H5n1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法

专利名称：H5n1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程疫苗，尤其涉及一种H5N1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术：
H5N1亚型禽流感是危害世界养禽业发展的重要疾病，高致病力H5N1亚型禽流感可导致感染禽群100％的死亡，被国际兽疫局列为I类烈性传染病。防治H5N1亚型禽流感最为广泛的方法就是应用H5N1亚型禽流感油乳剂灭活苗。但研究发现油乳剂灭活苗虽然可以减少排毒和减轻临床症状但不能提供给鸡群以完全保护(Halvorson，D.A.，Karunakaran，D.，Abraham，A.S.，Newman，J.A.，Sivanandan，V.& Poss，P.E.1986.Effiency of vaccine in control of avianinfluenza.InEasterday，B.C.，Alexander DJ Beard，C.W.(eds)Proseedings of the2nd International Symposium on Avian Influenza.Pp.264-70，US Animal HealthAssociation，Athens，Georgia.；McCapes，R.H.，R.A.Bankowski，and G.B.E.West.1986.Avian influenza in Califomia，p.118-129；Nakajima K，DesselbergerU，Palese P.Recent human influenza A(H1N1)viruses are closely relatedgenetically to strains isolated in 1950.Nature，1978，274-9)，而且干扰H5N1亚型禽流感疫情的监测。飞速发展的分子生物学技术促进了H5N1亚型禽流感疫苗的研究表达HA基因的痘苗病毒(Sutter，G.，Wyatt，L.S.，Foley，PL.，Bennink，J.R.& Moss，B.1994.A recombinant vector derived from the hostrang-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulatesprotective immunity in mice to influenza virus.Vaccine 121032-1040.)，禽痘病毒(Taylor J.，Weinberg R.，Kawaoka Y.，et al.1988.Protective immunity againstavian influenza induced by a fowlpox Virus recombinant Vaccine 6504-508；BeardC.W.，Schnitzlein W.M.，Tripathy D.N.，1992，Effect of route of administrationon the efficacy of a recombinant fowlpox virus against H5N2 avian influenza.Avian Dis.1992，361052-1055；Tripathy D.N.，Schnitzlein W.M.，1991，Expression of avian influenza virus hemagglutinin by recombinant fowlpox virus.Avian Dis.35186-191；Webster R.G.，Kawaoka Y.，Taylor J.，et al.1991.Efficacyof nucleoprotein and haemagglutinin antigens expressed in fowlpox virus asvaccine for influenza in chickens.Vaccine 9303-308；Boyle D.B.，Heine H.G.，1993.Recombinant fowlpox virus vaccines for poultry.Immunol Coll Biol.71391-397)，反转录病毒(Hunt L A.，Brown D.W.，Robinson H.H.，et al.1988.Retrovirus-expressed hemagglutinin protects against lethal influenza virusinfections.J Virol 623014-19)和杆状病毒(Crawford J.，Wilkinson B.，Vosnesenskey A.，et al.1999.Baculovirus-derivved hemagglutinin vaccinesprotect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes.Vaccine172265-2274)基因工程疫苗也都被证明非常有效，DNA疫苗也能够提供足够的保护。虽然重组活载体疫苗具有使用方便的优势，但不能用于二次免疫和禽痘病毒免疫过的鸡场。H5N1亚型禽流感核酸疫苗虽然很有希望，但距临床应用还有很长的路，其最大缺点是免疫保护产生需要较长的时间，不适于紧急预防的需要。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服以上现有技术的不足，提供一种新的H5N1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗。
本发明所要解决的另一技术问题是提供该基因工程亚单位疫苗的制备方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的本发明的H5N1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，由下述组分组成SEQ ID No.1所述基因序列通过昆虫/杆状病毒表达系统表达后所得的蛋白、SEQ ID No.2所述基因序列通过原核表达系统表达后所得的蛋白和免疫佐剂。
本发明的禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，所述的免疫佐剂为白油；本发明的禽流感病毒基因工程亚单位疫苗中所述的两种蛋白的浓度均为10μg/ml；本发明的禽流感病毒基因工程亚单位疫苗中免疫佐剂所占的体积百分比是50％，两种蛋白溶液加在一起所占的体积百分比是50％。
本发明的H5N1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗的一种制备方法，包括以下步骤1、H5N1亚型禽流感病毒主要宿主保护性抗原蛋白的制备利用RT-PCR的方法获得H5N1亚型禽流感病毒主要宿主保护性抗原(HA)基因，用特异性引物将HA基因信号肽序列缺失，所得的序列如SEQID No.1所述，将SEQ ID No.1所述序列的基因克隆到杆状病毒转移载体上，所得的重组杆状病毒转移载体DNA与商品化的苜蓿尺蛾核型多角体病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染Kit(购于invitrogen公司)共转染sf9细胞(购于invitrogen公司)，产生带有该HA基因的苜蓿尺蛾核型多角体病毒，将纯化后的重组杆状病毒感染昆虫细胞后表达外源蛋白，将所表达的蛋白收集纯化备用。
2、H5N1亚型禽流感病毒基质蛋白的制备利用RT-PCR的方法获得H5N1亚型禽流感病毒基质蛋白(M2)基因，将M2基因用特异性引物将26～55位氨基酸跨膜区基因序列缺失，所得基因序列如SEQ ID No.2所述，将SEQ ID No.2所述的基因序列克隆到大肠杆菌融合表达载体中，将所得的重组大肠杆菌融合表达载体转化至感受态细胞中诱导表达外源蛋白，收集纯化所表达的蛋白备用，3、将步骤1和2所制备的目的蛋白混合在一起后与免疫佐剂按1∶1的体积比混合即得。
上述制备方法中，其中步骤(1)中纯化后的重组杆状病毒所感染的昆虫细胞是Hfive细胞(购于invitrogen公司)；步骤(2)中所述的大肠杆菌融合表达载体是PGEX-6P-1(购于invitrogen公司)，所述的感受态细胞是JM109(购于大连宝公司)。
本发明的H5N1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗与现有的H5N1亚型禽流感疫苗相比具有以下优点(1)本发明基因工程亚单位疫苗不能在体内复制，对宿主没有致病的风险，是最具安全性和稳定性的一种基因工程疫苗，它仅含有在真核表达系统中高效表达病原的1-2种特定的免疫相关蛋白成份，在体内不能增殖，不存在散毒的危险，安全性可靠；(2)本发明基因工程亚单位疫苗易于大规模工业化生产、成本低廉；(3)以本发明为基础建立的鉴别诊断方法，可以区分免疫者和自然感染者，不干扰流行病学调查；(4)本发明所使用的苜蓿尺蛾核型多角体病毒对人、禽、畜等脊椎动物无侵染性，是较安全的表达系统。


图1本发明提供的表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)主要保护性抗原(HA)蛋白重组杆状病毒转移载体的PCR及酶切鉴定。
图2本发明提供的重组杆状病毒PCR鉴定。
图3本发明提供的重组杆状病毒三轮噬斑纯化后的噬斑滴度。
图4本发明提供的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)主要保护性抗原(HA)基因在昆虫细胞表达的SDS-PAGE电泳图。
图5本发明提供的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)主要保护性抗原(HA)基因在昆虫细胞表达的Western-blot印迹。
图6本发明提供的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)基质蛋白(M2)基因重组融合表达载体pGEX-6P-1的酶切鉴定。
图7本发明提供的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)基质蛋白(M2)基因在原核表达系统的SDS-PAGE电泳图及Western-blot印迹。
图8本发明提供的基因工程亚单位疫苗对SPF鸡的抗体持续期。
以下通过实施例进一步阐明本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
具体实施例方式H5N1亚型禽流感病毒主要保护性抗原(HA)基因及基质蛋白(M2)基因的制备1、试验材料H5N1亚型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)简称GD1/96毒株，购于哈尔滨兽医研究所动物流感中心；SPF鸡胚(购于哈尔滨兽医研究所SPF动物室)2、试验方法1)用GD1/96毒株接种10日龄SPF鸡胚，48小时后收集尿囊液备用。
2)取500μl尿囊液，加入SDS至终浓度0.5％，蛋白酶K至终浓度50μg/ml后，于37℃水浴中作用1.5h，再用DEPC处理水饱和酚(pH4.0)、酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，上清加入1/10体积的NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2h，12000rpm(Beckman F2402H转头)4℃离心20min，弃上清，沉淀干燥后重悬于DEPC处理水，-20℃保存备用。
3)利用OLIGO 4.0软件设计合成扩增HA以及M2基因特异性引物HA基因上游引物序列为5′-AAAATGGAGAGAATAGTGCTT-3′，下游引物序列为5′-CGTGGATCCTTATATACAAATAG-3′，下游引物引入Xho I位点；并设计合成去除编码HA信号肽的核苷酸序列特异性上游引物序列为5′-ATA GGA TCCGACAAAATTTGCCTTG-3′，该引物引入BamH I位点，先以上下游引物扩增出HA全长序列，然后用去除编码HA信号肽的特异引物和下游引物扩增出不含信号肽序列的HA基因。设计合成四条M2基因引物，其中MF1和MR294用于扩增全长的M2基因，MR75与MF166用于缺失M2跨膜区序列，四条引物如下MF1Primer5′-ACC GGA TCC ATG AGT CTT CTA ACC-3′，上游引物引入BamH I位点；MR294Primer5′-ATT CTC GAG TTA CTC CAG CTC TAT GT-3′，下游引物引入Xho I位点。MR75Primer5′-ACC GCC ACC GCC AGG ATCACT TGA ATC-3′，MF 166Primer5′-GGC GGT GGC GGT AAA TAC GGT TTGAAAAG-3′。首先分别用MF1、MR75和MF166、MR294为引物扩增出M2蛋白跨膜区两端的序列，然后将其作为模板，以MF1、MR294为引物扩增出缺失跨膜区的M2基因。
4)取RNA悬液10μl与20pmol(1μl)上游引物混匀后置于70℃水浴中，作用10min，再依次加入5×反转录酶缓冲液、0.1M DTT 2μl、2.5M 4dNTP 4μl、RNA酶抑制剂1μl、M-MLV反转录酶1μl(10U)，37℃水浴中作用1.5h。转录完毕后，95℃作用5min灭活反转录酶，在PCR管中依次加入10×Taq聚合酶缓冲液10μl、2.5mmol dNTP 4μl、20pmol上、下游引物各1μl、Taq DNA聚合酶1μl(1～2U)后，灭菌去离子水补足100μl，在PTC-100基因扩增仪上扩增。反应条件是94℃5min、94℃1min、52℃1min、72℃1.5min，35个循环，最后72℃10min延伸。取5μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检查扩增HA结果。M2的反应条件是94℃5min、94℃1min、54℃1min、72℃30s，35个循环，最后72℃5min延伸。取5μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检查扩增M2结果。
将所得的扩增产物回收纯化后测序，其序列分别见序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所述。
H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的制备(一)将实施例1所制备的HA基因克隆到pMD-18T载体上(购于大连宝公司)。
1、按DNA凝胶纯化试剂盒(购于华舜公司)操作说明在无其他DNA污染的琼脂糖凝胶及其电泳液中作电泳。将电泳后的PCR产物，用洁净的手术刀片切下含有目的片段的凝胶，称重，按300μl/100μg加入溶液S1，置56℃～60℃的水浴10min，每3min振摇一次，使凝胶完全融化，将其转移至纯化柱中12000rpm离心1min弃之液体，用500μl溶液W1冲洗附着在滤膜上的沉淀，12000rpm离心15sec弃去管底液体，用500μl溶液W1重复操作一次，弃去残余液体，在于12000rpm离心1min，将过滤柱换至另一个1.5ml离心管，于滤膜中部加入溶液T1，室温静置1分钟，或置于56℃～60℃的水浴1min，12000rpm离心1min，收集上清待用或冻存于-20℃备用。
2、按《分子克隆实验指南》(金冬雁译第二版)中介绍的方法制备感受态细胞。以无菌接种环取冻存的菌种划线接种于LB平板，37℃培养过夜。挑取生长良好的单菌落接种于3ml LB液体培养基，37℃培养振荡培养4～6h。将培养物按1％的比例接种于100ml LB液体培养基，于37℃225rpm摇床培养至培养物的OD600为0.3～0.4。将培养物倒入无菌预冷的50ml离心管中，2000rpm 4℃(Beckman JA18转头)离心10min，弃上清，将沉淀重悬于无菌的10ml 0.1mol/l CaCl2中冰浴30min。2000rpm 4℃离心10min，弃上清，再将沉淀重悬于4ml CaCl2中，加无菌甘油至终浓度为15％，混匀后分装至微量离心管中，200μl/管，直接用于转化或置-70℃冰箱冻存备用。以上各步均在无菌环境下操作。
3、将回收纯化的目的基因与载体pMD18-T片段按3∶1(摩尔比)混合成10μl，不足10μl的用TE补足，然后加入10μl快速连接溶液I于14℃～16℃水浴中反应45分钟。
4、取10μl连接产物加入200μl感受态细胞JM109中，混匀，冰浴30min，42℃热休克90s，再冰浴1～2min，之后加入800μl LB液体培养基，37℃振荡培养培养45min。将其室温离心30s，弃上清，重悬的细胞中加入16μl浓度为50μg/ml的X-gal和4μl浓度为200μg/ml的IPTG，混匀后涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平皿，待液体被吸收后，倒置平皿37℃培养过夜。
5、随机挑取生长于LB平板上的单个白色菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取1.5ml培养物倒入微量离心管中，12000rpm 4℃离心1min，除去培养液(尽可能使细菌沉淀干燥)，将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖，2.5mmol/L TrispH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0)中，剧烈振荡使之重悬。加200μl新鲜配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS现用现配)，快速颠倒离心管数次以混合内容物，确保离心管整个内表面与溶液II接触。待混合物清亮后，加入溶液III(5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)150μl温和振荡数次，使溶液III分散均匀，置冰上3～5min。12000g 4℃离心5min，将上清转移到另一离心管加等量酚、酚/氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，将上层水相小心取出后加两倍体积无水乙醇-20℃沉淀15min以上。12000g 4℃离心10min，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀一次，离心弃上清。干燥后，用适量含RNase(20μg/ml)的TE溶解DNA沉淀，贮存于-20℃，冻存备用。
6、利用限制性内切酶EcoR I消化重组质粒，反应在20μl体系中进行质粒DNA 5μl，10×Buffer 2μl，EcoRI 1μl，最后用灭菌去离子水加至20μl，于37℃作用2小时。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，分析其片段的大小。
7、取酶切鉴定阳性质粒DNA 1μl，用灭菌去离子水1∶100倍稀释后，取1μl作模板，反应条件是94℃5min、94℃1min、52℃1min、72℃1.5min，35个循环，最后72℃10min延伸。取5μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检查扩增HA结果。
(二)将上述HA基因克隆到杆状病毒表达转移载体。用步骤(一)的方法制备纯化的杆状病毒转移载体pMelBacA。首先进行BamH I酶切，反应体系50μl载体质粒5μl，10×Buffer 5μl，BamH I 3μl，灭菌去离子水37μl，于37℃保温2h。然后用CIAP对载体进行去磷酸化反应，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，70％乙醇冲洗，最后将其沉淀溶于少许20μl TE中。于-20℃保存备用。
将步骤(一)中获得的目的基因用BamH I酶切，纯化回收HA基因片段。然后按外源片段载体按3∶1(摩尔比)混合成10μl，不足10μl的用TE补足，然后加入10μl快速连接溶液I于14℃～16℃水浴中反应45分钟。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞JM109中，铺于含Amp+的LB琼脂平板，随机挑取数个菌落接种于Amp+的LB液体培养基，提取质粒进行酶切和PCR鉴定，阳性重组子命名为pH5HA。
用HA特异性引物PCR以及限制性内切酶EcoR I消化重组质粒鉴定重组转移载体(结果见图1)。
(三)挑取步骤(二)中的阳性重组子pH5HA的单菌落接种于Amp+的LB液体培养基，37℃摇床培养过夜。收集5～25ml细菌培养物，1000g室温离心10min，弃上清至尽量吸尽余液，加入1.25ml细胞悬浮液使细胞完全悬浮；加入1.25ml细胞裂解液，充分混匀，室温作用5min；加1.75ml中和液，立刻混匀，1000g室温离心20min；将上清转移另一管中加入0.25ml的内毒素去除树脂，剧烈混匀，室温作用10min，这期间间隔数秒摇动一次；将离心管放置在磁力棒(MagnesilTM Magnetic Separation Unit)上，轻轻转动使树脂完全吸附在管壁上；吸取上清至一新管中加入1ml 5M异硫氰酸胍溶液，充分混匀后加入0.75ml颗粒物(MagnesilTM Paramagnetic Particles)振荡混匀，室温作用2～3min，置于磁力棒上使颗粒吸附；弃上清在沉淀物中加入4/40洗液重悬颗粒，重复吸附弃上清；加2.5ml 80％的乙醇洗液，并重复洗涤三次，室温干燥10min；用1.2ml灭菌去离子水重悬沉淀，室温作用1min，置于磁力棒上吸附后转移上清；加入0.5倍体积7.5M的醋酸钠和2.5倍体积95％的乙醇，混匀，14000g室温离心15min；用250μl 70％的乙醇洗涤沉淀，14000g室温离心5min，沉淀干燥后，加入200μl去离子水重悬DNA。将所得质粒在分光光度计(Mltrospec3000，Pharmacia Biotech INC)上测定其含量及纯度，于-20℃冻存备用。
sf9细胞(购于invitrogen公司)培养使用含100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。10％胎牛血清的TNM-FH培养基(购于invitrogen公司)培养，一般每3天分瓶传代一次。处于对数生长期细胞占95％的sf9细胞用于转染实验和重组病毒的蚀斑纯化试验。
转染过程按照Bac-N-BlueTM转染试剂盒(购于invitrogen公司)使用手册进行。将0.5μg Bac-N-BlueTM DNA，4μl(1μg/μl)pMelBacH5HA重组质粒，1ml Grace’s昆虫培养基(购于invitrogen公司)(不加任何添加剂和胎牛血清)和脂质体20μl(使用前旋涡振荡混匀，最后加入)加入到1.5ml微量离心管中，混匀10s后温孵育15min。对转染混合物进行孵育的同时，在不冲散细胞单层的前提下，小心地吸去预先制备的待转染用细胞培养物的培养基，加2ml Grace’s昆虫培养基(不加添加剂和胎牛血清)，小心地冲洗细胞单层。吸去培养基，将转染混合物一滴一滴地加入到细胞单层上。室温孵育4小时，不时地轻柔晃动细胞培养皿。孵育4小时后，加1ml TNM-FH完全培养基，用封口胶密封平皿，27℃孵育72小时。用吸管从转染平皿吸取2ml培养基，保存在无菌聚丙烯管中(4℃保存)，补加3ml新鲜TNM-FH完全培养基(Crawford J.，Wilkinson B.，Vosnesenskey A.，et al.1999.Baculovirus-derivvedhemagglutinin vaccines protect against lethal influenza infections by avian H5 andH7subtypes.Vaccine 172265-2274)，27℃继续培养。转染后4～7天，于400×倒置显微镜下观察细胞的生长状况，确定转染是否成功。
细胞转染病毒储存液，用TNM-FH完全培养基做10-3、10-4、10-5等稀释度，用于感染Sf9单层细胞。先用TNM-FH培养基使平皿底面浸湿，然后加入对数期的活力在98％以上的Sf9细胞(1.5～2.0×106mm平皿)，室温孵育30min以便形成单层，然后用巴斯德吸管吸弃2ml培养基，逐滴加入1ml的病毒液，室温放置1h。吸管吸弃感染病毒液，必须吸尽。然后在细胞单层上覆盖0.8％低熔点琼脂糖的培养液(含150μg/ml X-gal)3ml/平皿。平皿用parafilm封口，27℃培养箱至细胞出现蓝色蚀斑，用巴氏吸管小心的穿透琼脂糖，挑取单个蓝色蚀斑，分别转移到预先制备好的12孔细胞培养板中的Sf9细胞单层27℃培养箱培养2～3天，取0.75ml培养上清用于重组病毒鉴定，观察细胞病变，直至细胞溶解，收集培养液，分装保存于无菌小管中，此即为重组病毒第一代种毒。
取0.75ml病毒培养上清室温下Eppendorf微量离心管5000rpm离心5min，使细胞沉淀。转移上清到新的无菌微量离心管中，加5μl蛋白酶K(20mg/ml)和25μl 10％SDS，37℃温育1小时。加入等体积酚—氯仿(1∶1)抽提，室温下最大速度离心5分钟。转移上层水相到新鲜的无菌微量离心管中，加1/10体积3M醋酸钠和300μl无水乙醇，-20℃沉淀20min。12,000rpm 4℃离心10min，75％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于无菌水中。
根据Invitrogen公司Bac-N-BlueTM转染试剂盒使用手册合成杆状病毒转移载体通用引物上游引物序列为5′-TTT ACT GTT TTC GTA ACA GTTTTG-3′，下游引物序列为5′-CAA CAA CGC ACA GAA TCT AGC-3′。PCR扩增特定序列鉴定重组病毒(结果见图2)。
经PCR鉴定的阳性第一代重组病毒，第二次进行蚀斑纯化细胞扩增后，第二次PCR鉴定，直至确认无野生病毒污染为止。二次蚀斑纯化的重组病毒培养液种毒液与培养液按1/100的比例接种Sf9细胞，27℃培养箱培养至90％以上的细胞出现病变。收获培养上清，以相同方法第三次蚀斑纯化，收获的培养上清为第三代种毒。噬斑法测定其滴度(结果见图3)，分装于无菌细胞冻存管，每管1ml分别于4℃和-70℃保存。
(四)把种毒按照步骤(三)介绍的方法，通过蚀斑技术测出该重组病毒的感染复数(m.o.i.)，然后按照1m.o.i.病毒接种量将种毒接种至HFive细胞中培养，分别与不同的时间收获细胞以及上清液，储存以备检测表达蛋白。
表达蛋白经分离后，用pH7.4的PBS重悬后，超声波裂解至乳浊状；分别配制12％分离胶，5％的浓缩胶，待其聚合后，用微量移液器加样，在BIO-RAD垂直电泳槽上180V电泳，待染料移至凝胶底部时停止电泳。将其中一凝胶置于0.25％考马斯亮蓝染色液中(0.25％R250，45％甲醇，10％乙醇)2h，用脱色液(45％甲醇，10％乙酸)脱色，观察电泳结果。另一凝胶置于转印装置，用于Western-blot检测(见图4)。
先将蛋白样品作SDS-PAGE，取下之后，将其置于半干转印仪上(NC膜一面朝正极)接通电源，25V45分钟后取下NC膜，剪下Marker，用染色液染5-10秒，然后用脱色液脱色，其余部分NC膜用PBST清洗后，用封闭液与室温封闭2-3小时，然后用PBST洗三次，加一抗(AIV多克隆抗血清1∶100与PBS稀释)于37℃作用2小时，再用PBST洗三次后，用Buffer I(Tris-Cl10mmol/lpH7.5NaCl 150mmol/l)洗10分钟之后加碱性磷酸酶标记的二抗(兔抗鸡IgG)37℃作用1小时，之后用Buffer I洗三次后，再用Buffer II(Tris-Cl50mmol/lpH7.5NaCl 150mmol/l)洗一次，置于显色液(NBT66μl，BCIP33μl溶于10ml碱性磷酸酶缓冲液)中显色，最后用自来水终止显色(结果见图5)。
H5N1亚型禽流感病毒基质蛋白的制备将实施例1中已改建好的M2基因按照实施例2步骤(一)中的方法将M2基因克隆至pMD-18T载体(购于大连宝公司)上。然后将其用BamH I和Xho I酶从T载体上切下来。之后将酶切下来的片段与用BamH I/XhoI酶处理好的pGEX-6P-1载体(购于)按实施例2步骤(一)的方法连接。
用与pGEX-6P-1载体连接好的重组载体为模板，以以MF1、MR294为引物PCR扩增鉴定已缺失跨膜区的M2基因，证明该基因已成功构建至融合表达载体pGEX-6P-1上(参照图6)。
在含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的2ml LB培养基中接种阳性菌株的单菌落，37℃培养至OD600＝0.6。将细菌培养物离心30秒，收集细胞。然后用2ml新鲜培养基重悬，加到50ml含终浓度为30μg/ml卡那霉素的LB培养基中。37℃培养至OD600＝0.7。取出10ml未诱导的菌液作对照，其余菌液加IPTG至终浓度为100mM，37℃诱导4小时。将诱导菌液置于冰上5min，然后5000g离心5min收获细胞。用10ml(0.25倍培养基体积)冷的20mmol/LTris-HCl(pH8.0)悬浮。10000g离心1min，尽量去除上清液。细胞沉淀用100μlPBS重悬，超声波处理电压2-3档，每次10秒，处理8次。然后将其样品采用实例2步骤(四)的方法对所表达的蛋白做SDS-PAGE和Western-blot鉴定(参照图7)。
H5N1亚型禽流感基因工程亚单位疫苗的制备。
将所表达的H5HA蛋白和M2所表达产物经分光光度计(Ultrospec 3000)定量测出总蛋白含量后，根据表达蛋白薄层扫描峰值所显示的目的蛋白含量，从而测算出H5HA蛋白的纯含量，据此用PBS作不同梯度稀释，使乳化后的H5HA+M2蛋白的纯含量分别为50+50μg/ml、10+50μg/ml和2+50μg/ml。取注射用白油93份，5份司盘-80，混合后加硬脂酸铝2份，边加边搅拌至透明为止，高压灭菌备用。取7份吐温-80装入带玻璃珠的瓶中灭菌，冷却后加定量稀释后的目的蛋白H5HA稀释液，充分摇动使吐温-80完全溶解为止。取油相2份放于胶体磨或乳缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以2900rpm搅拌6min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。乳化后，取10ml疫苗以3000rpm离心15min，若有分层现象，应重复搅拌一次。若仍出现分层现象则作报废处理。
试验例1本发明疫苗的效果试验本发明实施例所制备的H5HA蛋白和M2蛋白溶液与佐剂乳化成不同浓度，制备成肌肉注射疫苗。
试验材料SPF鸡购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；同源HPAIV(A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)简称GD1/96毒株，购自哈尔滨兽医研究所动物流感中心。
1、免疫保护效力试验SPF鸡免疫二周后用同源HPAIV攻击，各免疫组鸡均能完全抵抗同源强毒的攻击，只是在H5油苗对照组从一羽鸡的喉拭子分出该病毒，阴性对照SPF鸡则在攻毒后一周内全部死亡，并且能检测到排毒。结果见表1。
表1 本发明疫苗免疫保护效力试验

试验结果说明本发明疫苗能激发良好的保护性免疫反应，免疫原性强。
2、最佳免疫剂量试验SPF鸡每羽免疫200μl，其中含目的蛋白H5HA和M2分别为10+10μg/羽和2+10μg/羽和0.4+10μg/羽，免疫二周后用同源HPAIV攻击，10+10μg/羽和2+10μg/羽免疫组鸡能完全抵抗同源强毒的攻击，且没有发病鸡；0.4+10μg/羽免疫组有3/10例发发病且死亡。免疫组攻毒耐过鸡在攻毒一周后检测抗体，效价均升高，阴性对照鸡则全部死亡。结果见表2。
表2 本发明疫苗最佳免疫剂量试验

3、最佳免疫日龄试验取SPF鸡，其日龄分别为1、7、14、21、28日龄；以最佳免疫剂量2+10μg/羽免疫，1日龄鸡免疫一周后抗体效价较低，不能提供完全保护，攻毒后有3/10例发病，2/10例死亡。而免疫两周和三周后抗体效价明显上升，用GD1/96(H5N1)攻毒后，1-4周龄免疫组鸡均能提供确实的保护力以抵抗同源病毒的攻击，而对照组均发病死亡，试验结果见表3。
表3 本发明疫苗最佳免疫日龄试验结果

4、抗体持续期试验20+10μg/羽免疫组试验鸡免疫2周后，HI抗体效价达到5log2，在加强免疫后4周HI抗体达到最高，为8.5log2然后随之缓慢下降，于初次免疫后6个月左右仍为5.8log2；而2+10μg/羽免疫组免疫2周后，HI抗体效价为4.2log2，在加强免疫后4周HI抗体达到最高，为8log2。之后，抗体效价下降速度相对较快，于初次免疫后6个月左右仅为2.8log2(参照图8)。
序列表.txtSEQUENCE LISTING<110>中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所<120>H5N1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗<130>patent<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1659<212>DNA<213>Avian influenza virus<400>1gatcagattt gcattggtta ccatgcaaac aactcgacag agcaggttga cacaataatg 60gaaaagaacg ttactgttac acatgcccaa gacatactgg aaaagacaca caatgggaag 120ctctgcgatc taaatggagt gaagcctctc attttgagag attgtagtgt agctggatgg 180ctcctcggaa accctatgtg tgacgaattc atcaatgtgc cggaatggtc ttacatagtg 240gagaaggcca gtccagccaa tgacctctgt tacccagggg atttcaacga ctatgaagaa 300ctgaaacacc tattgagcag aacaaaccat tttgagaaaa ttcagatcat ccccaaaagt 360tcttggtcca atcatgatgc ctcatcaggg gtgagctcag catgtccata ccatgggagg 420tcctcctttt tcagaaatgt ggtgtggctt atcaaaaaga acagtgcata cccaacaata 480aagaggagct acaataatac caaccaagaa gatcttttag tactgtgggg gattcaccat 540cctaatgatg cggcagagca gacaaagctc tatcaaaacc caaccactta catttccgtt 600ggaacatcaa cactgaacca gagattggtt ccagaaatag ctactagacc caaagtaaac 660gggcaaagtg gaagaatgga gttcttctgg acaattttaa agccgaatga tgccatcaat 720ttcgagagta atggaaattt cattgctcca gaatatgcat acaaaattgt caagaaaggg 780gactcagcaa ttatgaaaag tgaattggaa tatggtaact gcaacaccaa gtgtcaaact 840ccaatggggg cgataaactc tagtatgcca ttccacaaca tacaccccct caccatcggg 900gaatgcccca aatatgtgaa atcaaacaga ttagtccttg cgactggact cagaaatacc 960cctcaaagag agagaagaag aaaaaagaga ggactatttg gagctatagc aggttttata1020gagggaggat ggcagggaat ggtagatggt tggtatgggt accaccatag caatgagcag1080gggagtggat acgctgcaga caaagaatcc actcaaaagg caatagatgg agtcaccaat1140aaggtcaact cgatcattga caaaatgaac actcagtttg aggccgttgg aagggaattt1200aataacttgg aaaggaggat agagaattta aacaagcaga tggaagacgg attcctagat1260gtctggactt ataatgctga acttctggtt ctcatggaaa atgagagaac tctagacttt1320catgactcaa atgtcaagaa cctttatgac aaggtccgac tacagcttag ggataatgca1380aaggagctgg gtaatggttg tttcgagttc tatcacaaat gtgataatga atgtatggaa1440agtgtaaaaa acggaacgta tgactacccg cagtattcag aagaagcaag actaaacaga1500gaggaaataa gtggagtaaa attggaatca atgggaactt accaaatact gtcaatttat1560tcaacagtgg cgagttccct agcactggca atcatggtag ctggtctatc tttatggatg1620tgctccaatg gatcgttaca atgcagaatt tgcatttaa 1659
序列表.txt<210>2<211>213<212>DNA<213>Avian influenza virus<400>2atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tatacatttc ttacatctat 60gcggatcgat ggggaggtgg cggtgaatac ggtttgaaaa gagggccttc tacggaagga 120gtgcctgagt ctatgaggga agaatatcgg caggaacagc agagtgctgt ggatgttgac 180gatgatcatt ttgtcaacat agagctggag taa 21权利要求
1.一种H5N1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于由下述组分组成SEQ ID No.1所述基因序列用昆虫/杆状病毒表达系统表达后所得的蛋白、SEQ ID No.2所述基因序列用原核表达系统表达后所得的蛋白和免疫佐剂。
2.按照权利要求1所述的禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述的免疫佐剂为白油。
3.按照权利要求1所述的禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述的两种蛋白的浓度均为10μg/ml。
4.按照权利要求1所述的禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于免疫佐剂所占的体积百分比是50％，其余是两种蛋白溶液。
5.一种H5N1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)H5N1亚型禽流感病毒主要宿主保护性抗原蛋白的制备将HA基因用特异性引物将信号肽序列缺失，所得的序列如SEQ ID No.1所述，将SEQ ID No.1所述序列的基因克隆到杆状病毒转移载体上，所得的重组杆状病毒转移载体DNA与商品化的苜蓿尺蛾核型多角体病毒DNA共转染sf9细胞，产生带有该HA基因的苜蓿尺蛾核型多角体病毒，将纯化后的重组杆状病毒感染昆虫细胞后表达外源蛋白，将所表达的蛋白收集纯化备用，(2)H5N1亚型禽流感病毒基质蛋白的制备将M2基因用特异性引物将26～55位氨基酸跨膜区基因序列缺失，所得基因序列如SEQ ID No.2所述，将SEQ ID No.2所述的基因序列克隆到大肠杆菌融合表达载体中，将所得的重组大肠杆菌融合表达载体转化至感受态细胞中诱导表达外源蛋白，收集纯化所表达的蛋白备用，(3)、将步骤(1)和(2)所纯化的目的蛋白混合在一起后与免疫佐剂按1∶1的体积比混合即得。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征是步骤(1)中纯化后的重组杆状病毒所感染的昆虫细胞是Hfive细胞。
7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征是步骤(2)中所述的大肠杆菌融合表达载体是PGEX-6P-1。
全文摘要
本发明公开了一种新的H5N1亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法，本发明疫苗由下述组分组成SEQ ID No.1所述基因序列用昆虫/杆状病毒表达系统表达后所得的蛋白、SEQ ID No.2所述基因序列用原核表达系统表达后所得的蛋白、免疫佐剂。本发明疫苗免疫鸡后，能激发良好的保护性免疫反应，而没有活病毒的任何危险，不存在基因重组、毒力返强等缺陷，并且能区分免疫者和自然感染者从而不干扰流行病学调查，也不会造成任何环境与生态安全问题。
文档编号A61P31/16GK1781553SQ200410096238
公开日2006年6月7日 申请日期2004年11月29日 优先权日2004年11月29日
发明者孟庆文, 于康震, 陈化兰, 刘光亮, 施建忠 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所