专利名称：人蛋白c多肽的制作方法
技术领域：
本发明属人类医药领域。具体而言，本发明尤其涉及一种具有截短的重链的分离的人蛋白C多肽，以及运用这种人蛋白C多肽的方法，和此种人蛋白C多肽的药物组合物。
蛋白C是维生素K依赖的丝氨酸蛋白水解酶，它天然产生抗凝剂，此抗凝剂通过钝化凝结级联中的因子Ⅴa和Ⅷa而调节血管稳态。人蛋白C最初在肝脏中以461氨基酸的单链多肽形式产生。前体分子经过多次翻译后修饰，包括1)42个氨基酸的信号肽的裂解；2)从单链酶原中蛋白水解除去156位的赖氨酸残基和157位的精氨酸残基，形成双链形式的分子，(即一条165氨基酸残基的轻链通过二硫键与含丝氨酸蛋白水解酶的262氨基酸残基的重链相连)；3)轻链的前42位氨基酸中聚集的9个谷氨酸进行维生素K依赖的羧化，形成9个γ羧基谷氨酸残基；和4)在4个位点糖附着(1个位点在轻链，另三个位点在重链)。最后，环状的双链酶原经过凝血酶/凝血调节蛋白复合体裂解环状酶原的活化肽(残基158-169)活化产生活化的蛋白C(aPC)。
与其它蛋白联合，蛋白C作为最重要的促进血栓形成的血液凝结因子的下调者起作用。因此，蛋白C酶系统代表抗凝血的主要生理机制。
蛋白C在调节稳态中的关键作用通过杂合缺失中的血栓形成增加的速率，蛋白C抗性(例，由于共同因子V Leiden突变)和未处理的纯合蛋白C缺失导致的致命结果例示。活化的人蛋白C，血浆来源的和重组的，在静脉和动脉血栓形成的许多动物模型中表现为有效和安全的抗凝剂。在近来临床研究中，蛋白C在人血栓形成疾病中表现得十分有效，包括对蛋白C缺失的治疗和微血管血栓形成的治疗，如与脓血症相关的弥散性血管内凝血。
不幸的是，在蛋白C活化过程中，重链的C末端裂解，可能改变蛋白的结构，从而在药物制备上有缺陷。申请人发现aPC的截短的形式具有生物学活性。本发明因此提供一种带有截短的重链的分离的aPC多肽，一种优选制备这种多肽的方法，以及其作为药物的运用。
本发明提供一种分离的人蛋白C多肽，它包括一条轻链和一条截短的重链，其中所述的多肽为SEQ ID NO:1。
本发明进一步提供编码具有截短的重链的人蛋白C多肽的重组DNA分子，其中所述的DNA分子是SEQ ID NO；2。
本发明进一步提供一种治疗患者的血栓形成的疾病的方法，它包括，向所述的患者施用药物有效量的具有截短的重链的分离的人蛋白C多肽。
本发明还包括制备分离的具有截短的重链的人蛋白C多肽的方法。
为在此公开及权利要求的本发明的目的，以下术语如下定义。
aPC或活化的蛋白C，无论重组的或血浆衍生的aPC包括并优选人蛋白C，尽管aPC可包括其它具有蛋白C蛋白水解，酰胺裂解，酯水解，和生物活性(抗凝血的或血纤维蛋白溶酶水解)的种或衍生物。蛋白C衍生物的实施例在美国专利号5,453,373，美国专利号5,516,650中描述，在此全文纳入参考文献。
APTT-活化的部分组织促凝血酶原激酶时间。
HPC-人蛋白C酶原。
r-hPC-重组的人蛋白C酶原，产生于原核细胞，真核细胞或转基因动物。
r-aPC-重组的人活化的蛋白，通过体外活化r-hPC或从原核细胞，真核细胞或转基因动物的蛋白C的活化形式的直接分泌产生(WO97/20043)，包括，例如，从人肾293细胞作为酶原分泌，然后通过本领域技术人员熟知的技术纯化并活化，如美国专利号4,981,952中所述，且在此全文引入作为参考文献。
酶原-指分泌的，钝化的形式，蛋白C的单链或双链形式。
截短的重链-指蛋白C的具有4个C末端氨基酸的重链裂解。对人活化的蛋白C，截短的重链包括氨基酸残基170-415如SEQ ID NO:1所示。
轻链-指蛋白C的轻链。对于人活化的蛋白C，轻链包括氨基酸残基1-155或在C端有1或更多氨基酸缺失的多肽。
血栓形成失调-由于血液凝块在血管中的存在或形成导致的失调。血栓形成失调包括，但不仅限于中风，心肌梗塞，不稳定心绞痛，血管成形术或扩张后的突然关闭和外周血管手术导致的血栓形成。
血管闭塞失调和血凝过快状态失调包括但不仅限于脓血症，弥散性血管内凝血，紫癜爆发，重大创伤，重大外科手术，烧伤，成人呼吸窘迫综合症，移植，深静脉血栓形成，肝素诱导的血小板减少，镰状细胞贫血病，地中海贫血症，病毒性出血热，血栓形成血小板减少性紫癜，和溶血性尿毒综合症。
药用制剂-一种适合作为治疗试剂施用的制剂或溶液。
在此所用的药学有效量，代表一定量的能够在哺乳动物中抑制血栓形成紊乱的本发明的化合物。依据本发明施用的化合物的具体剂量取决于案例的具体情况，包括施用的化合物，处理的具体条件，和类似的需要考虑的事项。
HPC的结构是根据翻译后修饰的数量的复合体。HPC结构包括一条轻链(残基1-155)和一条重链(残基158-419)。HPC分子最初表达为一条419氨基酸的多肽链，但在其从细胞分泌之前，通过移除156-157位的赖氨酸-精氨酸二肽，蛋白转变为异二聚体形式。
重组的人蛋白C(r-hPC)其结构和复杂度与HPC类似。R-hPC向r-aPC的转变过程中，凝血酶选择性裂解活化十二肽(残基158-169)。申请人发现使四肽(残基416-419)从重链的C-末端裂解的条件导致脱416-419aPC多肽的形成。申请人进一步发现该aPC的形式是具有生物活性的(见实施例1，表1)，它可作为治疗剂单独使用或与天然aPC联合使用。本发明因此提供分离的脱(416-419)aPC，以及择优制备脱(416-419)aPC的方法，及其作为药物的运用。
本发明还提供用于制备具有截短的重链的蛋白C的DNA化合物。这些DNA化合物包括在野生型酶原蛋白C的前体肽的附近，下游，和位于翻译读码框内的人蛋白C的轻链编码序列。此DNA序列还编码在蛋白C分子成熟过程中加工的Lys-Arg二肽，和活化肽和蛋白C分子的截短的重链。
本领域的技术人员可认识到，由于遗传密码的简并性，不同的DNA化合物可编码以上所述的活化的蛋白C多肽。美国专利号4,775,624，在此全文引入作为参考文献，公开并要求保护编码人蛋白C分子的野生型形式的DNA序列。技术人员很容易确定DNA序列中的何种变化可用于构建其它能编码在此公开的多肽的DNA序列，本发明不限于具体的DNA序列。因此，以下描述的优选的本发明的DNA化合物，载体和转化体仅为例证而不限本发明的范围。
本发明的DNA化合物可通过对人蛋白C基因的定位诱变制备。适用便利技术收获培养物并分离质粒，质粒可直接转染到真核宿主细胞中制备具有截短的重链的蛋白C。优选将质粒转染到表达腺病毒E1A立即早期基因产物的宿主细胞，其中GBMT转录控制单元中发现的BK增强子在E1A存在时非常有效地增强表达。GBMT转录控制单元在美国专利号5,573,938和欧洲专利号91301451.0的文献中详细描述，在此全文引入作为参考文献。熟练技术人员了解宿主细胞表达或能够表达大DNA病毒的立即早期基因产物的量。优选用于本发明的衍生物表达的最优选细胞系为人肾293细胞系，在美国专利号为4,992,373的文献中公开，在此全文引入作为参考文献。在细胞系中表达后，从细胞培养物上清中纯化衍生物，方法见美国专利号为4,981,952的文献，在此全文引入作为参考文献。
本发明的DNA序列可化学合成，或通过结合限制性片段技术，结合或任何本领域的技术合成。DNA合成仪可用于构建本发明的DNA化合物。
本发明的例示的载体包括GBMT转录单元载体单元通过腺病毒晚期启动子刺激编码序列的转录。本领域的技术人员了解许多本领域常见的真核启动子，增强子，和表达载体，比个运用它们表达DNA序列，制备本发明的蛋白C的衍生物。本领域技术人员还了解可以在无增强子元件时发挥功能的真核表达载体。本发明的关键在于新的DNA序列和相应的具有截断的重链的aPC。
在此所述的活化的蛋白C多肽也可通过将活化的蛋白C与凝血酶反应从重链C末端裂解四肽(残基416-419)制备。裂解如下进行，将aPC暴露给凝血酶一段时间，在适当条件下10分钟到3-5小时。通过用凝血酶处理r-aPC制备的aPC多肽或通过真核细胞直接表达制备的aPC具有与aPC相同的活性。因此，具有截短的重链的aPC在对人血栓形成疾病的治疗中有效，对人血栓形成疾病的治疗包括对蛋白C缺失的，血管闭塞失调和包括脓毒，弥散性血管内凝血，紫癜爆发，重大创伤，重大外科手术，烧伤，成人呼吸窘迫综合症，移植，深静脉血栓形成，肝素诱导的血小板减少，镰状细胞贫血病，地中海贫血症，病毒性出血热，血栓形成血小板减少性紫癜，和溶血性尿毒综合症血凝过快状态以及包括血栓形成失调和造成血栓形成的疾病如中风，心肌梗塞的置换治疗，方法为施用具有截短的重链的分离的人蛋白C多肽。
本发明的另一个实施方案是治疗血栓形成失调的方法，包括给需要治疗的患者施用药学有效量的带有截短的重链的分离的人蛋白C多肽和抗血小板剂。
本发明的另一个实施方案为治疗脓毒的方法，包括向患者施用药物有效量的具有截短的重链的人蛋白C多肽和细菌渗透性增加蛋白。
具有截短的重链的分离的人蛋白C多肽可加药物允许的稀释基制剂为aPC的类似物的形式。稀释剂优选包括糖，如蔗糖，盐和柠檬酸盐缓冲液。优选的，aPC衍生物在pH5.5-6.5条件下制备。通常，在此所述的aPC衍生物的药学剂量与天然aPC类似，优选0.01mg/kg/hr到O.05mg/kg/hr。
以下制备和实施例仅用于例示。本领域技术人员了解其它制备活化的重组蛋白C的方法。
制备1人蛋白C的制备运用本领域技术人员熟知的技术，如在美国专利4,981,952中所述，从人肾293细胞重制备重组人蛋白C，美国专利4,981,952在此全文纳入参考文献。美国专利2,775,624公开并要求保护编码人蛋白C的基因，在此也全文纳入参考文献。用于在293细胞中表达人蛋白C的质粒为质粒pLPC，在公开于美国专利4,992,373和美国专利5,661,002，在此全文纳入参考文献。质粒pLPC的结构也公开于欧洲专利公开0445939，和Grinnell等，1987，生物技术5:1189-1192，在此全文纳入参考文献。简要的，该质粒转染到293细胞，然后鉴定稳定转化体，在无血清培养基中传代培养生长。发酵后，微量过滤获得无细胞培养基。
从培养液分离人蛋白C，使用美国专利4,981,952中技术的改进方法，在此全文纳入参考文献。澄清的培养基以4mM溶在EDTA中，后吸收到阴离子交换树脂(Fast-Flow Q,Pharmacia)。4体积20mMTris,200mM NaCl,pH7.4和2体积20mM Tris,150mM NaCl,pH7.4洗，结合的重组人蛋白C酶原用20mM Tris,150 mM NaCl,10mM CaCl2,pH7.4洗脱。洗脱后的蛋白经SDS-聚丙酰胺凝胶电泳测定纯度高于95％。
蛋白的进一步纯化如下进行，蛋白3M溶在NaCl中，后吸附到疏水相互作用树脂(Toyopearl Phenyl 650M,TosoHaas),在20mM Tris，3M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4中平衡。用2体积无CaCl2的平衡缓冲液洗2次，重组人蛋白C用20mM Tris,pH7.4洗脱。洗脱的蛋白移除残余钙。重组人蛋白C通过金属亲合柱(Chelex-100,Bio-Rad)，移去钙并再次与阴离子交换柱(Fast-Flow Q,Pharmacia)结合。这些柱按系列安排并在20mM Tris,150mM NaCl,5mMEDTA,pH7.4中平衡。加入蛋白后，Chelex-100柱在将其从系列中拆开前用一体积相同的缓冲液洗。阴离子交换柱先用3体积平衡缓冲液洗，后用0.4 M NaCl,20mM Tris-醋酸，pH6.5洗脱蛋白。重组人蛋白C和重组活化的蛋白C溶液的蛋白浓度分别在UV 280nm，消光系数0.1％=1.81或1.85测。
制备2重组人蛋白C的活化牛凝血酶在40mM HEPES,pH7.5的存在下与活化的CH-Sepharose4B(Pharmacia)在4℃偶联。偶联反应在装入柱的树脂上进行，使用约5000单位凝血酶/ml树脂。凝血酶溶液循环通过柱约3小时，后加MEA到循环溶液至浓度0.6ml/l。含MEA的溶液循环10-12小时，直到树脂上未反应的胺完全封阻为止。阻断后，凝血酶偶联的树脂用10体积1M nAcL,20Mm Tris,pH 6.5洗，去除非特异性结合的蛋白，在活化缓冲液中平衡后，用于活化反应。
纯化的rHPC 5mM溶于EDTA中(螯合任何残留的钙)，用20mMTris,pH7.4或20mM Tris-醋酸，pH 6.5稀释到浓度为2mg/ml。此溶液通过37℃50mM NaCl或20mM Tris pH 7.4或20mM Tris-醋酸pH6.5平衡的凝血酶柱。调整流速使rHPC和凝血酶树脂之间的接触时间约20分钟。收集流出物，立即测其酰胺裂解活性。如该物质不具有相当于aPC已确定的标准的特异活性(酰胺裂解)，降其重加到凝血酶柱直到活化rHPC。然后将此物质按1∶1用以上20mM缓冲液稀释，pH7.4或6.5在等待下一步时保持aPC在低浓度。
从aPC物质移除沥滤的凝血酶，将aPC与在含150mM NaCl的活化缓冲液(20mM Tris,pH 7.4或20mM Tris-醋酸，pH6.5)中平衡的阴离子交换树脂(Fast-Flow Q,Pharmacia)结合。在此条件下，凝血酶不与阴离子交换树脂作用，而通过柱进入点样洗脱物。一旦aPC与柱结合，用20mM平衡缓冲液2-6体积柱，而后用一步洗脱液(0.4M NaCl溶于5mM Tris-醋酸，pH6.5或20mM Tris,pH 7.4)洗脱结合的aPC。更多体积的洗加速更完全去除十二肽。
活化的蛋白C的抗凝结活性取决于对活化的部分组织促凝血酶原激酶时间(APTT)凝块分析的凝块时间的延长测定。标准曲线在稀释缓冲液(1mg/mL放射免疫测定级牛血清白蛋白(BSA),20mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,0.02％NaN3)制备，蛋白C浓度范围从125-1000ng/mL，样品制备为在此浓度范围内的几种稀释液。每个样品试管中加入50微升冰冷的马血浆和50微升重组的活化的部分组织促凝血酶原激酶时间试剂(APTT试剂Sigma)，37℃温育5分钟。温育后，向每管加入50微升适当样品或标准。以稀释缓冲液替代样品或标准确定基本凝块时间。Fibrometer(CoA Screener HemostasisAnalyzer,American Labor)的计时器在37℃向样品或标准加入50微升30 mM CaCl2后立即启动。样品中活化的蛋白C浓度从标准曲线的线性回归方程式计算得出。在此报道的凝块时间为3次重复的最小值的平均数，包括标准曲线样品。
实施例1脱416-419活化的蛋白C的制备
aPC用作制备脱416-419活化的蛋白C的起始材料。使用固定化的凝血酶树脂(10mg凝血酶/ml CH-Sepharose 4B树脂)。N-糖苷酶F购自Boehringer Mannheim。马血浆为AnimalTechnologies,Inc.(Tyler,TX)产品。活化的CH Sepharose4B购自Pharmacia Biotech。其它所有试剂为ACS试剂级，可从商业渠道获得。
将6mL固定化的凝血酶树脂加入0.2微米滤器。约5×20mL 40mMTris缓冲液，pH 7.02洗树脂。洗过的固定化的凝血酶树脂转移到50mL聚丙烯小管，向管中加入一份12mL 2.67mg/mL aPC溶液(120mgaPC溶于45ml pH7.02的40mM tris缓冲液中)，Tris缓冲液将悬液最终体积补到约21mL。悬液在室温温育，不断轻微搅动。温育10,25,50,100,160和240分钟后，从小管移出3mL液体。这些移出部分200RPM(ICE CRU-5000离心机)离心1分钟，上清转到1.5mL聚丙烯小管。这些小管立即置于干冰中冷冻溶液。同时用不含固定化的凝血酶的Ch-Sepharose 4B树脂制备对照样品。
蛋白含量分析。每分(150mcL)样品溶液用450mcL的40mM tris缓冲液，pH7.02或试剂水稀释。样品细胞用样品溶液洗两次，测定溶液的UV吸收度(=280nm)。Tris缓冲液或试剂水用作测定的空白。
蛋白多肽分布的LC/MS分析。约600mcL每份的样品溶液与240mg脲，88mcL 3M tris缓冲液(pH=8.0)和15mcL50mg/mL二硫苏糖醇混合，混合物在37℃温育30分钟。加入50mcL50mg/mL碘乙酰胺溶液烷化，黑暗中室温温育30分钟。样品在一次性凝胶过滤柱上去盐，N-糖苷酶F去糖基化，LC/MS分析。
RP-HPLC分析。300-400微升一份的解冻样品溶液与足够体积的0.1％TFA溶液混合，得到约1mg/mL溶液。此溶液用作高浓度样品。低浓度样品通过将50mcL一份的高浓度样品与450mcL的0.1％TFA溶液混合制备。100微升每份的酶中高浓度及低浓度样品注入到HPLC系统。
APTT分析。样品通过自动活化的部分组织促凝血酶原激酶时间(APTT)CoaLab分析仪分析。所有样品用人工移液管稀释到终浓度在410ng和420ng aPC/mL之间。分析中使用303/de aPC参考标准。如上所述制备的脱(416-419)aPC通过APTT分析测定，具有与天然aPC相同的生物学活性。APTT抗凝结活性和脱416-419aPC的百分比间的关系见表1。脱16-419aPC的百分比可高至68％而仍保持与天然aPC相同的抗凝结活性。通常，用在此描述的方法制备的aPC包括从1％到25％的脱416-419 aPC。
序列表<110>伊莱利利公司<120>蛋白C多肽<130>蛋白C截短的重链<140>x12279<141>1999-06-02<160>2<170>patentIn ver.2.0<210>1<211>1244<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述C末端截短的重组人蛋白C<400> 1gccaactcct tcctggagga gctccgtcac agcagcctgg agcgggagtg catagaggag 60atctgtgact tcgaggaggc caaggaaatt ttccaaaatg tggatgacac actggccttc 120tggtccaagc acgtcgacgg tgaccagtgc ttggtcttgc ccttggagca cccgtgcgcc 180agcctgtgct gcgggcacgg cacgtgcatc gacggcatcg gcagcttcag ctgcgactgc 240cgcagcggct gggagggccg cttctgccag cgcgaggtga gcttcctcaa ttgctcgctg 300gacaacggcg gctgcacgca ttactgccta gaggaggtgg gctggcggcg ctgtagctgt 360gcgcctggct acaagctggg ggacgacctc ctgcagtgtc accccgcagt gaagttccct 420tgtgggaggc cctggaagcg gatggagaag aagcgcagtc acctgaaacg agacacagaa 480gaccaagaag accaagtaga tccgcggctc attgatggga agatgaccag gcggggagac 540agcccctggc aggtggtcct gctggactca aagaagaagc tggcctgcgg ggcagtgctc 600atccacccct cctgggtgct gacagcggcc cactgcatgg atgagtccaa gaagctcctt 660gtcaggcttg gagagtatga cctgcggcgc tgggagaagt gggagctgga cctggacatc 720aaggaggtct tcgtccaccc caactacagc aagagcacca ccgacaatga catcgcactg 780ctgcacctgg cccagcccgc caccctctcg cagaccatag tgcccatctg cctcccggac 840agcggccttg cagagcgcga gctcaatcag gccggccagg agaccctcgt gacgggctgg 900ggctaccaca gcagccgaga gaaggaggcc aagagaaacc gcaccttcgt cctcaacttc 960atcaagattc ccgtggtccc gcacaatgag tgcagcgagg tcatgagcaa catggtgtct 1020gagaacatgc tgtgtgcggg catcctcggg gaccggcagg atgcctgcga gggcgacagt 1080ggggggccca tggtcgcctc cttccacggc acctggttcc tggtgggcct ggtgagctgg 1140ggtgagggct gtgggctcct tcacaactac ggcgtttaca ccaaagtcag ccgctacctc 1200gactggatcc atgggcacat cagagacaag gaagcccccc agaag 1245<210>2<211>415<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述C末端截短的重组人蛋白氨基的序列<400>2Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu1 5 10 15Cys Ile Glu Glu Ile Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln20 25 30Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp35 40 45Gln Cys Leu Val Leu Pro Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys50 55 60Gly His Gly Thr Cys Ile Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys65 70 75 80Arg Ser Gly Trp Glu Gly Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu85 90 95Asn Cys Ser Leu Asp Asn Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu100 105 110Val Gly Trp Arg Arg Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp115 120 125Asp Leu Leu Gln Cys His Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro130 135 140Trp Lys Arg Met Glu Lys Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu145150 155 160Asp Gln Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr165 170 175Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys180 185 190Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His Pro ser Trp Val Leu Thr195 200 20权利要求
1．一种分离的人蛋白C多肽，包括一条轻链和一条截短的重链。
2．权利要求1的多肽，其中所述多肽为SEQ ID NO:1。
3．一种编码权利要求1的人蛋白C多肽的重组DNA分子。
4．权利要求3的重组DNA分子，其中所述DNA分子是SEQ IDNO:2。
5．权利要求1的分离的人蛋白C多肽，其中所述人蛋白C多肽为活化的。
6．一种在需要治疗的患者中治疗患者的血栓形成失调，血管闭塞失调和凝血过快状态的方法，该方法包括向所述患者施用药学上有效量的权利要求1的具有截短的重链的分离的活化的蛋白C多肽。
7．一种包含权利要求2的核酸的载体。
8．一种包含权利要求2的分离的核酸的宿主细胞。
全文摘要
本发明描述了带有一段截短的重链的分离的人蛋白C多肽。该分离的多肽保留了野生型人蛋白C的生物活性。此种多肽对血管闭塞失调,血凝过快,血栓形成失调及造成血栓形成的疾病的治疗有用。
文档编号C12N15/09GK1303428SQ99806859
公开日2001年7月11日 申请日期1999年6月1日 优先权日1998年6月1日
发明者L·黄, R·M·里金 申请人:伊莱利利公司