一种药物组合物、制备方法及在医学中的应用的制作方法

专利名称：一种药物组合物、制备方法及在医学中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物，具体涉及一种用于治疗阴道内菌群失调和阴道炎的药物组合物、制备方法及在医学中的应用。
背景技术：
阴道微生态平衡的破坏是各种妇科炎症的诱因，也是各种妇科疾患的结果。阴道炎症的治疗主要包括杀菌剂、微生态制剂两方面。杀菌剂的治疗特异性强，效果显著，但抗菌谱广，选择性不强，因此副作用较多，且复发率高。现有单菌种微生态制剂均以细菌性阴道炎作为治疗靶点，适用范围局限。同时，阴道不同区段正常菌群分布有一定的规律，即深部以双歧杆菌为主，中段以乳酸杆菌为主，这样各种正常菌群不协调改变可导致不同区段的阴道炎。
在制剂方面，尽可能提高活菌存活率一直是微生态制剂追求的目标，其存活率的影响因素主要体现在温度、分散保护剂的使用、氧含量、酸碱度等方面。本发明的发明人已公开的专利号为01128659.8、发明名称为“一种双歧杆菌、乳酸杆菌混合活菌滴剂及制备方法”对此进行了一些探讨，该发明着重于提出一种阴道双歧杆菌、乳酸杆菌的分离纯化方法。但还存在如下不足1、说明书中所述的抗炎、抗感染、抑菌、抗肿瘤和免疫调节作用，是根据双歧杆菌的体外试验文献报道推断而来，没有具体的实验数据进行支持。由于双歧杆菌属和乳酸杆菌属分别含有上百株，各菌株理化特性不尽相同，产生的治疗效果当然不同。如已被证实，格氏乳杆菌和卷曲乳杆菌对大肠杆菌和淋球菌根本无效，不但无抗肿瘤和免疫调节作用，而且对人体还能造成机会感染。因此，这种推断并不客观，存在相当的不确定性。2、在治疗的适应症方面，该发明只提及“抗炎、抗感染、抑菌效果好”，没有特定的适应治疗范围，也没有具体的实验结果进行支撑，仅是现有文献基础上的推断。3、没有考虑药物的酸碱度同时对乳酸杆菌和双岐杆菌的活菌存活和生长条件的影响、对抑制致病菌的增长条件的影响、对局部(阴道)用药环境酸度相适宜条件的影响。4、在使用时，由于是在体外以平衡液混合溶解，很难避杂菌的污染，同时有氧环境会降低药物的活菌数。而且，该发明没有涉及治疗的疗程，因此疗效很难以一定标准进行判定。5、制备过程中所加的甘油赋形剂会影响活菌数。

发明内容
本发明的目的之一是提出一种既适合于鉴定编码为47757732的双歧杆菌和/或鉴定编码为44346222的乳酸杆菌的活菌存活和生长条件，又能抑制致病菌的增长，又能与局部(阴道)用药环境酸度相适宜的药物组合物及其制备方法。
本发明的另一目的是提供鉴定编码为47757732的双歧杆菌和/或鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备治疗阴道炎药物中的用途，特别是制备治疗细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、淋病性阴道炎等药物中的用途。
本发明的又一目的是提供鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备治疗阴道内菌群失调药物中的用途。
本发明的又一目的是提供鉴定编码为47757732的双歧杆菌和/或鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备清除大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌、白色念珠菌等药物中的用途。
实现上述目的的技术方案一种药物组合物，含有治疗有效量的鉴定编码为47757732的双歧杆菌(以下简称双歧杆菌)和/或鉴定编码为44346222的乳酸杆菌(以下简称乳酸杆菌)，适量的酸、碱以及药物学可接受载体，所述适量的酸、碱使其混合后的药物组合物PH值为3.75-5.3，PH值优选4～5。
所述酸是柠檬酸、酒石酸、富马酸或己二酸，所述碱是碳酸钠或碳酸氢钠。
一种药物组合物的制备方法，包括如下步骤(1)分别制备鉴定编码为47757732的双歧杆菌和/鉴定编码为44346222(是否还有一个44346022)的乳酸杆菌的冻干菌粉；(2)将药物学可接受载体干燥、粉碎后与适量的酸、碱混合均匀，使其混合物的PH值为3.75-5.3；(3)将步骤(1)制得的菌粉与步骤(2)制得的混合物混合后压制成形。
进一步地，所述药物学可接受载体包括填充剂、干燥粘合剂和粘合剂，步骤(2)进一步包括如下步骤(4)将填充剂、干燥粘合剂和粘合剂干燥、粉碎后过筛；(5)将酸、填充剂、碱、干燥粘合剂搅拌混合均匀；(6)向步骤(5)中加入粘合剂，制得混合物软材；(7)将混合物软材制粒并烘干，制得步骤(2)中所述的混合物。
进一步地，所述步骤(3)是先将步骤(1)制得的菌粉与一填充剂混合研匀分散后再与混合物混合后压制成形。
进一步地，所述药物学可接受载体包括填充剂乳糖、淀粉，干燥粘合剂、填充剂维晶纤维素，崩解剂、干燥粘合剂低取代羟丙基纤维素，粘合剂5％PVPK30乙醇溶液(95％)，所述酸是酒石酸，所述碱是碳酸氢钠，步骤(2)进一步包括如下步骤(4)将称量的酒石酸加入淀粉搅拌混合，再将称量的碳酸氢钠和乳糖加入并混合均匀；(5)在步骤(4)中再加入维晶纤维素和低取代羟丙基纤维素混合均匀后以5％PVPK30乙醇溶液(95％)作粘合剂，制软材；(6)将软材在制粒机中用制粒、烘烤，制得空白颗粒；步骤(3)进一步包括如下步骤(7)将称量的菌粉分别与适量的乳糖研匀分散；(8)再与空白颗粒等量递加混合均匀，(9)加入润滑剂混匀，压制成片。
本发明提供鉴定编码为47757732的双歧杆菌和/或鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备治疗阴道炎药物中的用途，特别是制备治疗细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、淋病性阴道炎等药物中的用途。
本发明提供鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备治疗阴道内菌群失调药物中的用途。
本发明提供鉴定编码为47757732的双歧杆菌和/或鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备清除大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌、白色念珠菌等药物中的用途。
本发明提供上述药物组合物在制备治疗阴道炎药物中的用途，特别是制备治疗细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、淋病性阴道炎等药物中的用途。
本发明提供上述鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备治疗阴道内菌群失调药物中的用途。
本发明提供上述药物组合物在制备清除大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌、白色念珠菌等药物中的用途。
采用上述技术方案，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于1、通过在含有鉴定编码为47757732的双歧杆菌和/或鉴定编码为44346222的乳酸杆菌的药物组合物中加入酸和碱，并控制药物组合物的PH值为3.75-5.3(PH值优选4～5)，模拟了女性阴道的PH环境，与正常生理条件相一致，因而既适合活菌的存活和生长条件，又能抑制致病菌的增长，又能与局部(阴道)用药环境酸度相适宜，不会对人体造成刺激。另外，PH在4～5范围以内，片剂可压性好，便于制作片剂。2、通过药效学试验证实，单一的阴道乳杆菌和双歧杆菌及其两种菌以不同比例混合液，对阴道炎致病菌均有抑杀菌效果。而且发现，当单一的阴道乳杆菌或双歧杆菌及其两种菌以不同比例混合后的浓度达到一定值后(1×107CFU/克)，对致病菌的抑制率已达到了接近100％。且詹氏乳杆菌与青春双歧菌的比例与抑杀效果无相关关系。3、通过体内治疗细菌性阴道炎实验证实二联活菌洁阴剂不但具有治疗细菌性阴道炎的肯定疗效，而且在达到治疗效果的同时，具有维持或重建阴道内正常菌群微生态环境的作用。4、通过体内治疗霉菌性阴道炎和淋病性阴道炎实验研究证实a、二联活菌洁阴剂在产生有效治疗作用的基础上，具明显的重建阴道内微生态环境，补充正常菌群纠正菌群失调的突出优点，对预防疾病的复发或再感染可产生积极的作用。b、二联活菌制剂重建的阴道内正常菌群可以继续发挥治疗作用。c、临床应用中没有发现其有明显副作用，对哺乳期女性应用未受到限制，这些正是二联活菌洁阴剂的优势所在。
具体实施例方式
一、药物的制备1、菌粉的制备按照专利号为01128659.8发明名称为“一种双歧杆菌、乳酸杆菌混合活菌滴剂及制备方法”中所述的方法，制得经API-20A鉴定编码为44346022/44346222的乳酸杆菌菌种和编码为47757732的双歧杆菌菌种，将菌种分别接种于发酵罐中，培养至对数生长期，离心后制得乳酸杆菌菌泥和双歧杆菌菌泥，菌泥浓度不低于1.0×109CFU/克，加入分散保护剂，约-70℃冻干后，采用冷冻干燥法制得乳酸杆菌菌粉和双歧杆菌菌粉。
加入的分散保护剂可以是脱脂牛奶、乳糖、谷氨酸钠、半胱氨酸和淀粉等，其中，半胱氨酸的加入量控制在0.01％～0.1％之间。加入半胱氨酸的作用是还原氧，使菌粉中氧含量下降，同时在冻干过程中保护细菌不被破坏。当半胱氨酸含量低于0.01％时作用不明显，但由于半胱氨酸本身会抑制细菌的增长，当半胱氨酸含量高于0.1％时，反而会杀死活菌。
2、剂型的制备(1)药物组成包括乳酸杆菌、双岐杆菌、酸、碱和其它药学上可接受的载体，通过酸、碱调节控制制剂的PH值为3.75-5.3之间，优选pH值为4～5之间。
由于培养液PH值的变化对乳酸杆菌和双岐杆菌菌泥的产量影响较大，实验表明，PH调整至6.3-6.5时培养24h湿菌泥得率最高。因此，不通过酸碱调节，将制得的菌泥制成菌粉后直接与药学上可接受的载体结合用于人体是不太适合的。
通过向药物中加入酸、碱调节，使药物的PH值控制在3.75-5.3之间，既能保证乳酸杆菌和双岐杆菌的活菌存活和生长；同时抑制致病菌的增长，又可与局部(阴道)用药环境酸度相适宜，适宜人体，避免受到刺激。
可供选择的酸源有柠檬酸、酒石酸、富马酸、己二酸等，碱源有碳酸钠、碳酸氢钠等。
本实施例选择性质稳定、不易吸湿的酒石酸为酸源，碳酸氢钠为碱源。为了获得与局部用药环境酸度相适宜、有利于活菌存活的最佳酸度(pH4～5)，我们考察了酸、碱不同比例对酸度的影响。取不同比例酸、碱制得的泡腾片(以常规辅料为填充剂)各5片分别溶解于50ml蒸馏水中，测定泡腾片溶解后的pH值。见表1表1


由上表可见，酒石酸与碳酸氢钠的比例选择为0.8∶1～1.4∶1，优选0.9∶1～1.2∶1。
将药物制成片剂(简称二联活菌洁阴泡腾片或泡腾片)，药学上可接受的载体包括各种填充剂、粘合剂、干燥粘合剂、等，进一步地，根据需要，还包括崩解剂、润滑剂、润湿剂和溶剂等。
选用常用的乳糖和淀粉作为本发明的填充剂。选用维晶纤维素作为颗粒间的干燥粘合剂和填充剂。选用低取代羟丙基纤维素作为崩解剂和干燥粘合剂，加入崩解剂能使阴道用药后泡腾片迅速崩解，药物分散在较大范围粘膜表面，迅速提高局部血药浓度而发挥作用，且没有栓剂的油腻性。选用硬脂酸镁作为润滑剂。
粘合剂的选择要制成片剂，必须有一定的硬度。采用适宜的粘合剂，有利于片剂成型并增加片剂硬度。另外，由于泡腾片中分别含有一定的酸源、碱源，片剂在放置过程中容易吸湿并反应产生气体而使片膨胀、破裂，硬度的增加可以减少片剂中颗粒间孔隙，而且在贮存过程中较有效抵抗潮湿空气的侵入。我们选择三种常用的不同种类的粘合剂，以不同浓度的乙醇为溶剂，分别配成一定浓度的溶液，按拟定的同一处方制粒，然后压片，以颗粒的成型性、片剂硬度及崩解时限为指标考察不同浓度粘合剂的粘合效果。结果如表2表2不同浓度粘合剂的粘合效果

实验结果表明，采用5％PVP乙醇溶液作为粘合剂所制得的颗粒有较好的成型性，所压的片剂有适宜的硬度，崩解速度较快，且PVP能溶于高浓度乙醇中，适用于非水制粒。HPMC(5％)粘合剂也较理想，但需要一定含水量的乙醇配制，可适于不同的制备工艺。
表3给出了三个实验例表3实验例筛选及结果(重量单位克)


从以上结果中可以看出，采用实验例2制备得到的片剂有较好的成型性，酸度在4～5范围以内，片剂可压性好，崩解时限符合要求，较其他两个实验例为优。后面药效实验采用实验例2制得的片剂进行。
(2)制备工艺空白颗粒制备在严格的环境下[RT18±1℃，相对湿度(45±1)％，无菌室]，所有辅料均预先干燥、粉碎并过100目筛。将称量的酒石酸置于混合器中，加入淀粉搅拌混合，称取碳酸氢钠和乳糖加入并混合均匀。再加入维晶纤维素和低取代羟丙基纤维素混合均匀后以5％PVPK30乙醇溶液(95％)作粘合剂，制软材，在制粒机中用18目筛制粒，50～60℃烘烤，控制水份2％以内，30目筛整粒，去除50目细粉得30～50目空白颗粒。
样品制备将称量的A、B菌粉分别与等量乳糖研匀分散，再与空白颗粒等量递加混合均匀，加入润滑剂混匀后压片，即得泡腾片，半成品质量检查合格后密封包装。
本产品为微生态制剂，有效成分为乳酸杆菌和双岐杆菌。由于剂量小(约占辅料总量的1％)，因此片剂的处方设计以辅料为主。由于主药剂量小及其生物制品的热、湿不稳定性，必须考虑到主药与辅料混合的均匀性及制剂加工过程中热、湿对产品质量的影响。因此采用非水制粒直接混合工艺，先制备空白颗粒再与小剂量主药等量递增获得主药均匀分散的颗粒，再在一定压力下压片制备泡腾片。避免热、湿等因素对活性成分的影响及保证制剂中主药的均匀性。
按照实验例2所述配方，采用上述制备工艺，共制得片剂1000片(以下命名为泡腾片)，经检测，含乳杆菌和双歧杆菌总数不少于2.0×105CFU/片，酸度平均为4.26。
二、二联活菌洁阴泡腾片体外药效学试验2.1材料和方法2.1.1实验材料(1)阴道詹氏乳杆菌LY2034、阴道青春双歧杆菌BH0203活菌菌粉。
(2)致病菌种大肠埃希氏菌ATCC2592标准株和临床株、金黄色葡萄球菌ATCC25923标准株和临床株、淋球菌临床株、白色念珠菌临床株由中南大学湘雅二医院检验科和中南大学湘雅医学院微生物与免疫学教研室提供。菌株形态、生化特征、致病菌的血清型和培养特性鉴定均符合该细菌的鉴定标准[1]。淋球菌通过形态学和API-NH生化鉴定条由中南大学湘雅二医院检验科鉴定。白色念珠菌通过形态学和API-C AUX生化鉴定条由中南大学湘雅二医院检验科鉴定。
(3)培养基MRS配方培养基(用于乳酸杆菌、双歧杆菌、白色念珠菌培养)；普通营养培养基(用于大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌培养)，淋球菌培养基购自广州乐通泰公司商品。
2.1.2实验方法(1)细菌比浊计数方法[3]以1.175％硫酸钡0.05ml加1％硫酸9.95ml，混匀后用530nm波长比色调整其浊度，使吸收值为0.1，该浊度为0.5麦氏单位，细菌数相当于5×108/ml。
(2)试验菌液和对照的制备用接种环取四种致病菌，划线接种于相应的培养平皿，37℃培养24h，詹氏乳杆菌、青春双歧杆菌分别接种于液体MRS培养基中，并分装5ml液体培养基用于对照，共同置于厌氧37℃培养24h。无菌棉签收集致病菌，洗脱于装有0.9％生理盐水的试管中，并以0.9％生理盐水调整各菌液相应浓度0.5麦氏单位。
2.1.3体外杀菌试验各取致病菌菌液0.1ml，用涂布棒涂布于适宜培养基平皿，每种菌重复5个平皿，用琼脂板打孔器打孔，打孔直径为6mm，每个平皿打孔6个，编为1-6号，依次加入MRS液体培养基(空白对照组)、阴道詹氏乳杆菌、阴道青春双歧杆菌、詹氏乳杆菌和青春双歧杆菌1∶1混合液、詹氏乳酸杆菌和青春双歧杆菌3∶1混合液、詹氏乳酸菌和青春双歧杆菌1∶3混合液各200μl，37℃培养24h后，用精确度为1/10的游标卡尺测量抑杀菌环的直径。淋球菌培养平板系商用品，面积较小；乳杆菌∶双歧菌＝1∶3的比例组未做。
2.1.4体外液体最小抑菌浓度各取50μl饱和的标准株大肠杆菌加入到50ml胆盐乳糖培养基中，50μl饱和的标准株金黄色葡萄球菌加入到50ml 7.5％的NaCl肉汤培养基中，混匀后各分装5管，每管9ml，每管分别加入以MRS空白培养基稀释的不同浓度(1×109CFU/ml、1×107CFU/ml、1×106CFU/ml、1×105CFU/ml、1×104CFU/ml、1×102CFU/ml、空白)的詹氏乳杆菌/青春双歧杆菌，置37℃培养6-12h后，用平皿法计数大肠杆菌、金黄色葡萄球菌数量，并与空白对照组进行比较，得出最小的抑菌浓度。并通过青春双歧杆菌与詹氏乳杆菌不同比例混合，浓度为1×104CFU/ml，寻求不同比例的最佳抑杀菌效果。
2.2实验结果2.2.1最小抑菌浓度根据目前在市场上销售的口服类活菌制剂的有效剂量，选择在1×102CFU/ml、1×104--1×107CFU/ml、1×109CFU/ml的詹氏乳杆菌/青春双歧菌(统称益生菌)浓度进行试验。结果表明，詹氏乳杆菌、青春双歧杆菌菌液对阴道炎常见细菌大肠杆菌与金黄色葡萄球菌有明显的抑杀效果。在如下表中可以看出，未加益生菌的试管中致病菌浓度达到了2.0×109CFU/ml，加入1×102CFU/ml益生菌对两种致病菌均能产生一定的抑杀作用，1×104浓度的菌液对两种致病菌的抑杀效果明显上升，达到了98％以上，但是再增加益生菌至1×106CFU/ml并没有改变其抑杀作用，浓度1×107浓度的菌液对致病菌的抑制率已达到了接近100％。而且发现，在有效浓度的情况下，詹氏乳杆菌与青春双歧杆菌的比例与抑杀效果无相关关系。见表4、5、6。
表4不同浓度的青春双歧菌对致病菌的抑制效果

根据表4，可计算出青春双歧菌对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑杀效果在浓度为1×102CFU/ml时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率在27％-57％，而在浓度为1×104CFU/ml时对两种致病菌的抑制作用都达到了99％，再增加浓度抑制效果变化不大，至1×107CFU/ml时抑制率达到了100％。
表5不同浓度的詹氏乳杆菌对致病菌的抑制效果

根据表5，可计算出詹氏乳杆菌对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑杀效果在浓度为1×102CFU/ml时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率在60％-65％，而在浓度为1×104CFU/ml时对两种致病菌的抑制作用都达到了99％，再增加浓度抑制效果变化不大，至1×107CFU/ml时抑制率达到了100％。
表6不同比例的二联活菌对致病菌的抑制效果

表6给出不同比例的二联活菌对致病菌的抑制效果。根据表6，可以看出在有效浓度的情况下，不同比例混合的詹氏乳杆菌与青春双歧杆菌对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑杀效果，各组之间无显著性差异。
2.2.2固体培养基中的抑杀菌效果表7给出二联活菌对四种致病菌的杀菌效果，根据表7所示，单一的阴道乳杆菌和双歧杆菌及其两种菌以不同比例混合液，均有抑杀菌效果。实验显示，可形成清晰的抑杀菌环，而空白培养基(为扩增实验用乳杆菌和双歧杆菌同时配制，并置于增菌环境中)未形成抑杀菌环，目测可见以大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌临床株抑杀菌环最大，二联活菌优于单一双歧杆菌。而对淋球菌、白色念珠菌及金黄色葡萄球菌则非常接近。各不同比例混合液中，等比例混合液抑杀菌环稍大于其他各组且对金黄色葡萄球菌可获得较好抑杀菌效果，其环直径为30.4±0.5。总体结果分析，发现混合菌的抑杀菌环均稍大于单菌的抑杀菌环(乳杆菌对大肠埃希氏杆菌除外)。尽管从实验数据中可以看出1∶1比例混合菌似乎可取得较好的抑杀菌效果，但无统计学意义。
表7二联活菌对四种致病菌的杀菌效果(杀菌环直径mm，X±SD，n＝5)

统计学应用均数的one-wayANOVA统计方法，对淋球菌和白色念珠菌的作用接近(p＞0.05)，单一活菌和混合活菌的杀菌作用接近，詹氏乳杆菌和青春双歧杆菌比例为1∶1、3∶1、1∶3混合后的杀菌作用相近(p＞0.05)2.3结果分析和讨论为确定阴道詹氏乳杆菌LY2034株和阴道青春型双歧菌BH0203株在体外对阴道炎致病菌的杀灭或抑制作用，以及摸索最低的抑菌浓度，为后续的体内试验及制剂处方提供试验依据。本试验选择四种阴道炎常见致病菌大肠埃希氏菌ATCC25922和临床株、金黄色葡萄球菌ATCC25923和临床株、淋球菌临床株、白色念珠菌临床株作为受试菌。通过固体平皿打孔法和液体培养法发现，詹氏乳杆菌和青春双歧菌均对阴道炎常见致病菌有明显的抑杀作用。这种抑杀作用具备开发一种治疗阴道炎药物的条件。从量的角度分析，进一步发现这种抑杀作用具有一定的浓度依赖性。1×104CFU/ml的詹氏乳杆菌或青春双歧菌对这两种致病菌有明显的抑杀作用，抑杀效果达到了99.8％，随着浓度的递增，其抑杀效果亦无改变，出现一个平台期，所以，1×104CFU/ml为最小抑杀菌剂量(最小抑菌浓度，MIC)。根据临床用药的一般原则，用最小的量达到最大的效果，1×104CFU/ml为单次治疗用量。制成片剂后为确保疗效，制剂处方选择1×105CFU/片为佳。固体打孔法和液体培养法均发现，在有效浓度情况下，改变两者的比例对于致病菌的抑杀效果并无明显改变，即这种抑杀效果无叠加和拮抗作用。考虑到女性生殖道的解剖结构和菌群分布特点，即阴道中段以乳酸杆菌为主，阴道深部则以双歧菌占优，因此，本洁阴剂按女性正常菌群生理状态下的分布规律，选用阴道詹氏乳杆菌LY2034株和阴道青春型双歧菌LY2034株二联活菌作为治疗用菌种，同时补充中段和深部的菌群，混合比例为1∶1。
2.4结论1、詹氏乳杆菌及青春双歧菌在体外对常见的阴道炎致病菌均有良好的抑杀作用。
2、根据高效低毒的原则，后续制剂处方选择1×105CFU/片为佳。
3、根据女性生殖道的解剖和菌群分段特点，选用两种菌的混合制剂，比例为1∶1，同时补充不同区段的菌群。
三、二联活菌洁阴泡腾片体内药效学实验(一)——治疗细菌性阴道炎实验3.1目的用三种临床引起细菌性阴道炎的常见致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和淋球菌注入受试动物阴道建立阴道炎动物模型，观察二联活菌洁阴泡腾片对阴道炎的治疗作用，定量评价二联活菌制剂的药效。
3.2材料5号头皮针、10ml注射器、无菌石蜡油、0.2％氧氟沙星注射液(四川科伦大药厂，产品批号A020216，规格为100ml)。新西兰雌性大白兔60只，由中南大学湘雅二医院动物实验室提供。淋球菌专用培养基，购自广州乐通泰公司；甘露醇高盐琼脂(选择培养金葡菌)；伊美红蓝琼脂(选择培养大肠杆菌)，购自中国进出口商品检验技术研究所；MRS培养基(培养乳酸杆菌和双歧杆菌)。大肠埃希氏菌临床株菌液，配制成1.35×108CFU/ml的浓度；金黄色葡萄球菌临床株菌液，配成1.35×108CFU/ml的浓度，淋球菌临床株菌液，配制成6.3×106CFU/ml的浓度[1]，这些细菌均由中南大学湘雅二医院检验科提供和鉴定，上述三种致病菌等体积混合成造模菌。二联活菌菌粉由前述实验例2制得，辅料由中南大学药学院提供。
3.3方法3.3.1.细菌性阴道炎模型建立[2]60只雌性新西兰大白兔，体重1.95±0.30kg，用5号头皮针硅胶管涂无菌石蜡油，缓慢插入大白兔阴道，插入深度约5-8cm，回抽确定在阴道内注射造模菌液0.75ml，随后注少许空气确保药液全部注入腔内。造模第6天，随机处死12只大白兔。取阴道拭子涂片，Gram’s染色镜检，阴道洁度分级；三种致病菌选择性培养基培养做细菌学检查；取阴道组织，固定，行组织病理学检查。
3.3.2.动物实验将48只阴道炎模型大白兔分成6组，每组8只，分别为低剂量治疗组(7×103CFU/ml)、中剂量治疗组(7×104CFU/ml)、高剂量治疗组(7×105CFU/ml)、氧氟沙星组(10mg/kg)、辅料组、空白对照组[1]。每只阴道炎模型动物阴道内注射药液1ml，疗程为5天。分别在治疗前、治疗后测量体重、肛温，观察动物生长、活动情况和外阴洁净情况，无菌小棉签采阴道拭子涂片，Gram’s染色镜检，检查阴道洁度；三种致病菌选择性培养基和MRS培养基培养做细菌学检查；分别处死大白兔，取阴道组织10％中性福尔马林固定，石蜡包块、切片、HE染色做病理学检查。
3.3.3阴道洁度分级参照《妇产科学》第5版统篇教材I级镜下以阴道杆菌为主，并可见大量上皮细胞。
II级镜下有部分阴道杆菌和少量脓细胞和杂菌，上皮细胞亦可见。
III级镜下可见少量阴道杆菌和上皮细胞，伴有大量脓细胞和其它杂菌。
IV级镜下无阴道杆菌，除有少量上皮细胞外，主要是脓细胞和大量杂菌。
3.3.4造模成功判断标准[2]1.白兔外阴外观红肿、流脓、溃烂为+，外阴洁净为-。
2.阴道拭子涂片，阴道洁度分级III-IV级为+，I-II级为-。
3.选择性培养基培养三种细菌均生长为+，无致病菌生长为-。
4.取阴道组织，行组织病理学检查有充血、水肿、坏死和炎性细胞浸润为+，无充血、水肿和炎性细胞浸润为-。
4项判断标准有2项阳性即认为造模成功。
3.3.5阴道炎有效和治愈标准参照《妇产科学》第5版统篇教材1.阴道局部无充血、水肿、异常分泌物2.阴道洁度分级III-IV级，治疗后恢复为II级为有效，I级定义为治愈3.致病菌选择性培养基培养无菌生长为治愈4.病理检查无水肿、出血及炎性细胞浸润.
治愈标准阴道外观正常，洁度I级，无致病菌生长，病理检查正常，无充血、水肿、出血及炎性细胞浸润等改变。
好转标准阴道外观由充血水肿或流脓转变为正常，洁度由III-IV级转变为II级或I级，无或每平皿少数致病菌落，病理检查大致正常。
3.3.6治愈率及有效率的计算治愈率(％)＝痊愈的动物数/各组总动物数×100％有效率(％)＝(好转的动物数)/各组总动物数×100％3.4结果3.4.1雌兔阴道炎造模结果3.4.1.1雌兔阴道炎造模检测造模第6天，观察动物外阴外观，随机处死12只动物进行包括阴道洁净度分级，细菌学检测。阴道组织病理学检查，以评判造模是否成功。结果发现处死的12只雌兔全部造模成功，表现为阴道外观有不同程度的红肿，分泌物异常，洁度III-IV级；细菌学检查发现致病菌；病理学检查发现阴道粘膜充血、水肿、炎性细胞浸润。建模成功率100％。见表8表8 12只人工制造的大白兔阴道炎模型检测结果

表中“+、-”符号为根据判断标准所得。数字为动物编号。
3.4.1.2用于治疗观察的48只动物阴道分泌物检测阴道分泌物革兰氏染色检查。结果显示，治疗前动物的阴道洁净度均为III级和IV级，其中III级28只动物，IV级20只动物，符合阴道炎的诊断。证明未处死48只动物也形成了阴道炎，部分受试动物的阴道分泌物涂片镜下照片，可见大量脓球.。
3.4.2治疗前后阴道洁度与疗效通过阴道拭子涂片，革兰氏染色结果，治疗前阴道分泌液中见大量脓球和致病菌，无Gram’s阳性的杆菌，治疗第6天镜下观，中、高剂量涂片未见脓菌和致病菌，可见阴道杆菌。低剂量组，脓球明显减少，上皮细胞产生，致病菌减少；而氧氟沙星组镜下比较干净，无脓球和致病菌，也无Gram’s阳性的杆菌。
根据临床诊断细菌性阴道炎常用的检测方法，阴道分泌液革兰氏染色检查。结果显示如表9所示，治疗前动物的阴道洁净度均为III级和IV级，符合阴道的诊断。用低剂量的二联活菌制剂亦取得一定的治疗效果，治愈率达到50％，III级和IV级的洁度转为I-II级洁净度，有效率100％，中、高剂量的二联活菌制剂与氧氟沙星疗效相近，可达到88％治愈率和100％的有效率。辅料组和空白对照组无效，仅有12.5％动物自然好转，无痊愈的动物。疗效结果说明，二联活菌制疗效较为肯定，量的角度分析，中剂量足以达到治疗效果。
表9治疗前后阴道洁净度变化和疗效


表内数字为动物数，有效率和治愈率根据判断标准计算所得。
统计学应用spss软件采用多个样本率的X2检验方法，阴道洁度变化和疗效高剂量组、中剂量组、氧氟沙星组无差异(p＞0.10)，但与辅料组、空白对照组有显著性差异(p＜0.025)3.4.3细菌学检测3.4.3.1造模后三种致病菌选择性培养基培养取阴道拭子在三种致病菌选择性培养基培养48小时，处死的12只动物阴道拭子涂皿均发现三种选择性培养基上均有大量成片菌落生长，说明阴道炎模型动物是与三种致病菌有关。
3.4.3.2细菌形态学检测，在上述三种选择性培养基上挑单克隆涂片，Gram’s染色，镜下观察细菌形态，以便从形态学鉴定克隆中的细菌。结果分别显示，可见大量革兰氏阴性杆菌、大量革兰氏阳性葡萄球菌和大量革兰氏阴性双球菌，从形态学的角度，与选择性培养基的目标吻合，进一步证明致动物阴道炎模型的三种致病菌存在于动物的阴道内。
3.4.4治疗前后一般情况3.4.4.1治疗前后受试动物一般情况和体重变化进入试验的所有48号动物自造模至治疗的全过程存活，无一号死亡。受试动物均生长良好，活动自如，毛发见全身光滑。治疗前后体重各组均稍有增加，但无统计学差异。各组间动物体重增加也无统计学意义，间接说明二联活菌洁阴剂对受试动物无明显的毒性影响，结果见表10。
表10.造模前后体重的变化(kg，X±SD)


★统计学应用spss统计软件采用one-wayANOVA分析，各组间治疗前后体重无显著差异(P＞0.05)3.4.4.2治疗前后动物体温变化因为本实验模型是细菌性阴道炎。体温的变化对判断炎症性疾病程度，发生，发展具有一定意义。表11所示为48号受试动物治疗前后的变化。无论是在炎症发展的高峰期和治愈后，受试动物体温无明显变化。说明受试动物对致病菌所致阴道炎症，体温变化不明显。为说明该现象，本试验测定20号健康新西兰大白兔肛门与受试动物体温接近，平均为39.5℃左右。
表11造模前后体温的变化(℃，X±SD)

★统计学应用spss统计软件采用one-way ANOVA分析，各组间治疗前后体温无显著差异(P＞0.05)3.4.5治疗前后受试动物外阴情况治疗前阴道炎模型动物外阴，都有不同程度的充血，水肿，部分有脓性分泌物，少数有糜烂现象。治疗后除辅料及空白对照组动物外阴轻度充血水肿外，二联活菌制剂和氧氟沙星治疗组动物外阴均恢复正常的外观粉红色，干净无分泌物。
3.4.6细菌学检查3.4.6.1.二联活菌洁阴剂治疗后阴道分泌物致病菌和厌氧菌检测.
在注入致病菌造模成功的基础上，为观察二联活菌洁阴剂的抑杀菌效果，用三种致病菌的选择性培养基进入阴道分泌物涂片培养，予以检查是否有效的抑杀了致病菌达到了治疗目的.又因为阴道内的正常菌群大部分为厌氧菌，有报道称之为阴道杆菌，本试验采用培养二联活菌的MRS培养基厌氧培养，观察是否存在菌群失调，和治疗后菌群失调能否得到纠正。
观察结果表明高剂量组和氧氟沙星有强大的抑杀致病菌的作用，未培养出致病菌。二联活菌洁阴剂可重建动物的正常阴道菌群，而氧氟沙星无此作用。低剂量的二联活菌制剂甚有明显抑杀菌作用，致病菌落明显减少。且有重建阴道内正常菌群的作用，对照组动物阴道内仍有大量的致病菌存活，无厌氧菌。说明发生阴道炎后正常阴道内菌群微生态环境遭到了破坏。
3.4.6.2.细菌形态学鉴定。
为了明确选择培养基所能培养的菌群为相应的致病菌。取克隆镜检观察，结果显示，细菌学的形态与相应选择培养基的目的相符。分别显示，可见大量革兰氏阳性葡萄球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阴性双球菌、量杆状和短棒状厌氧菌。
3.4.6.3.二联活菌洁阴剂治疗后受试动物阴道分泌物致病菌和厌氧菌检测。
为全面评估二联活菌洁阴剂治疗阴道炎的机制。取所有各组受试动物阴道分泌物，用选择性培养基对致病菌进行检测，以便证明二联活菌制剂的治疗效果是通过抑杀致病菌或其他机理。同时用MRS培养基厌氧培养阴道炎正常菌群，以证明阴道炎动物存在菌群失调。二联活菌制剂治疗后能否达到重建阴道内菌群失调的目的。表12结果表明二联活菌制剂和氧氟沙星局部用药能有效地抑杀阴道内致病菌。以氧氟沙星作用最强。二联活菌洁阴剂的抑杀菌作用与剂量有关，中高剂量效果最好。空白和辅料无抑杀菌作用。从中可以看出阴道炎模型动物阴道内存在菌群失调。用二联活菌洁阴剂可重建或纠正阴道炎模型动物阴道内的菌群失调。
表12治疗第六天阴道拭子培养48小时后有菌落生长的平皿数

表内数字为平皿数，+为有菌生长，-为无菌生长。
治疗后，阴道拭子在4种选择性培养基上划皿培养48小时，空白对照组和辅料组仍有大量杂菌生长，几乎没有厌氧菌生长.中高剂量组几乎没有致病菌生长，有大量厌氧菌生长.氧氟沙星组几乎没有致病菌生长也没有厌氧菌生长.*p＜0.05与空白对照组，辅料组比较，+p＜0.05与空白对照组，辅料组，氧氟沙星组比较，统计学应用spss软件采用多个样本率的X2检验方法分析。
3.4.7受试动物治疗后的病理学变化治疗各组的阴道粘膜外观光滑，无溃疡及糜烂，结构清楚。治疗组中，低剂量组二只动物阴道内可见稍有粘稠的分泌物，空白对照组及辅料组各一只动物阴道不充血水肿，其余都可见不同程度的充血水肿及分泌物增多，粘稠。镜下观察发现中，高剂量的二联活菌制剂治疗的动物，组织病理学无异常。低剂量组2号动物阴道组织见充血伴水肿。对照组动物见明显的镜下充血，水肿，并有5只动物伴炎性细胞浸润(如表13)。
表13治疗后阴道炎模型阴道组织病理学改变

◆表中数字为病理学异常例数，每组动物数为8只。造模第5天阴道组织镜下观，有充血、水肿和炎性细胞浸润；治疗第6天阴道组织镜下观，充血、水肿明显减轻，未见炎性细胞浸润，无糜烂，高剂量组、中剂量组、氧氟沙星组无差异，但与辅料组、空白对照组有显著性差异(p＜0.05)，统计学应用spss软件采用X2检验方法分析。
3.5结果分析在体外有效性试验结果基础上，观察二联活菌制剂治疗阴道炎动物模型的效果。用三种致病菌直接注入新西兰大白兔阴道内，能成功地制备出阴道炎动物模型。从外观、阴道分泌物检测、细菌学检测及阴道组织病理学检查证明了动物阴道炎的存在，其特点为阴道分泌物脓球是主要指标，能很好地反映阴道炎的存在，与现行的临床诊断吻合。组织病理学以充血水肿为主的非特异性改变。细菌学检测有一定的意义。从阴道分泌物涂片和空白治疗组厌氧菌培养未发现正常菌，证明阴道炎发生后阴道内存在菌群失调，即致病菌可抑杀阴道内正常菌。
用二联活菌制剂治疗后，阴道外观的红肿及分泌物减少至消失，恢复正常外观。将临床用于检测洁净度判断炎症的方法发现，治疗后的动物模型阴道分泌物明显好转，几乎均有朝洁净方向发展。中、高剂量组疗效显著，治愈率88％，明显优于辅料组及空白对照组，与氧氟沙星的治疗效果接近。从阴道涂片和致病菌选择性培养基培养结果说明，氧氟沙星治疗效果尽管很明显，镜下分泌物洁净且无细菌的痕迹，达到了治疗目标，同时也留下了菌群失调潜在隐患。可导致疾病的复发或重新感染。从空白对照组和辅料对照组的细菌培养结果显示，致病菌引起的阴道炎可导致引道内正常菌群破坏。二联活菌洁阴剂治疗原理是纠正菌群失调，补充正常菌来达到的。因此，结果显示中、高剂量二联活菌剂在达到治疗效果的同时，保持和重建了阴道内正常菌群微环境是本制剂的主要优势。
3.6结论1、二联活菌洁阴剂具有治疗细菌性阴道炎的肯定疗效。与氧氟沙星局部用药效果接近，治愈率为88％。剂量为中等剂量(7×104CFU/ml)为好。
2、二联活菌洁阴泡腾片治疗阴道炎的作用机理是通过建立正常菌群抑杀致病菌达到的。
3、二联活菌洁阴泡腾片具有维持或重建阴道内正常菌群微生态环境的作用。
参考文献[1]徐叔云，卞如濂，陈修，《药理实验方法学》，人民卫生出版社，2002年版[2]施新猷，《现代医学实验动物学》，北京，人民军医出版社，2000年版四、二联活菌洁阴泡腾片体内药效学实验(二)——治疗霉菌性阴道炎和淋病性阴道炎实验4.1材料5号头皮针、10ml注射器、无菌石蜡油。淋必治(2g，批号020601山东鲁抗医药股份有限公司生产)。氟康唑注射液(100ml，0.2g，批号020203025上海华源制药股份有限公司生产)。雌性新西兰大白兔72只，由中南大学湘雅二医院动物实验室提供。淋球菌专用培养基，购自广州乐通泰公司；玫瑰红钠琼脂(培养白色念珠菌)购自中国进出口商品检验技术研究所(北京陆桥技术有限责任公司)；MRS培养基(培养乳酸杆菌和双歧杆菌)。白色念珠菌临床株菌液(3.6×107CFU/ml)，淋球菌临床株菌液(6.3×106CFU/ml)[3]，由中南大学湘雅二医院检验科提供和鉴定。二联活菌菌粉按前述实验例2制备，辅料由中南大学药学院提供。
4.2方法4.2.1.霉菌性和淋病性阴道炎模型建立72只雌性新西兰大白兔，随机分成2组，每组36只，一组阴道内注射白色念珠菌液造模，另一组注射淋球菌液造模。用5号头皮针硅胶管涂无菌石蜡油，缓慢插入大白兔阴道，插入深度约5-8cm，回抽确定在阴道内注射相应造模菌液0.25ml，白色念珠菌液浓度3.6×107CFU/ml淋球菌液浓度6.3×106CFU/m，造模第6天，每组随机处死6只大白兔。做阴道拭子涂片，Gram’s染色镜检，阴道洁度分级，二种选择性培养基培养进行细菌学检测。取阴道组织，10％中性福尔马林固定，行组织病理学检查。
4.2.2.动物实验将30只白色念珠菌阴道炎模型大白兔随机分成5组，每组6只，分别为低剂量治疗组(7×103CFU/ml)、中剂量治疗组(7×104CFU/ml)、高剂量治疗组(7×105CFU/ml)、氟康唑组(14mg/kg)、生理盐水对照组[2]。将30只淋病性阴道炎模型大白兔随机分成5组，每组6只，分别为低剂量治疗组(7×103CFU/ml)、中剂量治疗组(7×104CFU/ml)、高剂量治疗组(7×105CFU/ml)、淋必治组(140mg/kg)、生理盐水对照组，每只阴道炎模型动物阴道内注射药液1ml。随后注射少量空气以确保药液进入腔内，治疗7天。分别在治疗前、治疗后观察动物生长、活动情况和外阴洁净情况，无菌小棉签取阴道拭子涂片，Gram’s染色镜检，检查阴道洁度；选择性培养基培养进行细菌学检测；分别处死大白兔，取阴道组织10％中性福尔马林固定，石蜡包块、切片、HE染色行病理学检查。
4.3结果4.3.1雌兔阴道炎建模结果4.3.1.1处死的12只雌兔阴道炎造模结果造模后第6天，随机处死12只大白兔，观察外阴外观，做阴道拭子涂片，Gram’s染色镜检，阴道洁度分级，细菌学检测。取阴道组织行病理学检查，以评判造模是否成功。结果发现处死的12只雌兔全部造模成功，表现为阴道外观有不同程度的红肿，分泌物异常，洁度III-IV级，阴道粘膜充血，水肿。结果表明大白兔全部造模成功，成功率100％，见表14。
表14 12只大白兔造模成功判断结果

表中“+”号为根据判断标准所得。数字为动物编号。
5、9、20、26、31、36号为白色念珠菌造模组，42、45、53、60、69、71淋球菌造模组。
4.3.1.2未处死60只动物阴道分泌物涂片阴道分泌物革兰氏染色检查。结果显示，治疗前动物的阴道洁净度均为III级和IV级，其中III级29只动物，IV级31只动物，符合阴道炎的诊断。证明未处死60只动物也造模成功。
4.3.2治疗前后阴道洁度的变化4.3.2.1受试动物阴道拭子涂片革兰氏染色镜下检测治疗前白色念珠菌和淋球菌动物模型阴道分泌液中见大量脓球充斥于视野。氟康唑治疗后白色念珠菌动物模型和淋必治治疗后淋球菌动物模型阴道分泌物无脓球，视野比较干净。中、高剂量的二联活菌制剂治疗的淋球菌性和白色念珠菌性阴道炎动物模型阴道分泌物大部分无脓球，治疗组各一例可见少许脓球。低剂量组二联活菌制剂治疗组，白色念珠菌组2例，淋球菌组3例阴道分泌物可见少许脓球。
其中，白色念珠菌造模组治疗前后动物阴道拭子检查造模第5天取阴道拭子涂片，可见大量脓球和致病菌；氟康唑组未见脓球和致病菌，上皮细胞产生；高剂量组治疗后第8天，未见脓球和致病菌，可见阴道杆状菌；中剂量组治疗后第8天，未见脓球和致病菌，可见阴道杆状菌；生理盐水组治疗后第8天，可见脓球及致病菌，未见阴道杆状菌。
淋球菌造模组治疗前后动物阴道拭子检查造模第5天取阴道拭子涂片，可见大量脓球和致病菌；B为淋必治治疗组，未见脓球和致病菌，可见上皮细胞产生；高剂量组治疗第8天，未见脓球和致病菌，可见阴道杆状菌；中剂量组治疗第8天，未见脓球和致病菌，可见阴道杆状菌；生理盐水组治疗第8天，可见脓球及致病菌，未见阴道杆状菌。
4.3.2.2二联活菌洁阴剂治疗白色念珠菌阴道炎动物阴道洁度和疗效结果显示，以氟康唑的疗效最好，有效率和治愈率达100％。二联活菌洁阴剂疗效肯定，有效率甚达100％，以阴道洁度为标准的治愈率为83％，较氟康唑的疗效差。低剂量治疗组的治愈率甚达66％。二联活菌制剂各治疗组均优于生理盐水组，有统计学意义。结果如表15。
表15白色念珠菌造模组治疗前后阴道洁度变化和疗效

表内数字为动物数，有效率和治愈率根据判断标准计算所得。
统计学应用spss软件采用多个样本率的X2检验方法，阴道洁度变化和疗效高剂量组、中剂量组、氟康唑组无差异(0.25＞p＞0.10)，但与辅料组、空白对照组有显著性差异(0.025＞p＞0.01)4.3.2.3二联活菌洁阴剂治疗淋病性阴道炎阴道洁度和疗效。
如表16结果所示，淋球菌性阴道炎以以淋必治的疗效最好，有效率和治愈率达100％。二联活菌洁阴剂疗效肯定，有效率甚达100％，以阴道洁度为标准的治愈率为83％，较淋必治的疗效差。低剂量治疗组的治愈率甚达66％。二联活菌制剂各治疗组均优于生理盐水治疗组，有统计学意义。
表16淋球菌造模组治疗前后阴道洁度变化和疗效

表内数字为动物数，有效率和治愈率根据判断标准计算所得。
统计学应用spss软件采用多个样本率的X2检验方法，高剂量、中剂量、淋必治对淋病性阴道炎疗效无差异(p＞0.10)，但与低剂量组、生理盐水组有显著性差异(p＜0.025)。
4.3.3细菌学检测造模动物致病菌检查白色念珠菌造模组取阴道拭子在玫瑰红钠琼脂培养基上涂皿，培养48小时，有大量菌落生长，说明阴道炎模型动物是与白色念珠菌有关，造模成功；而MRS培养基，未见活菌生长。
淋球菌造模组取阴道拭子在淋球菌专用培养基上涂皿，培养48小时，发现有大量菌落生长，说明阴道炎模型动物是与淋球菌有关，造模成功；而MRS培养基，未见活菌生长。
细菌形态学检测在上述两种选择性培养基上挑单克隆涂片，Gram’s染色，镜下观察细菌形态。对应可见大量革兰氏阳性球菌及革兰氏阴性双球菌。
4.3.4治疗前后动物一般情况和外阴外观实验动物生长良好，活动自如，毛发贴身光滑，造模前外阴干净，无红肿，无脓性分泌物，造模第5天观察，实验动物均不同程度出现外阴红肿，有脓性分泌物，其中42号、44号、57号动物见溃烂，经过5天不同剂量药物治疗后，高、中剂量组和氟康唑组、淋必治组治疗后动物外阴红肿均消失，脓性分泌物明显减少。低剂量组治疗后外阴无充血水肿，生理盐水组治疗后动物外阴有充血水肿。
4.3.5治疗后细菌学检测4.3.5.1霉菌性阴道炎模型治疗后细菌学检测二联活菌制剂治疗白色念珠菌性阴道炎受试动物后，阴道分泌物中白色念珠菌和厌氧菌检测结果如表17，氟康唑能有效杀灭白色念珠菌，用玫瑰红钠琼脂选择性培养，氟康唑治疗组所有6只动物阴道分泌物中均未发现有白色念珠菌，高、中剂量的二联活菌制剂治疗组有5只动物阴道分泌物中均未发现有白色念珠菌，说明二联活菌洁阴剂有肯定的抑杀白色念珠菌的作用。低剂量组的二联活菌制剂有4只动物阴道分泌物中均未发现有白色念珠菌生长，进一步说明该制剂有明显抑杀白色念珠菌的作用。而生理盐水治疗组均可培养出白色念珠菌。用厌氧菌MRS相对选择培养二联活菌，表17结果显示，氟康唑治疗组未培养出二联活菌，而各剂量的二联活菌治疗组均可培养出厌氧的二联活菌。同时各剂量组厌氧培养发现，高、中剂量组各1例，低剂量组2例培养皿中出现白色念珠菌生长，生理盐水治疗组可发现大量白色念珠菌生长。
表17治疗后阴道拭子白色念珠菌和厌氧菌有菌落生长的平皿数 表内数字为平皿数，+为有菌生长，-为无菌生长。
雌性白兔治疗第8天，阴道拭子在3种选择性培养基上划皿培养48小时，发现生理盐水组仍有大量致病菌生长，几乎没有厌氧菌生长，而中高剂量组几乎没有致病菌生长，但有大量厌氧菌生长，氟康唑组几乎没有致病菌生长也，没有厌氧菌生长.▲vs●中、高剂量组和氟康唑组抑菌显著，明显优于生理盐水组，■vs★中、高剂量组厌氧菌平皿数明显多于氟康唑组，统计学应用spss软件采用多个样本率的X2检验方法分析，高剂量组、中剂量组、氟康唑组无差异(0.25＞p＞0.10)，与生理盐水组有显著性差异(0.025＞p＞0.01)。
4.3.5.2二联活菌洁阴剂治疗后阴道分泌物致病菌和厌氧菌检测在注入致病菌造模成功的基础上，为观察二联活菌洁阴剂的抑杀菌效果，用玫瑰红钠琼脂选择性培养基将阴道分泌物涂片培养，予以检查是否有效的抑杀了致病菌达到了治疗目的.又因为阴道内的正常菌群大部分为厌氧菌，有报道称之为阴道杆菌，本试验采用培养二联活菌的MRS培养基厌氧培养，观察是否存在菌群失调，和治疗后菌群失调能否得到纠正。高剂量组和氟康唑有强大的抑杀致病菌的作用，未培养出致病菌。二联活菌洁阴剂可重建动物的正常阴道菌群，而氟康唑无此作用。低剂量的二联活菌制剂甚有明显抑杀菌作用，致病菌落明显减少。且有重建阴道内正常菌群的作用，对照组动物阴道内仍有大量的致病菌存活，无厌氧菌。说明发生阴道炎后正常阴道内菌群微生态环境遭到了破坏。
4.3.5.3淋病性阴道炎模型治疗后细菌学检测二联活菌制剂治疗淋球菌性阴道炎受试动物后，阴道分泌物中淋球菌和厌氧菌检测结果如表18，淋必治能有效杀灭淋球菌，用淋球菌专用培养基选择性培养，淋必治治疗组所有6只动物阴道分泌物中均未发现有淋球菌，高、中剂量的二联活菌制剂治疗组有5只动物阴道分泌物中均未发现有淋球菌，说明二联活菌洁阴剂有肯定的抑杀淋球菌的作用。低剂量组的二联活菌制剂有4只动物阴道分泌物中均未发现有淋球菌生长，进一步说明该制剂有明显抑杀淋球菌的作用。而生理盐水治疗组均可培养出淋球菌。用厌氧菌MRS相对选择培养二联活菌，表18结果显示，淋必治治疗组未培养出二联活菌，而各剂量的二联活菌治疗组均可培养出厌氧的二联活菌。同时各剂量组厌氧培养发现，高、中剂量组各1例，低剂量组2例培养皿中出现淋球菌生长，生理盐水治疗组可发现大量淋球菌生长。
表18治疗第八天阴道拭子培养48小时后有菌落生长的平皿数 表内数字为平皿数，+为有菌生长，-为无菌生长。
雌性白兔治疗第8天，阴道拭子在3种选择性培养基上划皿培养48小时，发现生理盐水组仍有大量致病菌生长，几乎没有厌氧菌生长，而中高剂量组几乎没有致病菌生长，但有大量厌氧菌生长，淋必治组几乎没有致病菌生长也，没有厌氧菌生长.▲vs●中、高剂量组和淋必治组抑菌显著，明显优于生理盐水组，■vs★中、高剂量组厌氧菌平皿数明显多于淋必治组，与生理盐水组有显著性差异，统计学应用spss软件采用多个样本率的X2检验方法分析。高剂量组、中剂量组、淋必治组无差异(0.25＞p＞0.10)，与生理盐水组有显著性差异(0.025＞p＞0.01)。
4.3.5.4二联活菌洁阴剂治疗后阴道分泌物致病菌和厌氧菌检测在注入致病菌造模成功的基础上，为观察二联活菌洁阴剂的抑杀菌效果，用淋球菌专用选择性培养基将阴道分泌物涂片培养，予以检查是否有效的抑杀了致病菌达到了治疗目的，观察是否存在菌群失调，和治疗后菌群失调能否得到纠正。高剂量组和淋必治有强大的抑杀致病菌的作用，未培养出致病菌。二联活菌洁阴剂可重建动物的正常阴道菌群，而淋必治无此作用。低剂量的二联活菌制剂甚有明显抑杀菌作用，致病菌落明显减少。且有重建阴道内正常菌群的作用，对照组动物阴道内仍有大量的致病菌存活，无厌氧菌。说明发生阴道炎后正常阴道内菌群微生态环境遭到了破坏。
4.3.6.受试动物组织病理学检测4.3.6.1.二联活菌制剂治疗白色念珠菌所致阴道炎的组织病理学变化。
表19的结果显示，中高剂量二联活菌制剂和氟康唑治疗组，阴道组织外观无充血水肿，光滑，组织学检查其无充血，水肿及炎性细胞浸润。低剂量治疗组有一例外观轻度充血改变，病理学检查发现1例充血，水肿伴少许炎性细胞浸润，1例镜下充血水肿。生理盐水。6例外观均有充血水肿。其中3例镜下仅见充血水肿无炎性细胞浸润。另3例不仅粘膜充血水肿伴有炎性细胞均润。
表19白色念珠菌造模组白兔治疗后阴道组织病理改变

◆表中数字为病理学异常例数，每组动物数为6只白色念珠菌造模组治疗第8天阴道组织镜下观，充血、水肿明显减轻，未见炎性细胞浸润，统计学应用spss软件采用X2检验方法分析，高剂量组、中剂量、淋必治组无差异，但与生理盐水组有显著性差异(p＜0.05)4.3.6.2二联活菌制剂治疗淋球菌所致阴道炎的组织病理学变化表20的结果显示，中高剂量二联活菌制剂和淋必治治疗组，阴道组织外观无充血水肿，光滑，组织学检查其无充血，水肿及炎性细胞浸润。低剂量治疗组有一例外观轻度充血改变，病理学检查发现1例充血，水肿伴少许炎性细胞浸润，1例镜下充血水肿。生理盐水6例外观均有充血水肿。其中3例镜下仅见充血水肿无炎性细胞浸润。另3例不仅粘膜充血水肿伴有炎性细胞浸润。
表20淋球菌造模组白兔治疗后阴道组织病理改变

◆表中数字为病理学异常例数，每组动物数为6只淋球菌造模组治疗第8天阴道组织镜下观，充血、水肿明显减轻，未见炎性细胞浸润，无糜烂，统计学应用spss软件采用X2检验方法分析，高剂量组、中剂量、淋必治组无差异，但与生理盐水组有显著性差异(p＜0.05)4.4结果分析用两种致病菌直接注入新西兰大白兔阴道内，能成功地制备出霉菌性阴道炎和淋菌性阴道炎动物模型，从外观，阴道分泌物检测，细菌学检测，阴道组织病理学检查证明了动物阴道炎的存在，其特点为阴道分泌物脓球是主要指标，能很好地反映阴道炎的存在，与现行的临床诊断吻合。组织病理学以充血水肿明显的非特异性改变。细菌学检测有一定的意义。同时也发现阴道炎发生后阴道内存在菌群失调。
经过从受试动物的一般情况，阴道外观模拟临床检测的阴道分泌物洁度，致病菌和正常菌群的细菌学检测，组织病理学等多项检查，全面评价二联活菌制剂的疗效。结果表明，二联活菌制剂能有效地治疗白色念珠菌和淋球菌所致的阴道炎，中高剂量的治愈率均达到了80％以上。与临床主要治疗药物氟康唑和淋必治的疗效接近。从细菌学检测的角度，二联活菌洁阴剂有明显的抑制白色念珠菌和淋球菌的作用。中高剂量的效果与氟康唑和淋必治的抑杀菌效果接近。氟康唑和淋必治抑杀白色念珠菌和淋球菌的能力强于二联活菌制剂。重要的是，二联活菌洁阴剂在产生有效治疗作用的基础上，可以纠正阴道内的微生态失衡，建立正常菌群微环境。对预防疾病的复发或再感染可产生积极的作用。而氟康唑和淋必治尽管治疗效果和抑杀菌作用疗效肯定，同时也留下了阴道内微生态环境失衡的隐患。该阶段是易于再感染和复发的时段。再者，氟康唑和淋必治为化学药物作用时间短。而二联活菌制剂重建的阴道内正常菌群可以继续发挥治疗作用。其次，氟康唑和淋必治在临床应用中发现其有明显副作用，尤其对某些哺乳期女性应用受到限制，这些也正是二联活菌洁阴剂的优势所在。
4.5结论1，二联活菌洁阴剂治疗淋菌性阴道炎的疗效接近于淋必治。抑杀淋球菌的效果稍逊于淋必治，用量以中剂量适用于临床治疗。
2，二联活菌洁阴剂治疗白念性阴道炎疗效接近于氟康唑。抑杀白念的效果比氟康唑差。中等剂量适合为推荐量。
3，二联活菌洁阴剂具明显的重建阴道内微生态环境，补充正常菌群纠正菌群失调是其突出优点。
参考文献[1]何晓青卫生防疫细菌检验[C]，北京新华社出版，1989。
徐叔云，卞如濂，陈修，《药理实验方法学》，人民卫生出版社，2002年版[3]施新猷，《现代医学实验动物学》，北京，人民军医出版社，2000年版。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于含有治疗有效量的鉴定编码为47757732的双歧杆菌，鉴定编码为44346222的乳酸杆菌，适量的酸、碱以及药物学可接受载体，所述适量的酸、碱使其混合后的药物组合物PH值为3.75-5.3。
2.权利要求1所述药物组合物，其特征在于所述药物组合物的PH值为4～5。
3.权利要求1所述药物组合物，其特征在于所述酸是柠檬酸、酒石酸、富马酸或己二酸。
4.权利要求1所述药物组合物，其特征在于所述碱是碳酸钠或碳酸氢钠。
5.权利要求1所述药物组合物，其特征在于所述酸是酒石酸，所述碱是碳酸氢钠。
6.权利要求5所述药物组合物，其特征在于按重量百分比计，所述酒石酸与碳酸氢钠比例为0.8∶1～1.4∶1。
7.权利要求6所述药物组合物，其特征在于所述酒石酸与碳酸氢钠比例为0.9∶1～1.2∶1。
8.权利要求1所述药物组合物，其特征在于所述药物学可接受载体包括填充剂和粘合剂。
9.权利要求8所述药物组合物，其特征在于所述药物学可接受载体还包括干燥粘合剂。
10.权利要求9所述药物组合物，其特征在于所述药物学可接受载体还包括崩解剂。
11.一种药物组合物，其特征在于所述药物制剂中鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌的活菌数含量不低于1×102CFU/克。
12.权利要求11所述药物组合物，其特征在于所述药物制剂中鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌的活菌数含量为1×104CFU/克～1×107CFU/克。
13.鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备治疗阴道炎药物中的用途。
14.鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备治疗阴道内菌群失调药物中的用途。
15.鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备治疗细菌性阴道炎药物中的用途。
16.鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备治疗霉菌性阴道炎药物中的用途。
17.鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备治疗淋病性阴道炎药物中的用途。
18.鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备清除大肠埃希氏菌药物中的用途。
19.鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备清除金黄色葡萄球菌药物中的用途。
20.鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备清除淋球菌药物中的用途。
21.鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌在制备清除白色念珠菌药物中的用途。
22.权利要求1-12任意一项所述药物组合物在制备治疗阴道内菌群失调药物中的用途。
23.权利要求1-12任意一项所述药物组合物在制备治疗阴道炎药物中的用途。
24.权利要求23所述药物组合物在制备治疗细菌性阴道炎药物中的用途。
25.权利要求23所述药物组合物在制备治疗霉菌性阴道炎药物中的用途。
26.权利要求23所述药物组合物在制备治疗淋病性阴道炎药物中的用途。
27.权利要求1-12任意一项所述药物组合物在制备清除大肠埃希氏菌药物中的用途。
28.权利要求1-12任意一项所述药物组合物在制备清除金黄色葡萄球菌药物中的用途。
29.权利要求1-12任意一项所述药物组合物在制备清除淋球菌药物中的用途。
30.权利要求1-12任意一项所述药物组合物在制备清除白色念珠菌药物中的用途。
31.药物组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)分别制备鉴定编码为47757732的双歧杆菌和鉴定编码为44346222的乳酸杆菌的冻干菌粉；(2)将药物学可接受载体干燥、粉碎后与适量的酸、碱混合均匀，使其混合物的PH值为3.75-5.3；(3)将步骤(1)制得的菌粉与步骤(2)制得的混合物混合后压制成形。
32.权利要求31所述药物组合物的制备方法，其特征在于所述药物学可接受载体包括填充剂、干燥粘合剂和粘合剂，步骤(2)进一步包括如下步骤(2-1)将填充剂、干燥粘合剂和粘合剂干燥、粉碎后过筛；(2-2)将酸、填充剂、碱、干燥粘合剂搅拌混合均匀；(2-3)向步骤(5)中加入粘合剂，制得混合物软材；(2-4)将混合物软材制粒并烘干，制得步骤(2)中所述的混合物。
33.权利要求31所述药物组合物的制备方法，其特征在于所述步骤(3)是先将步骤(1)制得的菌粉与一填充剂混合研匀分散后再与混合物混合后压制成形。
34.权利要求31-33任意一项所述药物组合物的制备方法，其特征在于所述酸是柠檬酸、酒石酸、富马酸或己二酸。
35.权利要求31-33任意一项所述药物组合物的制备方法，其特征在于所述碱是碳酸钠或碳酸氢钠。
36.权利要求31-33任意一项所述药物组合物的制备方法，其特征在于所述酸是酒石酸，所述碱是碳酸氢钠。
37.权利要求35所述药物组合物的制备方法，其特征在于按重量百分比计，所述酒石酸与碳酸氢钠比例为0.8∶1～1.4∶1。
38.权利要求37所述药物组合物的制备方法，其特征在于所述酒石酸与碳酸氢钠比例为0.9∶1～1.2∶1。
39.权利要求31所述药物组合物的制备方法，其特征在于所述药物学可接受载体包括填充剂乳糖、淀粉，干燥粘合剂、填充剂维晶纤维素，崩解剂、干燥粘合剂低取代羟丙基纤维素，粘合剂5％PVPK30乙醇溶液(95％)，所述酸是酒石酸，所述碱是碳酸氢钠，步骤(2)进一步包括如下步骤(2-1)将称量的酒石酸加入淀粉搅拌混合，再将称量的碳酸氢钠和乳糖加入并混合均匀；(2-2)在步骤(4)中再加入维晶纤维素和低取代羟丙基纤维素混合均匀后以5％PVPK30乙醇溶液(95％)作粘合剂，制软材；(2-3)将软材在制粒机中用制粒、烘烤，制得空白颗粒；步骤(3)进一步包括如下步骤(3-1)将称量的菌粉分别与适量的乳糖研匀分散；(3-2)再与空白颗粒等量递加混合均匀，(3-3)加入润滑剂混匀，压制成片。
40.权利要求31-33、39任意一项所述药物组合物的制备方法，其特征在于所述冻干菌粉中加入有含量为0.01％～0.1％的半胱氨酸。
全文摘要
本发明涉及一种药物组合物，含有治疗有效量的鉴定编码为47757732的双歧杆菌，鉴定编码为44346222的乳酸杆菌，适量的酸、碱以及药物学可接受载体，所述适量的酸、碱使其混合后的药物组合物pH值为3.75－5.3。本发明还涉及该药物组合物的制备方法及在医学中的应用，特别是制备治疗阴道内菌群失调、细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、淋病性阴道炎等药物中的用途。通过药效学试验证实，当两种菌的浓度达到一定值(1×10
文档编号A61P15/02GK1718198SQ20041004022
公开日2006年1月11日 申请日期2004年7月9日 优先权日2004年7月9日
发明者林刚, 卢放根 申请人:湖南一泰中南医药研究有限公司