专利名称：肝细胞生长因子基因修饰骨髓间质干细胞在心肌缺血治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体说是涉及以骨髓间质干细胞为基因载体，携带肝细胞生长因子基因在心肌缺血治疗中的应用。
背景技术：
缺血性心脏病是发病率高且严重危害人体健康的心脏病，在西方国家它是成年人死亡的首要病因。我国相对而言，冠心病的发病率较低，但却呈逐年上升的趋势。目前冠心病的治疗方法主要有手术干预和药物治疗两大类。针对局部心肌缺血情况，已经开展了多种促血管生长因子的基因治疗研究；针对局部心肌组织坏死，也开展了干细胞局部注射的替代疗法。研究表明，将从骨髓获得的单个核细胞或间充质干细胞注射到心肌缺血的局部及周边，可以改善心脏的功能。但干细胞替代治疗面临的一个主要问题是移植的干细胞在局部组织的存活率问题。研究表明，移植到局部损伤组织的干细胞，90％以上因环境不适而死亡，难以达到预期的治疗效果。选择合适的基因对干细胞进行修饰，提高细胞的移植存活率将可能提高治疗效果。如用癌基因akt修饰能明显提高间质干细胞在心肌缺血部位的存活率，从而大大提高治疗效果。将促血管生长因子基因和干细胞结合起来，对心肌缺血同时进行基因和细胞治疗，目前还没有这方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于心肌缺血治疗的方法，即用携带肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor.HGF)基因的骨髓间质干细胞(bone marrow-derived mesenchymalstem cells，MSC)局部注射治疗缺血性心脏病。该方法既可以改善心肌局部缺血(HGF具有明显的促血管生成作用)、降低局部胶原沉积(HGF具有抗纤维化作用)，又可以修复部分坏死的心肌细胞(MSC具有向心肌细胞分化的能力)。同时，HGF又是一个存活因子和趋化因子。其趋化作用可使修饰的干细胞因局部的HGF水平高而停留在损伤组织局部，而抗凋亡作用又可使细胞的移植存活率升高。因此，HGF基因修饰的MSC在心肌缺血的治疗中具有明显的优势。
具体实施方案如下1.分离和鉴定骨髓间质干细胞，证明重组腺病毒可以有效的转染骨髓间质干细胞。
2.证明携带人干细胞生长因子基因的骨髓间质干细胞可以整合到缺血心肌局部，并且能明显改善心肌缺血和心脏的功能。
图1 MSCs的肌源性分化。
5-aza处理MSCs 14天后免疫组化染色肌源性标志α横纹肌肌动蛋白结果图2通过Ad-GFP(携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒)对骨髓间质干细胞的转染测定腺病毒载体对间质干细胞的转染率。
图3当MOI＝150pfu/cell时，Ad-GFP对骨髓间质干细胞的转染情况。
1.光镜下的间充质干细胞；2.同一视野下荧光显微镜的观察结果图4酶联免疫(ELISA)方法检测转染AD-HGF(MOI＝150pfu/cell)后细胞培养上清HGF的表达水平。
图5心肌缺血局部注射高表达HGF的MSCs(5×106)后28天大体心脏切片TTC染色结果。
图6大鼠心肌注射MSCs、Ad-HGF和高表达HGF的MSCs后28天时，缺血区的血管生成情况。
a.对照组(AD-GFP)；b.注射Ad-HGF实验组；c.注射MSCs实验组；d.注射高表达HGF的MSCs实验组图7原位杂交检测注射的MSCs在局部缺血组织中的整合情况。
a.阳性对照组(雄性大鼠心肌组织)；b.阴性对照组(雌性大鼠心肌组织)；c.注射MSCs实验组图8天狼猩红染色法检测治疗后局部缺血组织的胶原沉积情况。
a.正常心肌组织；b.结扎未治疗组(对照组)；c.注射Ad-HGF治疗组；d.注射高表达HGF的MSCs实验组表1 心肌缺血区大小和形态计量学测定结果。
表2 血液动力学测定结果。
具体实施例方式(1)骨髓间质干细胞的分离培养将大鼠脱臼致死，用75％的乙醇浸泡消毒，在无菌条件下分离股骨并剪去两端，用PBS冲出骨髓，进行Percoll(密度1.073)梯度密度离心，取中间单核细胞层，离心收集细胞，用DMEM-LG培养(Sigma)基洗细胞三次。将获得的细胞用含10％血清(Hyclone)的DMEM-LG分瓶培养，24h后洗去未贴壁的细胞，继续培养直至出现细胞克隆(约10天)。将细胞克隆消化后分瓶培养，记为第一代。本实验使用细胞为传代培养的第3～5代细胞。
(2)骨髓间充质干细胞向心肌细胞的诱导分化将细胞接种于12孔培养板，培养48h后，加入10μmol/L的5-氮杂胞苷(5-aza，Sigma)，继续培养，以后每周换液两次，同时加入相同浓度的5-aza。14天时对细胞进行肌源性标志检测，即免疫组化检测α横纹肌肌动蛋白表达。抗α横纹肌肌动蛋白抗体为Santa Cruz公司产品。结果如图1所示，5-aza处理后细胞表达α横纹肌肌动蛋白肌细胞标志。
(3)腺病毒载体对间充质干细胞的转染率将细胞接种于6孔培养板，待细胞长至80～90％汇合时，进行腺病毒转染。转染之前将培养液吸出，用DMEM-LG洗细胞一次，加入不同MOI的Ad-GFP(携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒，由美国百特医疗用品公司基因治疗部(Gene Therapy Unit，Baxter HealthcareCompany，USA)惠赠)，MOI分别为0、50、100、150、200、400pfu(plaque forming unit)/细胞，以DMEM-LG为对照。1-2小时后吸出病毒液，同时加入完全培养基。48小时后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况，并用流式细胞术检测转染效率。结果表明腺病毒转染MSC具有很高的效率，如图2和图3所示。
(4)Ad-HGF转染MSC后HGF的表达用MOI＝200pfu/细胞的Ad-HGF(携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒，由放射医学研究所实验血液学研究室构建)转染细胞，于不同时间收集培养上清，用ELISA方法检测HGF的表达情况。培养上清和包被液(0.5mol/LNaHCO3缓冲液，pH 9.6)以1∶1的比例混匀，加入酶标板，每孔100μl，4℃包被24h；倒掉包被液，用5％小牛血清的PBS封闭过夜；加入HGF抗体(R&D)，100μl/孔，37孵育60min；弃去一抗，用含0.05％TWEEN-20的PBS洗去未结合的抗体，3×5min；加入二抗，每孔100μl，37℃孵育45min，清洗同上；用OPD-H2O2系统显色，490nm波长测定。结果MSC转染Ad-HGF后，HGF的表达水平明显升高，并可以持续14天以上。如图4所示。
(5)大鼠心肌缺血模型的建立Wistar大鼠，二级，雌性，体重350-400g(购自军事医学科学院实验动物中心)，用1％戊巴比妥钠溶液麻醉(30mg/kg)；剪去左侧胸部的毛，用碘伏消毒，再以75％的酒精脱碘；沿肋骨走向在左侧第四肋间切开皮肤，钝性分离胸大肌，先接上呼吸机，再剪开胸膜，垫高大鼠背部；以手挤压其腹部暴露心脏；结扎冠状动脉前降支。结扎之后分四组进行实验(1)空白对照组；(2)心肌内注射Ad-GFP 1×109pfu组；(3)心肌内注射Ad-HGF 1×109pfu组；(4)心肌内注射经200pfu/细胞Ad-HGF转染的MSCs5×106组。
(6)大鼠心肌缺血的治疗效果在结扎后28天，用1％戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠(30mg/kg)；剪去右侧胫部的毛，用碘伏消毒，再以75％的酒精脱碘；切开皮肤，分离颈动脉，插管进行血液动力学检查。结果如表1所示，治疗后大鼠的血液动力学指标得到了明显改善。
随后处死大鼠，取心脏，均匀切成0.5cm厚的薄片，用含1％TTC(Sigma)的PBS溶液在37染色20min，然后用4％甲醛溶液固定，缺血区不着色，非缺血区染成砖红色，结果如图5所示。将组织切片扫描成数字图像，进行软件分析缺血区大小和左心室厚度等指标，结果如表2所示。制作石腊切片，进行HE(苏木素-伊红)染色，观察血管的分布密度。结果实验组缺血区明显较少，新生血管数量明显增多。如图6所示。
用原位杂交检测性别决定基因sry的方法检测注射MSCs在局部心肌组织的整合情况。结果如图7所示，注射的雄性MSCs细胞在雌性心肌组织缺血局部发生了整合，分化成了心肌样细胞，形态上与周围的心肌细胞没有明显的差异。
同时，对组织进行了天狼猩红染色，用偏振光显微镜观察胶原及其胶原类型，结果显示治疗组组织中胶原薄且明显减少，而对照组创伤组织中有丰富的大而粗的红色I型胶原(见图8)，表明HGF有明显的减少创伤组织中胶原形成的作用。
权利要求
1.促血管生长基因修饰干细胞在心肌缺血治疗中的应用。
2.该方法的特征是用肝细胞生长因子基因对骨髓间质干细胞进行修饰，然后局部注射治疗心肌缺血。
全文摘要
用携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒转染骨髓间质干细胞，获得高表达肝细胞生长因子的干细胞，局部注射治疗心肌缺血，既可以改善局部缺血症状、降低胶原沉积，又可以修复部分坏死的心肌细胞，具有明显的治疗效果。
文档编号A61K48/00GK1657101SQ20041000439
公开日2005年8月24日 申请日期2004年2月19日 优先权日2004年2月19日
发明者段海峰, 王立生, 吴祖泽, 吴丹莉, 刘红军, 张群伟, 王 华, 鲁茁壮, 贾向旭, 哈小琴 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所