包埋有金属卟啉络合物的类脂质体、其制造方法以及利用该类脂质体的药物的制作方法

专利名称：包埋有金属卟啉络合物的类脂质体、其制造方法以及利用该类脂质体的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包埋有金属卟啉络合物的类脂质体(非离子型表面活性剂泡囊，niosome)，更详细地说，涉及在生物体内作为抗癌剂或抗氧化剂而发挥作用的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体及其制造方法。
背景技术：
一般已知，在生物体内产生的很多的活性氧种与炎症疾病、神经疾病、动脉硬化、癌、糖尿病等多种病症有关，通常，生物体中具有超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶等自由基清除酶来对抗这些活性氧种以保证平衡。
然而，生物体内的癌细胞中已知大量存在O2-·，据悉，其可使这些酶的活性降低。
另一方面，炎症疾病、神经疾病、动脉硬化、糖尿病等疾病，其病因是SOD、过氧化氢酶等自由基清除酶的平衡破坏、O2-·等活性种增加所致。
据报道金属卟啉络合物具有高的SOD活性，所以可以预料，通过将该络合物施用至生物体内，能有效消除以O2-·为首的活性氧种，使生物体免受活性氧对生物体内的危害。
但是，将金属卟啉络合物单独施用至生物体内，在安全性、效果方面存在许多问题，目前的实际情况是还没有作为药物来利用。

发明内容
本发明是鉴于这些问题而完成的，本发明的课题是提供一种可安全地将金属卟啉络合物施用至生物体内并可发挥金属卟啉络合物所具有的SOD活性的方法。
另外，本发明提供只选择性地作用于癌细胞的抗癌剂以替代目前临床使用的副作用大的顺铂、丝裂霉素C等抗癌剂，以及提供治疗与活性氧种相关的炎症疾病、神经疾病、动脉硬化、糖尿病等的癌以外的疾病的抗氧化剂。
本发明人等以癌细胞内存在的O2-·为靶向，对利用金属卟啉络合物的SOD活性作用降低其浓度的方法进行了种种研究，结果发现，通过将金属卟啉络合物包埋在类脂质体中，可以使该金属卟啉络合物在保持其优异SOD活性的同时安全地施用至体内，并且可以滞留于血液中，从而完成了本发明。
即，本发明涉及包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其含有阳离子化金属卟啉络合物和类脂质体形成用物质。
另外，本发明涉及包埋有金属卟啉络合物的类脂质体的制造方法，其特征为，将阳离子化金属卟啉络合物和类脂质体形成用物质混合，接着，在介质中对该混合物进行超声处理。
进而，本发明涉及包埋有金属卟啉络合物的类脂质体的制造方法，其特征为，使阳离子化金属卟啉络合物和阴离子型表面活性剂反应，形成离子络合物，接着，将该离子络合物和类脂质体形成用物质混合，进而，在介质中对该混合物进行超声处理。
本发明还涉及含有上述包埋有金属卟啉络合物的类脂质体作为有效成分的药物。


图1是表示在作为金属卟啉络合物使用FeT2MPyP系、作为类脂质体形成用物质使用普朗尼克(Pluronic)F-88时抗癌特性试验结果的图。图中，▲表示离子络合物2(FeT2MPyP/4SAS)，■(虚线)表示普朗尼克F-88，■(实线)表示CDDP，◆表示MMC，●表示本发明品9。
具体实施例方式
本说明书中，所谓“包埋有金属卟啉的类脂质体”意味着金属卟啉络合物嵌入类脂质体形成用物质(例如非离子型表面活性剂或其与胆甾醇类等的混合物)形成的类脂质体中而其一部分露在类脂质体膜外；或者全部包藏在类脂质体膜内。
本发明的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体含有阳离子化金属卟啉络合物和类脂质体形成用物质。
作为本发明包埋有金属卟啉络合物的类脂质体(以下有时仅称为“Por包埋类脂质体”)的构成成分的阳离子化卟啉络合物，是具有含阳离子性氮原子的基团作为取代基的卟啉络合物，例如可举出式(I)、(II)或(III)表示的物质 (式中，R1至R4中的至少一个表示选自N-低级烷基吡啶基、低级烷基铵苯基、N-低级烷基咪唑基中的基团，R11至R16以及R21至R26表示低级烷基或低级烷氧基，R17和R18表示选自N-低级烷基吡啶基、低级烷基铵苯基、N-低级烷基咪唑基中的基团，R27至R28表示N-烷基铵基)。
更具体地，可例示出上述式(I)中R1为甲基吡啶基的下述物质5，10，15，20-四(2-甲基吡啶基)卟啉(T2MPyP)、5，10，15，20-四(4-甲基吡啶基)卟啉(T4MPyP)、5，10，15，20-四(3-甲基吡啶基)卟啉(T3MPyP)等；上述式(II)中R2为甲基吡啶基酰胺基乙基的[1，3，5，8-四甲基-2，4-二乙烯基-6，7-二(4-甲基吡啶基酰胺基乙基)]卟啉(PPIX-DMPyAm)等。
作为这些阳离子化卟啉络合物上的配位金属，优选铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、铜(Cu)、钼(Mo)、铬(CR)、铱(IR)等。
上述中，络合有金属的由式(I)表示的阳离子化卟啉络合物的合成可以基于K.Kalyanasundaram，Inorg.Chem.，23，2453(1984)、A.D.Adler etal.，J.Inorg.Nucl.Chem.，32，2443(1970)、T， Yonetani et al.，J.Biol.Chem.，245，2988(1970)、P. Hambright，Inorg.Chem.，15，2314(1976)等中记载的方法进行。
另外，络合有金属的由式(II)表示的阳离子化卟啉络合物的合成可以基于E.Tsuchida，H.Nishide，H.Yokoyama，R.Young，and C.K.Chang，Chem.Lett.，1984，991等中记载的方法进行。
即使只使用上述阳离子化卟啉络合物也可以制造本发明的Por包埋类脂质体，但是优选使阳离子化金属卟啉络合物与阴离子型表面活性剂反应得到离子络合物(以下仅称为“离子络合物”)，利用离子络合物进行制造。
作为能用于该离子络合物制造的阴离子型表面活性剂，优选脂肪酸的碱金属盐、烷基硫酸的碱金属盐，作为例子可举出月桂酸(LAS)、肉豆蔻酸(MAS)、棕榈酸(PAS)、硬脂酸(SAS)、油酸(OAS)等脂肪酸的碱金属盐；十二烷基硫酸(SDS)、十四烷基硫酸(STS)、十六烷基硫酸(SHS)、十八烷基硫酸(SOS)等烷基硫酸的碱金属盐。另外，脂肪酸的碱金属盐、烷基硫酸的碱金属盐优选为钠盐、钾盐等。
在形成上述离子络合物时，只要在适当的溶剂中将阳离子化金属卟啉络合物和阴离子型表面活性剂混合即可，阳离子化金属卟啉络合物和阴离子型表面活性剂的混合比以它们的摩尔比计只要在1∶1至1∶20的程度即可。
上述阳离子化金属卟啉络合物或其与阴离子型表面活性剂形成的离子络合物，与类脂质体形成用物质混合，通过用于形成类脂质体的常规方法可以制成Por包埋类脂质体。
作为该类脂质体形成用物质，可以利用已报道的用于形成类脂质体的多种化合物，优选利用非离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂与胆甾醇类或三酰基甘油的混合物。
其中，作为非离子型表面活性剂，可以使用聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物等中的1种或2种或2种以上的物质。作为这些非离子型表面活性剂的具体例子，可举出Tween-61(以下，有时简称为“TW61”)、Tween-80、Span 80(均为日本油脂公司制造)、普朗尼克F-88(以下有时简称为“F88”)(旭电化公司制造)等。
另外，作为胆甾醇类，可举出胆甾醇、α-胆甾烷醇、β-胆甾烷醇、胆甾烷、链甾醇(5，24-胆甾二烯-3β-醇)、胆酸钠或胆钙化甾醇等。
利用上述阳离子化金属卟啉络合物或离子络合物和类脂质体形成用物质来形成Por包埋类脂质体时，首先，必须取这些成分置于适当的溶剂中进行充分的混合。
类脂质体形成时，式(II)或(III)表示的阳离子化金属卟啉络合物可以直接被包埋在类脂质体中，但是优选式(I)的阳离子化金属卟啉络合物以离子络合物的形式形成类脂质体。
关于用于形成类脂质体的阳离子化金属卟啉络合物和类脂质体形成用物质的使用量，相对于1摩尔阳离子化金属卟啉络合物或离子络合物，类脂质体形成用物质为10～500摩尔，特别是优选为50～300摩尔。
类脂质体的形成可以通过已公知的方法进行，例如，将上述两种成分溶解在挥发性溶剂中，混合后，仅挥发除去挥发性溶剂，接着在其中加入适当的水性溶剂例如蒸馏水、生理盐水等，剧烈搅拌，或超声处理，从而制成Por包埋类脂质体。
另外，根据需要，可以使用溶解有药学有效成分的溶液、或某种培养基等来代替水性溶剂，得到内含这些物质的Por包埋类脂质体。
使用荧光光谱、动态光散射测定等，对得到的Por包埋类脂质体如后所述进行结构解析，结果显示，阳离子化金属卟啉络合物部分存在于类脂质体的表面或脂质等的亲水部，表面活性剂的烷基侧链埋入脂质的疏水部。
另外，已知，类脂质体的粒径小于等于100nm，特别是可制成直径小于等于30nm的小胞体，其大小是当进入体内时可到达细胞的大小。
进而，如后所述，进行Por包埋类脂质体的抗癌特性试验，结果表明，与施用作为所述类脂质体原料的单一的阳离子化金属卟啉络合物的情况相比，使用Por包埋类脂质体时的效果优异，该效果优于目前作为抗癌剂使用的顺铂或丝裂霉素C的效果。
另外，评价Por包埋类脂质体的SOD活性，结果可知，其显示出与作为该类脂质体原料的单一阳离子化金属卟啉络合物同等的SOD活性，并可形成血中滞留型的SOD化合物。
如上所述，本发明的Por包埋类脂质体由于具有优异的抗癌作用，所以在癌症治疗领域可以用作抗癌剂。
因此，通过直接给药、静脉给药、皮下给药等，将该Por包埋类脂质体施用至癌症患者，可以治疗该患者的癌症。
同样，本发明的Por包埋类脂质体具有优异的抗氧化作用，可以使生物体免受活性氧对生物体内的危害，例如炎症疾病、神经疾病、动脉硬化、糖尿病。
因此，通过直接给药、静脉给药、皮下给药等，将本发明的Por包埋类脂质体施用至炎症疾病、神经疾病、动脉硬化或糖尿病的患者，可以治疗这样的患者的癌症。
实施例以下示出实施例和试验例，更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何制约。
实施例1铁[5，10，15，20-四(2-甲基吡啶基)卟啉](FeT2MPyP)的合成(1)将500ml丙酸搅拌-加热到110℃，然后，加入15ml(0.158mol)2-吡啶基甲醛。其后，用注射器缓缓地滴加12ml(0.173mol)吡咯，于110℃回流1小时，进行环化缩合。反应后，放冷至室温，蒸馏除去溶剂。中和、洗涤，并进行柱色谱层析(氧化铝basic type I、氯仿)，得到产物5，10，15，20-四(2-吡啶基)卟啉(产量1.1g、收率4.4％)。
1H-NMR δH(CDCl3、ppm)-2.82(吡咯NH的H，2H)、7.72～9.14(吡啶的H，16H)、8.87(吡咯的H，8H)UV-vis λmax(氯仿、nm)418、513、544、586、645
FAB-Mass(m/z)619、620(2)其次，在氩(Ar)氛围气下，在150ml二甲基甲酰胺中加入0.2g(3.2×10-4mol)上述(1)得到的5，10，15，20-四(2-吡啶基)卟啉，使其溶解，进而加入由0.2g铁和5ml 48％氢溴酸得到的溴化铁(FeBr2)，回流4小时。反应后，放冷到室温，蒸馏除去溶剂。
进行水/氯仿的分液操作和柱色谱层析(氧化铝basic type I、甲醇)，得到前体铁[5，10，15，20-四(2-吡啶基)卟啉](产量0.21g、收率94％)。
UV-visλmax(甲醇、nm)408、512、566FAB-Mass(m/z)672(3)在30ml二甲基甲酰胺中加入0.1g上述(2)得到的铁[5，10，15，20-四(2-吡啶基)卟啉]和6ml对甲苯磺酸甲酯，于130℃回流5小时。回流后，放冷到室温，蒸馏除去溶剂。萃取，并进行柱色谱层析(氧化铝basic typeI、甲醇)，得到目的物质FeT2MPyP(收率91％)。
UV-visλmax(水、nm)408、584元素分析(％)Found.C75.11、H3.97、N17.66、C/N4.25Calcd.C77.58、H4.24、N18.12、C/N4.28(4)工序(1)中的2-吡啶基甲醛变换为4-吡啶基甲醛，除此之外，与上述工序(1)～工序(3)相同，得到铁[5，10，15，20-四(4-甲基吡啶基)卟啉](FeMT4MPyP)。其它的金属[5，10，15，20-四(2-甲基吡啶基)卟啉](MT2MPyP)和其它的金属[5，10，15，20-四(4-甲基吡啶基)卟啉](MT4MPyP)也可以基于上述方法合成。
实施例2锰[5，10，15，20-四(2-甲基吡啶基)卟啉](MnT2MPyP)的合成(1)将500ml丙酸加热到110℃，缓缓地加入15ml 2-吡啶基甲醛，其后缓缓地加入12ml吡咯，全部加完后回流1小时。反应后，进行放冷、蒸发、中和以及洗涤。其后，通过柱色谱层析(碱性氧化铝、氯仿)等精制，得到紫色结晶5，10，15，20-四(2-吡啶基)卟啉(产量1.68g、收率7.08％)。
1H-NMR δH(CDCl3、ppm)-2.8(吡咯NH的H，2H)、7.7(吡啶的H(4位)，4H)、8.1(吡啶的H(5位)，4H)、8.2(吡啶的H(6位)，4H)、9.2(吡啶的H(4位)，4H)、8.8(吡咯的H，8H)UV-visλmax(氯仿，nm)418、513、544、586、645FAB-Mass(m/z)619、620(2)其次，对200ml含有500mg上述(1)得到的5，10，15，20-四(2-吡啶基)卟啉的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，进行氩(Ar)置换，然后加入1.98g乙酸锰·四水和物，Ar氛围气下回流3小时。反应后，进行放冷、蒸发、水/氯仿的分液操作、减压干燥，得到锰[5，10，15，20-四(2-吡啶基)卟啉](产量409mg、收率75.2％)。
UV-visλmax(氯仿、nm)461、555FAB-Mass(m/z)672(3)其后，使200mg上述锰[5，10，15，20-四(4-吡啶基)卟啉]和12ml对甲苯磺酸甲酯反应(130℃、8小时)。反应后，放冷，进行水/氯仿的分液操作，进而进行柱色谱层析[(1)酸性氧化铝和(2)碱性氧化铝、甲醇]，得到目的物质MnT2MPyP(产量153mg)。
UV-visλmax(水、nm)456、555(4)工序(1)中的2-吡啶基甲醛变换为4-吡啶基甲醛，除此之外，与上述工序(1)至工序(3)相同，得到锰[5，10，15，20-四(4-甲基吡啶基)卟啉](MnT4MPyP)。其它的金属[5，10，15，20-四(2-甲基吡啶基)卟啉](MT2MPyP)和其它的金属[5，10，15，20-四(4-甲基吡啶基)卟啉](MT4MPyP)也可以采用与上述相同的方法合成。
实施例3Por包埋类脂质体的合成(1)(1)取作为阳离子化金属卟啉络合物的1.4mg(1μmol)实施例1得到的FeT2MPyP和作为表面活性剂的0.3mg(1μmol)SAS，置于试管中，在其中加入10ml作为溶剂的甲醇，混合，调制成离子络合物1(FeT2MPyP/1SAS)。
另外，使用1.2mg(4μmol)SAS和1.2mg(4μmol)OAS来代替上述的1μmol SAS，分别得到离子络合物2(FeT2MPyP/4SAS)和离子络合物3(FeT2MPyP/4OAS)。
同样地，作为阳离子化金属卟啉络合物，使用MnT2MPyP、MnT4MPyP、FeT2MPyP+MnT2MPyP(0.5μmol∶0.5μmol)以及FeT4MPyP+MnT4MPyP(0.5μmol∶0.5μmol)，作为表面活性剂使用SAS、OAS，调制成表1所示的离子络合物4～9。
表1

(2)其次，在试管中放入上述离子络合物1(1μmol)和作为类脂质体形成用物质的0.131g(100μmol)Tween-61以及0.0386g(100μmol)胆甾醇，作为溶剂使用少量氯仿，进行混合。蒸馏除去溶剂以形成薄膜，然后在其中加入10ml生理盐水，进行超声处理(Ar下、冰浴中、30W、3min、探针(プロ一ブ)型超声照射装置)。超声处理后，静置(60℃、30min)并进行过滤灭菌(0.22μm)，得到Por包埋类脂质体(FeT2MPyP/1SAS包埋TW61-Chol类脂质体；本发明品1)。
(3)使用离子络合物2(1μmol)，与上述(2)同样地得到Por包埋类脂质体(FeT2MPyP/4SAS包埋TW61-Chol类脂质体(本发明品2)。另外，使用离子络合物1、2、4～6，与上述同样地得到表2所示的Por包埋类脂质体(本发明品3至8)。
表2

实施例4Por包埋类脂质体的合成(2)称取表1的离子络合物2(0.5μmol)和作为类脂质体形成用物质的0.54g(50μmol)普朗尼克(Pluronic)F-88以及0.0154g(40μmol)胆甾醇，置于试管中，向其中加入作为溶剂的少量氯仿(约3ml)。蒸馏除去溶剂以形成薄膜，然后加入10ml生理盐水，进行超声处理(冰浴中、30W、30min、探针型超声照射装置)。超声处理后，静置(50℃、30min)并进行过滤灭菌(0.22μm)，得到Por包埋类脂质体(FeT2MPyP/4SAS包埋F88-Chol类脂质体；本发明品9)。
实施例5
Por包埋类脂质体的动态光散射测定(之一)进行动态光散射测定(Nicomp 370、Particle Sizing System)，以测定Por包埋类脂质体的粒径和粒径分布。基于实施例3而合成的FeT2MPyP/1SAS包埋TW61-chol类脂质体(本发明品1)和FeT2MPyP/4SAS包埋TW61-chol类脂质体(本发明品2)的动态光散射测定结果示于表3。
表3

根据其结果，对于数量分布，平均粒径28.5nm的类脂质体存在90％，平均粒径146nm的类脂质体存在10％。该结果与TEM观察的结果对应。根据表4可知，任何Por包埋类脂质体的平均粒径都小于等于100nm，施用至体内时，Por包埋类脂质体可以穿过毛细血管内皮到达目的细胞。
实施例6Por包埋类脂质体的动态光散射测定(之二)与实施例6同样，进行MnT2MPyP/1SAS包埋TW61-chol类脂质体(本发明品5)的动态光散射测定，其结果，类脂质体的平均粒径为28.5nm(分布比例为90％，余量的是平均粒径146nm的类脂质体，其占10％左右)、MnT2MPyP/4SAS包埋TW61-chol类脂质体(本发明品6)的平均粒径为28.5nm(分布比例为90％，余量的是平均粒径146nm的类脂质体，其占10％左右)，所以平均粒径小于等于100nm，其大小即使在施用至生物体内时也不会产生问题。
实施例7Por包埋类脂质体的荧光光谱测定
(1)进行Por包埋类脂质体的荧光光谱测定(岛津制作所、RF-5300PC)，以评价在Por包埋类脂质体中所包埋的卟啉络合物存在于类脂质体内的哪个位置。
在该测定中，由于金属卟啉络合物一般会使荧光消光，所以代替金属卟啉络合物使用没有进行金属插入的不含阳离子化金属的卟啉络合物(以下称为“不含金属的络合物”)，其是基于实施例1、2等合成的，将其作为荧光探针。另外，包埋有不含金属的络合物的类脂质体的合成基于实施例3进行。(以下，对于不含金属的络合物的缩写，替换M，将阳离子化金属卟啉络合物缩写中的M换为H2来表示。例如，金属[5，10，15，20-四(2-甲基吡啶基)卟啉](MT2MPyP)的不含金属的络合物表示为H2T2MPyP，金属[5，10，15，20-四(4-甲基吡啶基)卟啉](MT4MPyP)的不含金属的络合物表示为H2T4MPyP。)如上所述，所调制的包埋有不含阳离子化金属的络合物的类脂质体，例如对含有包埋有H2T2MPyP/4SAS的TW61-chol类脂质体和含有H2T2MPyP/4SAS的各种溶液进行H2T2MPyP的荧光光谱测定(测定波长的范围为500nm～800nm)，包埋有H2T2MPyP/4SAS的TW61-chol类脂质体水溶液的荧光光谱中，在645nm具有波峰。
该荧光峰波长处于在水中的和甲醇中的H2T2MPyP的荧光波长的中间(荧光峰波长(短波长侧)水＜包埋类脂质体溶液＜甲醇(长波长侧))。
另外，各种溶剂中的H2T2MPyP的荧光光谱的波峰例如为甲醇(642nm)、乙醇(643nm)、2-丙醇(645nm)、正丁醇(645nm)、乙二醇(642nm)，该H2T2MPyP在上述各种溶剂中的荧光光谱具有与上述相同的光谱波形。但是，水中的H2T2MPyP的荧光光谱的峰变宽，強度也大大降低，甚至峰值位移到短波长(630nm)。由此，认为类脂质体中包埋的H2T2MPyP存在于双分子膜的亲水部附近，其为与上述醇类类似的极性环境，即较水环境稍稍偏向非极性的(稍稍疏水的)环境。另外，包埋有H2T2MPyP/1SAS的TW61-chol类脂质体的结果也相同。
(2)其次，使用荧光探针8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)，进行荧光光谱测定，该物质存在于类脂质体双分子膜的亲水部附近成为双分子膜的极性、流动性等的指标。首先，甲醇、甲醇/氯仿以及包埋有ANS的TW61类脂质体(没有包埋卟啉络合物)溶液中的ANS的荧光光谱均为在485nm(激发波长385nm)显示波峰的类似的谱图。然后，测定一同包埋有卟啉络合物和ANS的TW61类脂质体溶液中的ANS的荧光光谱，其中，在450nm和500nm显示2个波峰，而不是在485nm显示波峰，这2个峰的荧光强度也较485nm峰的荧光强度低。根据在其附近存在卟啉络合物的Soret带的吸收峰，可以认为ANS和卟啉络合物产生了相互作用，认为卟啉络合物存在于ANS近傍。由此，认为类脂质体中包埋的H2T2MPyP存在于与上述的醇类类似的极性环境中，存在于双分子膜的亲水部附近。
另外，对于一起包埋有作为荧光探针的存在于双分子膜内部(疏水部)的1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)和卟啉络合物的类脂质体，在卟啉络合物的Soret带、以及DPH的峰410nm、434nm和457nm处，没有观察到峰值减小，由此可知，DPH和卟啉络合物相互之间没有发生作用，卟啉络合物并不存在于DPH近傍。借此，认为类脂质体中包埋的H2T2MPyP存在于与上述的醇类类似的极性环境，存在于双分子膜的亲水部附近。
实施例8Por包埋类脂质体的荧光消偏振测定作为荧光探针，使用存在于双分子膜亲水部近傍的1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH、1μM)，对包埋有金属卟啉络合物的类脂质体进行荧光消偏振测定(岛津制作所、RF-5300PC以及RF-540/5000用偏振光测定附属装置、测定温度的范围5℃～60℃、激发波长361nm、荧光波长428nm)。例如，对含有DPH的TW61-chol类脂质体(空白)进行荧光消偏振测定，其温度-偏光度的关系(逆S型曲线)中，在TW61-chol类脂质体双分子膜的相变温度(Tc＝36℃)附近可以看到荧光偏光度减少。对含有DPH的包埋有FeT2MPyP/1SAS的TW61-chol类脂质体进行荧光消偏振测定，其温度-偏光度的关系中，在Tc(＝37℃)附近可以看到荧光偏光度减少，这与上述空白相同，但是在凝胶状态下偏光度呈现较大值。这是基于FeT2MPyP/1SAS与Tween-61和胆甾醇的相互作用，其证明了FeT2MPyP/1SAS存在于Tween-61和胆甾醇形成的类脂质体双分子膜中。
另外，对含有DPH的包埋有MnT2MPyP/1SAS的类脂质体进行荧光消偏振测定，其温度-偏光度关系中，与上述空白相比相变温度稍稍向高温侧偏移，纵轴的偏光度也在凝胶区域增加。这些也是基于MnT2MPyP/1SAS与Tween-61和胆甾醇的相互作用，证明了MnT2MPyP/1SAS存在于Tween-61和胆甾醇形成的类脂质体双分子膜中。
实施例9Por包埋类脂质体的抗癌特性试验通过使用Alamar Blue法的杀死细胞试验(细胞死亡试验)来研究本发明的Por包埋类脂质体的抗癌特性。
本试验的试验样品使用各种Por包埋类脂质体(金属卟啉络合物浓度0μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)，对照样品使用作为上述Por包埋类脂质体的成分的金属卟啉络合物(浓度0μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)和类脂质体(浓度2500μM、5000μM、10000μM、20000μM)。(均与Por包埋类脂质体的浓度对应。)比较样品使用目前使用的抗癌剂顺铂(CDDP、浓度0μM、10μM、20μM、40μM、80μM)和丝裂霉素C(MCC、浓度0μM、7.5μM、15μM、30μM、60μM)等，细胞使用小鼠肺癌细胞[Lewis Lung Carcinoma(LLC)、理研ジ一ンバンク]。
具体试验方如下。即，用加有10％FBS的DMEM培养基培养细胞，进行细胞计数和细胞浓度调制，得到细胞悬液(100μl/well、细胞数1×104cell/well)。将该细胞悬液加到96孔板的各孔中，在二氧化碳(CO2)培养箱(CO25％)内培养24小时。除去培养板孔内的培养基后，添加预先调制的各浓度的样品溶液(100μl/well、药剂浓度0～100μM)，再在CO2培养箱内培养24小时。添加已过滤灭菌的alamar bule溶液(10μl/well)，再培养5小时。然后，使用酶标仪(microplate reader)，进行吸光度测定(测定波长570nm，参照波长600nm)。
使用包埋有FeT2MPyP的普朗尼克F-88类脂质体(本发明品9)作为Por包埋类脂质体时的结果示于图1。由该结果可见，样品添加浓度增大的同时LLC的细胞存活率降低，显示出有效的抗癌特性。特别是FeT2MPyP浓度大于等于25μM的离子络合物FeT2MPyP/4SAS的LLC细胞存活率比CDDP和MMC的LLC细胞存活率稍低。进而，可见，包埋有FeT2MPyP/4SAS的F88-Chol类脂质体的添加浓度增大的同时LLC细胞存活率降低，添加浓度为50μM时细胞存活率小于等于10％，较目前所使用的CDDP和MMC显示出更优异的抗癌特性。
另外，作为Por包埋类脂质体的FeT2MPyP/1SAS包埋TW61-chol类脂质体(本发明品1)和FeT2MPyP/4SAS包埋TW61-chol类脂质体(本发明品2)也较目前所使用的CDDP和MMC显示出更优异的抗癌特性(例如，添加浓度为50μM时，抗癌特性依如下顺序增加目前所使用的抗癌剂＜离子络合物＜阳离子化金属卟啉络合物＜包埋有金属卟啉络合物的类脂质体)。借此，可以说包埋有金属卟啉络合物的类脂质体是优异的抗癌剂。
实施例10金属卟啉络合物与过氧化氢(H2O2)的相互作用据报道，一般在大量过剩的过氧化氢(H2O2)的存在下，低分子的金属卟啉络合物由于卟啉环露出而与H2O2高频率地相互作用，从而易于分解[R.F.Pasternack and B.Halliwell，J.Am.Chem.Soc.，101，1026(1979)]。此处，通过UV-可见光测定，来研究低分子类的MnT2MPyP、类脂质体(高分子)类的MnT2MPyP/1SAS包埋TW61-chol类脂质体(本发明品5)、MnT2MPyP/4SAS包埋TW61-chol类脂质体(本发明品6)与H2O2的相互作用。即，基于与各浓度H2O2的相互作用以及由相互作用所致的分解，卟啉络合物出现Soret带吸收峰(456nm)，测定该吸收峰的衰减曲线，并由该衰减曲线算出反应速度常数(kH2O2)，根据由此算出的半衰期(t1/2)来进行评价。另外，一同示出了作为参考的铜/锌超氧化歧化酶(Cu/Zn-SOD)的结果。样品的调制基于实施例2进行，H2O2浓度为1.2mM、2.0mM、3.0mM、30mM，金属卟啉络合物浓度为5μM。这些结果示于表4。
表4

由该结果可知，t1/2依如下顺序增加Cu/Zn-SOD＜MnT2MPyP＜MnT2MPyP/4SAS包埋TW61-chol类脂质体＜MnT2MPyP/1SAS包埋TW61-chol类脂质体。其原因认为是，MnT2MPyP为低分子类物质，卟啉环露出而与H2O2高频率地相互作用，因此易于分解；与之相对，MnTM2PyP包埋TW61-chol类脂质体为高分子类物质，卟啉环没有露出，不能与H2O2高频率地相互作用，因此难以分解。该结果与实施例7的荧光光谱测定的结果对应。另外，MnT2MPyP/1SAS包埋TW61-chol类脂质体的t1/2比Cu/Zn-SOD的t1/2大，MnT2MPyP/1SAS包埋TW61-chol类脂质体显示出比Cu/Zn-SOD高的H2O2耐受性。
实施例11Por包埋类脂质体的SOD活性评价(之一)通过Mccord、Fridovich等和Butler等的细胞色素c法来评价Por包埋类脂质体的SOD活性(即O2-·清除活性)[(1)J.M.Mccord and I.Fridovich，J.Biol.Chem.，244，6049(1969)和(2)J.Butler，W.H.Kopenol，E.Margoliash，J.Biol.Chem.，257，10747(1982)]。具体如下进行。按金属卟啉浓度调整不少于5个水平的0～1000μM的Por包埋类脂质体溶液(A溶液)。然后，取0.3mM黄嘌呤水溶液、60μM细胞色素c水溶液和30mM磷酸缓冲水溶液(pH7.8)各20ml，进而加入24ml纯水，得到混合溶液(B溶液)。在2.1ml该B溶液中加入0.3ml A溶液和0.2ml纯水，放置(25℃、10min)。在放置后的混合溶液中，立刻混入0.1ml的7μg/ml过氧化氢酶水溶液、5μl的25U/ml黄嘌呤氧化酶(XOD)水溶液，在550nm(基于亚铁细胞色素c生成的吸收峰)进行UV-可见光(UV-vis)下的随时间变化的测定(最终的试验溶液的各成分浓度是金属卟啉络合物0～100μM、黄嘌呤0.05mM、XOD 2.5U/ml、细胞色素c 10μM以及过氧化氢酶0.23μg/ml)。另外，对不添加Por包埋类脂质体的溶液(空白)进行同样的测定。
UV-可见光下的随时间的变化的测定中，通过“时间-550nm的吸光度”的关系求出未添加Por包埋类脂质体的体系和添加Por包埋类脂质体的体系的亚铁细胞色素c的生成速度(vi和vo)，进而，由下式计算出抑制系数(IC，inhibition coefficient)，最后，通过“金属卟啉络合物浓度-IC”的关系求出IC＝50％时金属卟啉的浓度(IC50)，以此作为SOD活性的指标(IC50越小，类脂质体显示的SOD活性越大)。另外，作为对比，对MnT4MPyP等也做同样的SOD活性评价。
抑制系数(IC)＝1-(vi/vo)vo未添加Por包埋类脂质体的体系的亚铁细胞色素c的生成速度vi添加Por包埋类脂质体的体系的亚铁细胞色素c的生成速度表5中示出了各种金属卟啉络合物体系的IC50。另外，MnT4MPyP的IC50以Fridovich等的文献值表示[I.Batinic-Haberle，L. Benov，and I.Fridovich，J.Biol.Chem.，273，24251(1998)]。
表5

*1I.Batinic-Haberle，L.Benov，and I.Fridovich，J.Biol.Chem.，273，24251(1998)由该结果明显可知，MnT2MPyP/1SAS包埋TW61-chol类脂质体和MnT2MPyP/4SAS包埋TW61-chol类脂质体的IC50与低分子体系[MnT2MPyP(文献值)]的IC50类似，显示出有效的SOD活性。
实施例12Por包埋类脂质体的SOD活性评价(之二)通过Riley等的止流法(stopped flow method)来评价Por包埋类脂质体的SOD活性(即O2-·清除活性)[D.P. Riley，W.L.Rivers，and R.H.Weiss，Anal.Biochem.，196，344(1991)]。具体如下进行。在36℃，将含有作为O2-·发生源的过氧化钾的二甲基亚砜溶液和含有各种浓度的Por包埋类脂质体的60mM HEPES/HEPESNa缓冲溶液(pH8.1)急速混合，测定基于O2-·的245nm的吸光度随时间的衰减(O2-·消失反应的衰减曲线)。通过该衰减曲线，求出“ln(吸光度)-时间”的关系，进而由该关系的斜率计算出表观速度常数。最后，由“金属卟啉络合物浓度-表观速度常数”关系的斜率，求出O2-·消失反应的速度定数(kcat)。
表6中示出了各种金属卟啉络合物体系的kcat。另外，MnT4MPyP的kcat以Ohse、Kawakami等的文献值表示[T.Ohse，S.Nagaoka，Y. Arakawa，H.Kawakami，and K.Nakamura，J.Inorg.Biochem.，85，201(2001)]。
表6

*2T.Ohse，S.Nagaoka，Y. Arakawa，H.Kawakami，and K.Nakamura，J.Inorg.Biochem.，85，201(2001)由该结果可知，MnT2MPyP/1SAS包埋TW61-chol类脂质体和MnT2MPyP/4SAS包埋TW61-chol类脂质体的kcat与低分子体系[MnT2MPyP(文献值)]的kcat接近，显示出有效的SOD活性。
产业上的可利用性本发明的Por包埋类脂质体以过氧化阴离子自由基(O2-·)为靶向，可以确实使其减少。
因此，可以使癌细胞中的O2-·减少，发挥治愈癌症的优异效果，并且其效果是选择性的，所以可用作无副作用的新抗癌剂。
另外，本发明的Por包埋类脂质体具有SOD活性，并且作为可在血液中滞留的抗氧化剂具有优异的效果，所以可以保护生物体免受由活性氧产生的生物体内障碍。
权利要求
1.包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其含有阳离子化金属卟啉络合物和类脂质体形成用物质。
2.如权利要求1所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其中，阳离子化金属卟啉络合物与阴离子型表面活性剂形成离子络合物，以离子络合物的形式存在。
3.如权利要求1或2所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其中，类脂质体形成用物质是非离子型表面活性剂、或非离子型表面活性剂与胆甾醇类或者三酰基甘油的混合物。
4.如权利要求1～3任一项所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其是粒径小于等于100nm的小胞体。
5.如权利要求1～4任一项所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其中，所述阳离子化金属卟啉络合物是下式(I)、(II)或(III)表示的物质 式中，R1至R4中的至少一个表示选自N-低级烷基吡啶基、低级烷基铵苯基、N-低级烷基咪唑基中的基团，R11至R16以及R21至R26表示低级烷基或低级烷氧基，R17和R18表示选自N-低级烷基吡啶基、低级烷基铵苯基、N-低级烷基咪唑基中的基团，R27至R28表示N-烷基铵基。
6.如权利要求1～5任一项所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其特征为，所述阳离子化金属卟啉络合物是金属[5，10，15，20-四(2-甲基吡啶基)卟啉](MT2MPyP)、金属[5，10，15，20-四(4-甲基吡啶基)卟啉](MT4MPyP)或金属[[1，3，5，8-四甲基-2，4-二乙烯基-6，7-二(4-甲基吡啶基酰胺基乙基)]卟啉](MPPIX-DMPyAm)中的1种或2种以上，该络合物的金属部分(M)为铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、铜(Cu)、钼(Mo)、铬(Cr)或铱(Ir)。
7.如权利要求3所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其中，非离子型表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯或聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物中的1种或2种以上。
8.如权利要求3所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其中，非离子型表面活性剂是Tween-61、Tween-80、Span80或普朗尼克F-88中的1种或2种以上。
9.如权利要求3所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其中，胆甾醇类是胆甾醇、α-胆甾烷醇、β-胆甾烷醇、胆甾烷、链甾醇(5，24-胆甾二烯-3β-醇)、胆酸钠或胆钙化甾醇。
10.如权利要求2所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体，其中，与阳离子化金属卟啉络合物形成离子络合物的阴离子型表面活性剂是月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、十二烷基硫酸、十四烷基硫酸、十六烷基硫酸或十八烷基硫酸或它们的盐。
11.包埋有金属卟啉络合物的类脂质体的制造方法，其特征为，将阳离子化金属卟啉络合物和类脂质体形成用物质混合，接着，在介质中对该混合物进行超声处理。
12.包埋有金属卟啉络合物的类脂质体的制造方法，其特征为，使阳离子化金属卟啉络合物和阴离子型表面活性剂反应，形成离子络合物，接着，将该离子络合物和类脂质体形成用物质混合，进而，在介质中对该混合物进行超声处理。
13.一种药物，其含有权利要求1～9任一项所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体作为有效成分。
14.如权利要求13所述的药物，其是抗癌剂。
15.如权利要求14所述的药物，其是抗氧化剂。
16.如权利要求13所述的药物，其是炎症疾病、神经疾病、动脉硬化或糖尿病的治疗用药剂。
17.癌症的治疗方法，其特征为，将权利要求1～9任一项所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体施用至癌症患者。
18.如权利要求17所述的治疗方法，其是直接施用、静脉施用或皮下施用。
19.炎症疾病、神经疾病、动脉硬化或糖尿病的治疗方法，其特征为，将权利要求1～9任一项所述的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体施用至炎症疾病、神经疾病、动脉硬化或糖尿病的患者。
全文摘要
本发明涉及包埋有金属卟啉络合物的类脂质体、其制造方法以及利用该类脂质体的药物。所述包埋有金属卟啉络合物的类脂质体含有阳离子化金属卟啉络合物和类脂质体形成用物质。本发明的包埋有金属卟啉络合物的类脂质体具有SOD活性，以过氧化阴离子自由基(O
文档编号A61P3/00GK1942184SQ20048004291
公开日2007年4月4日 申请日期2004年3月4日 优先权日2004年3月4日
发明者汤浅真, 小柳津研一, 山口有朋, 羽生幸弘, 笠原一训, 小室雅廉 申请人:汤浅真