蛋白激酶Czeta调控肿瘤细胞趋化运动的用途的制作方法

专利名称：蛋白激酶Czeta调控肿瘤细胞趋化运动的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白激酶Czeta调控肿瘤细胞趋化运动的用途。
背景技术：
趋化因子及其受体在不同阶段肿瘤生存、生长和转移中起着非常重要的作用，不仅调节肿瘤细胞的生长和转移，而且趋化不同类型的白细胞，形成利于肿瘤细胞生存、生长、分化的微环境。如Muller及其同事发现，在小鼠模型中，CXCR4和它的配体SDF-1α控制乳腺癌转移的分布模式，参见文献(Muller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokinereceptors in breast cancer metastasis.Nature 2001；41050-56.)因此，阻断趋化运动可以有效地控制癌细胞的转移并缩小或消除肿瘤。
曾有研究发现，肿瘤细胞的趋化运动是通过化诱因子及其受体活化G蛋白信号通路介导的，例如，MIP-3β/CCR7、IL-8/CXCR1-2、SDF-1α/CXCR4等。化诱因子的受体属于七次穿膜受体超家族，它们通过下游偶联的G-蛋白传递活化信号。近十年来，细胞生物学家对七次穿膜受体和G蛋白调控的趋化运动的分子机理进行了深入研究，认识到趋化因子和特异受体偶联后，能够活化一系列细胞内信号转导过程，包括PI3K活化，Ca2+动员，PKC活化，细胞内肌动蛋白聚集、细胞形态改变，最终导致细胞的定向迁移或者其它的生物学活动(Kimmel AR andParent CA.The Signal to MoveD.discoideum Go Orienteering.Science.3001525-1527，2003.)。
除了G蛋白信号通路以外，实际上其它的信号传递通路，酪氨酸蛋白激酶受体，也可以调控趋化运动。例如，表皮生长因子及其受体(EGF/EGFR)也能够诱导细胞的趋化运动，且与G蛋白的信号传递无关(Price JT，Tiganis T，Agarwal A，Djakiew D，and Thompson EW.Epidermal Growth Factor Promotes MDA-MB-231 Breast Cancer Cell Migration through aPhosphatidylinositol 3-Kinase and Phospholipase C-dependent Mechani sm.Cancer Res.595475-5478，1999.)。但是对酪氨酸蛋白激酶受体诱导的趋化运动的分子机制所知甚少。EGF/EGFR在肿瘤的生长和转移中可能同样起着非常重要的作用。研究发现在多数乳腺癌细胞中，EGFR表达水平增高，而且往往与临床预后不良密切相关。以EGFR为靶点设计的特异性抗EGFR的封闭抗体阻断EGFR的功能后，能够有效抑制小鼠体内多种EGFR高表达的肿瘤细胞的生长和转移(Baselga J，Mendelsohn J.The epidermal growth factorreceptor as a target for therapy in breast carcinoma.Breast CancerRes Treat.1994；29127-38.)。
研究还发现，多种趋化因子受体活化后能够诱导一种人蛋白激酶C(Protein Kinase C，以下简称PKC)的活化。而PKC的活化对于白细胞和其它的细胞的趋化运动、趋化因子受体自身的负反馈调节以及不同趋化因子受体之间的功能调节非常重要。不同的趋化因子、不同的受体和不同的细胞类型导致不同的PKC亚型的活化。
但是，PKC亚型在EGFR诱导的肿瘤细胞趋化运动中功能尚属未知，也未见到以PKC亚型为靶点设计特异抗癌药物方面的研究。

发明内容
本发明的目的是1.研究EGF/EGFR诱导的细胞趋化运动机制，寻找EGFR和趋化因子授体诱导的趋化运动的信号传递途径中可能分享共同的下游信号蛋白，并了解此信号蛋白在EGFR诱导的细胞趋化运动中的作用；2.确定在EGF诱导的肿瘤细胞趋化运动中起关键作用的PKC亚型。
3.以上述确定的PKC亚型为靶点设计有效抑制肿瘤细胞的转移和生长的药物。
本发明发现PKCζ是肿瘤细胞的趋化运动的必需组分，抑制该酶的活化可以有效地抑制EGFR和趋化因子受体诱导的肿瘤细胞的趋化运动。
本发明的技术方案是运用对不同PKC亚型特异的抑制剂分析EGF诱导肿瘤细胞的趋化性定向移动的分子机理。然后分析不同的特异性PKC抑制剂对EGF诱导的肿瘤细胞趋化运动的影响，以便确定起关键作用的PKC亚型。运用合成的特异的PKCζ假底物短肽抑制PKCζ的活性和免疫荧光等方法进一步验证该种PKC分子确实参与EGF诱导的乳腺癌细胞的趋化运动的信号转导过程。
具体研究方法及结果如下1.利用微孔趋化小室，以乳腺癌细胞株MDA-231为肿瘤细胞模型研究EGF诱导的细胞趋化运动。
细胞趋化是一种有效、直接、简便的研究体外细胞定向运动的方法。本发明使用不同浓度的人EGF和SDF-1α检测乳腺癌细胞的趋化运动。结果显示，EGF以剂量依赖方式诱导MDA-231趋化运动，并且，与趋化因子相比，ECF趋化能力更强。
2.检测特异的抑制剂对细胞趋化运动能力的影响因为已知PI3K和PKC参与趋化因子诱导的细胞趋化运动，本发明检测不同浓度的特异的PI3K的抑制剂Ly294002和不同PKC亚型特异的抑制剂对细胞趋化运动能力的影响，以确定PI3K和PKC是否也参与EGF诱导的乳腺癌细胞MDA-231的趋化运动。结果显示蛋白激酶Czeta(以下简称PKCζ)和PI3K特异抑制剂能够抑制EGF诱导的乳腺癌MDA-231细胞的趋化运动。提示PI3K和PKCζ亚型很可能参与EGF诱导的肿瘤细胞的趋化运动。
3.EGF能够特异诱导PKCζ亚型的活化细胞内PKC的膜移位是PKC活化的特异标志。在静止的细胞中，PKC主要分布于细胞质，细胞受到刺激后，PKC活化并且移位到细胞质膜或者核膜。为了确定PKCζ能够被EGF特异刺激活化，用免疫荧光染色确定PKC分子在细胞内的分布。结果表明EGF能够特异诱导PKCζ膜移位。另外，PI3K抑制剂Ly294002能够完全抑制这一过程。结果表明，与趋化因子诱导的下游信号途径一致的是，PI3K也参与EGF诱导的细胞内信号转导过程，并且PKCζ活化依赖PI3K。
使用抑制剂得到的结果只能给我们提示信号通路中可能起作用的蛋白分子，为了进一步确定PKCζ参与EGF诱导的细胞趋化运动，用合成的特异的PKCζ假底物短肽(Pseudosubstrate)和对照短肽与细胞孵育后检测细胞的趋化运动能力。结果显示，与对照短肽相比，特异的PKCζ底物短肽以剂量依赖方式抑制细胞趋化，且在100μM浓度时完全抑制。表明PKCζ参与EGF诱导MDA-231细胞中的趋化运动并且起着非常重要的作用。
本发明从以上工作的结果中得出，PKCζ参与肿瘤细胞的趋化运动，是肿瘤细胞趋化运动的必需组分，抑制该酶的活化可以有效地抑制EGFR和趋化因子受体诱导的癌转移。因此PKCζ是设计高效、特异的抗癌细胞生长和转移的药物的关键靶点。


图1说明特异的PI3K的抑制剂Ly294002和不同PKC亚型特异的抑制剂对EGF诱导的乳腺癌细胞MDA-231的趋化运动的影响。
细胞与不同浓度的抑制剂(见实施例中说明)在37℃共同孵育45-60分钟后，直接加到趋化小室的上板孔中，检测抑制剂对细胞的趋化能力的影响。如图所示，PI3K抑制剂Ly294002和PKCζ抑制剂能够完全抑制细胞的趋化，而G6850、G6976对细胞的趋化无显著影响。
图2表明合成的特异的PKCζ底物短肽(Pseudosubstrate)能够特异抑制MDA-231细胞趋化运动。与对照短肽相比，特异的PKCζ假底物短肽以剂量依赖方式抑制细胞趋化，并且在10μM浓度时完全抑制特异的PKCζ，假底物短肽和对照短肽对细胞的随机趋化能力没有影响。合成短肽对细胞的随机趋化能力没有影响。
具体实施例方式本发明用以下实施例进一步清楚说明本发明的技术内容，需要说明的是，尽管在实施例中仅举出了用人乳腺癌MDA-231细胞进行实验，但本领域的其它技术人员可以在不脱离本发明实质性内容的范围内使用其它肿瘤细胞达到类似结果。
名词解释蛋白激酶C蛋白激酶C超家族分三个家族classical PKC、novel PKC和atypical PKC。蛋白激酶Czeta(以下简称PKCζ)是PKC超家族的ζ亚型，是atypical PKC家族的成员之一，该家族的蛋白激酶可能具有一定的组成性活性，但是与其它家族的蛋白激酶C相同的是，它们也可以被磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰肌醇类(PI)以及不饱和脂肪酸激活。激活的PKCζ磷酸化下游底物分子中的某些丝氨酸和苏氨酸位点，调节下游分子的功能，因此PKCζ也属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。
实验材料来源人乳腺癌MDA-231细胞由美国国家癌症研究所Dr.Joost J.Oppenheim赠送；趋化小室购自Neuro Probe公司；EGF购自BD公司；0.01％Fibronectin来自Sigma；Ly294002、G6850、G6976、Chelerythrine Chloride、合成的PKCζ假底物短肽和对照短肽购自Calbiochem公司；Oregon green 514-Phalloidin购自Molecular Probe公司；兔抗人PKCα和抗人PKCζ多克隆抗体购自Santa Cruz公司。
实施例1 EGF能够诱导MDA-231细胞趋化运动1.实验方法用趋化小室检测细胞的趋化运动是一个非常成熟的方法，可使用本领域常规方法具体操作。简略地说，将不同浓度的化诱因子EGF和SDF-1α加到趋化小室下层板的孔中。用滤膜分隔上下小室，上层小室加MDA-231细胞。孵育后去除膜上层非特异趋化的细胞后，将膜固定、Diff-Quick染色后显微镜下计数(400x视野)。每孔计3个视野的平均数作为该孔的趋化细胞数。样品孔的趋化细胞数，与对照孔的细胞数的比率即为趋化指数。结果用3个孔的平均趋化指数±标准差(Mean±SD)表示。每个实验至少重复3次。
2.实验结果趋化因子SDF-1α能够以剂量依赖方式诱导MDA-231细胞的趋化运动，趋化指数约为4倍左右。同样，EGF也能够诱导MDA-231细胞的趋化运动，趋化指数可达到10倍以上。
3.结论人EGF能够诱导MDA-231趋化运动，且与趋化因子SDF-1α相比，EGF是更强的趋化诱导剂。
实施例2 PKCζ和PI3K特异抑制剂对MDA-231趋化运动的抑制1.实验方法用特异的PI3K的抑制剂Ly294002(30μM)和不同PKC亚型特异的抑制剂，100nM G6850，50nM G6976，10μM Chelerythrine Chloride在37℃预先处理细胞45-60min，然后直接加到趋化小室上板孔中，检测细胞对EGF的趋化运动能力。
2.实验结果见图1，PI3K特异的抑制剂Ly294002能够有效抑制EGF诱导的MDA-231趋化运动；与之相同，PKCζ特异的抑制剂Chelerythrine Chloride也能够完全抑制MDA-231细胞的趋化。然而，G6850和G6976，抑制cPKC和nPKC，对EGF诱导的MDA-231运动没有明显的抑制作用。
3.结论Ly294002和Chelerythrine Chloride能够有效抑制EGF诱导的乳腺癌细胞MDA-231的趋化运动，提示PKCζ，而非其他的PKC亚型，和PI3K参与EGF诱导的乳腺癌MDA-231细胞的趋化运动，并且起着重要的作用。
实施例3 免疫荧光方法确定EGF能否特异诱导PKCζ分子在MDA-231细胞中活化1.实验方法实验前48h种植MDA-231细胞，用含0.1％BSA的无血清FPMI 1640继续培养3h。用含抑制剂(30μM Ly294002)或者不含抑制剂的无血清培养基(FPMI 1640，0.1％BSA)继续处理细胞60min。用培养基(FPMI 1640，0.1％BSA)或EGF(用FPMI 1640，0.1％BSA稀释到50ng/ml)刺激特定一段时间后用4％PFA将细胞固定。PBS洗涤两次后用0.2％Tween 20于4℃穿膜30min。再次洗涤后用兔抗人PKC的特异多抗(分别1∶100稀释到PBS中)室温孵育1h后，用PBS充分洗涤3次，然后加FITC-(异硫氰荧光素)标记的羊抗兔二抗室温避光孵育1h，再次充分洗涤后共聚焦荧光显微镜观察PKC的分布。
2.实验结果在未受EGF刺激的细胞中，PKCα和PKCζ主要分布于细胞浆。EGF刺激后，PKCζ分布改变移位到细胞内膜，与之形成鲜明对比的是，PKCα的分布在EGF刺激前后没有变化。说明在MDA-231乳腺癌细胞中，EGF能够诱导PKCζ的活化，并且，PKCζ的活化是特异的。经过PI3K抑制剂Ly294002预处理后，对未受刺激细胞内的PKCα和PKCζ的分布没有影响，然而完全抑制了EGF诱导的PKCζ的膜移位，说明PI3K参与EGF诱导的PKCζ的活化过程，PKCζ的活化依赖PI3K。
3.结论EGF能够特异活化PKCI，PI3K抑制剂Ly294002完全抑制PKCζ活化，提示与趋化因子诱导的下游信号途径一致的是，PKCζ参与EGF诱导的细胞内信号转导，并且PKCζ活化依赖PI3K。使用抑制剂得到的结果只能给我们提示信号通路中可能起作用的蛋白分子。
实施例4 特异的PKCζ假底物短肽抑制细胞趋化实验1.实验方法用合成的特异的PKCζ假底物短肽(Pseudosubstrate)和对照短肽与细胞37℃孵育1h后检测细胞的趋化运动能力。
2.实验结果结果见图2。与对照短肽相比，特异的PKCζ假底物短肽以剂量依赖方式抑制细胞趋化，并且在100μM浓度时完全抑制。特异的PKCζ假底物短肽和对照短肽对细胞的随机趋化能力没有影响。
3.结论PKCζ参与EGF诱导的MDA-231细胞的趋化运动，抑制PKCζ的功能能够完全抑制细胞的定向运动。
以上各实验表明，PKCζ是肿瘤细胞的趋化运动的必需组分，抑制该酶的活化可以有效地抑制EGFR和趋化因子受体诱导的癌转移，并导致肿瘤的缩减。因此PKCζ是设计高效、特异的抗癌细胞生长和转移的药物的关键靶点。
权利要求
1.蛋白激酶Czeta调控肿瘤细胞趋化运动的用途。
2.权利要求1所述蛋白激酶Czeta的用途，所述肿瘤细胞趋化运动是肿瘤的生长和转移的关键过程。
3.权利要求1或2所述蛋白激酶Czeta的用途，所述肿瘤细胞是乳腺癌细胞。
4.蛋白激酶Czeta用于设计和制备抗肿瘤药物的用途。
5.权利要求4所述蛋白激酶Czeta的用途，所述抗肿瘤药物是抗乳腺癌药物。
6.蛋白激酶Czeta抑制肿瘤生长和转移的用途。
全文摘要
本发明涉及蛋白激酶Czeta(Protein Kinase Cζ，PKCζ)在调控肿瘤细胞趋化运动中的用途。本发明发现PKCζ是肿瘤细胞的趋化运动的必需组分，抑制该酶的活化可以有效地抑制EGFR和趋化因子受体诱导的肿瘤细胞的趋化运动。因此PKCζ是设计高效、特异的抗癌细胞生长和转移的药物的关键靶点。
文档编号A61K38/48GK1647820SQ20041000114
公开日2005年8月3日 申请日期2004年1月30日 优先权日2004年1月30日
发明者张宁, 孙荣华, 朱斯特J·奥本海姆, 马大龙 申请人:北京大学