段、且该片段已被连接到一个合适的载体序列上的DNA构建体。然后把连接混合物转化到合适的宿主中。
编码本发明的纤维素酶的基因可以采用λ-噬菌体(表达)载体和大肠杆菌宿主细胞进行克隆(另一方面，可以采用在保守区上设计的共有引物进行PCR克隆)。本申请人已经发现了编码本发明的纤维素酶的基因在大肠杆菌中的转化和表达生成了一种活性的蛋白质。在大肠杆菌的第一个克隆步骤之后，可以把本发明的纤维素酶的基因转移到一个更为优选的工业用的表达宿主中，如芽孢杆菌属或链霉菌属的物种，如曲霉属或木霉菌属之类的丝状真菌或者如酿酒酵母之类的酵母。可以在这些宿主生物体中得到的高水平的表达和分泌会使该纤维素酶在发酵培养基中进行积累，随后可以从中回收该纤维素酶。
表达宿主细胞优选地包括芽孢杆菌属的种，更优选地为地衣形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。在一个特别优选的实施方案中，转化宿主除去了蛋白酶基因以确保产物纤维素酶在发酵液或其浓缩液中不进行蛋白酶解。在Ferrari等人的美国专利5,264,366中给出了一个关于缺失蛋白酶的芽孢杆菌菌株优选的一般转化和表达的实验方案，其中该文献引入本文一并参考。转化的芽孢杆菌属宿主优选地在pH大约为6.9时进行发酵。例如在Berka等人的美国专利5,364,770中描述了曲霉属中的转化和表达，其中该文献引入本文一并参考。当转化宿主细胞为芽孢杆菌时，优选的启动子为aprE启动子。
已经表明从CBS 670.93得到的速溶的大约为50kD的纤维素酶在含有甘氨酸，醋酸铵，四硼酸钠(borax)和/或tris的缓冲溶液体系中是有益的。也已发现在CMC上镁的存在会激活该纤维素酶，而钙的存在则抑制该酶。并已发现钙和镁的比例大约为750ppm250ppm时会导致有益的活性。
按照本发明，可以在按照现有技术已公认的在洗涤剂中使用纤维素酶的方法在洗涤组合物中使用上述纤维素酶组合物。在碱性pH下速溶纤维素酶突出的活性会导致目前的纤维素酶在高pH洗涤剂中特别有用。
在下面的实施例中将更为详尽地解释本发明，这些实施例的给出仅仅是出于说明的目的但不应当用于限制本发明。
实施例1从碱性土壤和水样中筛选和分离纤维素酶采用两种方法从碱性土壤和水样中分离产生纤维素酶的微生物。在一种方法中，把土壤和水样悬浮于0.85％的盐水溶液并直接用于检测纤维素酶产生菌落的羧甲基纤维素(CMC)-琼脂扩散分析中。在第二个方法中，通过在40℃下、在含有液体基本培养基或GAM-培养基的纤维素中温育1至3天来富集含有菌株的土壤和水样中的纤维素酶。采用检测纤维素酶产生菌落的CMC-琼脂扩散分析来分析显示有细菌生长的培养物中纤维素酶的活性。CMC-琼脂扩散分析和富集方法使用了在pH大约为9.7时制备的基本培养基，该培养基包含1％KNO3、0.1％酵母提取物(Difco)、0.1％KH2PO4、0.02％MgSO4-7H2O、1％Na2CO3、4％NaCl和0.25％CMC(Sigma C-4888)。为了固化加入1.5％的琼脂。
采用两种方法其中之一进行CMC-琼脂扩散分析，这依赖于是否检测菌落或液体部分。为了检测菌落，把在0.85％盐水溶液中的细胞悬浮物涂布在含有基本培养基的CMC上。在40℃下温育1至3天后，将该平板进行平板复制并且用0.1％的刚果红淹没亲代平板15分钟。用1MNaCl使该平板脱色30分钟。将在菌落周围显示有一个澄清区域的菌株作为一个潜在的纤维素酶产生微生物而加以分离。通过用移液管从培养皿中一层5毫米的基本培养基向朝外穿孔的孔中吸取40μl酶溶液或发酵液的等分试样来分析液体部分。在40℃下温育16小时后，通过刚果红/NaCl处理来检测纤维素酶的活性。澄清区域的直径是CMC酶活性的测量手段。
选择通过采用两种筛选方法中的任一种显示有澄清区域的菌株来培养并分离纤维素酶。在培养摇床(New Brunswick Scientific，Edison，新泽西，美国)上于40℃、250r.p.m.下在100毫升摇瓶中的25毫升GAM-培养基里发酵该菌落72小时。在pH9和40℃的培养基中测定CMC酶活性以证实发酵液中纤维素酶的存在。用于酶产生的复合培养基(GAM)由胨(Difco)0.5％、酵母提取物(Difco)0.5％、葡萄糖·H2O 1％、KH2PO40.1％、MgSO4·7H2O 0.02％、Na2CO31％、NaCl 4％组成。在加入1％CMC后用4M HCl调节pH至9.5。
采用上述方法可以分离纤维素酶产生微生物，该微生物还具有如下特征，如呈小而直的棒状，偶尔成对出现并且能够运动。末端至亚末端芽孢呈椭圆形并存在孢囊明显的凸起在GAM-琼脂上的菌落呈现出奶白色，颜色黯淡(即无光泽)且具有丝状边缘的不规则表面。在16S rRNA序列分析的基础上，该微生物分类为芽孢杆菌属的一个种。在本文中该微生物命名为CBS 670.93并且以该保藏号保藏在荷兰Baarn的真菌菌种保藏中心。
实施例2DNA的分离，纤维素酶的转化和表达选择亲碱性的芽孢杆菌菌株CBS 670.93作为用于在大肠杆菌中表达克隆的供体菌株。按照由Saito和Miura在Biochim. Biophys. Acta.，第72卷，第619-629页(1963)中描述的方法分离染色体DNA。
采用反应缓冲溶液(Gibco BRL生命技术公司，Gaithersburg，Md.，美国)在供应厂商推荐的条件下，于37℃下采用连续稀释的酶溶液，通过限制酶Sau3A部分消化分离的染色体DNA 1小时。消化的DNA由琼脂糖凝胶电泳分级分离并且按照供应厂商所描述的实验方案、采用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司，Chatsworth，Ca.，美国)从凝胶中分离合适的部分(2-6kb)。
按照供应厂商(Stratagene克隆系统，La Jolla，Ca.，美国)所描述的实验方案在BamH1，经消化的CIAP处理的ZAP表达载体中将染色体DNA的Sau3A片段用于构建基因组的基因文库。将含有克隆的DNA插入片段的pBK-CMV噬菌粒从ZAP表达TM载体中切除并转化至大肠杆菌菌株XLOLR中。
通过由Wood等人在Meth. Enzym.，第160卷，第59-74页(1988)中所描述的琼脂扩散来筛选重组克隆。分离出在菌落周围显示有澄清区域的菌株。在4*YEP-培养基中发酵48小时后测定分离的重组体的CMC酶活性，其中4*YEP-培养基由酵母提取物(Difco)4％、胨(Difco)8％、乳糖0.2％、氨苄青霉素100μg/ml组成。纯化重组蛋白质(实施例3)并测定氨基酸序列(SEQID NO2)。
按照供应厂商所描述的实验方案、采用QIAprep质粒试剂盒(QIAGEN公司)来分离纤维素酶产生重组体的质粒DNA。该质粒含有染色体DNA的大约为1.9kb的插入片段。采用一组从N-末端氨基酸序列得到的简并寡核苷酸作为引物来测定一个有1933个碱基对的片段的核苷酸序列，以便在1.9kb的插入片段上定位该基因。具有1933个碱基对的片段包括一个有1422个碱基对的开放读框，从中可以推导出有467个氨基酸的蛋白质包含一个含有26个氨基酸的前导序列。然后可以测定编码所说纤维素酶的基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1)以及分离的单一纤维素酶推定的氨基酸序列(SEQ IDNO2)并将其显示在图2中。
实施例3纯化纤维素酶在由酵母提取物(Difco)4％、胨(Difco)8％、乳糖0.2％、100μg/ml氨苄青霉素所组成的复合培养基(4*YEP)上培育实施例2的纤维素酶产生克隆。经离心(8000rpm)从培养液体中分离发酵液。用硫酸铵(65％饱和)沉淀上清液中的纤维素酶。将该沉淀溶解在含有5mM EDTA、pH7的25mM磷酸盐盐缓冲溶液中，直至电导率达到7mS/cm。在用含有5mM EDTA、pH7的25mM磷酸盐缓冲溶液洗涤Q-琼脂糖凝胶FF(直径5cm，长10cm)离子交换柱直至吸水性为0.2AU之后，再将上述溶液加入柱中。在80分钟里把溶在pH为7的25mM磷酸盐中的0至0.5M NaCl的梯度加入该柱中，随后在10分钟里为从0.5至1M NaCl的梯度。在第一梯度中发生洗脱。洗脱后，用1M NaOH清洗(向上流动)该柱并用含有5mM EDTA、pH7的25mM磷酸盐再次平衡该柱。依赖于洗脱方案，得到的纤维素酶纯度达到大约80％。
实施例4按照本发明的纤维素酶的性质为测定本发明大约为50kD的纤维素酶的pH/温度特性，在不同的pH和温度值下、于CMC上测量该纤维素酶的活性。把含有大约为50kD的纤维素酶的溶液混合到以10mM磷酸盐缓冲溶液(pH7)稀释的缓冲溶液(pH是通过采用缓冲溶液进行控制的，该缓冲溶液为一种包含100毫升1M磷酸、100毫升柠檬酸和600毫升蒸馏水的混合物并用4M NaOH调节其pH至4、5、6、7、8、9或10，之后用蒸馏水补充该混合物至1升)中。稀释该酶溶液直至在pH7与40℃下测量为0.05U/ml为止。检测每一种缓冲溶液体系以确定在混合0.5毫升缓冲溶液、0.5毫升底物(1％CMC)和0.1毫升10mM磷酸缓冲溶液之后实际的pH值。对于pH为4、5、6、7、8、9和10的溶液实际的pH分别为4.2、5.2、6.2、7、8、8.7和9.9。
图1中显示的结果表明该纤维素酶突出的碱性活性。校正曲线的斜率取决于酶底物混合物的pH值，为此在每一pH值下的两个葡萄糖标准物采用10和25倍稀释的每100毫升500毫克葡萄糖H2。
采用如下改进的PAHBAH方法(Lever M. Anal.生物化学1972，47，273-279和Lever M. Anal.生物化学1977，81，21-27)可以分析纤维素酶的活性。采用一个固定的酶浓度可以测定pH/温度特性，其中酶浓度应符合在pH7和40℃下测量的剂量响应分布的线性范围。该酶浓度可以在所有其它的测定条件下用于活性的测定。试管中装有250μl溶于pH为9的50mM甘氨酸缓冲溶液中的2.5％CMC(低粘度的CMC从Sigma公司购买)和50kD纤维素酶的250μl等分试样，并用合适的缓冲溶液进行稀释。在水浴中于40℃下温育该试管30分钟，之后加入1.5毫升含有100毫升铋溶液(在100毫升中含有48.5克硝酸铋、28.2克酒石酸钾钠和12.0克NaOH)的当日新制备的PAHBAH溶液(溶于100毫升0.5M NaOH的1％PAHBAH)。在70℃下加热该混合物10分钟，之后在冰上冷却2分钟。在410nm下测量其吸收。为了消除酶样品的本底吸光度，进行如下的对照实验在与该测试试管相同的条件下温育含有底物的试管。温育后，加入1.5毫升PAHBAH和酶制剂(按照上述顺序加入)。一单位(U)定义为以每分钟每克产物还原糖测定时，从CMC等价物产生1μmol葡萄糖的酶量。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名Gist-brocades(B)街道Wateringseweg 1(C)城市Delft(E)国家荷兰(F)邮政编码(ZIP)2611XT(ii)发明名称新的纤维素酶及其应用(iii)序列数2(iv)计算机可读形式(A)存储介质类型软磁盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，#1.25版(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度1404个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定无(iii)反义无(vi)最初来源(A)生物体Bacillus sp.
(C)个体分离物CBS 670.93(ix)特征
(A)名称/关键词sig-肽(B)位置1..78(ix)特征(A)名称/关键词mat_肽(B)位置79..1404(D)其它信息/功能＝“内切葡聚糖酶”/EC_编号＝3.2.1.4/产物＝“BCE103纤维素酶”(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..1404(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG AAA AAG ATA ACT ACT ATT TTT GCC GTA TTG CTC ATG ACA TTG GCG48Met Lys Lys Ile Thr Thr Ile Phe Ala Val Leu Leu Met Thr Leu Ala-26 -25 -20 -15TTG TTC AGT ATA GGA AAC ACG ACA GCG GCT GAT GAT TAT TCA GTT GTA96Leu Phe Ser Ile Gly ASn Thr Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Ser Val Val-10 -51 5GAG GAA CAT GGG CAA CTA AGT ATT AGT AAC GGT GAA TTA GTC AAT GAA144Glu Glu His Gly Gln Leu Ser Ile Ser Asn Gly Glu Leu Val Asn Glu10 15 20CGA GGC GAA CAA GTT CAG TTA AAA GGG ATG AGT TCC CAT GGT TTG CAA192Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Met Ser Ser His Gly Leu Gln25 30 35TGG TAC GGT CAA TTT GTA AAC TAT GAA AGC ATG AAA TGG CTA AGA CAT240Trp Tyr Gly Gln Phe Val Asn Tyr Glu Ser Met Lys Trp Leu Arg Asp40 45 50GAT TGG GGA ATA ACT GTA TTC CGA GCA GCA ATG TAT ACC TCT TCA GGA288Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ser Ser Gly55 60 65 70GGA TAT ATT GAC 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GAT CCT AAC GTC ATG TAT GCA672His His Ala Ala Asp Asn Gln Leu Ala Asp Pro Asn Val Met Tyr Ala185 190 195TTT CAT TTT TAT GCA GGA ACA CAT GGA CAA AAT TTA CGA GAC CAA GTA720Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Asn Leu Arg Asp Gln Val200 205 210GAT TAT GCA TTA GAT CAA GGA GCA GCG ATA TTT GTT AGT GAA TGG GGG768Asp Tyr Ala Leu Asp Gln Gly Ala Ala Ile Phe Val Ser Glu Trp Gly215 220 225 230ACA AGT GCA GCT ACA GGT GAT GGT GGT GTG TTT TTA GAT GAA GCA CAA816Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val Phe Leu Asp Glu Ala Gln235 240 245GTG TGG ATT GAC TTT ATG GAT GAA AGA AAT TTA AGC TGG GCC AAC TGG864Val Trp Ile Asp Phe Met Asp Glu Arg Asn Leu Ser Trp Ala Asn Trp250 255 260TCT CTA ACG CAT AAG GAT GAG TCA TCT GCA GCG TTA ATG CCA GGT GCA912Ser Leu Thr His Lys Asp Glu Ser Ser Ala Ala Leu Met Pro Gly Ala265 270 275AAT CCA ACT GGT GGT TGG ACA GAG GCT GAA CTA TCT CCA TCT GGT ACA960Asn Pro Thr Gly Gly Trp Thr Glu Ala Glu Leu Ser Pro Ser Gly Thr280 285 290TTT GTG AGG GAA AAA ATA AGA GAA TCA GCA TCT ATT CCG CCA AGC GAT1008Phe Val Arg Glu Lys Ile Arg Glu Ser Ala Ser Ile Pro Pro Ser Asp295 300 305 310CCA ACA CCG CCA TCT GAT CCA GGA GAA CCG GAT CCA GGA GAA CCG GAT1056Pro Thr Pro Pro Ser Asp Pro Gly Glu Pro Asp Pro Gly Glu Pro Asp315 320 325CCA ACG CCC CCA AGT GAT CCA GGA GAG TAT CCA GCA TGG GAT TCA AAT1104Pro Thr Pro Pro Ser Asp Pro Gly Glu Tyr Pro Ala Trp Asp Ser Asn330 335 340CAA ATT TAC ACA AAT GAA ATT GTG TAT CAT AAC GGT CAG TTA TGG CAA1152Gln Ile Tyr Thr Asn Glu Ile Val Tyr His Asn Gly Gln Leu Trp Gln345 350 355GCG AAA TGG TGG ACA CAA AAT CAA GAG CCA GGT GAC CCA TAC GGT CCG1200Ala Lys Trp Trp Thr Gln Asn Gln Glu Pro Gly Asp Pro Tyr Gly Pro360 365 370TGG GAA CCA CTC AAA TCT GAC CCA GAT TCA GGA GAA CCG GAT CCA ACG1248Trp Glu Pro Leu Lys Ser Asp Pro Asp Ser Gly Glu Pro Asp Pro Thr375 380 385 390CCC CCA AGT GAT CCA GGA GAG TAT CCA GCA TGG GAT TCA AAT CAA ATT1296Pro Pro Ser Asp Pro Gly Glu Tyr Pro Ala Trp Asp Ser Asn Gln Ile395 400 405TAC ACA AAT GAA ATT GTG TAC CAT AAC GGC GAG CTA TGG CAA GCA AAA1344Tyr Thr Asn Glu Ile Val Tyr His Asn Gly Gln Leu Trp Gln Ala Lys410 415 420TGG TGG ACA CAA AAT CAA GAG CCA GGT GAC CCA TAT GGT CCG TGG GAA1392Trp Trp Thr Gln Asn Gln Glu Pro Gly Asp Pro Tyr Gly Pro Trp Glu425 430 435CCA CTC AAT TAA1404Pro Leu Asn440(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度467个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Lys Ile Thr Thr Ile Phe Ala Val Leu Leu Met Thr Leu Ala-26 -25 -20 -15Leu Phe Ser Ile Gly Asn Thr Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Ser Val Val-10 -5 1 5Glu Glu His Gly Gln Leu Ser Ile Ser Asn Gly Glu Leu Val Asn Glu10 15 20Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Met Ser Ser His Gly Leu Gln25 30 35Trp Tyr Gly Gln Phe Val Asn Tyr Glu Ser Met Lys Trp Leu Arg Asp40 45 50Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ser Ser Gly55 60 65 70Gly Tyr Ile Asp Asp Pro Ser Val Lys Glu Lys Val Lys Glu Thr Val75 80 85Glu Ala Ala Ile Asp Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Ile90 95 100Leu Ser Asp Asn Asp Pro Asn Ile Tyr Lys Glu Glu Ala Lys Asp Phe105 110 115Phe Asp Glu Met Ser Glu Leu Tyr Gly Asp Tyr Pro Asn Val Ile Tyr120 125 130Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Ser Asp Val Thr Trp Asp Asn Gln135 140 145 150Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Pro Val Ile Arg Asp Asn Asp155 160 165Pro Asn Asn Ile Val Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val170 175 180His His Ala Ala Asp Asn Gln Leu Ala Asp Pro Asn Val Met Tyr Ala185 190 195Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Asn Leu Arg Asp Gln Val200 205 210Asp Tyr Ala Leu Asp Gln Gly Ala Ala Ile Phe Val Ser Glu Trp Gly215 220 225 230Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val Phe Leu Asp Glu Ala Gln235 240 245Val Trp Ile Asp Phe Met Asp Glu Arg Asn Leu Ser Trp Ala Asn Trp250 255 260Ser Leu Thr His Lys Asp Glu Ser Ser Ala Ala Leu Met Pro Gly Ala265 270 275Asn Pro Thr Gly Gly Trp Thr Glu Ala Glu Leu Ser Pro Ser Gly Thr280 285 290Phe Val Arg Glu Lys Ile Arg Glu Ser Ala Ser Ile Pro Pro Ser Asp295 300 305 310Pro Thr Pro Pro Ser Asp Pro Gly Glu Pro Asp Pro Gly Glu Pro Asp315 320 325Pro Thr Pro Pro Ser Asp Pro Gly Glu Tyr Pro Ala Trp Asp Ser Asn330 335 340Gln Ile Tyr Thr Asn Glu Ile Val Tyr His Asn Gly Gln Leu Trp Gln345 350 355Ala Lys Trp Trp Thr Gln Asn Gln Glu Pro Gly Asp Pro Tyr Gly Pro360 365 370Trp Glu Pro Leu Lys Ser Asp Pro Asp Ser Gly Glu Pro Asp Pro Thr375 380 385 390Pro Pro Ser Asp Pro Gly Glu Tyr Pro Ala Trp Asp Ser Asn Gln Ile395 400 405Tyr Thr Asn Glu Ile Val Tyr His Asn Gly Gln Leu Trp Gln Ala Lys410 415 420Trp Trp Thr Gln Asn Gln Glu Pro Gly Asp Pro Tyr Gly Pro Trp Glu425 430 435Pro Leu Asn440
权利要求
1.一种纤维素酶或其衍生物，所述纤维素酶是可以从Bacillus sp. CBS670.93得到的或者来源于Bacillus sp.CBS 670.93的。
2.一种组合物，该组合物含有包含按照SEQ ID NO1的氨基酸序列的纤维素酶或与SEQ ID NO1具有大于89％的序列相同性的其衍生物。
3.按照权利要求2的组合物，其中所说纤维素酶与SEQ ID NO1具有至少95％的序列相同性。
4.一种组合物，该组合物含有包含按照SEQ ID NO1的氨基酸序列的纤维素酶或与SEQ ID NO1具有至少92.5％的序列相似性的其衍生物。
5.按照权利要求4的组合物，其中所说纤维素酶具有至少97％的序列相似性。
6.按照权利要求1的组合物，其中所说纤维素酶是可从Bacillus sp.CBS670.93得到的。
7.一种组合物，该组合物含有编码按照权利要求2或4的氨基酸序列的DNA。
8.一种组合物，该组合物含有编码按照权利要求3或5的氨基酸序列的DNA。
9.一种表达载体，该表达载体含有权利要求7的DNA组合物。
10.一种表达载体，该表达载体含有权利要求8的DNA组合物。
11.一种用权利要求7的DNA组合物转化的宿主细胞。
12.一种用权利要求8的DNA组合物转化的宿主细胞。
13.一种表达纤维素酶的方法，该方法包括(a)用编码按照权利要求2或4的氨基酸序列的DNA转化合适的微生物；(b)在适于所说DNA表达的条件下，制备含有所说的合适微生物的发酵液；(c)在允许所需量的所说纤维素酶表达的条件下，维持所说的发酵液一段时间；以及(d)收集含有所说纤维素酶的所说发酵液。
14.一种洗涤组合物，该组合物含有权利要求1，2或4的纤维素酶。
15.一种处理织物的方法，该方法包括使所说织物和权利要求1，2或4的纤维素酶接触。
16.一种处理纤维素纸浆的方法，该方法包括使所说的纤维素纸浆和权利要求1，2或4的纤维素酶接触。
全文摘要
本发明提供了一种可以从Bacillus sp.CBS 670.93得到的纤维素酶组合物。一种优选的纤维素酶的计算的分子量大约为50kD,计算的等电点大约为4,在CMC上的最佳pH值在40℃下大约为6—10、在60℃下大约为7。
文档编号C12N15/09GK1185179SQ96193560
公开日1998年6月17日 申请日期1996年4月26日 优先权日1995年4月28日
发明者P·范索林根 申请人:金克克国际有限公司