专利名称：人源片段抗体的pBAD表达系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及人源片段抗体的pBAD表达系统。
人源抗体如Fab片段的制备主要有两条技术路线，一是鼠源抗体的人源化；二是从人的抗体基因文库中筛选出抗原特异性抗体Fab。应用生物技术原核表达人源抗-HBsFab最早源于Zebedee SL，此后国内外相继有多处制备人源生物工程抗HBsFab和ScFv的报道。迄今为止，所有抗HBsFab的制备均采用组合抗体文库技术，应用pComb3载体，ITPG诱导表达，一直处于实验研究阶段。Lac Z启动子是研究领域应用较多的启动转录元件，结构比较简单，使用方便，其不足之处是在非诱导态克隆基因的表达控制不够严格，会有一定量的基础表达，因而影响宿主菌的生长密度和诱导状态下的高表达。另外在批量制备时，IPTG也不是经济、实用的诱导剂。
pBAD载体是Invitogen公司的商品载体，有多种形式，原用于多种生物蛋白、多肽的克隆与表达，如血红素I蛋白(Rosado Ruiz T2001)，polycyclic aromatic ring dioxygenase(Khaa AA 2001)，重组绿荧光蛋白，人源破伤风抗毒素片段，乳酸脱氢酶等，均获较好效果。
本发明所要解决的技术问题是在现有pBAD系统的基础上加以改进，提供一种经济实用的批量制备人源片段抗体的pBAD表达系统。
本发明公开的制备人源片段抗体的pBAD表达系统是在pBAD系统的基础上，通过基因插入的方式对原质粒进行改造，形成双启动子、双肽分别表达，菌体质周腔定向分泌的载体形式，再分别克隆目的抗体片段基因于改构的pBAD中，经扩增、克隆和酶切电泳，菌体发酵，诱导表达和产物纯化获得目标抗体。
本发明所述的人源片段抗体是指抗体的Fab片段。本发明制备人源片段抗体的pBAD表达系统包括载体的改构与抗原特异Fab的克隆与表达，具体包括1、选择商品高表达载体pBAD/gIII作为本产品的克隆载体，应用供体的外周血或骨髓分离淋巴细胞，制备mRNA经反转录成cDNA，以特定目的基因两端的序列特异引物扩增出编码肽的基因片段(peptide 1，peptide 2)，电泳并胶回收目的片段。
2、依据peptide 1，peptide 2两端所引入的特异性酶切位点E1，E2(peptide 1两端的酶切位点)和E3，E4(peptide 2两端的酶切位点)，以相同的内切酶分别酶切载体，电泳并胶回收载体片段，分别以连接酶与相应的单肽基因连接，构建单肽表达载体。
3、连接产物转化Top10细菌后，经PCR法或酶切鉴定，筛选目的基因阳性克隆，形成pBAD启动单肽表达模式。
4、设计特异引物，以基因扩增方式制备包含单肽基因(peptide 2)和启动子、引导序列的核苷酸序列。
5、双酶切已克隆的含单肽(peptide 1)基因的载体和步骤4扩增制备的核苷酸序列，电泳并胶回收目的片段，以连接酶连接，改构后的质粒图见图5；6、载体转化Top10细菌后，经测序和酶切鉴定，筛选阳性克隆，增菌、发酵培养所选克隆，在阿拉伯糖诱导条件下表达融合蛋白，进行双启动表达试验，验证双肽同步表达的可行性。
本发明所述的分泌性表达载体为pBAD/gIII，其结构见
图1。
与商品pBAD系统比较，该系统的主要改进是增加了一个启动转录系统。在生物体内，为数不少的蛋白有两个或多个多肽构成，成为一个完整的功能体，因而两个亚单位的同步、等量比转录和翻译是此类蛋白表达的关键环节。鉴于人源抗体的结构特征以及许多此类蛋白的表达要求，本系统的改造具有很强的针对性和实用性。实验结果表明，该系统对双基因的同步表达是高效、可行的，也扩展了原系统的使用空间。
本发明所述的载体启动转录诱导剂为阿拉伯糖。加入阿拉伯糖后，pBAD中的转录子启动，大量转录目的基因并翻译成相应蛋白；属高拷贝载体，蛋白表达量高；可呈分泌性表达，便于活性蛋白的构形和部分的修饰。
本发明人源片段抗体的pBAD表达系统可用于任一活性抗体片段的表达，如Fab片段，Fv片段，ScFv等，由于抗体是一个巨大的生物产品范畴，涉及人类诸多疾病的防治，如几乎所有的传染病，破伤风、毒蛇伤、多种肿瘤、自身免疫病等等，因而该系统有极广的应用领域。此外，鉴于该载体系统的质周性、可溶性表达的特点，其他一些可溶性蛋白，融合蛋白的表达也可在该系统完成。
2、pBAHBs-Fd和pBAHBs-Lc的克隆 载体质粒分为二组，一组用Xho I和Bgl II双酶切，另一组用Pst I和Xba I双酶切，1％的琼脂糖电泳回收载体DNA。Fd PCR产物和Lc PCR产物用相同于克隆载体的双酶切，酶的用量为30u/μg，酚氯仿重复抽提、乙醇沉淀法纯化出PCR产物，按载体插入片段1∶5的比例16℃连接过夜。以连接产物转化感受态TOP10，取单菌落用LB增菌，质粒DNA制备同上，酶切电泳法筛选插入阳性菌落。
3.pBAHBs-Fab载体的构建(1)pBAD/Lc片段的制备此片段是指pBAD启动子和Lc片段，而非完整的轻链表达载体，制备的目的是在Fd重链载体中再插入另外一个pBAD启动子和Lc片段，形成双启动子、双肽定向表达的单载体结构。分别增菌pBAD-Fd和pBAD-Lc阳性克隆，Mini-prep提取质粒DNA，用pBAD-Lc两端引物(Forward5’-GAA TTC AAACCA ATT GTC CAT ATT GC，Backward5’-TT AAC TCT AGA ACTATG AAC)扩增出pBAD/Lc片段。
(2)pBAHBsFab克隆EcoR I和Xba I分别酶切切pBAHBs-Fd载体和pBAD/Lc扩增产物，连接后转入感受态TOP10菌株供双重插入筛选。
4.阳性菌株的筛选与鉴定筛选双重插入菌落，阿拉伯糖诱导表达，PAGE和Westem blot鉴定抗-HBsFab的表达效果。
(1)克隆载体的酶切鉴定取转化菌落，LB增菌过夜，常规法制备质粒DNA。1.Not I单酶切双重插入的载体，以同样酶切无插入pBAD载体为对照，琼脂糖电泳分别于5.7Kb和4.1Kb处可见酶切条带，证实Fd和pBAD/Lc基因的正确插入；2.Xho I与Xba I双酶切，用Marker显示分别于1.6Kb和4.1Kb处可见酶切条带。见图2。
(2)阳性克隆的诱导表达 取上述鉴定结果为正确插入的克隆，增菌至OD600 1.4，加入终浓度为0.02％的阿拉伯糖诱导表达，28-30℃过夜。次日，按反复冻融法制备菌液上清，10％的PAGE经Coommasia blue染色，于约47.5Kd处可见浓集的表达产物条带，见图3。
(3)Westerm Blot和抗原特异Dot Blot鉴定抗-HBs Fab的正确表达PAGE步骤同上，电泳毕，按半干转印法转印分离条带于硝酸纤维膜上，与HRP标记抗-Fab反应后，以DAB显色，证实于47.5Kd的蛋白区带确为Fab；HBsAg溶液(mg/血)3μl点样于硝酸纤维膜上，封闭液浸泡过夜，PBS冲冼后加入制备的菌液上清，室温反应2h，洗膜后再与HRP标记抗-Fab反应，用DAB液显色，表明表达产物具有抗原结合活性。见图4和6。实施例2 HIA-I类抗原的克隆与表达HLA-I类抗原的克隆与表达HLA-I类抗原具有结构不同的两个亚单位，分别为α与β链。在制备中要求一定的化学修饰如二硫键和空间结构的维持；要求等比例的合成；要求二个亚单位的自然结合并保持特定的立体构型。因载体己具备双启动表达结构，在启动子之后又有多克隆位点，因而可以应用分步克隆法完成HLA-I类抗原的克隆与表达。
1、先通过双酶切(XhoI，Bgl II for α链克隆，EcoR I，Xba I forβ链克隆)制备线性粘末端载体DNA。
2、用序列特异引物分别扩增出α与β链的基因片段，以相同的双酶切后与线性载体作单一亚单位的基因连接。
α链forward GAA CTC AGA T CAT TCT ATG AGA TAT TTC TTCACA TCC GTG3’backward AGA TCT
β链forward5’A CCGGAA TTCAAT CCC CTC ATT AAG 3’backward5’A CCGTCT AGACAG TCT TGG GCT CCT 3’3、筛选正确克隆载体，使用另外双种内切酶处理筛选过的载体和另一条链的基因，进行二次克隆和阳性株的筛选与鉴定。
4、对双克隆阳性株进行双启动表达实验和HLA-I类抗原的结构与功能研究。
其他某些二聚体，双亚单位蛋白的表达也可以使用该系统。
权利要求
1.人源片段抗体的pBAD表达系统，该系统是在原有pBAD系统的基础上，通过基因插入的方式对原质粒进行改造，分别克隆目的抗体片段基因于改构的pBAD中，经扩增、克隆和酶切电泳，菌体发酵，诱导表达和产物纯化获得目标抗体，其特征在于该系统对原质粒进行改造形成双启动子、双肽分别表达，菌体质周腔定向分泌的载体形式。
2.根据权利要求1所述的人源片段抗体的pBAD表达系统，其特征在于所述的人源片段抗体是指抗体的Fab片段。本发明制备人源片段抗体的pBAD表达系统
3.根据权利要求1所述的人源片段抗体的pBAD表达系统，包括载体的改构与抗原特异Fab的克隆与表达，其特征具体包括1)选择商品高表达载体pBAD/gIII作为本产品的克隆载体，应用供体的外周血或骨髓分离淋巴细胞，制备mRNA经反转录成cDNA，以特定目的基因两端的序列特异引物扩增出编码肽的基因片段peptide 1，peptide 2，电泳并胶回收目的片段；2)依据peptide 1，peptide 2两端所引入的特异性酶切位点E1，E2和E3，E4，以相同的内切酶分别酶切载体，电泳并胶回收载体片段，分别以连接酶与相应的单肽基因连接，构建单肽表达载体；3)连接产物转化Top10细菌后，经PCR法或酶切鉴定，筛选目的基因阳性克隆，形成pBAD启动单肽表达模式；4)设计特异引物，以基因扩增方式制备包含单肽基因peptide 2和启动子、引导序列的核苷酸序列；5)双酶切已克隆的含单肽peptide 1基因的载体和步骤4扩增制备的核苷酸序列，电泳并胶回收目的片段，以连接酶连接；6)载体转化Top10细菌后，经测序和酶切鉴定，筛选阳性克隆，增菌、发酵培养所选克隆，在阿拉伯糖诱导条件下表达融合蛋白，进行双启动表达试验，验证双肽同步表达的可行性。
全文摘要
本发明涉及人源片段抗体的pBAD表达系统。该系统是在pBAD系统的基础上，通过基因插入的方式对原质粒进行改造，形成双启动子、双肽分别表达，菌体质周腔定向分泌的载体形式，再分别克隆目的抗体片段基因于改构的pBAD中，经扩增、克隆和酶切电泳，菌体发酵，诱导表达和产物纯化获得目标抗体。该系统有极广的应用领域，特别适用于可溶性蛋白，融合蛋白的表达。
文档编号A61K39/395GK1442481SQ0311623
公开日2003年9月17日 申请日期2003年4月8日 优先权日2003年4月8日
发明者韩焕兴 申请人:韩焕兴, 陆慧琦, 罗荣城