7、8. 8、8. 9 或 9的溶液中接触。 在本发明的一个实施方案中，从修饰反应期间产生的杂质（如，反应物和副产物）中纯 化修饰的细胞结合剂通过使修饰反应产生的混合物（即，第一混合物）经历纯化过程进行。 在这方面，可使用正切流动过滤（TFF)(如，基于膜的正切流动过滤方法）、非吸附色谱法、 吸附色谱法、吸附过滤或选择性沉淀或任何其它合适的纯化方法以及它们的组合纯化第一 混合物。与根据本发明纯化之前的第一混合物相比，该第一纯化步骤提供了纯化的第一混 合物，即，增加浓度的具有结合至其的接头的细胞结合剂和减少量的未结合的双官能交联 剂。优选地，使用正切流动过滤或吸附色谱法（如，离子交换色谱法，诸如陶瓷羟磷灰石） 纯化第一混合物。 在纯化第一混合物以获得具有结合至其的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物之 后，通过使在第一纯化的混合物中具有结合至其的接头的细胞结合剂与细胞毒性剂在pH 为约4至约9的溶液中反应使细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂以形成 第二混合物，其中产生包含通过接头化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂和一种或多种杂 质（如，游离细胞毒性剂和反应副产物）的第二混合物。 任选地，可以省略修饰的细胞结合剂的纯化。因此，在本发明的一个实施方案中，包含 具有结合至其的接头的细胞结合剂以及反应物和其它副产物的第一混合物未经历纯化方 法。在此类情况下，细胞毒性剂可以与交联剂同时添加或在将交联剂加入至细胞结合剂之 后的某个较迟点如，1、2、3或更多小时加入细胞毒性剂。通过使修饰的细胞结合剂与细胞毒 性剂在pH为约4至约9的溶液中反应，修饰的细胞结合剂缀合于细胞毒性剂（如，类美坦 素（maytansinoid))，其中缀合步骤导致稳定的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物、不稳定的 细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物、未缀合的细胞毒性剂（即，"游离的"细胞毒性剂）、反应 物和副产物的混合物的形成。 缀合反应优选地在pH为约4至约pH9 (如，pH为约4. 5至约8. 5、约5至约8、约5. 5 至约7. 5、约6. 0至约7或约6. 5至约7. 5)下进行。在一些实施方案中，缀合反应在pH为 约6至约6. 5 (如，pH为5. 5至7、pH为5. 7至6. 8、pH为5. 8至6. 7、pH为5. 9至6. 6或 pH为6至6. 5)，pH为约6或以下（如，pH为约4至6、约4至约5. 5、约5至6)或pH为约 6. 5或以上（如，pH为6. 5至约9、约6. 5至约7、约7至约9、约7. 5至约9或6. 5至约8) 下进行。在一个实施方案中，缀合反应在pH为约4至pH小于6或在pH大于6. 5至9下进 行。当缀合步骤在pH为约6. 5或以上进行时，一些含有巯基的细胞毒性剂可易于通过二硫 键形成而二聚化。在一个实施方案中，可能需要从反应混合物中去除微量金属和/或氧以 及任选加入抗氧化剂或使用具有更多反应性离去基团的接头或加入多于一等份的细胞毒 性剂以允许在此类情况下有效的反应。 在缀合步骤之后，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历 纯化步骤。在这方面，可使用正切流动过滤（TFF)(如基于膜的正切流动过滤方法）、非吸附 色谱法、吸附色谱法、吸附过滤或选择性沉淀或任何其它合适的纯化方法以及它们的组合 纯化缀合混合物。本领域普通技术人员将理解缀合步骤之后的纯化使能够分离包含化学偶 联至细胞毒性剂的细胞结合剂的纯化的缀合物，其中与纯化步骤之前的缀合物相比，缀合 物包含杂质的量有所减少。在一个实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种 或多种杂质的混合物在缀合步骤之后且纯化步骤之前经历离子交换色谱膜以便在纯化之 前从混合物去除至少部分杂质。在另一实施方案中，包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和 一种或多种杂质的混合物在纯化步骤之后经历离子交换色谱膜以便去除在纯化之后混合 物中剩余的至少部分杂质。 因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞 结合剂的缀合物的方法，所述方法包括修饰步骤之后的第一纯化步骤和缀合步骤之后的第 二纯化步骤，其中所述方法包括在第二纯化步骤之前或之后使包含细胞结合剂细胞毒性剂 缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜以从混合物中去除至少部分杂质。 在一个实施方案中，本发明提供了用于制备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法， 其包括使细胞结合剂与双官能交联剂接触以将接头共价连接于细胞结合剂并且从而制备 包含具有结合至其的接头的细胞结合剂的第一混合物，（b)使第一混合物经历正切流动过 滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合，从而制备具有结合至 其的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物，（C)通过使在纯化的第一混合物中具有结合 至其的接头的细胞结合剂与细胞毒性剂在pH为约4至约9的溶液中反应使细胞毒性剂缀 合于具有结合至其的接头的细胞结合剂以制备包含含有通过接头化学偶联至细胞毒性剂 的细胞结合剂和一种或多种杂质的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的第二混合物，（d)使 第二混合物经历离子交换色谱膜以去除至少部分杂质，从而提供细胞结合剂细胞毒性剂缀 合物的纯化的第二混合物；以及（e)在步骤（d)之后使纯化的第二混合物经历正切流动过 滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合以进一步从杂质中纯 化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物，从而制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的纯化的第 三混合物，其中与纯化的第二混合物相比，所述纯化的第三混合物包含杂质的量有所减少。 本文描述的任何纯化方法可用于发明方法。在本发明的一个实施方案中，正切流动过 滤（TFF，也称为交叉流动过滤、超滤和渗滤）和/或吸附色谱树脂用于纯化步骤。例如，发 明方法可包括在修饰步骤之后使用TFF的第一纯化步骤和在缀合步骤之后使用TFF的第二 纯化步骤。或者，发明方法可包括在修饰步骤之后使用吸附色谱法的第一纯化步骤和在缀 合步骤之后使用吸附色谱法的第二纯化步骤。发明方法还可包括在修饰步骤之后使用吸附 色谱法的第一纯化步骤和在缀合步骤之后使用TFF的第二纯化步骤或在修饰步骤之后使 用TFF的第一纯化步骤和在缀合步骤之后使用吸附色谱法的第二纯化步骤。 在本发明的一个实施方案中，非吸附色谱法用作纯化步骤。例如，发明方法可包括在修 饰步骤之后使用非吸附色谱法的第一纯化步骤和在缀合步骤之后使用非吸附色谱法的第 二纯化步骤。 在另一实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂 的缀合物的方法，其中包含具有结合至其的接头的细胞结合剂的第一混合物在修饰反应之 后且缀合反应之前未经历纯化，其中所述方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和 一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜。当省略修饰的细胞结合剂的纯化时，本发 明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包 括修饰步骤、缀合步骤以及缀合步骤之后的第一纯化步骤，其中所述方法包括使包含细胞 结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在第一纯化步骤之前或之后经历离 子交换色谱膜以从混合物中去除至少部分杂质。在一个实施方案中，本发明提供了用于制 备纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的方法，其包括使细胞结合剂与双官能交联剂接触 以将接头共价连接于细胞结合剂并且从而制备包含具有结合至其的接头的细胞结合剂的 第一混合物，（b)通过使第一混合物中具有结合至其的接头的细胞结合剂与细胞毒性剂反 应使细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂以制备包含含有通过接头化学 偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的 第二混合物，（c)使第二混合物经历离子交换色谱膜以去除至少部分杂质，从而提供细胞结 合剂细胞毒性剂缀合物的纯化的第二混合物；以及（d)在步骤（c)之后使纯化的第二混合 物经历正切流动过滤、选择性沉淀、非吸附色谱法、吸附过滤、吸附色谱法或它们的组合以 从杂质中进一步纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物并且从而制备细胞结合剂-细胞毒性 剂缀合物的纯化的第三混合物，其中与纯化的第二混合物相比，所述纯化的第三混合物包 含杂质的量有所减少，并且其中包含在步骤（a)中制备的具有结合至其的接头的细胞结合 剂（以及反应物和其它副产物）的第一混合物未在步骤（b)之前经历纯化方法。本文描述 的任何纯化方法可用作缀合反应之后的纯化步骤。在优选实施方案中，正切流动过滤、吸附 色谱法或非吸附色谱法用作缀合反应之后的纯化步骤。 在一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学偶联至细胞毒性剂的细胞结合剂 的缀合物的方法，其中所述方法包括将预先形成的细胞毒性剂-接头化合物缀合于细胞结 合剂，如美国专利6, 441，163和美国专利申请公布No. 2011/0003969及2008/0145374所 述，随后进行纯化步骤，其中所述方法包括使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或 多种杂质的混合物在纯化步骤之前或之后经历离子交换色谱膜。本文描述的任何纯化方法 可用于发明方法。在优选实施方案中，正切流动过滤、吸附色谱法或非吸附色谱法用作纯化 步骤。 在一个实施方案中，细胞毒性剂-接头化合物通过使细胞毒性剂与包含接头的双官能 交联剂接触以将细胞毒性剂共价连接至接头来制备。在细胞毒性剂-接头化合物与细胞结 合剂接触之前，细胞毒性剂-接头化合物任选地经历纯化。 在本发明的一个实施方案中，本文描述的发明方法（如，一步方法）包括缀合步骤之 后的两个单独的纯化步骤。当发明方法包括缀合步骤之后的两个单独的纯化步骤时，包含 细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物可在纯化步骤之前或纯化步骤 之后的任一者或两者经历离子交换色谱膜以从混合物中去除至少部分杂质。本文描述的任 何纯化方法可用作缀合反应之后的纯化步骤。在优选实施方案中，正切流动过滤、吸附色谱 法、非吸附色谱法或它们的组合用作缀合反应之后的纯化步骤。 在一个实施方案中，在使混合物经历离子交换色谱膜（如，Q膜或S膜）之前，使混合物 经历纯化。在一个实施方案中，在使混合物经历纯化之前，使混合物经历离子交换色谱膜。 在另一实施方案中，在使混合物经历纯化之前和之后，使混合物经历离子交换色谱膜。在另 一实施方案中，在使混合物经历离子交换色谱膜之前和之后，使混合物经历纯化膜。 任何合适的TFF系统可以用于纯化，包括Pellicon型系统 (Millipore,Billerica,MA)、SartoconCassette系统(SartoriusAG,Edgewood,NY)和 Centrasette型系统（PallCorp.,EastHills,NY) 〇 任何合适的吸附色谱树脂可以用于纯化。优选的吸附色谱树脂包括羟磷灰石色 谱、疏水电荷诱导色谱（HCIC)、疏水相互作用色谱（HIC)、离子交换色谱法、混合模式离 子交换色谱、固定化金属亲和色谱（IMAC)、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱以及它们 的组合。合适的羟磷灰石树脂的实例包括陶瓷羟磷灰石（CHTI型和II型，Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)、HAUltrogel轻磷灰石(PallCorp. ,EastHills,NY) 和陶瓷氣磷灰石（CFTI型和II型，Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)。合适的 HCIC树脂的实例为MEPHypercel树脂（PallCorp.,EastHills,NY)。合适的HIC树 脂的实例包括丁基-琼脂糖、己基_琼脂糖、苯基_琼脂糖和辛基-琼脂糖树脂（均 来自于GEHealthcare,Piscataway,NJ)以及Macro-prep甲基和Macro-Prep叔丁基 树脂（BioradLaboratories,Hercules,CA)。合适的离子交换树脂的实例包括SP-琼 脂糖、CM-琼脂糖和Q-琼脂糖树脂（均来自于GEHealthcare,Piscataway,NJ)以及 UnosphereS树脂（Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)。合适的混合模式离子交 换剂的实例包括BakerbondABx树脂（JTBaker,PhillipsburgNJ)。合适的IMAC树 脂的实例包括螯合琼脂糖树脂（GEHealthcare,Piscataway,NJ)和ProfinityIMAC 树脂（Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)。合适的染料配体树脂的实例包括蓝 色琼脂糖树脂（GEHealthcare,Piscataway,NJ)和Affi-gel蓝色树脂（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。合适的亲和树脂的实例包括蛋白A琼脂糖树脂（如， MabSelect,GEHealthcare,Piscataway,NJ)，其中细胞结合剂为抗体和凝集素亲和树脂， 如Lentil凝集素琼脂糖树脂（GEHealthcare,Piscataway,NJ)，其中细胞结合剂具有适当 的凝集素结合位点。或者可以使用对细胞结合剂特异性的抗体。此类抗体可固定于，例如， 琼脂糖4FastFlow树脂（GEHealthcare,Piscataway,NJ)。合适的反相树脂的实例包括 C4、C8 和C18 树脂（GraceVydac,Hesperia,CA) 〇
[0046] 任何合适的非吸附色谱树脂可以用于纯化。合适的非吸附色谱树脂的实例包括但 不限于SEPHADEX?G-25、G-50、G-100、SEPHACRYL?树脂（如，S-200 和S-300)、SUPERDEX? 树脂（如，SUPERDEX?75 和SUPERDEX?200)、B[0-GEL_?树脂（如，P-6、P-10、P-30、P-60 和P-100)以及本领域普通技术人员已知的其它树脂。 发明方法包括在本领域已知的任何合适的温度下进行本文描述的反应（如，修饰反 应、缀合反应或一步反应）。例如，反应可在约20°C或更低（如，约-KTC(条件是，如通 过存在用于溶解细胞毒性剂和双官能交联剂的有机溶剂防止溶液冷冻）至约20°C、约0°C 至约18°C、约4°C至约16°C)、在室温（如，约20°C至约30°C或约20°C至约25°C)或在高 温（如，约30°C至约37°C)下发生。在一个实施方案中，反应在约16°C至约24°C(如，约 16°C、约 17°C、约 18°C、约 19°C、约 20°C、约 21°C、约 22°C、约 23°C、约 24°C、或约 25°C)的 温度下发生。 在一个实施方案中，本文描述的发明方法还包括猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或 未反应的双官能交联剂的猝灭步骤。在纯化细胞结合剂细胞毒性剂之前进行猝灭步骤。或 者，在纯化细胞结合剂细胞毒性剂之后进行猝灭步骤。在一个实施方案中，发明方法包括 (a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物，然后 使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与包含接头的双官能交联剂在pH为约4至约9 的溶液中接触以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物，其中细胞结合剂通过接 头化学偶联至细胞毒性剂和杂质（如，游离细胞毒性剂和反应副产物），（b)使包含细胞结 合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换色谱膜，（c)在步骤（b) 之后猝灭混合物以猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联剂，（d)使猝 灭的混合物经历离子交换色谱膜，（e)任选地保持混合物，（f)使混合物任选地经历离子交 换色谱膜，以及（g)纯化混合物以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。在另一实施 方案中，发明方法包括（a)使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞 毒性剂的混合物，然后使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与包含接头的双官能交联 剂在pH为约4至约9的溶液中接触以提供包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的混合物， 其中细胞结合剂通过接头化学偶联至细胞毒性剂和杂质（如，游离细胞毒性剂和反应副产 物），（b)使包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物经历离子交换 色谱膜，（c)在步骤（b)之后任选地猝灭混合物以猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反 应的双官能交联剂，（d)使猝灭的混合物任选地经历离子交换色谱膜，（e)保持混合物，（f) 使混合物经历离子交换色谱膜，以及（g)纯化混合物以提供纯化的细胞结合剂细胞毒性剂 缀合物。 在一个实施方案中，通过使混合物与猝灭剂接触猝灭混合物。如本文所用，"猝灭剂"是 指与游离细胞毒性剂和/或双官能交联剂反应的试剂。 在一个实施方案中，可使用马来酰亚胺或卤代乙酰胺猝灭剂，诸如4-马来酰亚胺丁 酸、3-马来酰亚胺丙酸、N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺或碘乙酰氨基丙酸来确保猝灭细胞 毒性剂中的任何未反应的基团（诸如硫醇）。猝灭步骤可有助于防止细胞毒性剂的二聚化， 特别是具有未反应的硫醇基细胞毒性剂（诸如DM1)。二聚化的细胞毒性剂难于去除。猝灭 步骤还可以使任何不希望的硫醇-二硫化物与天然抗体二硫化物的交换反应最小化。在用 极性、带电的硫醇-猝灭剂（诸如4-马来酰亚胺丁酸或3-马来酰亚胺丙酸）猝灭时，过量 的、未反应的细胞毒性剂转化成极性的、带电的、水溶性加合物，其可在纯化步骤期间容易 地从共价连接的缀合物中分离。也可使用非极性和中性硫醇-猝灭剂猝灭。 在一个实施方案中，通过使混合物与和未反应的双官能交联剂反应的猝灭剂接触猝灭 混合物。例如，可将亲核试剂加入至混合物以便猝灭任何未反应的双官能交联剂。亲核试 剂优选地为含有亲核试剂的氨基酸，诸如赖氨酸、牛磺酸和羟胺。 或者，通过将混合物的pH降低至约5.O(如，4. 8、4. 9、5.O、5. 1或5. 2)来猝灭混合物。 在另一实施方案中，通过将pH降低至小于6. 0、小于5. 5、小于5. 0、小于4. 8、小于4. 6、小 于4. 4、小于4. 2、小于4. 0来猝灭混合物。或者，将pH降低至约4. 0(如，3. 8、3. 9、4. 0、4. 1 或 4. 2)至约 6. 0 (如，5. 8、5. 9、6. 0、6. 1 或 6. 2)，约 4. 0 至约 5. 0,约 4. 5 (如，4. 3、4. 4、4. 5、 4. 6或4. 7)至约5. 0。在一个实施方案中，通过将混合物的pH降低至4. 8来猝灭混合物。 在优选实施方案中，在混合物与猝灭剂接触之前，允许反应（如，修饰步骤、缀合步骤 或一步反应）进行至完全。在这方面，在包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能 交联剂接触之后约1小时至约48小时（如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5 小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小 时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21 小时、约22小时、约23小时、约24小时或约25小时至约48小时）将猝灭剂加入至混合物 中。 发明方法可以任选地包括将蔗糖加入至反应步骤（如，修饰步骤、缀合步骤或一步反 应）以增加细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的溶解度和回收率。期望以约0.1% (w/v)至 约 20% (w/v)(如，约 0.1% (w/v)、l% (w/v)、5% (w/v)、10% (w/v)、15% (w/v)或 20% (w/v))的浓度加入鹿糖。优选地，以约I% (w/v)至约10% (w/v)(如，约0. 5% (w/v)、 约 1 % (w/v)、约 1. 5 % (w/v)、约 2 % (w/v)、约 3 % (w/v)、约 4 % (w/v)、约 5 % (w/v)、约 6% (w/v)、约 7% (w/v)、约 8% (w/v)、约 9% (w/v)、约 10% (w/v)或约 11% (w/v))的浓 度加入蔗糖。另外，反应步骤也可包括加入缓冲剂。可使用本领域已知的任何合适的缓冲 剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓 冲液。在一个实施方案中，缓冲剂选自HEPPSO(N-(2-羟乙基）哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺 酸））、POPSO(哌嗪-1，4-双-(2-羟基-丙烷-磺酸）脱水物）、HEPES(4- (2-羟乙基）哌 嗪-1-乙烷磺酸）、HEPPS(EPPS) (4-(2-羟乙基）哌嗪-1-丙烷磺酸）、TES(N-[三（羟甲 基）甲基]-2-氨基乙烷磺酸）以及它们的组合。 在一个实施方案中，发明方法还包括一个或多个（如，一个、两个或三个）保持步骤以 从细胞结合剂释放不稳定结合的接头。保持步骤包括在用双官能交联剂修饰细胞结合剂之 后，在将细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂之后和/或在纯化步骤之后 保持混合物。当保持步骤包括在将细胞毒性剂缀合于具有结合至其的接头的细胞结合剂之 后和/或在缀合步骤之后的纯化步骤之后保持混合物，在保持步骤之前或保持步骤之后或 两者，可使混合物经历离子交换色谱膜。在一个实施方案中，方法包括使包含细胞结合剂细 胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在缀合步骤之后经历保持步骤，其中在保持步 骤之后且在纯化步骤之前使混合物经历离子交换色谱膜。在另一实施方案中，方法包括使 包含细胞结合剂细胞毒性剂缀合物和一种或多种杂质的混合物在缀合步骤之后经历保持 步骤，其中在保持步骤之后使混合物经历纯化步骤，随后使混合物经历离子交换色谱膜。在 使混合物经历离子交换色谱膜之前，混合物可以任选地经历第二保持步骤。 保持步骤包括将溶液在合适的温度（如，约2°C至约37°C)维持合适的时间段（如，约 1小时至约1周）以从细胞结合剂中释放不稳定结合的接头而大体上不会从细胞结合剂中 释放稳定结合的接头。在一个实施方案中，保持步骤包括将溶液维持在低温（如，约2°C至 约10°C或约4°C)、室温（如