专利名称：基于粘蛋白1核心序列的手性肽抗原及疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于刺激机体产生抗肿瘤免疫反应的肽疫苗，特别是涉及基于粘蛋白1之核心序列的手性肽抗原，含有所说的肽抗原的疫苗组合物，其制备方法及其作为免疫原在刺激机体产生免疫反应中的应用。
肿瘤免疫反应的基础在于肿瘤抗原的表达和存在。近二十年来，已相继发现了多种与肿瘤发生发展相关的肿瘤抗原，其中之一就是粘蛋白。粘蛋白是一类由各种正常或恶性上皮细胞表达的高分子量(≥200KDa)跨膜糖蛋白，已知存在有至少九种形式的糖蛋白。各种粘蛋白均具有相似的结构，都富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，并且具有不同数目的串联重复序列。其中粘蛋白1(MUC1)是第一个发现的，可被抗上皮细胞单克隆抗体识别的粘蛋白。MUC1多肽骨架由胞外段、跨膜段和胞内段三部分组成。其中，跨膜段和胞内段具有种间保守性，故推测其在MUC1功能的发挥中起重要作用。胞外段含有20-125个连续的重复序列，每个重复序列包括20个氨基酸，即PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA。其中S、T、A、G和P五种氨基酸占50％以上，且P对MUC1空间结构的形成并进而对分子的免疫原性发挥重要作用。大约有50-90％的O-连接的寡糖被连接到粘蛋白核心区(20氨基酸基元的串联重复区)的丝氨酸和苏氨酸残基上，从而提高了整个分子的刚性和柔韧性(Strous et al.，Crit.Biochem.Biol.2557，1992)。已知每个串联重复均包括5个可能的糖基化位点，并且在成对的苏氨酸和丝氨酸之间为含有抗原决定基的免疫优势区域。
人MUC1基因位于染色体1q21上，并含有7个外显子。MUC1基因的一个重要特征是其多态性，即其第2个外显子含有许多连续的重复序列(VNTR)。每个VNTR包括60个碱基且富含GC。不同人的VNTR数目从20到125个不等。
目前的研究表明，MUC1既可诱发抗肿瘤CTL免疫反应(MHC限制性的和非MHC限制性的)，同时又可抑制免疫活性细胞对肿瘤细胞的杀伤。高水平的MUC1表达与肿瘤的预后呈负相关，提示MUC1可能参与免疫反应的调节。研究发现，见于肿瘤细胞膜表面上的粘蛋白在某些方面不同于正常上皮细胞上的粘蛋白。例如，加在正常乳腺产生的粘蛋白上的O-葡聚糖是基于核心2的并且是与之复合的，而加在乳腺癌粘蛋白上的O-葡聚糖则是基于核心1的。这就意味着，串联重复序列中的某些抗原决定基在正常粘蛋白中是被遮蔽的，而在肿瘤相关粘蛋白中则是暴露的。因为乳腺癌粘蛋白分子上也携带有新的糖类抗原决定基，所以整个分子在抗原性上不同于正常乳腺粘蛋白。有人发现，乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌及其他一些分泌组织肿瘤有异常糖基化粘蛋白的表达。有证据表明，在某些患有转移的乳腺癌、结肠癌和卵巢癌的病人，血清粘蛋白水平提高与免疫治疗后抗肿瘤反应及病人存活率降低有关(MacLean etal.，J.Immunotherapy，2070，1997)。另外还发现，亲和纯化的肿瘤相关MUC1粘蛋白和合成的MUC1多肽核心重复序列可抑制人T细胞对多克隆刺激物的增殖反应，而且对细胞增殖的抑制程度与MUC1多肽核心中串联重复的数目成正比(Agawal et al，Nature Med.443，1998)。Chen等人(Chen L，et al，J.Immunol.139351-359，1997)进一步发现，肿瘤细胞分泌的MUC1可抑制T淋巴细胞的增殖，使之处于Go/G！期。Jerome及其同事的研究显示，某些肿瘤病人的淋巴结中存在可与人粘蛋白反应的细胞毒性淋巴细胞(CTL)，而抗MUC1抗体可阻断MUC1阳性靶细胞中CTL的活性(Jerome et al，CellularImmunity and Immunotherapy of Cancer，321-328，1990)。另一方面，用上皮细胞肿瘤和相关正常组织的反应性单克隆抗体进行的实验表明，肿瘤细胞因其粘蛋白分子的异常糖基化，而可能存在与正常细胞粘蛋白不同的抗原决定基。肿瘤细胞表达的粘蛋白分子糖基化不完全，糖链相对较短，从而导致粘蛋白分子串联重复序列在细胞表面上的暴露(Devine et al，CancerRes.，515826，1991)。
粘蛋白特别是MUC1的上述这些性质，特别是肿瘤细胞上粘蛋白核心序列的暴露，以及免疫系统对粘蛋白分子这些结构的反应能力，使我们有可能以粘蛋白特别是MUC1作为肿瘤免疫治疗的靶分子，利用基于粘蛋白的肽疫苗进行肿瘤特异性免疫治疗(Devine et al，Cancer Res.，512908，1991)。
近年来，一些研究者设计并制备了一系列基于粘蛋白特别是MUC1的合成或重组的抗原肽或其糖或脂的结合物，或含有这类肽及相关成分的免疫调节组合物。例如，美国专利5,744,144号公开了包括至少5个MUC1串联重复，并在串联重复序列N或C末端连有5个附加氨基酸的合成的MUC1样肽。所说的肽在没有糖基化的情况下呈现天然构象。美国专利6,177,256号公开了一种用作免疫原性抗肿瘤疫苗的，由氧化甘露糖和人粘蛋白MUC1多肽组成的结合物。美国专利6,168,804号公开了含有基于MUC1核心肽之串联重复区的抗原肽的缓释载体，及其在引发Th1型抗肿瘤免疫反应中的应用。其中所说的抗原肽包括由12-25个氨基酸组成的至少一个T细胞抗原决定基。另外，Sameul等人(Sameul，J.et al，Int.J.Cancer，75295-302，1998)以脂质体包裹MUC1合成肽并以磷脂作为佐剂免疫小鼠，结果诱导产生了T1型细胞免疫反应，并且大部分被免疫动物产生了MUC1特异性T细胞、INF和IgG。Reddish等人(Reddish，M.et al，Int.J.Cancer，76817-823，1998)以包括16个氨基酸的MUC1合成肽(BP16)与KLH的交联蛋白作为免疫原，并以Detox作为佐剂免疫转移性乳腺癌病人，结果大多数被试者产生了MUC1限制性CTL反应。Karanikas等人(Karanikas V，et al.，J.Clin.Invest.1002786-92，1997)用含有一个重复序列的合成肽与破伤风类毒素的结合物免疫乳癌病人，结果只诱发了微弱的免疫反应。Kim等人(Kim，SK et al.，Vaccine 19530-537，2001)使用12种不同的佐剂或复合佐剂配合合成的MUC1与KLH的结合蛋白免疫小鼠，结果显示复合佐剂比单一佐剂能更好地诱导抗MUC1抗体反应，表明选择适当的佐剂对于提高多肽疫苗之免疫原性具有重要作用。
本发明的一个目的是提供基于MUC1串联重复序列的免疫原性肽，特征在于所说的MUC1序列包括1-5个串联重复，其中每个串联重复至少含有一个D-型氨基酸，并且序列的两末端均为脯氨酸。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的免疫原性肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的基于MUC1串联重复序列的免疫原性肽具有提高了的MUC1特异的免疫原性。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的基于MUC1串联重复序列的免疫原性肽是以肽合成方法制备的。
本发明的另一个目的是提供MUC1特异性疫苗组合物，所说的疫苗组合物基本上是由如上限定的免疫原性肽以及一种或多种医药上可接受的佐剂组成的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的疫原性肽可以是与选自血清白蛋白、卵白蛋白和匙蓝蛋白的载体蛋白质化学偶联的。
本发明的再一个目的涉及如上限定的疫苗组合物在诱导MUC1特异性抗肿瘤免疫反应中的应用。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的MUC1特异性抗肿瘤免疫反应是MUC1特异性细胞毒性淋巴细胞反应。
本发明总地涉及用于刺激机体产生抗肿瘤免疫反应的肽疫苗，特别是涉及基于粘蛋白1之核心序列的手性肽抗原，含有所说的肽抗原的疫苗组合物，其制备方法及其作为免疫原在刺激机体产生免疫反应中的应用。
众所周知，细胞免疫在肿瘤免疫排斥中发挥关键性作用。T淋巴细胞可识别与靶细胞表面MHC1类或2类分子结合的长度约8-12个氨基酸的抗原肽。而作为杀伤靶细胞之主要效应细胞的细胞毒性淋巴细胞(CTL)则识别与MHC1类分子结合的内源性肽。已有证据表明，合成的肽抗原不需经过抗原呈递细胞(APC)的加工处理即可与MHC类分子结合，并在激活免疫反应中发挥内源性抗原肽的同样效力。
鉴于粘蛋白1(MUC1)在多种组织和器官上皮表面的广泛存在，以及其在相应肿瘤组织中的异常表达，故有可能以其作为一种潜在的肿瘤生物学标志物，并使用基于MUC1序列特别是包括MUC1之抗原决定基和不同数目串联重复序列的肽作为免疫原，进行相应肿瘤的特异性主动免疫治疗。然而，对于不含糖链的MUC1分子，特别是包括相对较少数目(例如一个)串联重复的基于MUC1的免疫原来说，无疑其免疫原性是很低的。为了克服这一关键性问题，本发明试图从以下几个方面入手提高分子的抗酶降解能力和光学稳定性，以提高分子的稳定性和免疫原性(1)在保留并且不改变MUC1抗原决定基(APDTR)的前提下，合理调整MUC1分子核心区的氨基酸排列顺序；(2)以一个或多个D型氨基酸代替野生序列中固有的L型氨基酸，以改善分子的抗酶解能力和受体结合活性；(3)在所说的肽的两末端加入或替换具有光学稳定性的脯氨酸；以及(4)将合成的基于MUC1的免疫原性肽偶联到选自血清白蛋白、卵白蛋白和匙蓝蛋白的载体蛋白质大分子多肽链上。
因此，本发明的一个目的是提供基于MUC1串联重复序列的免疫原性肽，特征在于所说的MUC1序列包括1-5个串联重复，其中每个串联重复至少含有一个D-型氨基酸，并且序列的两末端均为脯氨酸。
一般说来，在适当范围内，串联重复的数目越多所得多肽的免疫原性越强，但为了观察因加入D-型氨基酸所导致的局部手性特征对合成肽之免疫原性的影响，并且为了制备上的方便，本发明特别优选的是只含有一个重复单元的合成肽。
根据本发明的优选实施方案，所说的MUC1核心串联重复单元具有如下所示的氨基酸序列ProAlaHisGlyValThrD-SerAlaProAspThrArgProAlaProGlyD-SerThrAlaPro(SEG ID NO1)可以按照本领域已知的固相肽合成技术合成本发明的抗原肽(例如参见Steward，J.M.and Young J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2ndEd.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.(1984))。在固相肽合成方法中，首先将C末端氨基酸连接到一个适当的固相载体或树脂上。用于合成C末端羧基肽的的优选的固相载体是4-羟甲基苯氧甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)。用于C末端酰胺的优选固相载体是4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧乙酰胺乙基树脂(Apllied Biosystem Co.)。可借助N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)或2-(1-氢-1-苯并三唑基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)使C末端氨基酸偶联到树脂上(50-100℃，在二氯甲烷或DMF溶剂中反应1至24小时)。当固相载体是4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺乙基树脂时，应在与上述C末端氨基酸偶联之前用哌啶等仲胺将Fmoc基团裂解掉。可以使用邻苯三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸(HBTU，1当量)在DFM中与去保护的4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺乙基树脂偶联。
当固相合成结束时，可以用裂解试剂(例如苯甲硫醚、水、乙二硫醇及三氟乙酸)处理树脂结合的肽，以从树脂上去掉合成的肽并使之去保护。如果肽的C末端是烷基酰胺，可以用烷基胺进行氨解以裂解出树脂。或者，可以用乙醇进行转酯处理以去除多肽，然后再进行氨解或直接进行转酰胺基处理。可以使用上述的几种裂解剂除去侧链保护基团。
可以使用离子交换层析、亲水吸附层析、硅胶吸附层析、分配层析、高效液相层析(HPLC)，特别是反相HPLC等一系列层析步骤纯化完全去保护的合成肽。
可使用配有120A分析仪的Applied biosystems 477A型蛋白质序列仪，以自动Edman化学法分析纯化的肽的氨基酸序列。可使用激光解吸和电喷射质谱法测定各肽序列的分子质量。
因此，为了本发明的目的，可以首先使用自动或半自动多肽合成装置(例如美国ACT公司生产的ACT90型半自动多肽合成仪)，基本上按照已知的的固相肽合成法合成本发明的免疫原性肽。简单地说，可首先在合成仪反应瓶充分涨溶所需的固相树脂，然后以二异丙基碳二亚胺(DIC)、一水合羟基苯并三唑(HoBt)和二异丙基乙胺(DIPEA)作为偶联剂，在DMF溶剂中按固定程序重复固相肽连接步骤，直至完成整个肽链的合成。
肽链合成后，脱去保护基团并从固相树脂上切下所需的肽。沉淀并风干后，以反向高压液相层析法(RP-HPLC)纯化所需的合成肽并使用质谱法测定其分子量(参见实施例1)。
由于本发明的合成肽在体内和体外实验中均表现有明显改善了的特异免疫原活性(详见下文)，故有可能以其作为抗原材料，配合适当的免疫佐剂，制备具有临床应用价值的疫苗组合物。
因此，本发明的另一个目的是提供MUC1特异性疫苗组合物，所说的疫苗组合物基本上是由如上限定的免疫原性肽以及一种或多种医药上可接受的佐剂组成的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中作为本发明疫苗组合物之基本活性成分的所说的免疫原性肽可以是与选自血清白蛋白、卵白蛋白和匙蓝蛋白的载体蛋白质化学偶联的。为此，例如可以使用戊二醛法(沈关心，周汝麟主编，现代免疫学实验技术，第1版，第8-9页，湖北科学技术出版社)实现合成肽与载体蛋白质如小鼠血清白蛋白的结合。
本发明的疫苗组合物可含有一种或多种医药上可接受的佐剂。这些佐剂包括但不限于卡介苗(BCG)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素2(IL-2)和胸腺肽(TP)。
近年的研究发现，就免疫系统而言，GM-CSF可作用于抗原呈递细胞--树突状细胞，进而发挥促进免疫反应、调节免疫功能的作用。另外，大量研究表明，胸腺肽是提高免疫功能的有效制剂，并且可能通过调节T细胞功能来调节机体的免疫活性。因此，本发明特别选用细胞-巨噬细胞集落刺激因子和胸腺肽作为制备MUC1特异性肽疫苗的复合佐剂。
为了研究基于本发明修饰的合成肽疫苗组合物的生物学活性，我们使用接种了乳腺癌细胞GZ.A5.3H.4(为转染了人MUC1全长度cDNA的细胞系)的纯系小鼠作为实验对象，分别观察本发明的疫苗组合物对荷瘤动物的治疗效果和免疫保护效果，并进一步观察了合成肽疫苗对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响，和诱导特异性CTL杀伤活性的能力。实验中，以本发明的合成肽疫苗(以下简称为D-MUC1)加GM-CSF或TP为实验组，以同样加有GM-CSF或TP的基于MUC1核心区重复单元但不含有D-型氨基酸的合成肽疫苗(以下简称为L-MUC1)为阳性对照，并以生理盐水为空白对照。为了排除GM-CSF或TP的非特异性抗肿瘤免疫活性对观察结果的影响，实验中还另外增设两个阳性对照组，即GM-CSF组和TP组。
在治疗实验中，各组小鼠淋巴细胞经合成肽(10微克/ml)体外连续刺激4天后，D-MUC1+TP组动物的淋巴细胞增殖活性显著高于对照组，但L-MUC1组则与对照组基本相当。另一方面，D-MUC1+GM-CSF、D-MUC1+TP、GM-CSF和TP组小鼠淋巴细胞经合成肽(5-10微克/ml)体外诱导8天后，各组均产生了MUC1特异性CTL反应，并显示有对表达MUC1蛋白质之GZ.A5.3H.4细胞的特异性杀伤活性。在免疫保护实验中，各组小鼠淋巴细胞经合成肽(5微克/ml)体外连续刺激4天后，D-MUC1+TP组和D-MUC1+GM-CSF组动物的淋巴细胞增殖活性显著高于对照组，但L-MUC1组则与对照组基本相当。另一方面，L-MUC1、D-MUC1+GM-CSF、D-MUC1+TP、GM-CSF和TP组小鼠淋巴细胞经合成肽(5-10微克/ml)体外诱导8天后，各组动物均产生了MUC1特异性CTL反应，并显示有对表达MUC1蛋白质之GZ.A5.3H.4细胞的特异性杀伤活性，但其中L-MUC1的反应活性则稍低。
另外，我们还分析了本发明的合成肽诱导体液免疫的能力，结果发现，小鼠经两次疫苗接种后，只产生微弱的抗MUC1抗体反应(数据未示出)。
在此基础上，我们使用接种了高水平表达MUC1之GZ.A5.3H.4肿瘤细胞的小鼠模型，进一步观察了本发明修饰的多肽疫苗对动物移植瘤的治疗和预防效果。在对预先接种肿瘤细胞的荷瘤动物进行的治疗实验中，L-MUC1组小鼠的肿瘤生长速度和处死前的肿瘤重量均与对照组接近，而D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP组小鼠的这些参数则明显低于对照组。光学显微镜下可见D-MUC1+GM-CSF组肿瘤组织有大范围病理性坏死。D-MUC1+TP、GM-CSF和TP组小鼠肿瘤组织中也存在有相似的坏死病灶，但坏死程度和范围均小于D-MUC1+GM-CSF组。组织学检查进一步发现，在D-MUC1+GM-CSF佐剂的参与下，D-MUC1在小鼠体内诱导的CTL反应导致靶细胞以凋亡和坏死的方式死亡。在对预先接种本发明的合成肽疫苗的动物进行的免疫保护实验中，于动物接种上述肿瘤细胞后三周，断颈处死动物并测定肿瘤重量和体重。结果可见，L-MUC1组小鼠的肿瘤生长速度和处死前的肿瘤重量均与对照组接近，而D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP组小鼠的这些参数则明显低于对照组。光学显微镜下可见D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP组肿瘤组织有大范围病理性坏死。GM-CSF、TP和L-MUC1组动物虽也存在有相似的坏死病灶，但坏死程度和范围均小于D-MUC1+GM-CSF组。
作为一种肿瘤相关抗原，MUC1是细胞的固有成分。但在肿瘤细胞中，因其糖基化不完全而导致结构变化，并因此其免疫原性较弱。这也是大多数上皮组织肿瘤(如乳腺癌)病人MUC1特异性CTL反应低下的原因。因此，本发明人设计并合成了基于MUC1核心区串联重复单元的，以部分或全部D-型氨基酸取代其天然L-型氨基酸的修饰的抗原肽，并在此基础上成功地制备了以所说的肽与惰性载体蛋白质的结合物为基本活性成分的疫苗组合物。我们的体内和体外实验表明，本发明的合成肽疫苗可在某些细胞因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胸腺肽(TP)的辅助下，有效地诱导荷瘤动物的特异性抗肿瘤细胞免疫反应(CTL反应)。虽然有关机理目前尚不明确，但推测可能是由于(1)D-MUC1分子中的一个或多个氨基酸被相应的D-型氨基酸所取代，氨基酸的这种反向倒转使分子具有了不同于其野生序列的局部手性特征，从而改善了分子的免疫原性，提高了免疫系统对它的识别能力；(2)分子中D-型氨基酸的掺入改变了酶切位点处氨基酸的光学构象和分子的刚性，从而提高了肽分子抵抗蛋白酶降解的能力；(3)与惰性载体蛋白质的偶联和佐剂(细胞因子)的加入也在一定程度上提高了本发明疫苗组合物诱导或刺激机体抗肿瘤免疫反应的能力。
下列实施例旨在进一步举例说明本发明的基于MUC1核心串联重复之合成肽及其疫苗的生产方法和优点。应明确指出的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明的个别非必要技术特征所作的任何改动和改变都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例1本发明的基于MUC1核心串联重复区的抗原肽及相关疫苗的制备基本上按照已知的方法，使用Advenced ChemTech 90型肽合成仪合成具有下示氨基酸序列的肽N-ProAlaHisGlyValThrD-SerAlaProAspThrArgProAlaProGlyD-SerThrAlaPro-C(SEG ID NO1)。为此，首先称取固相树脂(H-Pro-CLTR，0.9mmol)，并用二氯甲烷(DCM)充分溶涨。然后使用DIC、HOBt和DIPEA偶联剂，在DMF溶剂中重复下列合成循环步骤，依次加入上述肽片段中所示的氨基酸1、首先用含20％哌啶的DCM洗涤(5分钟)反应器中的Fmoc-氨基酸；2、使用溶于DMF中的20％哌啶再次处理25分钟，以从氨基酸功能集团上除去Fmoc保护基团；3、用DMF洗2次，每次2分钟；4、使用甲醇(MeOH)洗1次，共2分钟；5、再次用DMF洗2次，每次2分钟；6、在DIC、HOBt和DIPEA偶联剂的存在下，加入相当于树脂氨基3倍量的被保护的氨基酸，室温下反应1小时；7、用DMF洗2次，每次2分钟；8、使用甲醇(MeOH)洗1次，共2分钟；9、再次用DMF洗2次，每次2分钟。
合成完成后，用四氢呋喃(THF)洗树脂(5分钟)以除去DMF，然后在氩气和氮气环境下风干树脂，从而得到树脂结合的肽。
将树脂结合的肽与预制备(-5至-10℃保存)的裂解试剂(三氟乙酸水∶苯酚∶以二硫醚∶茴香硫醚＝82.5∶5∶5∶2.5∶5)的混合物于大约0℃下搅拌约15分钟，再于室温下继续搅拌约60分钟。然后滤出树脂并用纯净的三氟乙酸淋洗。将滤出并洗过的树脂按每份0.5ml加到含有约8ml二乙醚的离心管内，离心所得到的悬浮液后，除去上清。可多次重复该过程直到所有的肽均被沉淀出来。用乙醚洗沉淀的滤液，然后风干并冷冻干燥之。
裂解完成后，使用Symmetry Prep C18柱以HPLC方法纯化如上得到的粗肽(用5-100％乙腈梯度经60分钟洗脱)，然后冷冻干燥如此纯化的肽。将所得到的肽用0.1％三氯乙酸溶解后，用点喷雾质谱仪测定分子量。
然后以戊二醛法完成合成肽与载体蛋白的连接。例如可称取小鼠血清白蛋白10mg，用硼酸盐缓冲液溶解后加入合成肽15mg。然后震荡下加入0.35％戊二醛1.0ml，并在室温下反应2小时。加入甘油(1mol/L)约0.25ml封闭未反应的戊二醛并保持30分钟，然后用硼酸盐缓冲液(pH8.5)透析过夜，从而得到所需的结合物。可使用激光解吸电离飞行时间质谱仪测定所得结合物的分子量，并进而确定合成肽与载体蛋白的分子比。可根据1mg/ml白蛋白的280nm吸光率为0.7，计算合成肽抗原溶液的蛋白质浓度。
为了最终制得本发明的疫苗组合物，可预先或使用前临时在所说的结合物中加入适当浓度的免疫佐剂。
实施例2本发明的疫苗组合物对小鼠淋巴细胞增殖能力和特异性CTL杀伤活性的影响本实施例使用接种了乳腺癌细胞GZ.A5.3H.4(为转染了人MUC1全长度cDNA的细胞系)的纯系小鼠作为实验对象，分别观察本发明的疫苗组合物对小鼠淋巴细胞增殖能力和特异性CTL杀伤活性的影响。
简单地说，在治疗实验中，60只6-8周令雌性Balb/c小鼠经皮下接种GZ.A5.3H.4乳腺癌细胞(Biomira公司惠赠)(5×105/0.1ml)后7天，随机分为6组，每组10只。在免疫保护实验中，于第二次免疫后一周皮下接种GZ.A5.3H.4乳腺癌细胞(Biomira公司惠赠)(1×106/0.1ml)，随机分为6组，每组10只。L-MUC1疫苗组动物背部皮下接种L-MUC1肽15微克/只，每周一次，共两次；D-MUC1疫苗+GM-CSF组动物背部皮下接种D-MUC1肽15微克/只，每周一次，共两次，同时腹腔注射GM-CSF 300ng/天；GM-CSF组腹腔注射GM-CSF 300ng/天；D-MUC1疫苗+TP组动物背部皮下接种D-MUC1肽15微克/只，每周一次，共两次，同时腹腔注射TP 0.4毫克/天；TP组腹腔注射TP 0.4毫克/天。
(1)免疫细胞功能检测(3H-TdR掺入法)第二次免疫接种后一周，每组随机选出四只动物，处死取脾脏并制备脾细胞悬液(2.5×106/ml)。按每孔2.5×105/孔(0.1ml)的浓度将细胞加入96孔培养板中。实验孔添加本发明的合成肽(终浓度5微克/ml和10微克/ml)后，37℃保温4天。然后各孔加入H-TdR(10微居里，50微升)，37℃继续保温14小时。收集各孔培养物，洗涤并烘干后测定并计算各孔的平均cpm值和刺激指数SI。结果如下列表1和表2所示。
表1合成肽疫苗对实验小鼠淋巴细胞增殖活性的影响(治疗实验) n＝4对照组L-MUC1D-MUC1+GM-CSFGM-CSF D-MUC1+TP TPMUC1 1.398±0.25 1.476±0.33 1.311±0.18 1.193±0.36 1.563±0.211.284±0.32(5μg/ml)MUC1 0.958±0.15 1.042±0.26 1.132±0.15 0.872±0.26 1.217±0.19**0.974±0.22(10μg/ml)**与对照组比较P＜0.05。
表2合成肽疫苗对实验小鼠淋巴细胞增殖活性的影响(免疫保护实验)n＝4对照组 L-MUC1D-MUC1+GM-CSF GM-CSF D-MUC1+TPTPMUC11.976±0.33 1.182±0.22 1.430±0.28**0.935±0.37 2.582±0.25*1.284±0.32(5μg/ml)MUC10.853±0.36 0.747±0.16 1.108±0.29 0.910±0.14 2.339±0.34*1.234±0.18**(10μg/ml)*与对照组比较P＞0.01，**与对照组比较P＜0.05。
从表1和2所示的结果可以看出，在治疗实验中，小鼠淋巴细胞体外经10微克/ml合成肽连续刺激4天后，D-MUC1+TP组的淋巴细胞增殖活性明显高于对照组，L-MUC1组的淋巴细胞增殖活性与对照组大致相当。同样，在免疫保护实验中，小鼠淋巴细胞体外经5微克/ml合成肽连续刺激4天后，D-MUC1+TP组的淋巴细胞增殖活性明显高于对照组，L-MUC1组的淋巴细胞增殖活性与对照组大致相当，但D-MUC1+TP和D-MUC1+GM-CSF组淋巴细胞增殖活性明显升高。经10微克/ml合成肽连续刺激4天后，L-MUC1组的淋巴细胞增殖活性与对照组大致相当，但D-MUC1+TP和TP组则明显高于对照组。
(2)特异性CTL检测(3H-TdR掺入法)第二次免疫后一周，处死动物分离脾脏并制备脾细胞悬液(20×107/ml)，取1ml悬液在培养板中加合成肽(5微克/ml)37℃保温8天，即得到效应细胞。然后取处于对数生长期的GZ.A5.3H.4乳腺癌细胞悬液1ml(1×106/ml)，加入3H-TdR(50微居里)37℃水浴4小时，洗涤并取50微升烘干后计算每个细胞的反射标记率。取放射标记的靶细胞悬液50微升(4万个细胞)加入96控培养板中并按不同的效/靶比例加入上述效应细胞100微升，然后37℃保温14小时。对照孔只加靶细胞。用胰蛋白酶消化30分钟后，收集细胞并烘干，然后测定放射计数(cpm)并计算效应细胞对靶细胞的杀伤活性。结果如下列表3和表4所示。
表3合成肽疫苗对实验小鼠特异性CTL杀伤活性的影响(治疗实验) n＝4效∶靶对照组 L-MUC1 D-MUC1+GM-CSF GM-CSF D-MUC1+TP TP100∶1 22.4±4.9 23.0±6.3 48.0±6.7*35.6±6.7*40.5±5.7*28.6±6.4**50∶114.6±4.4 20.3±7.1 39.9±8.0*30.0±3.5*35.4±3.9*22.5±5.0**10∶17.0±3.19.9±3.128.4±8.5*27.7±5.1*22.0±4.3*11.8±5.2***与对照组比较P＞0.01，**与对照组比较P＜0.05。
表4合成肽疫苗对实验小鼠特异性CTL杀伤活性的影响(免疫保护实验)n＝4效∶靶对照组 L-MUC1 D-MUC1+GM-CSF GM-CSFD-MUC1+TP TP100∶1 35.5±4.542.2±5.4**61.0±7.4 37.0±6.3 55.0±6.3*38.5±5.350∶131.6±3.437.5±5.7**53.9±5.2 35.0±3.1**43.4±5.9*35.9±4.5**10∶123.0±2.829.4±4.9**38.0±6.9 31.7±4.1*32.9±4.2*27.0±2.9***与对照组比较P＞0.01，**与对照组比较P＜0.05。
从表3和4所示的结果可以看出，在治疗实验中，小鼠淋巴细胞体外经10微克/ml合成肽连续刺激4天后，D-MUC1+GM-CSF、GM-CSF、D-MUC1+TP和TP组动物的淋巴细胞体外经本发明的合成肽诱导8天后，均产生了MUC1特异性CTL反应，并显示有对GZ.A5.3H.4肿瘤细胞的MUC1特异性杀伤活性。同样，在免疫保护实验中，L-MUC1、D-MUC1+GM-CSF、GM-CSF、D-MUC1+TP和TP组动物的淋巴细胞体外经本发明的合成肽诱导8天后，均产生了MUC1特异性CTL反应，并显示有对GZ.A5.3H.4肿瘤细胞的MUC1特异性杀伤活性。但D-MUC1+TP和D-MUC1+GM-CSF组的杀伤活性明显高于L-MUC1组。
实施例3本发明的疫苗组合物对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响本实施例使用接种了GZ.A5.3H.4乳腺癌细胞(为转染了人MUC1全长度cDNA的细胞系)的纯系小鼠作为实验对象，观察本发明的疫苗组合物对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的的影响。
基本上按照实施例2的方法制备肿瘤动物模型并分组。在治疗实验中，60只6-8周令雌性Balb/c小鼠经皮下接种GZ.A5.3H.4乳腺癌细胞(Biomira公司惠赠)(50万/0.1ml)后7天，如上随机分为6组(每组10只)，于第二次免疫后处死动物并测量肿瘤体积和重量。在免疫保护实验中，于第二次免疫后一周皮下接种GZ.A5.3H.4乳腺癌细胞(Biomira公司惠赠)(50万/0.1ml)，如上随机分为6组(每组10只)，于接种肿瘤细胞后21天处死动物并测量肿瘤体积和重量。结果如表5和表6所示。另外，实验中还切除肿瘤组织进行了病理组织学检查(结果未示出)。
表5合成肽疫苗对对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响(治疗实验)n＝4对照组 L-MUC1D-MUC1+GM-CSFGM-CSF D-MUC1+TP TP肿瘤重量 34.2±13.2 34.8±11.3 18.8±5.0*27.0±4.5 26.8±7.1 31.2±10.0(mg)*与对照组比较P＞0.01。
表6合成肽疫苗对对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响(免疫保护实验)n＝4对照组L-MUC1 D-MUC1+GM-CSFGM-CSF D-MUC1+TP TP肿瘤重量 52.7±13.4 54.8±21.0 31.8±11.4*49.0±18.5 30.8±11.7*50.4±14.5(mg)*与对照组比较P＞0.01。
由这些结果可以看出在对预先接种肿瘤细胞的荷瘤动物进行的治疗实验中，L-MUC1组小鼠的肿瘤生长速度和处死前的肿瘤重量均与对照组接近，而D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP组小鼠的这些参数则明显低于对照组。光学显微镜下可见D-MUC1+GM-CSF组肿瘤组织有大范围病理性坏死。D-MUC1+TP、GM-CSF和TP组小鼠肿瘤组织中也存在有相似的坏死病灶，但坏死程度和范围均小于D-MUC1+GM-CSF组。组织学检查进一步发现，在D-MUC1+GM-CSF佐剂的参与下，D-MUC1在小鼠体内诱导的CTL反应导致靶细胞以凋亡和坏死的方式死亡。在对预先接种本发明的合成肽疫苗的动物进行的免疫保护实验中，于动物接种上述肿瘤细胞后三周，断颈处死动物并测定肿瘤重量和体重。结果可见，L-MUC1组小鼠的肿瘤生长速度和处死前的肿瘤重量均与对照组接近，而D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP组小鼠的这些参数则明显低于对照组。光学显微镜下可见D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP组肿瘤组织有大范围病理性坏死。GM-CSF、TP和L-MUC1组动物虽也存在有相似的坏死病灶，但坏死程度和范围均小于D-MUC1+GM-CSF组。
权利要求
1.基于MUC1串联重复序列的免疫原性肽，特征在于所说的MUC1序列包括15个串联重复，其中每个串联重复至少含有一个D-型氨基酸，并且序列的两末端均为脯氨酸。
2.根据权利要求1的免疫原性肽，其中所说的免疫原性肽具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的免疫原性肽，其中所说的基于MUC1串联重复序列的免疫原性肽具有提高了的MUC1特异的免疫原性。
4.根据权利要求1的免疫原性肽，其中所说的基于MUC1串联重复序列的免疫原性肽是以肽合成方法制备的。
5.MUC1特异性疫苗组合物，所说的疫苗组合物基本上是由如权利要求1中限定的免疫原性肽以及一种或多种医药上可接受的佐剂组成的。
6.根据权利要求5的疫苗组合物，其中所说的免疫原性肽可以是与选自血清白蛋白、卵白蛋白和匙蓝蛋白的载体蛋白质化学偶联的。
7.根据权利要求5的疫苗组合物在诱导MUC1特异性抗肿瘤免疫反应中的应用。
8.根据权利要求7的应用，其中所说的MUC1特异性抗肿瘤免疫反应是MUC1特异性细胞毒性淋巴细胞反应。
全文摘要
本发明涉及用于刺激机体产生抗肿瘤免疫反应的肽疫苗，特别是涉及基于粘蛋白1之核心序列的手性肽抗原，含有所说的肽抗原的疫苗组合物，其制备方法及其作为免疫原在刺激机体产生免疫反应中的应用。
文档编号A61K39/00GK1480463SQ0212908
公开日2004年3月10日 申请日期2002年9月3日 优先权日2002年9月3日
发明者颜炜群, 王毅, 李玉林 申请人:吉林圣元科技有限责任公司