一种治疗肝炎和糖尿病的药物组合物的制作方法

专利名称：一种治疗肝炎和糖尿病的药物组合物的制作方法
背景技术：
本发明属植物药领域，涉及一种獐牙菜有效组分的制备方法及其在制药中的应用。
獐牙菜属植物在我国有70多种，其中20多种在民间被用于治疗肝胆疾病或其它炎症(《中国中药资源志要》，科学出版社，1974年，957页)，已被商业开发的植物品种很少，目前仅青叶胆被国家标准收载(《中国药典》2000版一部第155页)，另有獐牙菜、大籽獐牙菜、西南獐牙菜等品种曾被列入地方药材标准(黔D/WS-208-88)，来源于这些獐牙菜属植物的药材或成药是现有肝炎药中颇具特色的一类，疗效确切，副作用轻微，受到患者青睐。有报道对该属植物进行了药效学实验研究，进一步证实提取物具有保肝作用，如中药新药与临床药理，2003，14(5)304；中药新药与临床药理，2002，13(6)376。
獐牙菜属植物具有明显的化学分类学特征，普遍含有齐墩果酸、酮、黄酮、环烯醚萜苷等类型成分[西北植物学报，2003，23(12)2235]，有资料认为齐墩果酸和环烯醚萜苷是其活性成分，并已开发了齐墩果酸片、獐牙菜苦苷片、青叶胆总苷片(肝复康片)投放市场，用于肝炎或小儿腹痛的治疗。近年，也有文献报道，该属植物提取物和齐墩果酸对实验性糖尿病具有一定的作用[中国医药科技，2003，10(2)96；云南化工，2000，27(4)29；中国中药杂志，2002，27(12)884]，但未见药品上市或临床应用。许多化学研究文献已经明确揭示，獐牙菜属植物的化学成分具有多样性，组成十分复杂，值得注意的是，究竟何种有效成分在獐牙菜的抗肝炎和降血糖活性中起决定性作用，现有技术并没有明确的教导，更没有为有效地提取活性成分提供科学的依据。

发明内容
本发明的主要目的就是要进一步阐明獐牙菜类植物的药效物质，研制新的獐牙菜类药物，为工业化开发这一植物资源奠定技术基础。
本发明人通过大量创造性科研工作，首次将獐牙菜的保肝利胆活性成分从纷繁复杂的众多结构类型中锁定为主要含总酮和齐墩果酸的有效部位，针对该目标物专门设计了两条提取工艺路线，并首次发现了该组合物在糖尿病治疗方面的应用价值。进一步的活性筛选发现，所述总酮中又以龙胆酮酚的保肝和降糖作用最为关键，并与齐墩果酸之间存在着协同关系。
本发明的技术路线之一如附

图1-a所示，具体操作为取秋冬季节采集的獐牙菜属干燥全草，粉碎成粗粉，用低级醇或其它极性～中等极性有机溶剂(例如酒精、甲醇、丙酮或醋酸乙酯，优选60％～95％酒精)提取2～5次，合并提取液，浓缩，所得浸膏加约10倍量水搅拌，滤取不溶物，水洗，干燥，研细，脱脂(例如采用石油醚、汽油回流)，抽干，挥尽残留溶剂，即得。
本发明的技术路线之二如附图1-b所示，具体操作为取秋冬季节采集的獐牙菜属干燥全草，粉碎成粗粉，用碱水溶液(例如0.2％NaOH、1％Na2CO3、2％NaHCO3)提取，合并提取液，加入稀盐酸或稀硫酸使酸化至pH值3左右，滤集析出物，水洗至中性，干燥，即得。
上述两种方法得到的提取物具有相似的生物活性和理化性质，均为黄棕色粉末，味极苦，难溶于水(溶解度＜0.1％)，不易吸潮，化学性质稳定，可方便地通过现有技术制成片剂、胶囊、滴丸、颗粒剂等各种口服制剂。
本提取物所含成分具有酚羟基或羧基官能团，表现一定的酸性。有利的是，为提高其水溶性，可以通过与氢氧化钠溶液成盐促使其溶解，溶液滤过后，再经冷冻干燥或喷雾干燥得其钠盐，其外观性状也是黄棕色粉末，水溶性好，尤其适合制成注射用水针或粉针。
本发明方法与民间传统的水煎法有本质的不同。后者使用常水进行煎煮，提出物主要是水溶性成分，如环烯醚萜甙类、糖类、无机盐，杂质很多，而水溶性极低的酮类和齐墩果酸很少；本发明方法以獐牙菜中的酮类和齐墩果酸为提取精制对象，采用有机溶剂或碱水进行提取，充分地将目标物提取出来，又进一步除去水溶性成分及油脂类杂质，使服药量大幅度降低，提高了用药的有效性、安全性和可控性，所得有效组分动物模型上口服给药30mg/kg(相当于1～2g生药/kg)即可产生明显药效，而文献报道使用紫红獐牙菜总提物给药的有效剂量是7g生药/kg[中药新药与临床药理，2002，13(6)376]，是本发明组合物的三倍以上。
本发明方法路线短，操作简单，无需特殊设备，因此易于工业化。更重要的是，按照本方法制备的组合物是一种纯度高、质量可控、满足现代新药技术要求的植物药有效部位，可控物质含量达到50％以上，可作为原料药直接用于制备各种药剂。
本发明药物组合物的特征在于，它是以酮、齐墩果酸或二者的钠盐为主要活性物质；酮与齐墩果酸的重量比例为0.1～10∶1，优选1～4∶1。獐牙菜属植物中的酮类成分有多种，因产地、采收季节、生态环境的不同，具体数目和含量可能会有一定程度的波动和变化。上述配比所指酮实际包括多种酮类成分，或称总酮。本发明有效组分中的总酮具有显著的化学特征，龙胆酮酚是其主要活性成分，含量不低于1％(重量)，例如5％-80％，优选为8％～16％；还可进一步含有芒果苷、当药宁、当药苷、甲基当药宁、1，3，5，8-四羟基酮、1-羟基-2，3，5-三甲氧基酮、1-羟基-2，3，5，7-四甲氧基酮、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮、1-羟基-2，3，4，5-四甲氧基酮、1-羟基-3，7，8-三甲氧基酮、1，7-二羟基-3，4，8-三甲氧基酮等类似物，其含量为5％-85％(重量)，优选为20-60％。本发明有效组分的化学结构见附图-2。
本发明人以紫红獐牙菜(Swertia punicea Hemsl)、抱茎獐牙菜(S.franchetianaH Smith)、贵州獐牙菜(S.kauitchensis)为原料，在中试条件下对本发明制备方法进行了放大试验，试验数据见表-1。
表-1.提取中试实验结果


本发明制备工艺经反复试验证明，药物组合物的得率稳定在1.5％～3.5％，其中龙胆酮酚含量均大于2％，总酮与齐墩果酸的比例在0.1～10∶1范围内，多数集中在1～4∶1，二者含量之和均大于50％。紫红獐牙菜提取物的龙胆酮酚含量较高，因此，紫红獐牙菜是提取本发明药物组合物的优选药材品种。
为证实本发明工艺的先进性，本发明人按现有技术以水和80％酒精为溶剂，分别对同一批紫红獐牙菜药材进行加热提取，制备了粗提物，并测定了其中齐墩果酸、龙胆酮酚和总酮的含量，结果见下表。
表-2.不同方法提取物比较

上述实验表明，按现有技术所得紫红獐牙菜水提物和醇提物中，齐墩果酸与总酮含量之和分别是4.8％和12.9％，可控比例偏低，提取物中含大量吸湿性杂质，不适合作为原料药；而本发明工艺所得提取物中齐墩果酸与总酮含量之和高达57.7％，提取物基本不吸潮，适于制剂生产。
本发明药物组合物化学性质稳定，高温加速试验显示，本品在50℃恒温恒湿条件下放置3个月，其外观性状和理化性质无任何变化；总酮、齐墩果酸、龙胆酮酚等含量亦无明显下降(降幅＜1.0％)。值得注意的是，现有獐牙菜类药物青叶胆总苷的稳定性较差，在50℃恒温恒湿条件下放置3个月，不仅外观吸潮变色，更严重的是，主成分獐牙菜苦苷的含量由25％降至8％，下降幅度高达68％，超过了10％的变质限度。相比之下，本发明组合物的稳定性优势十分突出。
在本发明一个实施方案中，提供用于治疗或预防肝炎、糖尿病或其并发症的药物组合物，其中含有上述提取物(即有效部位)和适宜药用赋形剂，所述有效部位包括总酮、齐墩果酸或二者的钠盐为活性物质。所述总酮含有龙胆酮酚，还可以进一步含有芒果苷、当药宁、当药苷、甲基当药宁、1，3，5，8-四羟基酮和1-羟基-2，3，5-三甲氧基酮、1-羟基-2，3，5，7-四甲氧基酮、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮、1-羟基-2，3，4，5-四甲氧基酮、1-羟基-3，7，8-三甲氧基酮、1，7-二羟基-3，4，8-三甲氧基酮等成分。本领域普通技术人员可以理解和实施的是，所述酮、齐墩果酸或二者的钠盐的来源并不局限于紫红獐牙菜、抱茎獐牙菜、贵州獐牙菜等獐牙菜属植物，还可采用龙胆科其它植物来源的高纯度提取物、单体或上述物质的化学合成物。
附图1为本发明药物组合物的两种制备方法流程图附图2为本发明药物组合物的分子结构图为了更充分地反映本发明的技术细节，下面提供实施例加以说明。
实施例1紫红獐牙菜有效组分的制备(方法一)取紫红獐牙菜全草25kg，粉碎，置不锈钢提取罐内，加入85％酒精热提3次，每次酒精用量以液面淹没并高出药材5～10cm左右为度，第一次回流2小时，第2、3次各回流1小时；合并酒精提取液，减压浓缩，得浸膏4.6kg，比重1.25；往浸膏中加入40kg水，充分搅拌，可见大量棕褐色沉淀析出；过滤，水洗沉淀，抽干，真空干燥，再研细，用6倍量石油醚分3次回流脱脂，滤集不溶部分，抽干，挥尽溶剂，得黄棕色粉末0.76kg，即为紫红獐牙菜有效组分，得率3.04％。
任选地，还可进一步加入5％氢氧化钠溶液约1L使溶解，调pH7.5～8.0，滤过，经喷雾干燥得其钠盐0.75kg。
实施例2紫红獐牙菜有效组分的制备(方法二)取紫红獐牙菜全草25kg，粉碎，置不锈钢提取罐内，加入0.2％NaOH，加热回流提取3次，合并碱水提取液，加入10％H2SO4至pH值2～3，滤集沉淀，水洗，干燥，得黄棕色粉末0.82kg，即为紫红獐牙菜有效组分，得率3.28％。
实施例3含量测定1.总酮含量测定精密称取实施例1所得紫红獐牙菜有效组分30mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取1ml溶液，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；照分光光度法，在333nm的波长处测定吸收度，按龙胆酮酚的吸收系数(E1cm1％)为330计算。该样品中总酮含量按龙胆酮酚(C14H10O6)计，实测结果为40.6％。
2.齐墩果酸含量测定精密称取实施例1所得紫红獐牙菜有效组分50mg和齐墩果酸对照品10mg，分别置25ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液和对照品溶液。照高效液相色谱法，精密吸取上述两种溶液10μl，分别注入液相色谱仪，测定齐墩果酸的峰面积，按外标法计算含量。色谱条件色谱柱EclipesXDB C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相CH3CN-CH3OH-H2O-醋酸铵(80∶10∶10∶0.5)；检测波长207nm；流速1ml/min；温度40℃。本供试品中齐墩果酸的实测含量为20.18％。
3.龙胆酮酚含量测定精密称取实施例1所得紫红獐牙菜有效组分50mg和龙胆酮酚对照品5mg，分别置25ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液和对照品溶液。照高效液相色谱法，精密吸取上述两种溶液10μl，分别注入液相色谱仪，测定龙胆酮酚的峰面积，按外标法计算含量。色谱条件色谱柱PuritexC18(4.6mm×200mm，5μm)；流动相CH3CN-H2O(8∶2)；检测波长330nm；流速1ml/min；温度40℃。本供试品中龙胆酮酚的实测含量为10.50％。
实施例4制剂1.胶囊 取实施例1所得提取物60g，加入淀粉78g、硬脂酸镁2g，混匀，直接用全自动胶囊填充机填充成1000粒，抛光即得。每粒含组合物60mg。成人口服每日1～5次，每次1～10粒。
2.片剂 取实施例2所得提取物60g，加入淀粉80g、糊精5g，混合均匀，加入10％淀粉浆制软材，用14目尼龙筛网制粒，60～70℃通风干燥，16目筛整粒，加硬脂酸镁1.5g、羧甲基淀粉钠5g混匀，压制成1000片，包衣即得。每片含组合物60mg。成人口服每日1～5次，每次1～10片。
3.软胶囊 取PEG400 276g，置适宜容器内，加入PEG6000 6g，水浴加热至PEG6000溶解，搅匀，加入甘油18g，加入含量为95％的市售齐墩果酸12g、得自龙胆科植物的含量为90％的龙胆酮酚30g和得自芒果叶的含量为95％的芒果苷18g，用胶体磨研磨成均匀膏体，转移至软胶囊机的贮料桶，用0.3ml的模具压制成软胶囊1000粒，定型，洗去表面润滑剂，于20~30％相对湿度、28℃条件下干燥，即得。成人口服每日1～5次，每次1～10粒。
4.滴丸 取实施例1所得提取物10g，投入32g加热熔融的聚乙二醇6000中，搅拌至溶解，转移至贮液瓶中，密闭并保温在80～90℃，调节滴丸机液滴定量阀门，由上往下滴入10～15℃的液状石蜡中，共制1000粒，将形成的滴丸沥干并擦除液状石蜡，干燥即得。每粒含组合物10mg。成人口服每日1～5次，每次6～60粒。
药效和毒性实验1.紫红獐牙菜有效组分对大鼠慢性四氯化碳肝损伤的保护作用取Wistar大鼠140只，体重170～200g，雌雄各半，随机分成七组，即空白对照组、四氯化碳模型组、齐墩果酸阳性对照组、紫红獐牙菜高剂量组、紫红獐牙菜中剂量组、紫红獐牙菜低剂量组和紫红獐牙菜酒精总提物组。除空白对照组外，其余各组皮下注射四氯化碳1.2ml/kg，每周2次，连续15周。第六周时从动物尾部取血，测定sGPT和sGOT，并解剖部分动物，观察肝纤维化程度。自注射四氯化碳第七周起，按齐墩果酸100mg/kg、紫红獐牙菜高剂量组120mg/kg、紫红獐牙菜中剂量组60mg/kg、紫红獐牙菜低剂量组30mg/kg、紫红獐牙菜酒精总提物组300mg/kg灌胃给药(用土温-80配制成混悬液)，每日一次，连续60天。末次给药后取血，测定sGPT、sGOT，并取肝脏做病理组织学检查，结果见表-3。
表-3.紫红獐牙菜有效组分对四氯化碳诱导慢性肝损伤大鼠的影响

*.各给药组的给药前、给药后测定数据与空白组和四氯化碳组分别相比，均有非常显著性差异，p＜0.001。
试验结果表明，大鼠皮下注射四氯化碳，至第六周时可明显损伤肝功能，使转氨酶升高，病理组织检查可见肝细胞变性坏死和纤维化。试验结束时，四氯化碳组sGPT和sGOT明显升高，肝硬化形成，而给药组用紫红獐牙菜有效部位治疗60天，各剂量组对四氯化碳诱发的转氨酶升高有非常明显的降低作用，并明显减轻肝纤维化程度。紫红獐牙菜有效组分的药效明显优于齐墩果酸组和紫红獐牙菜总提物组。
2.紫红獐牙菜有效组分的利胆作用取家兔30只，随机分为5组，每组6只。①为生理盐水对照组；②为胆维他片(6mg/kg)阳性组；③～⑤为受试组，分别给予紫红獐牙菜有效组分(钠盐)120mg/kg、60mg/kg、30mg/kg。参照文献方法进行实验(中药药理研究方法学，人民卫生出版社，1994年，448页)，记录胆汁流量指标，测定数据见表-4。
表4.紫红獐牙菜有效组分对家兔胆汁流量的影响(n＝6)

组间t检验与对照组比较，1p＜0.05，2p＜0.01。
表4显示，对照组胆汁流量随时间变化而下降；与对照组相比紫红獐牙菜有效组分三个剂量组在给药后0.5～2h均可使胆汁流量降低率减小。表明本品有增加胆汁流量的作用。
实验1和2的数据证实，本发明药物组合物具有保肝利胆活性，可用于治疗肝炎，例如病毒所致甲、乙型肝炎。
3.紫红獐牙菜有效组分对链尿霉素诱导糖尿病小鼠的降血糖作用取NIH种雄性小鼠，体重22～24g，随机分成五组第1组为正常对照组，腹腔注射生理盐水0.15ml/10g；第2组～第5组腹腔注射链尿霉素150mg/kg，48小时后，从小鼠眼眶取血，照葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度，小鼠均产生不同程度的血糖升高，显示造模成功。将第2组设为模型组，小鼠每日灌胃给予生理盐水；第3、4、5组小鼠分别每日灌胃给予组合物60mg/kg、120mg/kg和优降糖5mg/kg，连续10天，于给药后第11天从眼眶取血，测定血糖浓度。结果见表-5。
表-5.紫红獐牙菜有效组分对糖尿病小鼠血糖的影响


*与正常对照组比较1p＜0.001，2p＜0.01；与模型组比较3p＜0.01。
数据表明，三个给药组的小鼠血糖水平给药后均有不同程度降低，紫红獐牙菜两个剂量组的下降幅度均大于优降糖组。
4.紫红獐牙菜有效组分对醛糖还原酶活性的抑制作用动物取Wistar大鼠，随机分组后置于温度18～29℃、相对湿度50～70％、40W日光灯照明、隔音的动物室内，每5只一笼群养，自由摄食、饮水，适应环境一周后用于实验。
红细胞的体外培养大鼠眼后眶静脉丛取血，EDTA抗凝，所得全血2500rpm×5min离心，弃血浆，按体积比1∶4用生理盐水洗涤红细胞3次，每次2500rpm×5min离心，弃上清液，留下压积红细胞。吸取红细胞0.5ml，加入0.5ml 20％的葡萄糖溶液(生理盐水配制)和1ml组合物溶液(用生理盐水稀释成不同浓度)，于37℃5％CO2培养箱中培养3小时。取出温孵液，离心，弃上清液，用4℃生理盐水洗涤红细胞3次，每次2500rpm×5min离心，弃上清液，留下压积红细胞。吸取10μl供测定血红蛋白(Hb)；吸取200μl按体积1∶3用生理盐水稀释，缓慢摇匀，得25％红细胞稀释液，供测定山梨醇含量。
红细胞山梨醇含量测定吸取25％红细胞稀释液0.5ml，加入1.2ml 6％高氯酸溶液，振摇1分钟，4000rpm×5min离心，吸取上清液1ml置试管中，加入50μl 0.025M高碘酸溶液，混匀，避光保存10分钟，加入50μ1 0.25M亚砷酸钠溶液，混匀后静置10分钟，加入2ml 0.2％变色酸-浓硫酸溶液，混匀，沸水加热30分钟，放冷至室温，于570nm处比色，读取各管的光密度值，计算红细胞的山梨醇含量，按照下式计算药物对红细胞中山梨醇生成的抑制率

式中Cc为空白组红细胞中山梨醇的生成量；Cm为模型组红细胞中山梨醇的生成量；Cs为各给药组红细胞中山梨醇的生成量。实验结果见表-6。
表2数据表明，本发明组合物对体外温孵红细胞中山梨醇的生成有显著抑制作用，并呈良好的剂量关系，其抑制率方程为y＝-0.2721x+1.3765，R2＝0.9356，IC50为6.0×10-4g/ml。
表6.组合物对体外温孵红细胞中山梨醇生成的影响

与模型组比较*p＜0.05；；**p＜0.01。
实验3和4的数据证实，本发明药物组合物具有降血糖和抑制醛糖还原酶活性，可用于预防和治疗糖尿病及其并发症，例如II型糖尿病和白内障。
5.紫红獐牙菜有效组分急性毒性试验选用体重在18～22g的健康小鼠，采用口服给药方式，测定出紫红獐牙菜有效组分的半数致死量(LD50)为9.5g/kg，为临床拟用剂量(60mg/kg)的158倍。
6.紫红獐牙菜有效组分长期毒性试验取大鼠180只，体重70～90g，雌雄各半，随机分成四组对照组50只、大剂量组50只、中剂量组40只、低剂量组40只，每组雌雄各半。三个剂量组的给药剂量分别为临床拟用量的50、30和10倍，即3g/kg、1.8g/kg、0.6g/kg，药物临用前加土温-80混悬，灌胃给药，每日一次，连续六个月。对照组灌服等量土温-80。实验期间每天观察记录动物一般状态，每周称量动物体重一次。实验结束时，对各组动物进行心电图、血液、生化及病理学检查。在实验进行到第三个月时处死大剂量组和对照组动物各10只；在第六个月时各组处死30只，保留10只，停药一个月观察药物可能有的毒性影响和恢复情况；第七个月时全部处死。结果显示，大鼠灌服紫红獐牙菜有效组分六个月后，三个剂量组动物的活动、食欲、大小便及生长发育均无显著性变化；各给药组动物的血象、肝肾功能、心电图及主要脏器指标与对照组比较均无显著性差异(经t检验结果统计，p＞0.05)，且均在正常生理范围内。病理学检查表明，对照组和三个给药组动物各脏器组织结构均未见明显病理性改变。
以上试验结果表明，本发明獐牙菜有效组分具有确切的保肝、利胆、降血糖、抑制醛糖还原酶活性，且毒性小，安全性好，高效低毒优势突出，可作为肝炎和糖尿病及其并发症的治疗药物。与现有药物齐墩果酸、优降糖分别比较，本发明组合物在药效上尚具有一定的优势。
权利要求
1.一种药物组合物，含有重量比例为0.1～10∶1的总酮与齐墩果酸活性成分。
2.权利要求1的组合物，其中总酮与齐墩果酸均为钠盐。
3.权利要求1和2的组合物，所述总酮包括龙胆酮酚。
4.权利要求3的组合物，所述总酮进一步包括芒果苷、当药宁、当药苷、甲基当药宁、1，3，5，8-四羟基酮、1-羟基-2，3，5-三甲氧基酮、1-羟基-2，3，5，7-四甲氧基酮、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮、1-羟基-2，3，4，5-四甲氧基酮、1-羟基-3，7，8-三甲氧基酮、1，7-二羟基-3，4，8-三甲氧基酮。
5.权利要求1～4之一的组合物，由紫红獐牙菜或其它近缘植物制得。
6.权利要求5药物组合物的制备方法，包括取獐牙菜属植物，粉碎，用低级醇或其它极性～中等极性有机溶剂提取，减压浓缩，所得醇浸膏加水溶解，滤取不溶物，水洗，干燥，脱脂，即得；或取獐牙菜属植物，粉碎，用碱水提取，合并提取液，酸化，滤集析出物，水洗，干燥即得。
7.权利要求6的方法，进一步包括将所得产物加入氢氧化钠溶液中使溶解，滤过，干燥，得其水溶性钠盐。
8.权利要求1-5之一的药物组合物在制备治疗肝炎的药物中的应用。
9.权利要求1-5之一的药物组合物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种獐牙菜有效组分及其制备方法。该提取物主要含酮和齐墩果酸，动物实验表明，本品可显著降低四氯化碳肝损伤大鼠血清转氨酶，促进胆汁分泌，降低链尿霉素诱导高血糖大鼠的血糖水平，并对醛糖还原酶活性具有明显的抑制作用，且毒性较低，具有明显的高效低毒优势。该有效组分的植物来源丰富，提取简便，化学性质稳定，适合于制备成各种剂型的肝炎和糖尿病治疗药物。
文档编号A61K31/56GK1686141SQ20051005967
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月31日 优先权日2005年3月31日
发明者潘锡平, 林艳和, 李彪 申请人:昆明生物谷医药研究院有限公司