专利名称：一种烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明提供一种烟叶烘烤用改善烟叶工业可用性品质的微生物制剂生产工艺，属 于微生物制剂生产工艺技术领域。
背景技术：
微生物的发酵工艺通常包括菌种、培养基组成、发酵过程控制和后处理过程。目 前，几乎所有微生物制剂的深层液体制备工艺都包括菌种制备、培养基组成、发酵过程控制 工艺和后处理工艺。而后处理工艺不可避免地带来昂贵的设备投入、巨大的能耗和发酵液 形成的污染源。目前国内对枯草芽孢杆菌的液体发酵进行了一些研究，郝林华等Q006)报道了 枯草芽孢杆菌液体发酵条件；沈智华等000 报道了枯草芽孢杆菌B115的优化培养条件； 张丽霞等O006)报道了枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化；钱风光等报道了生防菌枯草芽 孢杆菌BS25在3L发酵罐中的发酵工艺优化O009)。例如中国专利Q00510U6210. 6) 一种用于微生物肥料的芽孢杆菌液的同步发 酵方法本发明涉及一种用于微生物肥料的芽孢杆菌液的同步发酵方法，其为在发酵罐生产 过程中，将菌种的芽孢种子液，在种子罐上直接进行高温接种和高温处理。本发明的方法 可分别使成熟芽孢的同步形成率达到90 99%，一般可缩短发酵周期6个小时左右。该 方法克服了现有的微生物发酵方法接种的种子液易造成生长起点不一，菌体生长快慢参差 不齐，几代同堂，给生产控制带来困难，且芽孢形成率低的缺陷，并可在大规模的液体发酵 条件下，使之同步形成芽孢，并能提高芽孢形成的数量和比例，缩短生产周期的同步发酵方 法。
发明内容
本发明先直接用重量百分比W/W为10% 士 5%纯烟叶浸提的固体培养基，在 500C _60°C培养温度下，分离筛选得到烟叶中本身自带的、具有活性的高温菌株——YN104、 YN105、YN91，YN113、YN114菌株，然后再使用该菌种生产微生物制剂。本发明烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺是先直接用重量百分比W/W为10% 士5%纯烟叶浸提的固体培养基，在50°C -60°C培养温度下，分离筛选得到烟叶中本身自带 的、具有活性的高温菌株——￥附13、￥附05、￥附04、￥_1，￥附14菌株，然后再使用菌该菌生 产微生物制剂，具体步骤是A、将充分浸泡3-5天废弃烟叶液作为烟叶浸提原液，以体积比计，烟叶浸提原液/ 自来水按5% -15%的量(V/V)与琼脂(2. 5g/100mL)混合，不另添加任何附加成分和调节 PH值，在0. 11-0. 13MPa下25-35分钟高压灭菌后，倒双层平皿，制得纯烟叶浸提液固体平 板；按常规将烟叶样品梯度稀释后，取0. 2mL放入纯烟叶浸提液固体平板中，涂布均 勻后置50°C -60°C恒温箱培养至菌落出现，分离后得到在高温50°C -60°C还具有生理活性的烟叶表面微生物菌株，制剂生产工艺的菌种；B、采用上述A步骤分离出的高温芽孢杆菌菌种，按体积比例，用3-5%的接种量接 种于在含8 士 5% (重量/体积)经粉碎处理的废弃烟叶和92 士 95%自来水，经121-126°C、 0. 11-0. 13MI^下灭菌25-35分钟的发酵培养基中，搅拌速度120-130rpm，维持培养温度在 45-55°C，发酵时间40-4 ；在发酵结束前池，按发酵液重量百分比比例，加入0. 过滤除 菌的硫酸锰，继续搅拌至发酵结束；发酵液放罐直接分装容器，密封；即为提供烟叶烘烤用 的微生物制剂。所述工艺生产菌种是分离的高温菌菌种，其接种量为3-5%。 培养基成分为8 士 5 %经粉碎处理的废弃烟叶和92 士 95 %的自来水，不调节pH值。发酵结束前2_4h，加入0. 1-0. 5%经过滤除菌的硫酸锰，继续搅拌至发酵结束，发 酵液放罐时直接分装入容器，密封保存。发酵液即为提供烟叶烘烤用改善烟叶工业可用性品质的微生物制剂。本发明使用烟叶烘烤用微生物制剂成品时，用清水稀释1倍后喷施，不同生产菌 株生产的菌剂可按等体积混合后加水使用，喷施用量10000mL/亩。本发明分离的高温菌生产菌株(高温芽孢杆菌)，在8士5%经粉碎处理的废弃烟 叶低营养培养基中，经4 发酵后处以贫营养状态，并在发酵结束前2-4h添加少量硫酸锰 促使菌体生成芽孢(休眠体)，芽孢具有非常强的抵抗恶劣环境的能力。因此，制剂产品在 贫营养条件下，非常容易在普通常温环境下长期贮存。通过控制发酵培养基营养成分很容 易做到在发酵结束时使培养液呈贫营养状态，再通过添加少量硫酸锰工艺措施，促使发酵 液中的菌体在产品保存阶段由菌体状态生成芽孢状态。因此，省去投资和耗能量大、容易形 成污染源的后处理工艺。所以本发明生产烟叶烘烤用微生物制剂工艺非常简便易行。需要说明的是本发明只适用于产生芽孢的高温芽孢杆菌的深层培养制备。由 于高温微生物(菌种)的发现和应用，使常规的微生物制剂生产工艺发生了很大变化。 本发明生产的微生物制剂是应用于烟叶烘烤，烟叶烘烤过程是一个温度相对较高的过程 (45-600C )，因此从菌种筛选方法、培养基组成(经粉碎的废弃烟叶)、培养过程控制(大于 400C )和后处理工艺，利用硫酸锰可促进芽孢杆菌的芽孢形成和芽孢具有很强的抗逆性的 特性，简化了后处理工艺，省去后处理设备投入和能耗；所有发酵液均为制剂，避免了污染 源形成。这与常规发酵工艺和其它应用目标的制剂工艺有显著的不同和差别。本发明简化了发酵后处理工艺，在发酵完成后的发酵液中添加0. -0.5%的 MnSO4即制成微生物制剂。由于发酵液全部制成制剂，所以该工艺将不产生任何污染物。
以下结合实例对本发明作进一步详述。图1本发明微生物制剂工艺流程框图。图2使用过本发明微生物制剂改善烘烤烟叶实际品质的效果图。图3采用本发明方法制得的烟叶表面微生物菌株——菌株YN114的电镜照片。图4采用本发明方法制得的烟叶表面微生物菌株——菌株YN91的电镜扫描照片。图5采用本发明方法制得的烟叶表面微生物菌株——菌株YN105扫描电镜照片。
具体实施例方式实施例1 本发明菌株YN91和菌株YN114、YN113、YN104的发酵工艺参数。菌 株YN91的发酵培养基为小麦麸皮1.5%，尿素0.5%，NaCl 0.5%。发酵工艺参数温度 50°C，时间18h，搅拌速度125rpm。酶活水平在6960U/mL左右。菌株YN114的发酵培养基 为可溶性淀粉0.5%，牛肉膏1.0%，CaCO3O. 3%。发酵工艺参数温度43°C，时间36h，搅 拌速度125rpm。酶活水平在观(U/mL)左右。菌株YNl 13和YN104的发酵工艺参数与YNl 14 相同。具体方法如下培养基配制，取浸泡2-3天的废弃烟叶浸提原液5-15mL于500mL 三角瓶中，添加自来水95-85mL，加2. 5g琼脂粉，pH自然，摇勻后，用15磅高压灭菌30分 钟。培养基灭菌结束后，冷至60°C时，趁热分别倒双层皿，制成固体培养基备用。按微生物 分离常规方法将不同稀释度的烟叶样品0. 2mL涂布平皿后，置50°C恒温箱培养48h，检查菌 落出现情况。用本方法分离到50°C -60°C还具有生理活性的微生物菌株，则得到本发明所 菌株 YN91 和菌株 YN114、YN113、YN104、YN105。使用菌株YNl 14和菌株YN91，在瑞士比欧50L全自动发酵罐上，进行工艺参数优化 实验。使用本发明方法分离的高温菌菌株YN114在固体培养基上形成乳白色菌落，不 透明，边缘不整齐，中央微隆，质地褶皱，通常比较干。菌体长平均约为3. 3 μ m，宽平均约 为1.4μπι，电镜照片如图1。最适生长温度50°C，产生蛋白酶，发酵液的蛋白酶活力达到 28.25U/mL0使用本发明方法分离的菌株YN91在固体培养基上形成乳白色菌落，不规则，不透 明，质地褶皱，边缘呈波浪状。菌落形态随培养基的干湿度变化较大，潮湿时，菌落易扩散 呈粘质，表面呈奶油状，但大多数情况下，菌落粗糙有皱褶，中央突出，边缘不规则。菌体生 长迅速，在油镜下观察，YN91透明发亮，呈短杆状，不产芽孢，2. 6 μ m-1. 1 μ m,电镜照片见图 2。菌株YN91属于恶臭假单胞菌(I^eudomonas pridus)。产生淀粉酶，最适生长温度55°C 培养30小时，发酵液的酶活为7840U/mL。使用本发明制备的纯烟叶浸提液培养基与细菌培养基、马丁氏培养基考察了醇化 期1(3 品种的C3F等级(中部烟叶等级)和B2F等级(上部烟叶等级)烟叶中微生物的 数量及主要类群。结果表明①纯烟叶浸提液培养基100%为细菌，平均数量为37cfuX IO3/ go②细菌培养基细菌占95. 43%，真菌占1.42%，放线菌占3. 15%。平均数量分别为细 菌94cfuX104/g，真菌14CfuX103/g ，放线菌31cfuX 103/g。③马丁氏培养基细菌占 96. 95%，真菌占0. 83%，放线菌占2. 22%。平均数量分别为细菌17. 5cfuX 105/g，真菌 15cfuX 103/g，放线菌 40cfuX103/go从陈化烟叶获得的微生物数量情况看，三类微生物在醇化烟叶中的数量分布状况 是细菌(97.5%) >放线菌(1.79%) >真菌(0.75%)，与国内外研究报道的结果近似。 所不同的是用纯烟叶浸提液培养基分离培养仅有细菌生长，且数量比其它培养基低1-2个 数量级，较真实地反映了烟叶表面微生物的存在状况。在50L比欧全自动发酵罐中，使用“纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微 生物的方法”则步骤A分离的产淀粉酶高温菌菌种YN105种子培养液150mL，接种入装量 2. 4Kg经粉碎处理的废弃烟叶和30L自来水经121-126°C、0. 11-0. 13MPa下25_；35分钟灭菌的发酵罐培养基中，搅拌速度120rpm，培养温度控制在50士5°C，发酵至46小时时，添加过 滤除菌的硫酸锰30g，搅拌2小时后，放罐分装入塑料瓶，密封备用。产品保存半年，活菌数 大于500X 108cfu/mL，淀粉酶活性为^60U/mL。本发明在发酵结束前向发酵液中添加0. -0.5%的MnSO4搅拌15分钟后立即放 罐、用桶分装后密封即成微生物制剂成品。由于此工艺中发酵液全部被制成制剂，所以该发 酵工艺不产生任何污染物。成品使用时，用清水稀释1倍后喷施。使用量10000mL/亩。实施例2 在50L比欧全自动发酵罐中，使用“纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟 叶表面微生物的方法”则步骤A分离的产蛋白酶高温菌菌种YN114种子培养液150mL，接种 入装2. 4Kg经粉碎处理的废弃烟叶和30L自来水的灭菌培养基中，转速120rpm，培养温度 45士5°C，发酵至46小时时，添加过滤除菌的硫酸锰30g，搅拌2小时后，放罐分装塑料瓶，密 封备用。产品贮存半年，活菌数大于500X 108cfu/mL，蛋白酶活性为^.30U/mL。其它与实 施例相同.实施例3 在50L比欧全自动发酵罐中，使用“纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟 叶表面微生物的方法”则步骤A分离的产蛋白酶高温菌菌种YN113液150mL，接种入装2. 4Kg 经粉碎处理的废弃烟叶和30L自来水的灭菌培养基中，转速120rpm，培养温度50士5°C， 发酵至40小时时，添加过滤除菌的硫酸锰30g，搅拌2小时后，放罐分装入塑料瓶，密封备 用。产品贮存期一年，活菌数大于500X 108cfu/mL，蛋白酶活性为10U/mL。仍可在烘 烤过程中新陈代谢，改善烘烤烟叶品质如图3所示。本发明在发酵结束前向发酵液中添加 0. 1% -0. 5%的MnSO4搅拌15分钟后立即放罐、用桶分装后密封即成微生物制剂成品。由 于此工艺中发酵液全部被制成制剂，所以该发酵工艺不产生任何污染物。成品使用时，用清 水稀释1倍后喷施。使用量10000mL/亩。本发明是先在实验室条件下，结合微生物制剂生产菌种筛选的工作，对醇化烟叶 微生物的种类和数量分布进行了初步观察；从中分离纯化了一批无拮抗作用的产生蛋白酶 和淀粉酶细菌菌株；对产酶菌株的分类地位进行了研究，为进一步了解产酶菌株的遗传背 景和性状奠定了研究基础；对微生物制剂生产菌株(种)的培养基和培养条件进行了优 化。在50立升全自动发酵罐上对微生物制剂进行了中试规模的生产工艺流程和培养条件 研究。连续3年使用微生物制剂对大田烟叶进行了烘烤前应用，在宾川县的平川和大营镇 应用面积超过20亩，确定了使用量和使用方法。对烘烤后的烟叶进行了化学品质检测、感 官评吸和结果分析。本发明在发酵结束前向发酵液中添加0. 1-0. 5%的MnSO4H2O,搅拌15_20分钟后立 即放罐、用桶分装后密封即成微生物制剂成品。因为此工艺流程中发酵液被全部制成制剂， 所以该发酵工艺不产生任何污染物。使用成品时，用清水稀释1倍后喷施，不同生产菌株生 产的菌剂可按等体积混合后加水使用。喷施用量10000mL/亩。本发明工艺流程的最大特点是简洁实用，充分考虑节约生产成本和对环境友好无 污染。项目组已用50立升瑞士比欧全自动发酵罐(图幻按照上述工艺流程连续试生产10 余批次，该设备获得的实验参数可直接用于指导规模化生产。试生产的产品提供大田实验 应用，结果表明用该工艺流程和设备生产的微生物制剂对烘烤烟叶品质改善有一定效果。本发明枯草芽孢杆菌制剂使用方法以简便易行，人们容易接受为原则。因为上部 烟叶的烘烤方式是采取密集烘烤方式，在烘烤期间微生物制剂和酶制剂很不容易做到均勻喷洒，操作也十分不便。由于两种制剂都有上述对烟叶植株和操作人员的安全保障前提，故 更改为采收前喷施。这样就比较容易做到喷施均勻，操作也十分方便。实际实施是在烟叶 采收前1天，每亩使用枯草芽孢杆菌制剂或酶制剂lOOOOmL，均勻喷雾即可。本发明分别在三年用菌株YN91和菌株YNl 14等菌株生产的微生物制剂在大理州 祥云县、巍山县和宾川县进行大田实验，使用量为每亩IOOOOmL ；使用方法为采收前1天烟 叶表面喷施。烘烤结果表明微生物菌剂均对改善烟叶吃味有明显的作用，特别是回味改变 明显，在改变回味的同时，综合感官质量有明显提升。烟叶内在化学品质更趋完善，协调性 更好。从总体上看，就祥云县云烟87品种采烤前1天喷施处理的试验样品而论，菌2和 菌4制剂处理烟叶样品的整体质量稍好于对照样品，其它处理烟叶样品整体质量差于对照样品。表2. 5. 2-1不同微生物菌剂改善烟叶品质研究样品的感官质量评吸结果
权利要求
1.一种烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺，其特征在于先直接用重量百分比W/W为10% 士5%纯烟叶浸提的固体培养基，在50°C -60°C培养温度下，分离筛选得到烟叶中本身自带 的、具有活性的高温菌株——￥附13、￥附05、￥附04、￥_1，￥附14菌株，然后再使用菌该菌生 产微生物制剂，具体步骤是A、将充分浸泡3-5天废弃烟叶液作为烟叶浸提原液，以体积比计，烟叶浸提原液/自来 水按5% -15%的量(V/V)与琼脂(2. 5g/100mL)混合，不另添加任何附加成分和调节pH值， 在0. 11-0. 13MPa下25-35分钟高压灭菌后，倒双层平皿，制得纯烟叶浸提液固体平板；按常规将烟叶样品梯度稀释后，取0. 2mL放入纯烟叶浸提液固体平板中，涂布均勻后 置50°C _60°C恒温箱培养至菌落出现，分离后得到在高温50°C -60°C还具有生理活性的烟 叶表面微生物菌株，制剂生产工艺的菌种；B、采用上述A步骤分离出的高温芽孢杆菌菌种，按体积比例，用3-5%的接种量接种 于在含8士5% (重量/体积)经粉碎处理的废弃烟叶和92士95%自来水，经121-126°C、 0. 11-0. 13MI^下灭菌25-35分钟的发酵培养基中，搅拌速度120-130rpm，维持培养温度在 45-55°C，发酵时间40-4 ；在发酵结束前池，按发酵液重量百分比比例，加入0. 过滤除 菌的硫酸锰，继续搅拌至发酵结束；发酵液放罐直接分装容器，密封；即为提供烟叶烘烤用 的微生物制剂。
2.根据权利要求1所述的烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺，其特征在于所述工艺生产 菌种是分离的高温菌菌种，其接种量为3-5%。
3.根据权利要求1、2、3所述的烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺，其特征在于培养基成 分为8士5%经粉碎处理的废弃烟叶和92士95%的自来水，不调节pH值。
4.根据权利要求1、2、3、4所述的烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺，其特征在于发酵结 束前2-4h，加入0. 1-0. 5%经过滤除菌的硫酸锰，继续搅拌至发酵结束，发酵液放罐时直接 分装入容器，密封保存。
5.根据权利要求1或2所述的纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的 方法，其特征在于产淀粉酶菌株YN91的优化培养基为小麦麸皮1.5%，尿素0.5%，NaCl 0.5%，工艺参数为发酵温度50°C，时间18h，搅拌速度125rpm。
6.根据权利要求1或2所述的纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的方 法，其特征在于产蛋白酶菌株YNl 14的优化培养基为可溶性淀粉0. 5 %，牛肉膏1. 0 %， CaCO3O. 3%，工艺参数为发酵温度43°C，时间36h，搅拌速度125rpm。
7.根据权利要求1所述的烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺，其特征在于发酵液即为提 供烟叶烘烤用改善烟叶工业可用性品质的微生物制剂。
8.根据权利要求1所述的烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺，其特征在于使用烟叶烘烤 用微生物制剂成品时，用清水稀释1倍后喷施，不同生产菌株生产的菌剂可按等体积混合 后加水使用，喷施用量10000mL/亩。
全文摘要
本发明提供一种烟叶烘烤用改善烟叶工业可用性品质的微生物制剂生产工艺。属于微生物制剂生产工艺技术领域。其技术方案是使用“纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的方法”分离的高温菌菌种，按3-5％的接种量接种于经121-126℃、0.11-0.13MPa下25-35分钟灭菌后降温致60℃，含8±5％(重量/体积)经粉碎处理的废弃烟叶和92±95％的自来水，不调节pH值的发酵培养基中，120-130rpm搅拌发酵48h，维持发酵温度在45-55℃。在发酵结束前2-4h，加入0.1％过滤除菌的硫酸锰，继续搅拌至发酵结束。放罐直接容器分装，密封。发酵液即为提供烟叶烘烤用的微生物制剂。该工艺制备的高温芽孢杆菌制剂大部分形成芽孢，可长期保存。环保无污染。
文档编号A24B15/20GK102108340SQ20101056568
公开日2011年6月29日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者张家伟, 杨程, 潘杰, 王毅, 赖永红 申请人:昆明贵勋科技有限公司