专利名称：含有g－csf的成纤维细胞动员剂及创伤治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有粒细胞集落刺激因子(G-CSF)作为有效成分的成纤维细胞动员剂。另外，本发明涉及含有G-CSF作为有效成分的成纤维细胞固定生长剂。并且，本发明涉及含有G-CSF作为有效成分的创伤治疗剂。
背景技术：
人G-CSF是作为粒细胞系造血干细胞分化诱导因子被发现的造血因子，因其在机体内促进嗜中性粒细胞的造血，因而在临床中被用作骨髓移植或癌症化疗后的嗜中性粒细胞减少症治疗剂。另外，除上述作用外，人G-CSF具有通过作用于干细胞而刺激其分化增殖的作用，或者将骨髓中的干细胞向外周血中动员的作用。实际中，基于后者的作用，在临床现场可实施以促进施行强力化疗后的癌症患者的造血恢复为目的，移植被人G-CSF动员的外周血造血干细胞的外周血干细胞移植术。
发明内容
本发明的目的是不移植成纤维细胞，简便地向创伤组织动员成纤维细胞，使成纤维细胞在创伤组织固定生长，从而治疗创伤。
本发明者研究了心肌梗塞后创伤组织的再生。结果发现，通过给予G-CSF，成纤维细胞向心肌梗塞灶移动，防止了心脏功能的降低，改善了心脏的重构。本发明基于这一认识完成。
即，本发明提供了含有粒细胞集落刺激因子(G-CSF)作为有效成分的成纤维细胞动员剂。
另外，本发明提供了含有G-CSF作为有效成分的、位于心脏疾病发病后心脏的成纤维细胞的固定生长剂。
另外，本发明提供了含有G-CSF作为有效成分的创伤治疗剂。
另外，本发明提供了包括给予有效剂量G-CSF的成纤维细胞动员方法。
另外，本发明提供了包括给予有效剂量G-CSF的、用于使成纤维细胞在心脏疾病发病后的心脏固定生长的方法。
另外，本发明提供了包括给予有效剂量G-CSF的创伤治疗方法。
心肌梗塞后通过给予G-CSF，在梗塞灶内观察到了大量来自骨髓细胞的心肌细胞。另一方面，还观察到了其近10倍数量的成纤维细胞。即可见，通过给予G-CSF，各种来自干细胞的细胞从骨髓向梗塞灶游走，使梗塞灶再生，从而防止了心肌梗塞后的重构。认为通过给予G-CSF，不仅急性期内大量的白细胞浸润，慢性期(梗塞后60日)内成纤维细胞向梗塞灶的移动促进了创伤愈合，改善了重构。文献报道了通过向心肌梗塞后的梗塞灶内移植成纤维细胞，能够防止梗塞灶的重构(Hutcheson KA，Atkins BZ，Hueman MT，Hopkins MB，GlowerDD，Taylor DA，Transplant.9，2000，359-368)。本发明中，在心肌梗塞后通过给予G-CSF，能够使成纤维细胞从骨髓游走。从而，不必移植成纤维细胞就可以防止梗塞灶的重构，在临床应用上极为有利。
另外，这一事实意味着除心肌梗塞外，G-CSF还可在临床上应用于外伤等各种创伤的愈合过程。即，在创伤的愈合过程中通过给予G-CSF，不仅在早期可使粒细胞浸润，还能够提供成纤维细胞、加速创伤的愈合，进一步地生成更坚固的愈合组织。此前，人们认为在创伤愈合时给予G-CSF，会使粒细胞大量浸润，从而破坏组织(Romson，JL，Hook BG，Kunkel SL，Abrams GD，Schork MA，Lucchesi BR，Circulation 67(5)，1983，1016-1023)，但在本发明中，通过给予G-CSF能够使创伤部位更坚固地愈合。
图1是对骨髓移植60日后的外周血有核细胞的FACS分析结果示意图。
图2是骨髓细胞离心涂片标本的激光共聚焦显微镜照片。绿色表示GFP阳性的骨髓来源细胞，蓝色表示经DAPI染色的有核细胞。
图3是制成心肌梗塞后、皮下给予G-CSF 10日时间的小鼠(G-CSF给药组)及给予生理盐水的小鼠(对照组)的存活率示意图。
图4是制成心肌梗塞后60日的经胸壁M型超声心动图。自上到下依次为正常小鼠、对照小鼠及G-CSF给药组(100μg/kg)小鼠的左心室。
图5是制成心肌梗塞后60日给予G-CSF对左心室射血分数的效果示意图。自左到右依次显示了正常组、G-CSF给药组(100μg/kg)及G-CSF给药组(300μg/kg)的结果。
图6是制成心肌梗塞后60日给予G-CSF对左心室舒张末期径的效果示意图。自左依次显示了正常组、G-CSF给药组(100μg/kg)及G-CSF给药组(300μg/kg)的结果。
图7(a)是制成心肌梗塞后60日对照组(左图)和G-CSF给药组(右图)的心脏左心室短轴切面偶氮染色图。红色部分为肌纤维，蓝色部分为胶原纤维。
图7(b)是制成心肌梗塞后60日G-CSF给药组的心脏左心室短轴切面的偶氮(Azan)染色图(左图)及激光共聚焦显微镜照片(右图)。
图8是心肌梗塞灶的激光共聚焦显微镜照片。(a)表示非梗塞灶，(b)表示对照组心肌梗塞灶，(c)表示G-CSF给药组(100μg/kg)心肌梗塞灶。(d)表示对Lac-Z转基因小鼠给予G-CSF(100μg/kg)的心肌梗塞灶。
图9是心肌梗塞灶内存在的GFP阳性细胞数示意图。
图10是对心肌梗塞灶用抗α-平滑肌肌动蛋白抗体免疫染色的激光共聚焦显微镜照片。绿色表示GFP阳性细胞，蓝色表示被DAP I染色的核，红色表示α-平滑肌肌动蛋白。
图11是对心肌梗塞灶用抗血友病因子(vWF)抗体免疫染色的激光共聚焦显微镜照片。绿色表示GFP阳性细胞，蓝色表示被DAPI染色的核，红色表示vWF。
图12是对心肌梗塞灶用抗辅肌动蛋白抗体免疫染色的激光共聚焦显微镜照片。绿色表示GFP阳性细胞，蓝色表示被DAPI染色的核，红色表示辅肌动蛋白。
图13是对心肌梗塞灶用抗辅肌动蛋白抗体免疫染色的激光共聚焦显微镜照片。绿色表示GFP阳性细胞，蓝色表示被DAPI染色的核，红色表示辅肌动蛋白。
图14是对心肌梗塞灶每1μm进行切割后的切片，用抗辅肌动蛋白抗体免疫染色的激光共聚焦显微镜照片。绿色表示GFP阳性细胞，蓝色表示被DAPI染色的核，红色表示辅肌动蛋白。
图15是给予G-CSF后的心肌梗塞灶中GFP阳性细胞类别的比例示意图。
图16是给予G-CSF后对全骨髓移植组及单一造血干细胞移植组的外周血有核细胞数的效果示意图。
图17是给予G-CSF对制作心肌梗塞后存活率的效果示意图。图中的虚线表示全骨髓移植组，直线表示单一造血干细胞移植组，方块表示G-CSF给药组(+)，圆形表示非G-CSF给药组(-)。
图18是单一造血干细胞移植组中的心肌梗塞灶用抗波形蛋白抗体免疫染色的激光共聚焦显微镜照片。绿色表示GFP阳性细胞，蓝色表示被DAPI染色的核，红色表示波形蛋白。
图19是给予G-CSF对全骨髓移植组及单一造血干细胞移植组的GFP阳性细胞数的效果示意图。
图20是给予G-CSF后对单一造血干细胞移植组心肌梗塞边缘区域用抗辅肌动蛋白抗体免疫染色的激光共聚焦显微镜照片。绿色表示GFP阳性细胞，蓝色表示被DAPI染色的核，红色表示辅肌动蛋白。
具体实施例方式
本发明涉及含有G-CSF作为有效成分的成纤维细胞动员剂。成纤维细胞被动员的场所无特定限制。例如，存在受创伤组织时，通过给予G-CSF，能够向受创伤的组织动员成纤维细胞。
本发明中的创伤可以是身体组织的损害、损伤，例如，包括心脏、肺、肾脏、肠、肝脏、腱等内部组织或脏器的损害、损伤，或者皮肤等的外伤。作为负有创伤的组织的具体例子，可以优选举出心肌梗塞后的心脏。
成纤维细胞通常为结缔组织的固有细胞，是以粗面内质网和高尔基体发育良好为特征的具有椭圆形核和纺锤状原生质的细胞。另外，存在于多个脏器中的间质细胞中有包埋实质物质细胞作用的细胞也包含在内。成纤维细胞通常具有大量产生体内间质物质(胶原、粘连蛋白、粘多糖等)的能力。通过向负有创伤的组织动员成纤维细胞，能够促进创伤的愈合。
另外，本发明涉及含有G-CSF作为有效成分的、位于心脏疾病发病后心脏的成纤维细胞固定生长剂。
心脏疾病的具体例子可举出例如缺血性心脏疾病(心肌梗塞等)或心肌疾病(心肌病等)等。例如心肌梗塞后通过给予G-CSF，能够使成纤维细胞生长在心肌梗塞灶。
另外，本发明涉及含有G-CSF作为有效成分的创伤治疗剂。
本发明所用的G-CSF能够使用任何G-CSF，但优选高度纯化的G-CSF，更为具体的，是哺乳动物G-CSF、特别是具有与人G-CSF实质上同样的生物活性的物质。G-CSF的来源无特别限定，可以使用天然来源的G-CSF、通过基因重组法得到的G-CSF等，但优选使用通过基因重组法得到的G-CSF。在通过基因重组法得到的G-CSF中，可以是与天然来源的G-CSF氨基酸序列同样的G-CSF，或者该氨基酸序列中的1个或多个氨基酸缺失、替换、添加等了的与天然来源的G-CSF具有同样生物活性的G-CSF。氨基酸的缺失、替换、添加等可以采用本领域技术人员公知的方法。例如，本领域技术人员通过使用定点诱变法(Gotoh，T.等(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.等(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz，H.J.(1987)Methods Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，向G-CSF的氨基酸导入适当的突变，能够制备与G-CSF具有同等功能的多肽。另外，氨基酸的变异也可以在自然界中产生。一般地，在被替换的氨基酸残基中，优选替换成保持有氨基酸侧链性质的其他氨基酸。作为氨基酸侧链的性质可举出例如疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)，具有含羟基的侧链的氨基酸(S、T、Y)，具有含硫侧链的氨基酸(C、M)，具有含羧酸和酰胺基的侧链的氨基酸(D、N、E、Q)，具有含碱基侧链的氨基酸(R、K、H)，具有含芳香族的侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内任何氨基酸都以一个字母表示)。众所周知，具有相对于某氨基酸序列的1个或多个氨基酸残基缺失、添加和/或被其他氨基酸替换而修饰的氨基酸序列的多肽能够维持其生物活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982)79，6409-6413)。
另外，本发明中，G-CSF可作为蛋白质给予，也可以以基因治疗的方式给予编码G-CSF的基因。编码G-CSF的基因一般是通常以包含表达盒的表达载体等被给予。载体无特别限定，既可以使用非病毒载体，也可以使用病毒载体(别册实验医学，《基因导入和表达分析实验方法》，羊土社，1996等)。载体可举出例如质粒载体、病毒载体、噬菌体载体、粘粒载体、YAC载体等。表达载体中通常包含有启动子等调节因子等。基因导入法使用何种方法均可，例如，磷酸钙法、脂转染法、使用脂质体法的导入方法、裸DNA法、受体介导性基因导入法、使用基因枪的方法、DEAE-葡聚糖法、毛细管法等均可使用。另外，本发明中，既可以将基因直接导入体内，也可以向取出的细胞或培养后所得的细胞等中导入基因后再将该细胞放回体内。
另外，也可以使用G-CSF与其他蛋白质融合的蛋白质。在制备融合的多肽时，例如，可以将编码G-CSF的DNA与编码其他蛋白质的DNA符合读框地连接并将其导入表达载体，使其在宿主中表达。作为本发明中可与G-CSF相融合的其他蛋白质，无特别限定。
另外，也可以使用经化学修饰后的G-CSF。作为经化学修饰的G-CSF的例子，可举出例如进行糖链结构的改变、添加、缺失操作的G-CSF，或与聚乙二醇、维生素B12等无机或有机化合物等的化合物相结合的G-CSF等。
本发明所使用的G-CSF可用任何方法制造，例如，培养人肿瘤细胞或产生人G-CSF的杂交瘤的细胞株，用各种方法从中提取分离纯化得到的G-CSF，或通过基因工程方法由大肠杆菌、酵母菌、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、C127细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、昆虫细胞等中产生，并通过各种方法提取分离纯化后得到的G-CSF等均可使用。本发明中所使用的G-CSF，优选通过基因工程方法制造的G-CSF，并优选使用哺乳动物细胞(特别是CHO细胞)制造的G-CSF(例如，特公平1-44200号公告，特公平2-5395号公告，特开昭62-129298号公告，特开昭62-132899号公告，特开昭62-236488号公告，特开昭64-85098号公告)。
本发明的成纤维细胞动员剂等中，可以根据其给药方法或剂型，适当添加助悬剂、助溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、防吸附剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、无痛剂、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。
作为助悬剂的实例，可举出例如甲基纤维素、聚山梨酯80、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、黄蓍胶粉末、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯等。
作为助溶剂，可举出例如聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨酯80、烟酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯、低分子聚乙二醇混合物(Macrogol)、蓖麻油脂肪酸乙酯等。
作为稳定剂，可举出例如葡聚糖40、甲基纤维素、明胶、亚硫酸钠、偏亚硫酸钠等。
作为等渗剂，可举出例如D-甘露醇、山梨糖醇等。
作为防腐剂，可举出例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。
作为防吸附剂，可举出例如人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、环氧乙烷·环氧丙烷共聚物、羟丙纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯化氢化蓖麻油、聚乙二醇等。
作为含硫还原剂，可举出例如N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰基高半胱氨酸、硫辛酸、硫撑二乙醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、碳原子数1～7的硫代链烷酸等含有巯基的化合物等。
作为抗氧化剂，可举出例如异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁羟基苯甲醚、α-生育酚、生育酚乙酸酯、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯、或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。
进而，还可以含有氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠等无机盐；柠檬酸钠、柠檬酸钾、醋酸钠等有机盐等通常添加的成分。
本发明的成纤维细胞动员剂等，可以注射剂(皮下、皮内、肌肉内、静脉内、腹腔内等)，或是以适于经皮、经粘膜、经鼻等给药的剂型，或是以适于口服给药的剂型(片剂、胶囊剂、颗粒剂、液体制剂、混悬剂等)给药。本发明并不受给药途径或剂型的限制。
本发明的以G-CSF为有效成分的成纤维细胞动员剂等的给药量、给药次数可考虑治疗对象的患者的症状由本领域技术人员适当决定，通常，给药G-CSF以成人每人为0.1～500μg/kg/日，优选为1～50μg/kg/日的用量。给药次数可以是每周1～7天给药。但本发明并不受人G-CSF的用量的限制。另外，本发明的成纤维细胞动员剂等还可以与其他药物联合使用。
[实施例1] 全骨髓移植(1)骨髓移植模型小鼠的制备用4×106V直线加速器，对8～10周龄的C57BL/6小鼠(CLEA，东京，日本)全身单次照射致死量放射线(850cGy)，作为受体小鼠使用。由GFP转基因小鼠(C57BL/6，10～12周龄)(Oka be等，(1997)FEBS.Lett.407，313-319)的股骨和颈骨采集粗级分骨髓，通过尾静脉向受体小鼠移植5×106个骨髓细胞。
为确认受体小鼠骨髓中来自供体的GFP阳性骨髓细胞生长程度如何(被称作“嵌合率”)，对骨髓移植后60日的外周血有核细胞，用FACS Calibur(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)进行分析。结果如图1所示。对照小鼠的骨髓有核细胞中未发现GFP，但受体小鼠的细胞中97.8％为GFP阳性。嵌合率的多少是定量供体来源的GFP阳性细胞的重要指标。本实验中，作为骨髓移植模型小鼠，使用了外周血细胞嵌合率平均在95％以上的小鼠。这是基于满足骨髓来源细胞对创伤治疗贡献的定量评价的条件来考虑的。
图2中显示了骨髓细胞离心涂片标本。经DAPI染色后，在激光共聚焦显微镜下进行观察。结果显示，几乎所有的有核细胞(蓝色)发出绿色，骨髓细胞为GFP阳性。
(2)给予G-CSF对心肌梗塞小鼠的效果骨髓移植60日后，对小鼠进行0.5％异氟醚吸入麻醉，开胸、露出左心室，结扎左冠状动脉，制成心肌梗塞。制成心肌梗塞后24小时，将溶解于生理盐水的重组人G-CSF(中外制药(株)制)(100或300μg/kg/日)每日1次，连续10日，皮下给予小鼠(G-CSF给药组)。对照组小鼠仅给予生理盐水。
存活率调查了G-CSF给药组(300μg/kg)和对照组的存活率(n＝68)(图3)。对照组存活率在制成心肌梗塞后60日为约60％，G-CSF给药组的存活率为约90％。
形态观察制成心肌梗塞后60日时，对正常小鼠和对照组及G-CSF给药组小鼠，使用配有15MHz相控阵探头的ImagePoint1500超声波诊断仪(Philips Co.，USA)，进行经胸壁心回波(M型超声心动图)检查，对心肌梗塞灶进行形态观察。将小鼠用氯胺酮(30mg/kg)和甲苯噻嗪(6mg/kg)麻醉，使之维持自主呼吸。由图4明显看到，对照组中，与正常左心室相比，其前壁部分心肌变薄，无收缩，左心室内径扩大。与此相对，G-CSF给药组(100μg/kg)中，左心室舒张末期径的扩大程度与对照组相比受到抑制。另外，左心室前壁虽呈现低收缩，但与对照组相比有显著的改善。
心功能制成心肌梗塞后60日时，根据对照组和G-CSF给药组(100或300μg/kg)的M型超声心动图测定左心室收缩末期内径(LVESD)和舒张末期内径(LVEDD)(n＝68)。另外，根据Teichholz法计算舒张末期容积(EDV)及收缩末期容积(ESV)。左心室射血分数(EF)按下式进行计算。
EF％＝[(EDV-ESV)/EDV]×100结果如图5和图6所示。观察到所有G-CSF给药组的心功能得到显著改善。
组织学检查(i)切片的制作将小鼠用氯胺酮(30mg/kg)和甲苯噻嗪(6mg/kg)麻醉，用PBS进行心脏灌流，用溶于PBS的4％多聚甲醛进行灌注固定。取出心脏，将其包埋于OCT化合物(Miles Scientific，Naperville，IL，USA)中，用液氮快速冷冻。将包埋后的心脏切成薄片，制成切片。
(ii)偶氮染色制成心肌梗塞后60日时，将对照组和G-CSF给药组(300μg/kg)的心脏左心室短轴切面的冷冻切片进行偶氮染色。结果如图7(a)所示。对照组中观察到左心室径扩大，梗塞灶的“壁薄化”、伸展化，即观察到所谓的心肌梗塞后重构。与之相对比的是，G-CSF给药组中，梗塞后的重构为轻度，梗塞灶的“壁薄化”、伸展化减轻。即，通过给予G-CSF，心肌梗塞灶的组织再生，防止了重构。
另外，用激光共聚焦显微镜观察G-CSF给药组的切片时，显示心肌梗塞灶中GFP阳性骨髓细胞多数浸润(图7(b)，右图)。
(iii)免疫染色将冷冻切片(6μm)用PBS洗净，4℃下用抗体进行染色过夜。之后，用PBS洗涤3次，4℃下同与TRI TC(DAKO，Japan)结合的二抗一起温育4小时(红色)。核用DAPI(Sigma Aldrich)染色(蓝色)。
用激光共聚焦显微镜(LSM410；Carl Zeiss，Jena，Germany)观察心肌梗塞灶(图8)。非梗塞灶切片用抗α-辅肌动蛋白抗体(cloneEA-53；Sigma Aldrich，Saint Louis，MO，USA)染色。心肌细胞被染为红色，血管内残存极少数GFP阳性细胞(a)。对照组梗塞灶中只观察到极少数GFP阳性细胞(b)。与之相对比的是，G-CSF给药组(300μg/kg)中，梗塞灶中观察到大量GFP阳性细胞(c)。使用作为供体小鼠的Lac-Z转基因小鼠(10～12周龄Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME，USA)(c)进行同样的实验，确认(c)的梗塞灶中的绿色萤光不是非特异性萤光(d)。另外，将激光共聚焦显微镜下拍照得到的图像输入计算机，用NIH Image进行分析。计算对应梗塞灶单位面积细胞数中的GFP阳性细胞数。结果如图9所示。可以明确，通过给予G-CSF，来自骨髓的细胞向心肌梗塞灶游走。
接下来，确认该GFP阳性细胞为何种细胞。
图10显示了用抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(clone 1A4；SigmaAldrich)进行免疫染色的结果。来自骨髓的GFP阳性细胞被染为红色，可以明确其分化成为平滑肌细胞。
接着，对作为内皮细胞标志物的血友病因子(vWF)，使用抗vWF抗体(clone F8/86；DAKO)进行免疫染色(图11)。确认了GFP信号被vWF信号包围的区域，从而明确GFP阳性细胞也分化成为了内皮细胞。
进一步地，使用抗α-辅肌动蛋白抗体，对心肌细胞进行免疫染色(图12～14)。由图12和图13表明，GFP阳性细胞为辅肌动蛋白阳性信号。另外，其中可见一些横纹，暗示其为心肌细胞。由GFP阳性细胞可再生成为具有完全横纹的心肌。图14为每1μm进行切割的切片照片。显示来自骨髓的GFP阳性细胞再生成为完全的心肌细胞。
制成心肌梗塞后60日时，心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞占心肌梗塞灶中所观察到的GFP阳性细胞的比率总结于图15中。细胞数按如下方法求得。将心脏分为心尖部、中部、底部3部分，根据各自GFP阳性细胞的面积和组织厚度算出梗塞部组织的体积。测算每单位面积的GFP阳性细胞数，求出GFP阳性细胞的密度。根据GFP阳性细胞的密度和梗塞部位体积，算出梗塞部位组织中GFP阳性细胞的细胞数。80％以上的细胞为纺锤形，其形态与造血细胞不同。另外，这些细胞为CD45阴性，Mac-1阴性。即，这显示心肌梗塞灶中存在最多的是成纤维细胞。
来自骨髓的单一造血干细胞的移植从GFP转基因小鼠采集骨髓，用细胞分类器分离出GFP阳性级分后，回收c-kit阳性、Sca-1阳性、linage抗原阴性、CD34阴性的造血干细胞。将这些细胞中的1个与由其他正常供体小鼠采集的粗分离骨髓细胞5×106个向经致死量放射量照射后的受体小鼠进行骨髓移植。3个月后，确认骨髓中GFP阳性细胞的生长率。麻醉开胸后，结扎左冠状动脉制成心肌梗塞。之后，连续10日经皮下给予G-CSF(300μg/kg)。全骨髓移植组和单一造血干细胞移植组在给予G-CSF后10日的外周血有核细胞数均为30,000左右，未见差异(图16)。
对单一造血干细胞组(直线)和全骨髓移植组(虚线)，分别考察其给予G-CSF(方块)和不给予G-CSF(圆形)时的存活率(图17)。不仅是全骨髓移植组，单一造血干细胞移植组中，通过给予G-CSF，存活率也得到显著的改善。
接着，用与实施例1同样的方法制作单一造血干细胞移植组的心肌梗塞灶切片，用抗波形蛋白抗体(PROGEN BIOTECHNIK GMBH公司制，Cat.No.GP53)进行免疫染色。由图18可明确，认为在心肌梗塞灶中有GFP阳性细胞存在。明确有1个GFP阳性造血干细胞在心肌梗塞灶生长。另外，因其被抗波形蛋白抗体染色，认为其向成纤维细胞分化。
进一步地，对单一造血干细胞移植组和全骨髓移植组，与实施例1同样，测定了给予G-CSF和不给予G-CSF场合下的GFP阳性细胞数(图19)。不仅是全骨髓移植组，单一造血干细胞移植组中，通过给予G-CSF，GFP阳性细胞数也显著性增加。
对单一造血干细胞移植组给予G-CSF时的左心室切片，用抗心肌辅肌动蛋白抗体进行免疫染色(图20)。GFP阳性细胞变为辅肌动蛋白阳性，显示其分化为心肌细胞。
上述实施例1和2中的数值以平均值±SEM表示。通过ANOVA分析算出平均值间的显著性差异。对照组与G-CSF给药组的比较用log-rank检验或非参数Fisher多重比较检验进行。以p＜0.05为具有显著性。
对8～10周龄的C57BL/6小鼠进行致死量的放射线照射，将采集自CAG-EGFP小鼠(Okabe M.等，FEBS Lett.1997，407313-319)骨髓的全骨髓细胞(w-BM)或c-kit阳性、Sca-1阳性、lineage抗原阴性的单一细胞群(KSL-SP)通过尾静脉移植入其体内。8周后，结扎左冠状动脉制成心肌梗塞(MI)。MI制成后24小时，将生理盐水(G-CSF(-))或300μg/kg/日的G-CSF(G-CSF(+))每日1次，连续10日，经皮下给予小鼠。MI制成后8周时，解剖小鼠，对心脏进行免疫组织学分析。对各小鼠组(n＝10)的100个样品标本，测算梗塞灶的GFP阳性细胞、GFP阳性波形蛋白阳性细胞和GFP阳性辅肌动蛋白阳性细胞。GFP阳性细胞的平均值如表1所示。
表1 梗塞灶中GFP阳性细胞的定量分析
*梗塞灶的所有GFP阳性细胞数。
w-BM组中波形蛋白阳性细胞(成纤维细胞)和辅肌动蛋白阳性细胞(心肌细胞)从所有骨髓中再生，而KSL-SP组中只有成纤维细胞再生。这一结果暗示，造血干细胞无法再生长为心肌细胞。认为心肌细胞的再生是由间质干细胞分化得到的。
接着来看G-CSF的效果，w-BM组中动员了成纤维细胞和心肌细胞。KSL-SP组中尽管动员了成纤维细胞，但心肌细胞仅观察到3个。认为这些心肌细胞恐怕不是由再生而产生，而是细胞融合的结果。
如图17所示，所有组中，通过给予G-CSF，存活率得到改善。这些效果中，w-BM组中是有助于成纤维细胞和心肌细胞的动员，KSL-SP组中是有助于成纤维细胞的动员。特别是，成纤维细胞的增加作用于心肌梗塞部位的创伤愈合，作为促进抑制众所周知的与死亡率相关的重构的物质，非常重要。
工业实用性通过使用本发明的成纤维细胞动员剂，仅通过使少量的来自骨髓的细胞游走，能够不进行成纤维细胞移植，而使心肌梗塞灶等的组织再生，提高存活率。另外，通过使用本发明的创伤治疗剂，能够使创伤部位坚固地愈合。
权利要求
1.成纤维细胞动员剂，含有粒细胞集落刺激因子(G-CSF)作为有效成分。
2.权利要求1所述的动员剂，其特征在于，向创伤组织动员成纤维细胞。
3.权利要求1所述的动员剂，其特征在于，向心脏动员成纤维细胞。
4.权利要求3所述的动员剂，其特征在于，心脏是心脏疾病发病后的心脏。
5.权利要求4所述的动员剂，心脏疾病是心肌梗塞。
6.成纤维细胞固定生长剂，含有G-CSF作为有效成分、位于心脏疾病发病后的心脏。
7.权利要求6所述的固定生长剂，其心脏疾病是心肌梗塞。
8.权利要求6所述的固定生长剂，其心脏疾病发病后的心脏是心肌梗塞后的心肌梗塞灶。
9.创伤治疗剂，含有G-CSF作为有效成分。
10.成纤维细胞动员方法，包括给予有效剂量的G-CSF。
11.用于使心脏疾病发病后的心脏生长成纤维细胞的方法，包括给予有效剂量的G-CSF。
12.创伤治疗方法，包括给予有效剂量的G-CSF。
全文摘要
本发明的目的是，不移植成纤维细胞，简便地向创伤组织动员成纤维细胞，使成纤维细胞生长在创伤组织，从而治疗创伤。通过给予G－CSF，成纤维细胞向心肌梗塞灶移动，防止心脏功能的降低，改善心脏的重构。
文档编号A61P9/00GK1886150SQ200480031859
公开日2006年12月27日 申请日期2004年10月27日 优先权日2003年10月27日
发明者福田惠一, 藤田淳 申请人:学校法人庆应义塾, 中外制药株式会社