专利名称：一种大黄素注射制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于中药制药技术领域，具体涉及大黄素注射制剂及其制备方法。
背景技术：
大黄素是一种蒽醌类物质，主要存在于蓼科、鼠李科等植物中，是大黄、首乌、虎杖等中药的有效成分，也是一类重要的天然色素。药理实验表明大黄素具有抑制胰酶活性、抗炎、抑菌、免疫调节、保护肝肾、利胆、抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集、抗肿瘤等多种作用。以大黄、首乌、虎杖为君药，以大黄素为主要有效成分的制剂应用十分广泛，而大黄素尚未有用于临床的报道。大黄素药理活性广泛，毒副作用少，药源丰富，随着对其药理作用的深入研究，大黄素良好的临床应用前景将逐渐显露。
目前有以大黄素为主要有效成分的大黄注射液的研究报道，但未见大黄注射液的销售，可能与下列因素有关大黄素是强疏水性物质，溶于有机溶媒而几乎完全不溶于水；大黄素对湿、热不稳定[苏子仁等.大黄在提取精制工艺中的化学成分变化研究.药物分析杂志.1998，18(2)85]。上述因素使制备及贮存注射制剂存在较大困难。
β-环糊精(简称β-CD)是一种新型的药物包合材料，具环状中空筒型，环外亲水、环内疏水的特殊结构和性质。利用β-CD特殊的结构和性质，可以将不溶于水的药物分子包结，增加药物的溶解度和稳定性。在欧洲和日本已有西药的β-CD包合物产品上市，β-CD已载入美国、日本和中国药典。一般认为药物分子的溶解度越小，β-CD包合物的增溶作用则越大，如齐墩果酸的β-CD包合物可使它的溶解度提高12倍，累积溶出率增大6倍[颜耀东等.齐墩果酸-β-环糊精包合物的研究.中成药，1995，17(6)4]。β-CD只是CD中溶解度最小的一种经结构修饰后其溶解性大大提高，如羟烷基化β-CD衍生物，羧基β-CD衍生物等，环糊精在药物制剂中的应用将越来越广泛。
发明内容
针对大黄素具有广泛的药理作用，但由于其结构特点和化学性质的限制，缺乏制备可靠的大黄素注射制剂方法的现象，本发明通过将大黄素与复合剂复合，形成了大黄素与复合剂的复合体，增加了大黄素在水中的溶解度及制剂的稳定性，使大黄素在水中的溶解度由＜2.5×10-6mol/l(几乎不溶于水)提高到3×10-6～2×10-5mol/l，在此基础上制备成大黄素注射制剂，特别是制成静脉注射剂，包括不同容量的注射液和冻干粉针剂，为临床应用提供了一种稳定性好、质量高、疗效显著的大黄素注射制剂，本发明还公开了大黄素注射制剂的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
1在40～80℃水浴中，以适量蒸馏水溶解复合剂。
(1)复合剂为易溶于水的带有多羟基的大分子物质，包括改性淀粉、糊精、环糊精。
(2)优选复合剂为带有结合基团的β-CD。
(3)最佳复合剂为羟丙基β-CD。
2大黄素用70～95％的乙醇溶解。
3在40～80℃水浴保温并搅拌状态下，将大黄素乙醇溶液缓慢加入复合剂溶液中，恒温搅拌0.5～2h，得大黄素与复合剂的复合体溶液。
(1)大黄素与复合剂的摩尔比为1∶1～1∶10(2)大黄素与复合剂的摩尔比优选为1∶1～1∶3(3)大黄素与复合剂的摩尔比最佳为1∶24向大黄素与复合剂的复合体溶液中加入适量注射剂用水溶性药用辅料，搅拌使溶解，再补充适量注射用水，搅匀，过滤、分装、灭菌、包装即得本发明的大黄素注射制剂的输液剂。
注射剂用水溶性药用辅料为氯化钠、葡萄糖中的一种。
5将步骤4加入适量注射剂用水溶性药用辅料搅拌溶解后的复合体溶液，加入冻干赋形剂，经过滤、分装，冷冻干燥，即得本发明的大黄素注射制剂的冻干粉针剂。
(1)冻干赋形剂可以是任意常用的冻干赋形剂。
(2)优选冻干赋形剂为甘露醇、乳糖、蔗糖、或葡萄糖中的一种或两种的复合赋形剂。
本发明通过将大黄素与复合剂复合，制成的大黄素注射制剂可用于癌症、肝病、肾病等的治疗。实验证明，本发明的一种大黄素注射制剂稳定性好、质量高、疗效显著。
下面通过实验对本发明的一种大黄素注射制剂作进一步的说明。
实验一对本发明的大黄素注射液的稳定性考察1实验材料 大黄素注射液100ml∶40mg，广东天之骄药物开发有限公司实验室提供。
2实验方法与结果 取3批样品，每批50瓶，室温放置，间隔一定时间检查含量、澄明度合格率，结果见表1。
表1放置时间对大黄注射液稳定性的影响批号 020619 020903 0212207放置时间(月)0 6 12 0 6 120 6 12澄明度合格率(％)10010096 10098 9810010098含量(μg/ml)400398396398398396 400398395实验二大黄素注射液的体外溶血实验及血管刺激实验1实验材料 大黄素注射液100ml∶50g，广东天之骄药物开发有限公司实验室提供；家兔，8只，由第一军医大学实验动物中心提供，体重1.7～2.2kg。
2实验方法与结果2.1溶血实验家兔颈动脉取血，去纤维蛋白原，加约10倍于血液的生理盐水洗涤离心，去上清液，反复数次，至上清液不现红色为止，以生理盐水稀释成2％的红细胞悬液。取洁净试管12支，分为2组，依次编号，按表2所列先在各管加入2％兔红细胞悬液及生理盐水混匀，置37℃恒温箱中30分钟后，各管加入不同量的大黄素注射液(第1、7号管为对照不含大黄素)，摇匀后再置37℃恒温箱中，于15、30、60、120、180、240分钟各观察一次，若溶血则溶液呈透明红色，如有棕色沉淀，表示有红细胞凝聚作用，摇动数次后消失为假凝聚，否则为真凝聚。
实验结果见表2。结果显示大黄素注射液在高剂量和低剂量情况下均未有溶血和引起红细胞凝聚的作用。
表2大黄素注射液溶血实验试管号试剂类别与剂量12345678910 11 122％红细胞悬液(ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5生理盐水(ml)2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0大黄素注射液0.2mg/ml(ml)00.1 0.2 0.3 0.4 0.5大黄素注射液0.4mg/ml(ml) 00.1 0.2 0.3 0.4 0.5溶血------------红细胞凝聚 -------------表示无溶血或红细胞凝聚2.2血管刺激实验取家兔6只，分为2组，每组3只，一组各兔右耳耳缘静脉注射大黄注射液0.8mg/kg(相当于临床日用量)，另一组各兔右耳耳缘静脉注射等量生理盐水，每日一次，连续给药3天，末次给药后1h处死动物，取各兔耳距针眼5mm左右的上下各一段(约1.0×0.5cm)带有静脉的耳片，作病理切片进行组织学观察，检查有无血管充血，组织变性、坏死等显著的刺激反应。
兔耳片经病理组织学光镜检查，大黄素注射液组的6片耳片可见血管扩张，血管周围有红细胞，毛囊周围有少量白细胞浸润，而生理盐水组的耳片组织学检查均见血管周围有少量红细胞，两组耳片均未见血管壁变性、坏死，管腔内亦无血栓形成等改变。
实验三大黄素注射液的急性毒性实验及过敏实验1实验材料 大黄素注射液100ml∶40mg，广东天之骄药物开发有限公司实验室提供；昆明种小鼠40只，由第一军医大学实验动物中心提供，雌雄各半，体重20～25g；豚鼠6只，由第一军医大学实验动物中心提供，体重150～200g，雌雄各半。
2实验方法与结果2.1急性毒性实验取小鼠30只，分为2组，每组15只，雌雄各半，分别尾静脉注射大黄素注射液0.4mg/kg，等量生理盐水，给药1次，观察7d内动物的毒性反应，未见任何中毒症状及动物死亡。
2.2过敏性实验豚鼠6只，雌雄各半，间日腹腔注射0.4mg/ml大黄素注射液0.08mg/kg，共3次；然后分为2组，每组3只，分别于第一次腹腔注射的第14天和第21天在豚鼠右后肢掌外侧静脉注射同浓度同剂量的大黄素注射液，注射速度约2.0ml/min，注射后观察15min内动物情况，如出现竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3次等现象中的两种或以上者，或出现罗音、抽搐虚脱、死亡现象之一者，则认定为过敏实验阳性。
两组豚鼠分别在首次腹腔注射大黄素注射液的第14天和第21天再次注射同样药物后的15min内，各鼠均无竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽，或发生罗音、抽搐、虚脱、死亡等现象，说明大黄素注射液豚鼠过敏实验阴性。
实验四大黄素抗肝纤维化作用1实验材料SD大鼠50只，雄性，由第一军医大学实验动物中心提供，体重220～250g；大黄素注射液100ml∶100mg，广东天之骄药物开发有限公司实验室提供；透明质酸放射免疫试剂盒及层粘连蛋白放射免疫试剂盒，海军上海医学研究所。
2实验方法大鼠50只随机分为5组空白组、模型组、大黄素治疗组(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)。模型组用橄榄油将CCl4稀释成40％的溶液，首次以5ml/kg皮下注射，以后以3ml/kg皮下注射，3天1次，共42天。治疗组在模型组的基础上，同时给予不同剂量的大黄素注射液，每日1次，连续im给药42天。
以放射免疫法测定血清透明质酸和层粘连蛋白取肝组织标本以10％福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片，行VG和HE染色。光镜下观察HE及VG染色肝组织切片，将纤维增生程度分为0～4级。0级无纤维化；1级纤维结缔组织只局限于汇管区扩大，有向小叶发展倾向；2级纤维结缔组织增生进入肝小叶2/3及有1级同样的改变；3级纤维结缔组织增生进入小叶达中央静脉周围；4级纤维结缔组织在全小叶多处弥漫性增生，假小叶形成，并有3级同样的改变。
用2.5％戊二酮固定标本，经1％锇酸固定2h，丙酮乙醇逐级脱水，环氧树脂包埋，醋酸铀和柠檬酸铅染色，超薄切片，透射电镜观察。
3实验结果3.1大黄素注射液对血清透明质酸及层粘连蛋白影响 与正常组比较，模型组血清透明质酸及层粘连蛋白显著升高(P＜0.001)；与模型组比较，大黄素治疗组血清透明质酸及层粘连蛋白降低，结果见表3。
表3大黄素注射液对血清透明质酸及层粘连蛋白影响(x±s，n＝10)透明质酸含量 层粘连蛋白含量组别(μg/l) (μg/l)正常组 63.1±20.9 24.6±6.4模型组 167.8±43.7Δ79.3±27.2Δ10mg/kg95.3±34.0*48.6±18.7*大黄素治疗组 20mg/kg86.8±47.4*37.5±17.5*40mg/kg75.6±33.3**34.7±17.4**注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.0013.2大黄素对肝组织病理学的影响正常组肝脏肝板以中央静脉为中心呈条索状向四周放射样排列，板间有不规则肝窦，肝小叶内网状纤维支架完整，分布规律，无胶原纤维存在。模型组肝细胞变性坏死，肝小叶结构破坏，纤维结缔增生，假小叶形成。大黄素治疗组肝细胞变性坏死明显减轻，纤维结缔明显减少，未见明显的假小叶形成。各组肝纤维化情况见表4，与模型组比较，大黄素能明显改善肝纤维化程度。
表4大黄素对肝组织病理学的影响(只)纤维化分级组别 U0 IIIIIIIV正常组1000 0 0模型组0 02 3 510mg/kg 0 24 3 1 2.03*大黄素治疗组 20mg/kg 0 53 2 0 2.87**40mg/kg 0 63 1 0 2.93**注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.014电镜观察正常肝细胞呈多面体，细胞核为圆形或椭圆形，核膜清晰，胞浆内有散布的核糖体，有分布规律的内质网，线粒体呈圆形或椭圆形。模型组肝细胞核固缩、变形，核膜模糊不清，线粒体肿胀、结构模糊、嵴减少，内质网溶解，胞浆内有大量脂滴，核糖体脱失。大黄素治疗组肝细胞损害减轻，无明显的脂滴，线粒体膜性结构可见，内质网存在，但不如正常组规律。
实验五正交设计研制大黄素羟丙基-β-CD包合物1仪器与试药日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪；日本岛津SPD-6A紫外检测器；大黄素对照品，中国生物制品检定所；羟丙基-β-CD(HP-β-CD)，Aldrich Chem Co.。甲醇为色谱纯，Fisher公司；其余均为分析纯，水为超纯水。
2方法与结果2.1正交设计 经预实验及总结文献资料，影响制备大黄素HP-β-CD包合物的因素主要为A(HP-β-CD与大黄素摩尔比)、B(搅拌时间)和C(包合温度)3个因素，每个因素分了3个水平，按L9(34)正交试验表设计实验方案。其正交试验方案和结果见表5、表6。
表5因素水平表水因素平A HP-β-CD与大黄素摩尔比 B搅拌时间(h)C包合温度(℃)1 1∶1 0.5 402 2∶1 1603 3∶1 280表6正交试验结果试验号 A B C 药物包合率(％)1A1B1C150.762A1B2C263.383A1B3C382.264A2B1C277.785A2B2C392.496A2B3C179.647A3B1C370.308A3B2C162.919A3B3C267.72K165.47 66.2864.44K283.30 72.9369.63K366.98 76.5481.68R17.84 10.2617.25
2.2大黄素HP-β-CD包合物 精密称取HP-β-CD适量溶于100ml注射用水中，于相应温度恒温。精密称取一定量的大黄素，用适量乙醇溶解后，在转速为120r·min-1搅拌下缓缓滴入HP-β-CD溶液中，并继续搅拌至规定时间，放入冰箱中冷藏24h，滤过，用适量甲醇洗涤包合物沉淀，40℃干燥4h，精密称重，研磨，过5号筛，含量测定，计算药物包合率，置于干燥器中备用。
2.3包合物大黄素含量测定2.3.1色谱条件色谱柱BeckmanC18反相色谱柱(4.6×25cm，5μm)；流动相甲醇0.1％磷酸(90∶10)，流速1.0ml/min，检测波长286nm；柱温室温；定量方法外标法。
2.3.2对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品适量，加无水乙醇-醋酸乙酯(2∶1)制成每1ml含大黄素0.01mg的溶液。
2.3.3供试品溶液的制备精密称取大黄素HP-β-CD包合物供试品10mg，用0.1mol/l的盐酸溶液在37℃水浴中水解24h，醋酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸干，残渣加醋酸乙酯定容至10ml量瓶中，摇匀，即得。
2.3.4标准曲线的制作 精密吸取对照品溶液4，8，10，15，20μl，分别注入高效液相色谱仪，以峰面积值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，作线性回归，得回归方程Y＝98.813X-10.807，r＝0.9998，结果表明，大黄素在0.046～0.230μg范围内呈良好的线性关系。
2.3.5精密度试验 精密吸取供试液连续进样测定5次，大黄素峰的RSD为1.2％。
2.3.6回收率实验 精密称取包合物适量，加入一定量的大黄素对照品水解于100ml量瓶中，按相同的方法处理并测定，大黄素的平均回收率为100.2％，RSD为1.3％。
2.4包合物的药物包合率测定 药物包合率是考察药物被包合程度的指标之一。药物包合率(％)＝包合物中药物的量(g)/药物投料总量(g)×100％2.5数据处理与结果分析 将表2的药物包合率进行直观分析和方差分析，结果见表7，并用综合平衡法分析得到最佳条件为A2B3C3，即A2＝HP-β-CD大黄素(摩尔比)为2∶1；B3＝2h；C3＝80℃。各因素对药物包合率影响大小顺序为A＞C＞B。按此优化条件获得5批大黄素HP-β-CD包合物的药物包合率见表8。
表7方差分析表变异来源 SS γ MS F P总 1246.1128A586.758 2 293.37921.786 ＜0.05B162.667 2 81.334 6.040 ＜0.2C469.754 2 234.47717.442 ＜0.1误差 26.933 2 13.466表8包合物的药物包合率(n＝3，x±s)批号 药物包合率(％)030924 90.2±3.4030925 90.5±0.4030926 87.1±2.7030927 86.9±2.7030928 86.4±2.5将上述5个批号的包合物的药物包合率进行方差及q检验，结果表明5个批号间的药物包合率差异无显著性(P＞0.05)。两两批号间差异也无显著性(P＞0.05)，说明处方设计合理，生产工艺稳定。
具体实施例方式
实施例一取羟丙基β-CD60g，加注射用水250ml，置50℃水浴中，搅拌使溶解；取大黄素2g，加70％乙醇50ml，搅拌使溶解，在40～80℃水浴保温并搅拌状态下，将大黄素乙醇溶液缓慢加入羟丙基β-CD溶液中，恒温搅拌1h，加入氯化钠45g，搅拌溶解，再加注射用水至5000ml，过滤，分装成每瓶100ml，115℃灭菌30分钟，包装，即得。
实施例二取羟丙基β-CD120g，加注射用水2500ml，置70℃水浴中，搅拌使溶解；取大黄素8g，加80％乙醇100ml，搅拌使溶解，在40～80℃水浴保温并搅拌状态下，将大黄素乙醇溶液缓慢加入羟丙基β-CD溶液中，恒温搅拌1.5h，加入氯化钠90g，搅拌溶解，再加注射用水至10000ml，过滤，分装成每瓶50ml，115℃灭菌30分钟，包装，即得。
实施例三(冻干粉针剂)取羟丙基β-CD200g，加注射用水1000ml，置80℃水浴中，搅拌使溶解；取大黄素10g，加85％乙醇100ml，搅拌使溶解，在40～80℃水浴保温并搅拌状态下，将大黄素乙醇溶液缓慢加入羟丙基β-CD溶液中，恒温搅拌2h，加入甘露醇100g，搅拌溶解，再加注射用水至1500ml，无菌过滤，西林瓶分装成每瓶6ml，冷冻干燥，包装，即得。
实施例四(冻干粉针剂)取羟丙基β-CD150g，加注射用水500ml，置60℃水浴中，搅拌使溶解；取大黄素8g，加90％乙醇50ml，搅拌使溶解，在40～80℃水浴保温并搅拌状态下，将大黄素乙醇溶液缓慢加入羟丙基β-CD溶液中，恒温搅拌5h，加入甘露醇100g，搅拌溶解，再加注射用水至1000ml，无菌过滤，西林瓶分装成每瓶5ml，冷冻干燥，包装，即得。
权利要求
1一种大黄素输液剂，其特征在于它是由大黄素与复合剂形成的复合体和注射剂用水溶性药用辅料组成的。
2一种大黄素冻干粉针剂，其特征在于它是由大黄素与复合剂形成的复合体以及注射剂用水溶性药用辅料和冻干赋形剂组成的。
3根据权利要求1或2所述的输液剂或冻干粉针剂中大黄素与复合剂形成的复合体，大黄素与复合剂的摩尔比为1∶1～1∶10。
4根据权利要求1或2所述的输液剂或冻干粉针剂中大黄素与复合剂形成的复合体，大黄素与复合剂的最佳摩尔比为1∶2
5根据权利要求1或2所述的输液剂或冻干粉针剂，其中的复合剂为易溶于水的带有多羟基的大分子物质，包括改性淀粉、糊精、环糊精、β-CD。
6根据权利要求1或2所述的输液剂或冻干粉针剂，其中的复合剂也可以是羟丙基β-CD。
7根据权利要求1或2所述的输液剂或冻干粉针剂，其中的注射剂用水溶性药用辅料为氯化钠、葡萄糖中的一种。
8根据权利要求2所述的冻干粉针剂，其中的冻干赋形剂也可以是甘露醇、乳糖、蔗糖、或葡萄糖中的一种或两种的复合赋形剂。
9一种大黄素输液剂的制备方法，其特征在于大黄素用70～95％的乙醇溶解后，在40～80℃水浴保温并搅拌状态下，将大黄素乙醇溶液缓慢加入复合剂溶液中，恒温搅拌0.5～2h，得大黄素与复合剂的复合体溶液，向大黄素与复合剂的复合体溶液中加入适量注射剂用水溶性药用辅料，搅拌使溶解，再补充适量注射用水，搅匀，过滤、分装、灭菌、包装即得本发明的大黄素注射制剂的输液剂。
10一种大黄素冻干粉针剂的制备方法，其特征在于大黄素用70～95％的乙醇溶解后，在40～80℃水浴保温并搅拌状态下，将大黄素乙醇溶液缓慢加入复合剂溶液中，恒温搅拌0.5～2h，得大黄素与复合剂的复合体溶液，向大黄素与复合剂的复合体溶液中加入适量注射剂用水溶性药用辅料，搅拌使溶解，加入冻干赋形剂，经过滤、分装，冷冻干燥，即得本发明的大黄素注射制剂的冻干粉针剂。
全文摘要
本发明涉及一种大黄素注射制剂，其特征在于它是通过将大黄素与复合剂复合，形成了大黄素与复合剂的复合体，增加了大黄素在水中的溶解度及制剂的稳定性，在此基础上制备成大黄素注射制剂，特别是制成静脉注射剂，包括大、小容量的输液剂和冻干粉针剂，可用于治疗癌症、肝病、肾病等。
文档编号A61K31/122GK1555785SQ20041000231
公开日2004年12月22日 申请日期2004年1月8日 优先权日2004年1月8日
发明者张正生 申请人:张正生