离子交换膜的从细胞结合剂细胞毒性剂缀合物中去除杂质的用图
【专利说明】离子交换膜的从细胞结合剂细胞毒性剂缀合物中去除杂质 的用途 相关申请的交叉引用 本专利申请要求2012年10月4日提交的美国临时专利申请No. 61/709, 871的权益， 所述专利通过引用并入。 通过引用并入电子方式提交的材料 随同同时提交的且如下鉴定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表通过引用整体并 入本文：创建于2013年10月3日的名称为"714288SequenceListing. TXT"的一个8, 279 个字节ASCII(文本）文件。 发明背景 可用于治疗癌症和其它疾病的抗体-药物缀合物通常由三种不同的元件组成：细胞结 合剂；接头；和细胞毒性剂。常用的制造方法之一包括：修饰步骤，其中细胞结合剂与双官 能接头反应以形成共价连接于具有反应性基团的接头的细胞结合剂；纯化步骤，其中修饰 的抗体从修饰反应的其它组分中纯化；缀合步骤，其中修饰的细胞结合剂与细胞毒性剂反 应以形成所述接头（使用反应性基团）至细胞毒性剂的共价化学键，以及第二纯化步骤，其 中所述缀合物从缀合反应的其它组分中纯化。 最近的临床试验已经示出抗体-药物缀合物在治疗许多不同类型的癌症中的有希望 的作用。因此，需要生产可用于治疗患者的高纯度且高稳定性的缀合物。尽管在制备抗 体-药物缀合物中取得进步，但当前的方法受若干因素的限制。例如，由这些方法产生的缀 合物包含增加量的杂质，所述杂质包括游离细胞毒性剂（如，细胞毒性剂二聚体相关的物 质）和/或高分子量物质（如，二聚体和其它更高阶聚集物）。在本领域中利用的当前纯 化方法，诸如正切流动过滤和吸附色谱法，不能高效地去除这些杂质而未显著降低产量和/ 或对于大规模生产工艺为难处理的。 因此，仍需要制备比由当前方法产生的抗体-药物缀合物更稳定且纯度更高的改善的 方法。本发明提供此类方法。本发明的这些和其它优势以及另外的发明特征将从本文提供 的发明描述中显而易见。 发明概述 本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，所述方法包括使包 含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜以从混 合物中去除至少部分所述杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。本发明还 包括包含化学偶联至根据本文所述的方法制备的细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物。 发明详述 本领域普通技术人员将理解包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂（诸如抗体）的 缀合物（"抗体-细胞毒性剂缀合物"）通常通过以下制备：在低pH(S卩，pH7.0或以下） 下用双官能交联剂修饰抗体，纯化具有结合至其的接头的抗体，将细胞毒性剂缀合至具有 结合至其的接头的抗体，以及纯化所述抗体-细胞毒性剂缀合物。最近，已经通过使稳定结 合至细胞结合剂的接头的量最大化并且使导致缀合物不稳定的不期望的副反应最小化开 发了产生增强稳定性的缀合物的方法。例如，已经开发了这样的方法，其中用于制备缀合物 的方法在一个步骤中（参见，如，在美国专利申请公布No. 2012/0253021中所述的方法）和 /或在高的pH(如，pH7或以上）（参见，如，国际专利申请公布No.WO2012/135522中所 述的方法）下进行以便增加具有稳定结合至其的接头的细胞结合剂的期望物质的水平并 降低不期望的反应产物（如，具有不稳定结合至其的接头的细胞结合剂）的水平。尽管此 类方法产生增强稳定性的缀合物，但已经发现这些方法产生具有增加水平的杂质（诸如游 离细胞毒性剂（如，细胞毒性剂二聚体相关的物质）和/或高分子量物质（如，二聚体和其 它更高阶聚集物））的缀合物。本领域利用的当前纯化方法，诸如正切流动过滤和吸附色谱 法，不能高效地去除这些杂质而未显著降低产量和/或对于大规模生产工艺为难处理的。 令人惊讶地发现离子交换色谱膜可用于从包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合 物中去除至少部分杂质。特别地，出乎意料地发现，通过使混合物经历离子交换色谱膜，游 离细胞毒性剂（如，细胞毒性剂二聚体相关的物质）可有效地且高效地从包含细胞结合剂 细胞毒性剂缀合物的混合物中去除。因此，本发明提供用于制备增加纯度和稳定性的细胞 结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法，其包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或 多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜。 本发明提供用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，其包括使包含细胞 结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜以从混合物去 除至少部分杂质，从而提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。离子交换色谱膜可用于 去除通常见于包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物的多种杂质。例如，离子交换色 谱膜可用于去除一种或多种选自细胞毒性剂二聚体、细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集 物、游离细胞毒性剂、未缀合接头以及它们的混合物的杂质。 在一个实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含呈杂质的细胞毒 性剂二聚体，并且离子交换色谱膜从混合物中去除一些部分的细胞毒性剂二聚体以提供纯 化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合 物的混合物包含呈杂质的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的聚集物，并且离子交换色谱膜从 混合物中去除一些部分的细胞结合剂细胞毒性剂的聚集物以提供纯化的细胞结合剂细胞 毒性剂缀合物。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含呈杂 质的游离细胞毒性剂，并且离子交换色谱膜从混合物中去除一些部分的游离细胞毒性剂以 提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性 剂缀合物的混合物包含呈杂质的未缀合接头，并且离子交换色谱膜从混合物中去除一些部 分的未缀合接头以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。 在优选实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包含呈杂质的彼此通 过接头（如，DM1-MCC-DM1 ;DM1-SPP-DM1 ;或DM1-CX1-1-DM1)化学偶联的细胞毒性剂二聚 体，并且离子交换色谱膜从混合物中去除彼此通过接头（如，DM1-MCC-DM1 ;DM1-SPP-DM1 ; 或DM1-CX1-1-DM1)化学偶联的一些部分的细胞毒性剂二聚体以提供纯化的细胞结合剂细 胞毒性剂缀合物。在另一优选实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物包 含呈杂质的彼此未通过接头（如，DM1-DM1)化学偶联的细胞毒性剂二聚体，并且离子交换 色谱膜从混合物中去除一些部分的彼此未通过接头（如，DM1-DM1)化学偶联的细胞毒性剂 二聚体以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。 当包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱 膜时，所得纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物包含的至少一种或多种杂质水平与在使混 合物经历离子交换色谱膜之前的混合物中的一种或多种杂质水平相比较有所降低。例如， 与在使混合物经历离子交换色谱膜之前的混合物中的一种或多种杂质水平相比较，离子交 换色谱膜去除混合物中的至少5 %、至少10 %、至少15 %、至少20 %、至少25 %、至少30 %、 至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至 少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99 %或甚至100 %的一种或多种杂质。在一个实施方案中，与在使混合物经历离子交换色谱 膜之前的混合物中的一种或多种杂质水平相比较，离子交换色谱膜去除混合物中的约10 % 至约100%、约10%至约90%、约20%至约100%、约20%至约90%、约20%至约80%、约 30%至约100%、约30%至约90%、约30%至约80%、约40%至约80%、约40%至约90%、 约40%至约100%、约50%至约80%、约50%至约90%、约50%至约100% (如，约60%至 约90%、约70%至约90% )、约60%至约100%、约70%至约100%、约80%至约100%、约 90%至约100%或约95%至约100% (如，约96%至约100%、约97%至约100%、约98% 至约100%、约99%至约100%、约95%至约96%、约95%至约97%、约95%至约98%或约 95 %至约99% )的一种或多种杂质。 在一个实施方案中，在使混合物经历离子交换色谱膜之前，调节包含细胞结合剂细胞 毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物的pH。包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一 种或多种杂质的混合物的pH优选为约4至约9 (如，pH为约4. 5至约8. 5、约5至约8、约 5. 5至约7. 5、约6至约7、约6. 5至约7. 5、约7至约8、约8至约9、约4. 5至约6或约4. 5 至约5)。在一些实施方案中，混合物的pH为约6至约6. 5 (如，pH为5. 5至7、pH为5. 7至 6. 8、pH为5. 8至6. 7、pH为5. 9至6. 6或pH为6至6. 5)，pH为约6或以下（如，pH为约4 至6、约4至约5. 5、约4至约4. 5、约4至约5、约5至6)或pH为约6. 5或以上（如，pH为 6. 5至约9、约6. 5至约7、约7至约9、约7. 5至约9或6. 5至约8)。在一个实施方案中，混 合物的pH大于7. 5 (如，pH为7. 6至约9、7. 7至约9、约7. 8至约9、约7. 9至约9、7. 6至 约8. 5、7. 6至约8、7. 7至约8. 5、7. 7至约8、约7. 8至约8. 4、约7. 8至约8. 2、约8至约9 或约 8 至约 8. 5)。例如，混合物的pH可为pH7. 6、7. 7、7. 8、7. 9、8、8. 1、8. 2、8. 3、8. 4、8. 5、 8. 6、8. 7、8. 8、8. 9或9。在另一实施方案中，混合物的pH为约4. 8 (如，约4. 5至约5、约4. 6 至约5或约4. 7至约4. 9)。 多种离子交换色谱膜为本领域已知的并且可根据本文所述的发明使用。在一个实施 方案中，离子交换色谱膜为阴离子交换膜，诸如Q膜。在另一实施方案中，离子交换色谱膜 为阳离子交换膜，诸如S膜。在一个实施方案中，离子交换色谱膜为内毒素去除交换膜。 Q、S和内毒素（E)膜可商购获得，例如，来自PallCorporationandSartoriusStedim Biotech0 在优选实施方案中，离子交换色谱膜为阴离子交换膜（如，Q膜）。阴离子交换膜为带正 电荷的微孔膜。在一个实施方案中，带正电荷的阴离子交换部分为季铵基团。在一个实施方 案中，带正电荷的微孔膜包含多孔基底和具有悬垂阳离子基团的交联的涂料（参见例如， 美国专利No. 6, 780, 327、6, 851，561、7, 094, 347、7, 223, 341、7, 396, 465 中描述的那些）。在 一个实施方案中，多孔基底为亲水的（如，聚醚砜或交联的纤维素基质）。在另一实施方案 中，阳离子基团为季铵基团。在另一实施方案中，阴离子交换膜为包含多孔的聚醚砜基底和 具有悬垂季铵基团的交联的涂料的带正电荷的微孔膜。 已经描述了用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的多种方法（参见，如，美国专利 申请公布No. 2012/0253021 ;国际专利申请公布No.WO2012/135522 ;美国专利5, 208, 020 ; 美国专利6, 441，163 ;美国专利7, 811，572 ;美国专利申请公布No. 2006/0182750 ;美国专 利申请公布No. 2008/0145374 ;和美国专利申请公布No. 2011/0003969)。 在一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂 的缀合物的方法，其中将修饰反应和缀合反应组合成单步骤，随后为纯化步骤（即，美国专 利申请公布No. 2012/0253021中描述的一步方法），并且其中所述方法包括使包含细胞结 合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在纯化步骤之前或纯化步骤之后经历 离子交换色谱膜。一步方法包括使细胞结合剂（如，抗体）与细胞毒性剂接触以形成包含 细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合 物与包含接头的双官能交联剂在pH为约4至约9的溶液中接触以提供包含细胞结合剂细 胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质（如，游离细胞毒性剂和反应副产物）的第二混合物，其 中细胞结合剂通过接头化学偶联至细胞毒性剂。然后第二混合物经历纯化以提供纯化的细 胞结合剂细胞毒性剂缀合物。包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的第二 混合物在纯化步骤之前，纯化步骤之后或纯化步骤之前和纯化步骤之后经历离子交换色谱 膜。 一步反应优选在pH为约4至约pH9 (如，pH为约4. 5至约8. 5、约5至约8、约5. 5至 约7. 5、约6至约7、约6至约8、约6至约9或约6. 5至约7. 5)下进行。在一些实施方案 中，反应在pH为约6至约8 (如，pH为约6、约6. 5、约7、约7. 5或约8)下进行。 在一个实施方案中，反应在pH为约7. 1、约7. 2、约7. 3、约7. 4、约7. 5、约7. 6、约7. 7、 约 7. 8、约 7. 9、约 8、约 8. 1、约 8. 2、约 8. 3、约 8. 4、约 8. 5、约 8. 6、约 8. 7、约 8. 8、约 8. 9 或 约9下进行。在另一实施方案中，反应在pH为约7. 5至约9、约7. 5至约8. 5、约7. 5至约 8、约7. 8至约9、约7. 8至约8. 5、约7. 8至约8、约8至约9、约8至约8. 5或约8. 5至约9 下进行。在另一实施方案中，反应在pH为约7. 8 (如，pH为7. 6至8. 0或pH为7. 7至7. 9) 下进行。在另一实施方案中，修饰反应在pH为约8 (如，pH为7. 8至8. 2或pH为7. 9至 8. 1)下进行。 在另一实施方案中，反应在pH大于7. 5 (如，pH为7. 6至约9、7. 7至约9、约7. 8至约 9、 约7. 9至约9、7. 6至约8. 5、7. 6至约8、7. 7至约8. 5、7. 7至约8、约7. 8至约8. 4、约7. 8 至约8. 2、约8至约9或约8至约8. 5)下进行。 在一个实施方案中，接触通过以下实现：提供细胞结合剂，然后使细胞结合剂与细胞毒 性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后使包含细胞结合剂与细 胞毒性剂的第一混合物与双官能交联剂接触。例如，在一个实施方案中，在反应容器中提供 细胞结合剂，将细胞毒性剂加入至反应容器（从而接触细胞结合剂），然后将双官能交联剂 加入至包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物中（从而接触包含细胞结合剂和细胞毒性 剂的混合物）。在一个实施方案中，在反应容器中提供细胞结合剂，并在向容器提供细胞结 合剂之后立即将细胞毒性剂加入至反应容器中。在另一实施方案中，在反应容器中提供细 胞结合剂，并在向容器提供细胞结合剂之后的时间间隔（如，在向空间提供细胞结合剂之 后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1天或 更久）后将细胞毒性剂加入至反应容器中。可迅速地（即，短的时间间隔内，诸如约5分钟， 约10分钟）或缓慢地（诸如通过使用栗）加入细胞毒性剂。 然后，包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物可与双官能交联剂在细胞结合剂与细 胞毒性剂接触之后立即接触或在细胞结合剂与细胞毒性剂接触之后某个较迟点（later point)(如，约5分钟至约8小时或更久）接触。例如，在一个实施方案中，在将细胞毒性剂 加入至包含细胞结合剂的反应容器中之后立即将双官能交联剂加入至包含细胞结合剂和 细胞毒性剂的混合物中。或者，在细胞结合剂与细胞毒性剂接触之后约5分钟、约10分钟、 约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7 小时、约8小时或更久，包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物可与双官能交联剂接触。 在另一实施方案中，通过多个循环（如，1、2、3、4、5或更多个循环）加入细胞毒性剂和 双官能剂。例如，本发明提供了包括以下步骤的方法：a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触 以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物；然后使第一混合物与包含接头的双官 能交联剂在pH为约4至约9的溶液中接触以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一 种或多种杂质（如，游离细胞毒性剂和反应副产物）的第二混合物，其中细胞结合剂通过接 头化学偶联至细胞毒性剂；b)使第二混合物与细胞毒性剂接触以形成第三混合物；然后使 第三混合物与双官能交联剂在pH为约4至约9下接触以提供第四混合物；以及c)纯化第 四混合物以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在一个实施方案中，在步骤a)之后 的时间间隔（如，约1小时、约2小时、约3小时或更久）后进行步骤b)。在另一实施方案 中，在进行步骤c)之前，可将步骤b)重复若干次（如，1、2、3、4或更多次）。可在起始步骤 b)之后的时间间隔（如，约1小时、约2小时、约3小时或更久）后进行另外的步骤b)。 在另一实施方案中，在完成加入细胞毒性剂之前加入双官能交联剂。例如，在一个实施 方案中，在时间间隔（如，经约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小 时或更久）内将细胞毒性剂连续地加入至细胞结合剂中以形成包含细胞结合剂和细胞毒 性剂的混合物。在结束加入细胞毒性剂之前，将双官能交联剂加入至包含细胞结合剂和细 胞毒性剂的混合物中，条件是任何时间，细胞毒性剂摩尔过量于双官能交联剂。在一个实施 方案中，在时间间隔内（如，经约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3 小时或更久）连续地加入双官能交联剂。 在包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联剂接触之后，使反应进行约1 小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、 约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小 时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或更久 (如，约30小时、约35小时、约40小时、约45小时或约48小时）。 因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合 物的方法，所述方法包括使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒 性剂的第一混合物，然后使第一混合物与包含接头的双官能交联剂在pH为约4至约9的溶 液中接触以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的第二混合物，所述缀合物包含通过接 头化学偶联至细胞毒性剂和一种或多种杂质的细胞结合剂；(b)使第二混合物经历离子交 换色谱膜以去除至少部分杂质，从而提供细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合 物；以及（C)在步骤（b)之后使纯化的第二混合物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附 色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合以从杂质中进一步纯化细胞结合剂-细胞毒 性剂缀合物并且从而制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的纯化的第三混合物，其中与纯 化的第二混合物相比，纯化的第三混合物包含杂质的量有所减少。本文所述的任何纯化方 法可用于发明方法中。在优选实施方案中，利用正切流动过滤、吸附色谱法或非吸附色谱法 作为纯化步骤。 在本发明的一个实施方案中，使细胞结合剂与双官能交联剂（即，修饰反应）接触产生 包含具有结合至其的接头的细胞结合剂和一种或多种杂质（如，反应物和其它副产物）的 第一混合物。在本发明的一些实施方案中，第一混合物包含具有稳定和不稳定结合至其的 接头的细胞结合剂和一种或多种杂质（如，反应物和其它副产物）。在一段时间内于正常储 存条件（范围可为几个月至几年）下当接头和细胞结合剂之间的共价键大体上未变弱或断 裂时，接头"稳定地"结合至细胞结合剂。相比之下，在一段时间内于正常储存条件（范围 可为几个月至几年）下当接头和细胞结合剂之间的共价键大体上变弱或断裂时，接头"不 稳定地"结合至细胞结合剂。 修饰反应优选在pH为约4至约pH9 (如，pH为约4. 5至约8. 5、约5至约8、约5. 5至 约7. 5、约6至约7、约6至约8、约6至约9或约6. 5至约7. 5)下进行。在一些实施方案 中，修饰反应在pH为约6至约8 (如，pH为约6、约6. 5、约7、约7. 5或约8)下进行。 在一个实施方案中，修饰反应在pH为约7. 1、约7. 2、约7. 3、约7. 4、约7. 5、约7. 6、约 7. 7、约 7. 8、约 7. 9、约 8、约 8. 1、约 8. 2、约 8. 3、约 8. 4、约 8. 5、约 8. 6、约 8. 7、约 8. 8、约 8. 9 或约9下进行。在另一实施方案中，修饰反应在pH为约7. 5至约9、约7. 5至约8. 5、约7. 5 至约8、约7. 8至约9、约7. 8至约8. 5、约7. 8至约8、约8至约9、约8至约8. 5或约8. 5 至约9下进行。在另一实施方案中，修饰反应在pH为约7. 8 (如，pH为7. 6至8.O或pH为 7. 7至7. 9)下进行。在另一实施方案中，修饰反应在pH为约8 (如，pH为7. 8至8. 2或pH 为7. 9至8. 1)下进行。 在另一实施方案中，修饰反应在pH大于7. 5 (如，pH为7. 6至约9、7. 7至约9、约7. 8 至约9、约7. 9至约9、7. 6至约8. 5、7. 6至约8、7. 7至约8. 5、7. 7至约8、约7. 8至约8. 4、 约7. 8至约8. 2、约8至约9或约8至约8. 5)下进行。例如，发明方法包括使细胞结合剂 与双官能交联剂在pH为 7. 6、7. 7、7. 8、7. 9、8、8. 1、8. 2、8. 3、8. 4、8. 5、8. 6、8.