三大类菌混合液体发酵、固体发酵物饲料添加剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及到的是两种饲料添加剂，特别涉及三大类菌液体发酵、固体发酵饲料 添加剂及其制备方法，属微生物发酵领域。
【背景技术】
[0002] 混菌发酵是指两种或两种以上的微生物协同作用，共同完成某一目的新型发酵技 术。混菌发酵具有很强的独特性，能够以一类菌体的代谢产物成为另一类菌的营养物质，并 且能够获取某些单一发酵无法得到的产物，发酵代谢产物具有累加效应，发酵代谢产物利 用率高等优点。
[0003] 近年来微生物制剂产品应用越来越广泛，在制药方面更，生物制药工程已经成为 制药行业发展的重点；环境工程方面，污水处理，空气净化方面也得到了很大的应用；农业 方面，微生物先天所具有的改良土壤、解磷、解钾、促进植物吸收、防治病害方面也起到的巨 大的作用；饲料方面，在肠道内的种群优势作用、夺氧杀菌作用、提早建立免疫体统作用，促 进饲料利用率方面都起到了至关重要的作用。
[0004] 目前市场上流通的大多是以单菌干粉的形式存在，优势在于便宜保存，菌数多等 优点，同时存在代谢产物少，菌数高在饲料中添加混合是否均匀，在动物体内多久可以复 苏，如养殖户添加药物，菌剂基本上起不到作用等不利因素。
【发明内容】
[0005] 鉴于益生菌菌剂现有特性，本发明提供了采用三大类菌种酵母菌、乳酸菌和芽孢 杆菌的混合液体发酵和固体发酵形式得到液体饲料添加剂和固体饲料添加剂，该添加剂天 然、安全、绿色、营养价值高、能够预防疾病、提高机体免疫能力。
[0006] 本发明提供了利用这三大类菌混合液体发酵饲料添加剂的方法，具有菌数高、无 污染、通过饮水利用快的优点；还提供了这三大类菌混合固体发酵饲料添加剂的方法，产物 具有活力高、有丰富的代谢产物、发酵具有特殊酸香味，更容易吸引采食对象等优点。
[0007] 本发明使用的菌种是乳酸菌类5种菌：CGMCC1. 0557植物乳杆菌、CGMCC1. 1854嗜 酸乳杆菌、CGMCC1. 1480保加利亚乳杆菌、CICC6026植物乳杆菌、ACCC10637嗜酸乳杆菌；酵 母菌类3种菌：CGMCC2. 0120产朊假丝酵母、ACCC20060产朊假丝酵母、安琪酵母；芽孢杆菌 类6种菌： CGMCC1. 2009凝结芽孢杆菌、CGMCC1. 0813地衣芽孢杆菌、CGMCC1. 1806枯草芽孢杆菌、CGMCC1. 0504枯草芽孢杆菌、ACCC10619枯草芽孢杆菌、CICC10262纳豆芽孢杆菌。
[0008] 本发明是通过下述技术方案实现的： 液体发酵饲料添加剂的添加量在畜禽饮水中添加〇. 5%-3% ;固体发酵饲料添加剂在畜 禽饲料的0. 5%-5% ; 本发明提供的三大类菌混合液体发酵物饲料添加剂的制备方法包括以下步骤： a. 母种培育：将上述乳酸菌5种菌分别取0. 5ml菌液接种到已灭菌装有液体培养基的 试管中，在37°C条件下厌氧培养48小时，母种备用； 所述液体培养基为MRS乳酸菌培养基和鲜奶培养基； 将上述酵母菌3种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在28°C条件下培 养24小时，母种备用； 所述斜面培养基为PDA培养基； 将上述芽孢菌类6种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在37°C条件下 培养12小时，母种备用； 所述斜面培养基为LB培养基； b. 二级种子培养：将上述a所述的母种乳酸菌5种菌按照1%的接种量注入500ml液 体培养基中，在37°C条件下厌氧静置培养48小时，得液态菌液； 将上述a所述的母种酵母菌3种菌分别用蒸馏水洗脱后均匀涂布到装有固体培养基的 茄子瓶中，在28°C条件下静置培养24小时，得固态菌种，使用时用蒸馏水洗脱； 将上述a所述的母种芽孢菌6种菌分别用接种环接种到装有液体培养基的三角瓶中， 在37°C条件下气浴摇床中震荡培养12小时，得液体菌液； c. 将上述b所得的菌种全部接种到装有750L培养基的1000L发酵罐中37°C培养先厌 氧培养48小时，后耗氧培养24小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为 0. 02L-0. 5L，接种量为1%-5%。c所述的培养基为：葡萄糖5%，乳清粉0. 5%，硫酸铵0. 4%，酵 母膏0. 4%，氯化钠1%，磷酸氢二钾0. 1%，硫酸镁0. 02%，鲜奶3%，消泡剂0. 02%，其余为水；初 始ph为7。
[0009] 本发明提供的三大类菌混合固体发酵物饲料添加剂的制备方法包括以下步骤： a. 母种培育：同上述液体发酵物饲料添加的制备方法； b. 二级种子培养：同上述液体发酵物饲料添加的制备方法： c. 将上述b所得的菌液，乳酸菌接种到750L培养基的1000L乳酸菌发酵罐中，37°C培 养厌氧培养48小时；酵母菌接种到750L培养基的1000L酵母菌发酵罐中，28°C培养耗氧培 养24小时；芽孢菌接种到750L培养基的1000L芽孢菌发酵罐中，37°C培养耗氧、搅拌培养 16小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为 0? 02L-0. 5L，接种量为 1%-5% ; d. 将上述c培养好的菌液按照1:1:1的转移到已空消灭菌后的3000L发酵罐中，混合 均匀备用； e. 将上述d培养好的菌液按照5%-20%的比例接种到灭菌冷却后的固体培养基中，搅匀 后用呼吸袋按照50kg/袋包装，密封后堆放到无菌室内发酵，发酵时间不小于7天，温度控 制不低于28°C，不高于37°C; c要求的液体培养基，乳酸菌液体培养基的配方为：葡萄糖10%，酵母膏0. 5%，酪蛋白胨 0. 5%，柠檬酸氢二铵0. 2%，磷酸氢二钾0. 2%，乙酸钠0. 5%，硫酸锰微量，吐温-80 0. 1%，硫酸 镁0. 02%，乳清粉0. 2%，硫酸铵0. 2%，鲜奶4%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph6 ; 酵母菌培养基的配方为：葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏0. 5%，玉米面5%，糖化酶 0. 05%，尿素0. 1%，硫酸铵0. 1%，乳清粉2%，碳酸钙2%，其余为水，初始ph自然； 芽孢杆菌培养基配方为：氯化钠1%，葡萄糖10%，大豆蛋白胨1%，酵母膏〇. 5%，硫酸铵 0. 5%，磷酸氢二钾0. 2%，乳清粉2%，其余为水，初始ph为7 ; e.要求的固体培养基配方为：纤维饲料4%，玉米5%，沸石粉10%，米糠30%，硫酸铵2%， 尿素1%，乳清粉5%，葡萄糖5%，糖蜜15%，菌液5%-20%，其余为水。
[0010] 本发明通过合理的设计发酵时间、过程控制、接种量、固体发酵形式，使益生菌的 这三大类菌体都能保持稳定的活性和含有丰富的大量代谢产物。
[0011] 本发明的优点及有益效果为： 1、 本发明制备的混合液体发酵物饲料添加和固体发酵物饲料添加剂天然、安全、绿色、 无污染，能预防疾病，提高机体的免疫能力； 2、 本发明可根据用户自己的意愿选择混合液体发酵物饲料添加或者固体发酵物饲料 添加剂，方便用户； 3、 本发明为液体或30%-40%的湿固体发酵产品，在机体内活化时间短，见效快； 4、 本发明除了具有大量的有益菌外，还含有其生长过程中大量的优势代谢产物，如多 糖、肽、氨基酸和维生素等物质，更有益于机体营养的补充； 5、 固体发酵物饲料添加剂具有特殊酸香味，更容易吸引采食对象，促进采食量。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 以三大类菌混合液体发酵物饲料添加剂，具体步骤如下： a. 母种培育：将上述乳酸菌5种菌分别取0. 5ml菌液接种到已灭菌装有液体培养基的 试管中，在37°C条件下厌氧培养48小时，母种备用； 所述液体培养基为MRS乳酸菌培养基和鲜奶培养基； 将上述酵母菌3种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在28°C条件下培 养24小时，母种备用； 所述斜面培养基为PDA培养基； 将上述芽孢菌类6种菌分别划斜面到灭菌后装有固体培养基的试管中，在37°C条件下 培养12小时，母种备用； 所述斜面培养基为LB培养基； b. 二级种子培养：将上述a所述的母种乳酸菌5种菌按照1%的接种量注入500ml液 体培养基中，在37°C条件下厌氧静置培养48小时，得液态菌液； 将上述a所述的母种酵母菌3种菌分别用蒸馏水洗脱后均匀涂布到装有固体培养基的 茄子瓶中，在28°C条件下静置培养24小时，得固态菌种，使用时用蒸馏水洗脱； 将上述a所述的母种芽孢菌6种菌分别用接种环接种到装有液体培养基的三角瓶中， 在37°C条件下气浴摇床中震荡培养12小时，得液体菌液； c. 将上述b所得的菌种接种到装有750L培养基的1000L发酵罐中37°C培养先厌氧培 养48小时，后耗氧培养24小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为0. 2L， 接种量为5%。
[0013] 实施例2以三大类菌混合液体发酵物饲料添加剂，具体步骤如下： 母种培育，二级种子培养同实施实例1a、b c. 上述b所得的菌液，乳酸菌接种到750L培养基的1000L乳酸菌发酵罐中，37°C培养 厌氧培养48小时；酵母菌接种到750L培养基的1000L酵母菌发酵罐中，28°C培养耗氧培养 24小时；芽孢菌接种到750L培养基的1000L芽孢菌发酵罐中，37°C培养耗氧、搅拌培养16 小时； 所述操作均在无菌环境中进行，培养基均进过高温灭菌冷却过程； 所述通气为通入经无菌过滤的洁净空气，通气量为每升培养基每分钟通气量为〇. 2L， 接种量为3% ; d