专利名称：免疫抑制外体的制作方法
描述1.介绍本发明涉及用于介导免疫抑制反应的方法和组合物。本发明的组合物包含具有免疫抑制活性的外体。这种外体可衍生自各种不同细胞类型，其中包括抗原呈递细胞，如树突细胞和巨噬细胞。分离外体之前可通过基因工程改造细胞以使其表达能够增强所述外体免疫抑制活性的分子，和/或使细胞接触一种或多种试剂，如细胞因子或细胞因子抑制剂，这样也能够增强外体的免疫抑制活性。本发明还涉及这种外体在治疗与免疫系统不希望的活化有关的疾病和病症中的应用。本发明还包括直接分离已显示被免疫抑制的血清的外体。
2.发明背景自身免疫疾病的特征是对抗自身抗原的耐受性丧失、抗“自身”抗原(自身抗原)的淋巴细胞反应激活和靶器官的病理损伤。自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、骨关节炎、变态反应、系统性红斑狼疮、1型糖尿病、炎性疾病、哮喘等。多数情况下，可通过外周耐受预防自身免疫，外周耐受是一种可能涉及抗原呈递细胞(APC)尤其是树突细胞(DC)和效应T细胞之间一系列多步相互作用的过程。
例如，类风湿性关节炎(RA)是一种以末端动关节的慢性炎症为特征的使人虚弱的全身性自身免疫疾病。一旦发生RA，受影响的关节将出现炎性细胞浸润和滑膜增生，这会造成软骨和骨的进行性降解，导致完全丧失正常关节功能。最近，调节TNF-α和IL-1β促炎症活性的生物剂已显示可作为新的有效的抗关节炎药(Evans和Robbins，J.Rheumatol.21779-782(1994)；Robbins和Evans，Gene Ther.3187-189(1996)；Evans和Robbins，Curr Opin Rheumatol.8230-234(1996)；Evans等，Arthritis Rheum.421-16(1999)；Ghivizzani等，Clin Orthop.379(Suppl)S288-299(2000))。
此外，各种治疗剂的基因转移已显示在关节炎的动物模型中有效。具体地说，关节内局部注射和全身注射表达各种治疗剂如sTNF-α受体、IL-1Ra、I型和II型sIL-1受体、IL-10、vIL-10和IL-4的腺病毒载体在患关节炎的小鼠、大鼠和兔模型中有显著的抗关节炎作用(Arend，Lancet.341155-156(1993)；Bandara等，Proc NatlAcadSci U S A.9010764-10768(1993)；Ghivizzani等，Proc Natl Acad Sci U S A.954613-4618(1998)；Mori等，J.Immunol.1573178-3182(1996)；Joosten等，ArthritisRheum.39797-809(1996)；Kim等，Arthritis Res.2293-302；Kim等，J.Immunol.1641576-1581(2000))。
有趣的是，通过基因转移局部递送这些治疗剂到一个关节或爪在对侧膝盖或未处理的爪中产生治疗效果。例如，关节内注射表达vIL-10-EB病毒编码的IL-10基因—的腺病毒载体不仅在注射过的膝盖而且在对侧的对照膝盖内导致疾病病状减轻、减少白血细胞浸润和促进软骨代谢(Lechman等，J.Immunol.1632202-2208(1999))。由于这种效应最初是在兔膝盖关节炎模型中观察到的，因此被称为“对侧效应”。在兔、大鼠和小鼠关节内注射逆转录病毒载体、脂质体、甚至基因修饰的滑膜成纤维细胞也观察到了类似的效应(Ghivizzani等，Gene Ther.4977-982(1997)；Ceponis等，Arthritis Rheum.441908-1916(2001)；Kim等，MoI Ther.6591-600(2002))。
最近对这种效应的分析提示，修饰抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞和树突细胞(DC)的功能在对远端关节产生抗原特异性效应中起重要作用(Whalen等，MoI Ther.4543-550(2001)；Kim等，J.Immunol.1663499-3505(2001))。具体地说，培养时基因修饰的骨髓衍生的DC在鼠模型中是逆转已有关节炎的有效药剂这一事实进一步证实了DC的治疗作用。例如，将IL-4或FasL基因转移到DC然后注射入患有关节炎的小鼠能明显消退关节炎，一半以上的治疗小鼠至少在治疗后的两个月无病(Kim等，J.Immunol.1663499-3505(2001)；Kim等，MoI Ther.6584-590(2002)；Morita等，J.Clin Invest.1071275-84)。
树突细胞是专职APC，它在控制免疫应答中扮演关键作用，并可通过各种机制增强或减弱自身免疫应答。经基因工程改造以表达免疫抑制分子的DC被认为是减轻外源移植排斥和自身免疫疾病的有吸引力的方法(Lu等，1999，J.Leukoc.Biol.66293-296)。例如，通过重组腺病毒(Ad)载体将细胞毒T淋巴细胞抗原4-免疫球蛋白(CTLA4Ig)运送入DC已显示可提高这些DC在同种异体受体内的致耐原性(tolerogenicity)和存活(Lu等，1999，Gene Ther.6554-563)。
然而，这种方法也有一些潜在的问题。例如，尽管给予不成熟的低反应性DC能提高在宿主内的致耐原性，但通过病毒基载体转导DC可能会刺激其成熟，导致免疫刺激能力增强(Rea等，1999，J.Virol.7310245-10253)。因此，尽管它们具有减缓疾病发作的潜在疗效，给予完整的树突细胞还可能有不需要的后果。
30多年前就已经证实包括DC在内的各种细胞类型能释放称为外体(exosome)的小脂质泡。外体是大小为30-100nM的小颗粒，它最初被描述为衍生自晚期内体区室并释放自肿瘤细胞系(Culvenor等，J.Cell Biochem.20127-138(1982))和网状细胞(Johnstone等，J.Biol.Chem.2629412-9420(1987))的含有5’核苷酶活性和运铁蛋白受体的小颗粒。外体通过向内或向外出芽产生，这导致颗粒含有胞质溶胶和某些膜相关蛋白的暴露的胞外结构域(Stoorvogel等，Traffic 3321-330(2002))。外体已显示不同于凋亡小体和似乎由质膜脱落产生的较大微泡。已知许多细胞类型能产生外体，其中包括树突细胞、网状细胞、T淋巴细胞、B细胞、血小板、上皮细胞和肿瘤细胞(Johnstone等，Blood.741844-1851(1989)；Peters等，Eur J.Immunol.191469-1475(1989)；Raposo等，J.Exp Med.1831161-1172(1996)；Heijnen等，Blood943791-3799(1999)；Theiry等，J.Cell.Biol.147599-610(1999)；Wolfers等，NatureMed.7297-303(2001)；van Niel和Heyman，Am J.Physiol Gastrointest Liver Physiol.283G251-255(2002))。高度纯化的DC-衍生外体已显示含有某些胞质蛋白，如微管蛋白、肌动蛋白和某些肌动蛋白结合蛋白，以及I类和II类MHC抗原、CD86、ICAM-1、lamp-2、αM-β2整联蛋白、四穿膜区蛋白CD9和CD63和MFGE8/乳黏着蛋白(Raposo等，J.Exp Med.1831161-1172(1996)；Theiry等，J.Cell.Biol.147599-610(1999)；Escola等，J.Biol Chem.27320121-20127(1998)；Thery等，J.Immunol.1667309-7318(2001))。
还显示衍生自用肿瘤抗原肽脉冲的DC的外体能和DC一样有效刺激小鼠内的抗肿瘤反应，其中，外体在其表面暴露肿瘤抗原(Zitvogel等，Nature Med.4594-600(1998))。采用衍生自肿瘤抗原肽-脉冲的DC的外体进行的临床试验首先报道了积极的结果(Andre等，Adv Exp Med Biol.495349-354(2001)；Morse等，Proc.Am.Soc.Oncol.21 A42，p.11a(2002))。外体似乎具有免疫刺激能力并能够敏化抗原呈递细胞(Zitvogel等，US20040028692)。
还显示外体具有某些免疫抑制活性。某些T细胞以及黑色素瘤细胞产生表面含有FasL并能够刺激T细胞凋亡、允许肿瘤生长的外体(Andreola等，J.Exp Med.1951303-1316(2002)；Martinez-Lorenzo等，J.Immunol.1631274-1281(1999))。此外，由在存在INF-γ和消化的卵清蛋白时培养的大鼠肠上皮细胞产生的被称为耐体(tolerosome)的外体颗粒在注射后能诱导抗原特异性耐性(Karlsson等，Eur.J.Immunol.312892-2900(2001))。
Peche等报告，使用同种异体供体衍生的外体延长了大鼠的移植存活(Peche等，Transplantation 761503-1510(2003))。然而，作者还显示了抗-供体II类MHC同种异体抗体产生相应的增加，说明了同时发生的免疫刺激效应。
因此仍旧需要开发治疗自身免疫疾病和炎性疾病的安全有效的方法。本发明提供了治疗此类疾病和病症的组合物和方法。
3.发明概述本发明涉及具有免疫抑制活性的外体以及制造和利用所述外体的方法。明确地说，可给予哺乳类宿主本发明的外体以抑制不需要的免疫应答。
本发明的外体可衍生自多种不同T细胞，包括但不限于抗原呈递细胞如树突细胞和巨噬细胞。用来制备外体的细胞宜在收获外体之前经基因工程改造和/或用例如但不限于细胞因子或细胞因子抑制剂的试剂处理。
在各实施方案中，本发明提供了外体组合物以及它们用作免疫抑制剂的方法。可用本发明治疗的疾病和病症包括但不限于炎症；与炎症有关的症状，如变态反应、哮喘、关节炎和伤口愈合；和自身免疫疾病，包括但不限于类风湿性关节炎和糖尿病。此外，就外体的免疫抑制活性而言，本发明提供了通过拮抗外体以增强免疫应答的方法，例如用来增强对象的抗肿瘤免疫力。
4.附图简述
图1A-C。(A)来自鼠科BM-DC的外体的整体透射电子显微术(TEM)。标尺(bar)＝200nm。(B)为了解一些外体-相关蛋白的存在而进行的外体和BMDC裂解液的Western印迹分析。(C)为了解MHCI和II、CD11c、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)的表达而进行的鼠科DC-衍生外体和DC的流式细胞分析。
图2。骨髓树突细胞(“BMDC”)衍生的外体的荧光激活细胞分选(“FACS”)特征。
图3A-D。在脾中体内(IV)注射PKH67标记的外体、(A)MOMA-1+(B)ER-TR9+巨噬细胞和(C)CD11c+DC6小时后，DC-衍生外体的体内通行显示已使外体内在化。(D)经不同时间点上CD8-α和PKH67的FACS评估，用脾DC亚类使标记的外体内在化。
图4A-C。(A)小鼠骨髓DC和DC-衍生外体的流式细胞分析，其中，纯化的外体来自用Ad.对照和Ad.FasL转导的骨髓DC。(B)显示FasL的表达的DC-衍生外体和DC的Western印迹。(C)DC-衍生外体组分的透射电镜图。
图5。证明用带有FasL的外体和DC处理的小鼠足垫内迟发型超敏反应(DTH)的抑制的柱状图。“*”表示p＜0.01有显著性。
图6。证明采用同系外体和DC与同种异体外体和DC相比的小鼠足垫内DTH的抑制的柱状图。“*”表示p＜0.01有显著性。
图7A-B。(A)证明在野生型和MHC I缺陷型小鼠内注射外体和被Ad.Ψ5或Ad.FasL感染的DC后小鼠足垫内DTH应答的柱状图。“*”表示p＜0.01有显著性。(B)证明在野生型或MHC II缺陷型小鼠内注射外体和被Ad.Ψ5或Ad.FasL感染的DC后小鼠足垫内DTH应答的柱状图。“*”表示p＜0.01有显著性。
图8。证明免疫抑制外体的抗原特异性的柱状图。“*”表示p＜0.01有显著性。
图9A-B。(A)比较DC和DC-衍生外体的DTH-抑制效应的柱状图，所述外体制备自野生型或gld(FasL-/-)小鼠并用对照腺病毒(psi5)或表达FasL的腺病毒(FasL)感染，然后注射回在将KLH注射入足垫之前12小时已经用KLH免疫的野生型小鼠的足垫。(B)描述外体DTH抑制效应的柱状图，所述外体如(A)中制备并注射回lpr(Fas-/-)小鼠与野生型小鼠相比。
图10A-B。(A)证明将表达FasL的DC注射入胶原诱导的关节炎的鼠科模型能抑制疾病进展的图。“*”表示p＜0.01有显著性。(B)证明将呈递FasL的外体注射入胶原诱导的关节炎的鼠科模型能抑制疾病进展的图。“*”表示p＜0.01有显著性。
图11A-B。(A)证明在混合淋巴细胞反应(MLR)中加入表达vIL-10的DC能抑制T细胞增殖的图。(B)证明在混合淋巴细胞反应中加入分离自用Ad.vIL-10感染的DC的外体能抑制T细胞增殖的图。
图12A-B。(A)显示用Ad.vIL-10-转导的DC和衍生自DC/vIL-10的外体能抑制小鼠足垫的DTH应答的柱状图。(B)显示用重组鼠科IL-10处理的BMDC和衍生自用重组鼠科IL-10处理的DC的外体能抑制小鼠足垫的DTH应答的柱状图。“*”表示p＜0.01有显著性。
图13A-C。(A)来自用Ad-vIL-10转导的BM-DC的未处理或冻/融外体的整体透射电镜图。(B)来自Ad.vIL-10转导的BM-DC的未处理或冻/融外体制品的Western印迹，检测到Hsc70的存在。(C)证明分离自用Ad.vIL-10感染的DC的膜破裂外体不能抑制DTH应答的柱状图。
图14A-B。(A)证明分离自用Ad.vIL-10感染的DC的MHC II-耗竭外体的免疫抑制效应的柱状图。“*”表示p＜0.01有显著性。(B)证明分离自用重组IL-10处理的DC的MHC II-耗竭外体的免疫抑制效应的柱状图。“*”表示p＜0.01有显著性。
图15。证明注射入胶原-诱导的关节炎小鼠模型的表达vIL-10的DC抑制疾病进展的图。
图16A-C。衍生自DC/IL-10的外体在建立的胶原-诱导的关节炎模型中的疗效的分析。(A)外体分离自用Ad.vIL-10感染或用重组小鼠IL-10脉冲的DBA1小鼠骨髓DC，并给予具有建立的CIA的小鼠。(B)来自重组IL-10-脉冲的DC的外体被分成两组，其中一组先经过三轮冻融以破裂膜，再给予具有建立的CIA的小鼠。(C)在建立的CIA小鼠中测试来自DC/rmIL-10的外体，与直接注射重组小鼠IL-10进行比较。在A-C中，纯化的外体在第32天(用箭头表示)静脉注射入在第28天用牛II型胶原免疫并给予LPS的DBA1小鼠。用建立的肉眼评分系统周期性监测小鼠，该系统表示为所有爪的累加值，且最大可能记分为16。
图17。鼠科DTH模型中足垫肿胀的增加，其中，处理的足垫被注射DC/mbmIL-4、制备自DC/mbmIL-4的外体、DC/Psi5(对照)、制备自DC/Psi5的外体(对照)或盐水(对照)。
图18。鼠科DTH模型中足垫肿胀的增加，其中，处理的足垫被注射DC/smIL-4、制备自DC/smIL-4的外体、DC/Psi5(对照)、制备自DC/Psi5的外体(对照)或盐水(对照)。
图19。鼠科DTH模型中足垫肿胀的增加，其中，处理的足垫被注射DC/mbmIL-4、制备自DC/mbmIL-4的外体、DC/FasL、制备自DC/FasL的外体、DC/Psi5(对照)或制备自DC/Psi5的外体(对照)。
图20。野生型或lpr(Fas-/-)小鼠的鼠科DTH模型中爪肿胀的增加，小鼠被注射制备自DC的外体，所述DC收获自野生型或gld(FasL-/-)小鼠并经修饰以表达可溶性(smIL-4)或膜结合(mbmIL-4)IL-4。
图21A-B。注射制备自来自(A)同系或(B)同种异体小鼠的膜结合IL-4增强的DC的外体后，鼠科DTH模型爪肿胀的增加。
图22。显示鼠科DTH模型中爪肿胀增加的柱状图，其中，野生型或B7.1和B7.2缺陷型(KO)小鼠的处理的爪(黑色柱)被注射制备自DC的外体，所述DC用含IL-4基因的腺病毒载体或Ad.Psi5处理过。未处理的爪的大小用空心柱表示。
图23。描述CIA模型小鼠关节炎指数的图，小鼠用制备自用Ad.psi＝5(对照)、Ad.mIL-4或Ad.mbmIL-4感染的DC的外体处理。
图24A-B。(A)主要用DC/IL-4-衍生的外体处理的小鼠，或(B)给予来自原始对象(primary subject)的CD11C的小鼠内的DTH应答。
图25。显示用盐水、来自未处理DC的外体或制备自DC/IL-4的外体处理的小鼠内高血糖发生的图。
图26。显示给予DTH小鼠模型未处理全血清和用珠处理的全血清后48小时足垫肿胀的柱状图。
图27。显示采用血清、微泡和来自KLH免疫小鼠的外体的小鼠足垫内DTH抑制的柱状图。
图28。显示采用各种血清组分的小鼠足垫内DTH抑制的柱状图，其中，在加强免疫48小时后测量肿胀。
图29。显示采用各种血清组分的小鼠足垫内DTH抑制的柱状图，其中，血清分离自KLH和OVA免疫的小鼠，在加强免疫48小时后测量肿胀。
图30。分离自小鼠血清的外体的电子显微照片。
图31。用携带抗-II类MHC的珠标记的血清-衍生外体的FACS分析。
图32。显示鼠科DTH模型中爪肿胀增加的柱状图(其中，DTH抗KLH)，其中，处理的爪被注射(a)收集自KLH-免疫小鼠血清的外体(组I)，(b)收集自幼稚小鼠血清的外体(组II)，或(c)盐水(组III)。处理的爪用黑色柱表示，对侧爪用空心柱表示。
图33。显示鼠科DTH模型中爪肿胀增加的柱状图(其中，DTH抗KLH)，其中，处理的爪被注射(a)收集自KLH-免疫小鼠血清的外体(组I)，(b)收集自KLH-免疫小鼠的血清并用抗-MHCII抗体预吸附的外体；(c)收集自KLH-免疫小鼠血清的II类MHC阳性外体；(d)用抗-IgG抗体预吸附的外体耗竭对照；或(e)盐水。
图34。显示鼠科DTH模型中爪肿胀增加的柱状图，其中，(a)来自FasL缺陷型gld(FasL-/-)小鼠的血清-衍生的外体被给予野生型受体；(b)来自野生型小鼠的血清-衍生的外体被给予野生型受体；(c)来自gld小鼠的血清-衍生的外体被给予lpr(Fas-/-)受体，(d)来自野生型小鼠的血清-衍生的外体被给予lpr受体，或者(e)给予盐水作为对照。
图35。显示鼠科DTH模型中爪肿胀增加的柱状图，用外体供体动物免疫14天后收集的血清衍生的外体处理，免疫受体动物14天后给予。
图36。显示用VAS表示的疼痛的图，注射以下三组后测量6次VASOrthokine血清和两组去炎松。
图37。显示用SESaff(情感性疼痛标度(Affective Pain Scale))表示的疼痛的图，注射以下三组后测量6次SESaffOrthokine血清和两组去炎松。
图38。显示用SESsens(敏感性疼痛标度(Sensitive Pain Scale))表示的疼痛的图，注射以下三组后测量6次SESsensOrthokine血清和两组去炎松。
图39。显示疼痛Oswestry评分的图，注射以下三组后测量4次Oswestry评分Orthokine血清和两组去炎松。
图40A-F。Orthokine血清中富含外体的组分的透射电镜图(TEM)((B)是由过滤的血清产生的图象)。
5.发明详述为清楚但不限制性地描述，本发明的详述部分被分成以下小节(i)外体的细胞来源；(ii)调理细胞以收获外体；(iii)从细胞制备外体；(iv)从血清制备外体；(v)含外体的组合物；(vi)免疫抑制方法；和(vii)拮抗外体-介导的免疫抑制的方法。
5.1外体的细胞来源本发明的外体可衍生自多种不同细胞，其中包括但不限于抗原呈递细胞(“APC”)如树突细胞(“DC”)和巨噬细胞，它们可从例如骨髓、脾、淋巴结或胸腺等组织，或从衍生出它们的外周血或血清中收获。本发明的范围还包括专门的抗原呈递细胞，如皮肤的朗格汉斯细胞或肝脏的枯否细胞，它们可制备自它们的来源组织。收获APC和DC的方法尤其是本领域已知的。
如下述工作实施例所证实，观察到外体的免疫抑制活性依赖于II类MHC抗原，且当外体供体和受体同系时的活性要比同种异体时高。因此希望供体和受体之间的关系最密切。因此，虽然本发明包括将来自一种哺乳动物种类的外体用于免疫抑制另一种种类，但优选供体和预定受体的种类是相同的，和/或优选供体和预定受体的的II类MHC抗原是相同的(或基本类似或相容，例如采用用于预期组织移植物的考虑因素)，和/或优选供体和预定受体是相同的(自体)或有家庭关系的(兄弟/姐妹；姐妹/姐妹；父母/孩子)。类似地，由于外体的免疫抑制活性是抗原特异的，因此，在本发明的特定非限制性实施方案中，外体供体可用要在受体中抑制其反应的抗原免疫。
5.2调理细胞以收获外体在本发明优选的非限制性实施方案中，APC被调理以增强从其制备的外体的免疫抑制活性。“调理”在文中包括(i)在体外或体内使APC暴露于增强剂，以及(ii)基因工程改造APC以表达增强剂。
增强剂可以是细胞因子、细胞因子拮抗剂和NFκB拮抗剂，包括但不限于TGF-β、IL-10、CTLA4-Ig、sCD40-Ig、IL-4、IL-13、FasL、IL-I受体拮抗剂蛋白(“IRAP”)、vIL-10、sICAM-1、sICAM-3和TRAIL。在优选的非限制性实施方案中，所述增强剂是IRAP或IL-10或IL-4或其组合，在具体的非限制性实施方案中，所述增强剂被给予APC，例如在细胞培养物中，IRAP的浓度可以为约5μg/ml，或者IL-10的浓度可以为约1000U/ml，或者IL-4的浓度可以为约1000 U/ml。任选地，当特定抗原或特定抗原来源已知时，这种特定抗原或特定抗原来源(例如，固定或减毒的感染剂)可作为增强剂加入培养物，其用量为非毒性、非致病性的。
在本发明的一组实施方案中，APC可经基因工程改造以表达编码增强剂的异源“增强基因”。这种“增强基因”包括但不限于操作性连接于在APC中有活性的启动子元件的编码TGF-β、IL-10、CTLA4-Ig、sCD40-Ig、IL-4、IL-13、FasL、IRAP、VIL-10、sICAM-1、sICAM-3和TRAIL的核酸。在优选的实施方案中，所述增强基因是FasL、IL-10、IL-4或IRAP。增强基因产物可在外体表面(例如，膜结合)或在外体内部表达。或者，APC可经基因工程改造以表达编码血管生成因子的增强基因(例如，但不限于，Del1)或分选和定位信号。可用本领域已知方法引入增强基因，所述方法包括转染、转导、电穿孔、微注射等。可任选将增强基因掺入合适的表达载体以便于其引入，在本发明的非限制性实施方案中，表达载体可以是病毒载体。病毒载体可以是，例如，逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)或单纯疱疹病毒(HSV)载体。在本发明具体的优选实施方案中，所述病毒载体衍生自腺病毒。(通常可参见，Horwitz，M.S.，“腺病毒及其复制”，引自Virology，第二版，Fields等编，Raven Press，New York，1990)。重组腺病毒具有用作编码腺病毒载体外源蛋白质的核酸分子表达系统的优点，包括分裂和非分裂细胞向性、最小致病潜能、能以高效价复制以制备载体贮液、以及能够携带大插入物。见Berkner，K.L.，1992，Curr.Top.Micro Immunol，15839-66；Jolly D.，1994，Cancer Gene Therapy，151-64。
在本发明具体的非限制性实施方案中，增强基因可含在衍生自基本缺失E1和E3结构域的腺病毒血清型2(Ad2)或血清型5(AD5)的腺病毒载体中。其它腺病毒血清型也可用作腺病毒载体的骨架，其中包括Ad6、Ad9、Ad12、Ad15、Ad17、Ad19、Ad20、Ad22、Ad26、Ad27、Ad28、Ad30和Ad39。在列举的这些腺病毒血清型中，优选Ad2和Ad5。
任选含在病毒载体内的含有操作性连接于合适启动子元件的增强基因的核酸可通过递送系统提供给APC，如包裹入脂质体、微粒或微囊。
5.3从细胞制备外体从细胞制备外体是本领域已知的；参见，例如，Raposo等，J.Exp.Med.1831161(1996)。
在本发明具体的非限制性实施方案中，外体可从APC的培养物制得，该APC培养物优选如下所述用增强剂调理(在细胞培养物中或通过基因工程改造)的APC培养物。收集培养物上清并于300g离心5分钟、1,200g离心20分钟、10,000g离心30分钟连续离心3次以除去细胞和碎片，然后100,000g离心1小时。为除去过量的血清蛋白质，外体团然后用PBS洗涤并在100,000g再离心1小时，之后将所得团块重悬于PBS。外体可通过微量Bradford蛋白质测定(Bio-Rad，CA)量化，优选将通过测定确定与1mg蛋白质相对应的外体的量悬浮于20ml PBS。可任选通过电子显微术证实外体的完整性(见图1A)，且外体可任选通过FACS分析定性以表征表面标记(见下面的第6和7节)。
5.4从血清制备外体根据本发明，可用于免疫抑制的外体可收集自合适对象的血清。优选地，所述对象也是血清-衍生的外体的预定受体(自体给予)。如果外体的供体和受体不相同，由于外体-介导的免疫抑制活性的抗原特异性和II类MHC依赖性，优选供体和受体是II类MHC抗原相容的和/或供体已经暴露于需要在受体中抑制对其的免疫力的抗原。
由于外体是大小为30-100nM的小颗粒，因此可通过除去外周血样品中较大的细胞组分在血清中回收它们，例如，但不限于，在1500g离心10分钟。
优选地，可通过连续离心步骤更加严格地纯化外体。例如可采用上述从细胞培养物上清制备外体的方法或等价方法，但不限于此。这种方法优选包括采用实验室超速离心机。在一个非限制性的实施例中，外体可分离自血清(用标准实验室技术收集自外周血)，通过1200g离心5分钟、1200g离心20分钟和10,000g离心30分钟三次连续离心，然后100,000g离心1小时，所得团块用PBS洗涤，重悬于PBS，然后再100,000g离心1小时，之后可将所得团块重悬于PBS。
在本发明的一个优选的实施方案中，外周血可在存在珠时培育以刺激细胞因子产生，然后再收集血清和外体。可用于此目的的珠包括但不限于直径为0.5-10mm或0.5-5mm的玻璃或塑料珠，珠可任选用试剂处理，如能刺激淋巴细胞增殖的CrSO4(Mignini等，2004，Preventive Med 39(4)767-775；Rhee等，2002，Clin Exp Immunol127(3)463-469)。在本发明的一个优选的非限制性实施方案中，使用直径2.5mm、表面积21mm2的医用玻璃珠，将珠在50％CrSO4(Merck，德国)中培育5分钟以进行表面修饰，然后用蒸馏水洗涤直到洗涤液的pH与蒸馏水的pH相同，同时洗涤液电导率小于0.3μS。可将处理过的珠放在合适容器内，如微量滴定板、离心管、培养管或针筒，然后灭菌(例如通过高压灭菌或γ照射)。然后将外周血加入含有珠的容器，再在37℃、5％CO2下无菌培育例如24小时。然后可通过离心如3500rpm离心10分钟从珠/血悬浮于收集血清。通常可回收最初外周血总体积的20％。然后将所得含外体的血清储存于-20℃。Orthokine血清就是用这种方法制备的(见美国专利Nos.6759188和6713246)。
在本发明一个相关的特定非限制性实施方案中，可在与珠一起培育之前或者同时将IRAP加入外周血样品。例如，每毫升外周血可加入5μgIRAP。
在本发明的一个优选的非限制性实施方案中，可用如下方法制备外体的浓缩制品，从任选与珠和/或IRAP一起培育的外周血收集血清，方法是通过离心除去形成的血液成分(例如，3000-5000g离心10分钟)，然后再超速离心，例如，100,000g离心1小时。所得团块可重悬于生理盐水，然后宜进行灭菌(例如，通过0.2μm滤器过滤)。用来悬浮团块的体积决定了外体的浓度。优选地，所述浓度在100ml血清1ml外体浓缩物(“100倍浓缩”)和2ml血清1ml外体浓缩物(“2倍浓缩”)之间，优选在约50ml血清1ml外体浓缩物(“50倍浓缩”)和5ml血清1ml外体浓缩物(“5倍浓缩”)之间，优选约10ml血清1ml外体浓缩物(“10倍浓缩”)。
5.5含外体的组合物本发明提供了含外体的组合物，其中的外体被悬浮于合适的药用载体。
本发明的组合物以外体浓度为特征，相对于它们在外体供体或预定受体内的平均血清浓度而言，外体被浓缩。在非限制性实施方案中，相对于血清的浓度可以在约100倍和2倍之间，或在50倍和5倍之间，或约10倍。
如上所述，本发明的组合物可含有获自经增强剂处理的APC或外周血的外体。
本发明的组合物可含有通过超速离心制备的外体。
在一组优选的非限制性实施方案中，本发明提供了含有外体的药物组合物，所述外体通过培养经增强剂调理的对象的APC，然后从所述经调理的APC的培养基中分离外体而制备。
在另一组优选的非限制性实施方案中，本发明提供了含有外体的药物组合物，所述外体通过将外周血与玻璃珠一起培育、从外周血收集血清、以及通过超速离心从所述血清分离外体而制备。
在另一组优选的非限制性实施方案中，本发明提供了含有外体的药物组合物，所述外体通过在存在增强剂(优选IRAP)时将玻璃珠与外周血一起培育、从外周血收集血清、以及优选通过超速离心从所述血清分离外体而制备，并优选制造浓缩的外体制品。
5.6免疫抑制方法本发明提供了在需要这种治疗的对象中减少、抑制或防止免疫应答的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的APC衍生的外体。所述减少/抑制/防止可通过炎症参数的降低得到证实，所述参数例如有炎症的临床征兆(肿胀、发红、发热、疼痛、关节灵活性受限、皮疹、炎症性神经病、脑膜炎、脑炎)、变态反应或哮喘的临床征兆(打喷嚏、发痒、咳嗽、发疹、荨麻疹、喘息)、炎性肠病的临床征兆(痉挛、大便出血和/或有粘液)或临床标记如CRP、ESR、WBC。
需要减少、抑制或防止免疫应答的疾病和病症包括但不限于关节炎、变态反应、哮喘或自身免疫疾病，例如，但不限于，类风湿性关节炎、青少年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、舍格伦综合征、I型糖尿病、韦格纳肉芽肿病、多发性硬化、克罗恩病、银屑病、格雷夫斯病、口炎性腹泻、斑秃、中枢神经系统血管炎、桥本甲状腺炎、重症肌无力、古德帕斯丘综合征、自身免疫性溶血性贫血、格-巴二氏综合征、结节性多动脉炎、特发性血小板性紫癜(idiopathic thrombocyticpurpura)、巨细胞动脉炎、原发性胆汁性肝硬变、阿狄森病、强直性脊柱炎、莱特尔综合征、大动脉炎和白癫风。可按照本发明治疗的其它症状包括诸如肌营养不良的疾病以及炎症可能会影响正常愈合的症状，如软组织、韧带或骨骼的意外损伤或医源性损伤，或者非免疫事件造成的组织损伤，例如心肌梗塞后的心肌受损。
本发明的方法包括给予需要这种治疗的对象有效量的按照本发明制备的外体。例如，可给予上述章节所描述的外体组合物。外体可通过任何临床途径给予，但优选静脉内、肌内、关节内、皮下、膜内给予，或者在例如外科手术过程中通过局部注射或灌输给予。
要给予的外体的量如下，或者可根据临床基础例如根据对象-对象基础决定。在具体的非限制性实施方案中，每千克对象体重可给予的外体的量约为5-100μg蛋白质，或者约为50μg蛋白质。术语“具有特定量蛋白质的外体”指外体制品中存在的蛋白质的量可被量化(例如，通过5.3节所述的Bradford蛋白质测定法或测量蛋白质的其它标准技术)，且蛋白质的量被用作外体用量的指标。在一组本发明具体的非限制性实施方案中，可给予人类对象收集自约20-50ml、50-100ml、100-200ml、200-300ml、300-400ml或400-500ml外周血的血清衍生的外体。在另一组本发明具体的非限制性实施方案中，可给予人类对象的外体的量约为100μg-5mg蛋白质，或约500μg-2mg蛋白质。
在具体的非限制性实施方案中，本发明提供了在需要这种治疗的对象中抑制免疫应答的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的制备自抗原呈递细胞培养物的外体。文中，“抗原呈递细胞培养物”是通过本领域已知方法收集的富含抗原呈递细胞的细胞培养物；这种培养物不必100％纯。
5.7拮抗外体-介导的免疫抑制的方法由于发现APC衍生的外体具有免疫抑制作用，在某些条件下它们可显示出负面作用，例如，抑制宿主对肿瘤或感染的免疫应答。因此，本发明提供了抑制这种不需要的免疫抑制的方法，包括在需要增强免疫力的部位给予有效量APC衍生的外体的抑制剂。这种抑制剂可以是，例如，针对外体相关抗原的抗体，所述抗原如运铁蛋白或图1C、2和4A所示的任何表面分子。
6.实施例外体-I的定性为证明DC-衍生外体的免疫调节作用，从以高密度培养在GMCSF/IL-4中的C57BL/6小鼠骨髓前体产生DC。然后通过差速离心从培养基分离DC产生的外体，并通过电子显微术、Western印迹和流式细胞术定性。
6.1材料和方法小鼠雌性C57BL/6(H-2Kb)小鼠和雄性DBAl/LacJ(H-2Kq)小鼠，皆7-8周龄，购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。动物保存在匹兹堡大学生物技术中心(Pittsburgh，PA)无病原体的动物设备内。
产生和培养骨髓-衍生的DC按Kim等，J.Immunol.1663499-3505(2001)的描述产生骨髓-衍生的DC(BMDC)。简言之，从小鼠胫骨和股骨收获骨髓并使骨髓通过和尼龙网以除去小骨块和碎片。在第0天用0.83M NH4Cl缓冲液裂解污染的红血球，并用Ab(RA3-3A1/6.1，抗-B220；2.43，抗-Lyt2；GK1.5，抗-L3T4；都来自美国典型培养物保藏所，Manassas，VA)和兔补体(Accurate Chemical and Scientific，Westbury，NY)的混合物耗竭淋巴细胞。然后将细胞在完全培养基(CM；RPMI 1640，含10％FBS、50μM 2-ME、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100μg/ml链霉素和100IU/ml青霉素)内培养24小时以除去粘附的巨噬细胞。然后，在第1天将未粘附的细胞置于含重组鼠科GM-CSF(1000U/ml)和重组鼠科IL-4(1000U/ml)的新鲜CM内。将细胞培养4天，在第5天收获细胞以进行腺病毒转导或用重组细胞因子处理。
为进行腺病毒感染，以每孔1×106DC/孔铺于24孔板，并在总体积为1ml的无血清培养基内加入5×107PFU各重组腺病毒。37℃培育24小时之后收集细胞，用PBS洗涤5次，并加入新鲜培养基。在第7天回收感染的DC和外体，充分洗涤并注射入动物。
外体纯化如先前的描述在第7天通过差速离心从BMDC培养物的细胞培养物上清制备外体(Raposo等，J.Exp Med.1831161-1172(1996))。简言之，对从各BMDC回收的培养物上清在300g(5分钟)、1,200g(20分钟)和10,000g(30分钟)进行三次连续离心以除去细胞和碎片，然后在100,000g离心1小时。为除去剩下的血清蛋白质，外体团用大体积PBS洗涤并在100,000g离心1小时，最后重悬于120μl PBS供进一步研究。外体可通过微量Bradford蛋白质测定(Bio-Rad，CA)量化。各批次根据蛋白质含量标准化，取1μg悬浮于20μl PBS以进行体内小鼠研究。为进行MHC II吸附，将100μl洗涤过的抗-小鼠MHC II顺磁珠(Miltenyi Biotech)与预稀释的外体(1μg/20μl)一起在4℃培育1小时，培育时温和振荡。磁性分离后用PBS将留在微量离心管内的组分调至最初体积。在干冰/乙醇浴中快速冷冻随后在37℃浴中升温，如此独立进行3轮以冻/融预稀释的外体。通过IL-10 ELISA(Endogen)确定最终的外体制品内IL-10和vIL-10的污染浓度。
电子显微术外体通过差速离心纯化，将10ml加载到Formvar/碳涂布网格上，用10μl中性1％磷钨酸水溶性负染，并用JEOL-1210计算机控制的高对比度120kv透射电子显微镜观察。
蛋白质分析在添加了CLAP(胰凝乳蛋白酶、亮肽素、抑肽酶和胃蛋白酶抑制剂，各100μM)的10mM三乙醇胺、1mM EDTA、10mM乙酸、250mM蔗糖(pH7.4)中匀浆细胞以将胞质溶胶和所有的膜分离，匀浆通过在25-G针管中推拉60次进行。在1200g离心以除去上清液中的核和细胞碎片。100,000g离心1小时后所有的膜都留在细胞团中。10μg细胞裂解液或外体制品然后在5-20％梯度SDS-PAGE上分离，转移到硝酸纤维素，并用增强化学发光检测试剂盒(Amersham)通过Western印迹检测。
FACS分析采用FACScan(Becton Dickinson，Sunnyvale，CA)，通过表型分析多数培养细胞(60-95％)内CD11b、CD11c、CD80、CD86和MHC I类和II类的表达来确定。就外体而言，将30μg沉淀的外体与10μl直径4μm的醛/硫酸盐乳胶珠(Interfacial Dynamics，Portland，OR)室温培育15分钟，终体积为30-100μl，然后再用1ml PBS温和振荡培育2小时。在100mM甘氨酸中培育30分钟以终止反应。外体涂布的珠用FACS洗涤缓冲液(3％FCS和0.1％NaN3，用PBS配制)洗涤三次并重悬于500μl FACS洗涤缓冲液。将珠与各种第一抗体一起培育1小时，然后如果需要再与FITC-偶联的第二抗体一起培育，洗涤并在FACSCaliber(Becton Dickinson，SanDiego，CA)上分析。用Lysis II FACScan软件(Becton Dickinson)获得并分析数据。
6.2结果通过整体透射电子显微术对外体团进行超结构分析显示，直径40-90nm的特征性碟形外体明显富集(图1A)。Western印迹分析证实，DC-衍生外体为外体相关蛋白CD71和Hsp70阳性(图1B)，但对于外体内未发现的蛋白质如Hsp90、不变链和钙联接蛋白呈阴性。为进一步证实外体组分的完整囊泡特性，从eGFP/C57小鼠的BMDC纯化外体，这是由于动物内的大部分细胞组成型表达标记蛋白eGFP(图1B)。高度富集的外体组分的Western分析显示出显著水平的全长eGFP，说明可溶性eGFP被包裹在BMDC衍生的外体腔的保护性环境中。
通过流式细胞术进一步检测DC-衍生外体组分的表面蛋白。100,000xg离心回收外体，使其结合乳胶珠并用一些抗鼠科DC相关白细胞标记蛋白的单克隆抗体染色。外体表面有高水平MHC II正染，检测出更中等水平的MHC I、CD11C、CD80(B7.1)和CD86(B7.2)(图1C)。这些数据一起证明了能够富集完整的外体，所述完整外体含有如其它文献所述的许多DC-衍生外体相关蛋白的标记(Stoorvogel等，Traffic.3321-330(2002)；Raposo等，J.Exp Med.1831161-1172(1996)；Kleijmeer等，Traffic.2124-137(2001))。
7.实施例外体-II的定性表面抗原图2显示了FACS分析结果，该结果证明了DC-衍生外体的表面表型。将外体与CD11b(为分析II类MHC)或II类MHC(IAd)抗体涂布的4.5μm珠一起培育。用珠来增加外体尺寸以便可通过FACS检测。珠涂布的外体然后用指定蛋白的PEmAb标记。除了图2所示的表面抗原，骨髓-衍生的外体也为CD11c、CD14、CD54、MFG-E8、CD80、CD86和CD9阳性。显著比例的外体为CD11a、CD11b和膜结合TNF-α阳性，而对CD8-α、CD32、CD49d、CD25、CD40、CD107a(Lamp-1)、CD95和Trail呈阴性。有趣的是，尽管只有少量制备外体的DC是FasL阳性的，但99％的外体为FasL(CD 178)阳性。该结果说明，FasL被优先分选入外体，不局限于任何理论，FasL似乎在提供所观察疗效中发挥本质作用。
通行(trafficing)图3A-D显示了DC-衍生外体的体内通行。BDMC-衍生的外体用PKH67标记，IV注射入小鼠，注射后2小时开始分析小鼠(Kim等，J.Immunol.1663499-3505(2001))。检测脾边缘区中MOMA-1+巨噬细胞、ER-TRP+巨噬细胞和CD11c+DC内标记的外体。在CD11c+DC中，发现外体与Lamp-1+内吞小泡有关。此外，起初CD8-α阴性CD11c+细胞摄入外体，而标记的外体在CD8-α+Dc阳性的百分数随时间增加。24小时后，外体显示与T细胞区域内的CD11c+DC有关。同时，对外体阳性DC的分析显示，它们未上调DC成熟标记(IAb、CD86或CD54)。这些结果说明，脾中发现的不成熟DC以及巨噬细胞能有效内化DC-衍生外体，但不会诱导DC成熟也不会影响DC成熟的能力。因此，外体功能的工作模型为，它们与脾和淋巴结内抗原呈递细胞的亚类相互作用，随后抑制T细胞应答，从而可能诱导调节T细胞群。
8.实施例衍生自DC/FasL的外体有免疫抑制活性符号“DC/’X”表示树突细胞被工程改造以表达X，或者DC先被暴露于X然后再从树突细胞制备外体，其中的‘X’是诸如FasL、IL-10、IL-4等的试剂。
8.1衍生自携带外源FasL的DC/FasL的外体以下实施例证明，分离自被外源基因转导的DC的外体能够呈递基因产物。具体地说，当DC被携带FasL基因的腺病毒载体转导时DC-衍生外体展示FasL。
8.1.1材料和方法DC产生按照先前的描述产生骨髓衍生的DC(Whalen等，MoI Ther.4543-550(2001)；Kim等，J Immunol.1663499-3505(2001)；Kim等，MoI Ther.6584-590(2002))。简言之，从C57BL/6小鼠的胫骨和股骨收集骨髓。裂解污染的红血球并用抗体混合物(RA3-3A1/6.1、抗-B220；2.43、抗-Lyt2；GK1.5、抗-L3T4；都来自ATCC，MD)耗竭淋巴细胞。细胞然后在完全培养基(CM)内培育24小时以除去粘附的巨噬细胞。然后将未粘附的细胞置于含1000U/ml mGM/CSF和mIL-4的新鲜CM内。将细胞培养4天，收获细胞以进行腺病毒转导。腺病毒感染时，在总体积为1ml的无血清培养基内将1×106DC与5×107PFU病毒混合。培育24小时后DC用PBS剧烈洗涤3次，再培育48小时。在第8天收集培养物上清以纯化外体，并回收感染的DC。
外体分离如先前的描述略微改动分离外体(Raposo等，J.Exp Med.1831161-1172(1996))。将收集的培养物上清在300g离心10分钟、1200g离心20分钟、3000g离心30分钟。最后一次离心的上清液再在超速离心机中100,000g离心1小时。外体团用盐水洗涤，100,000g离心1小时，并重悬于盐水。
流式细胞术为对DC进行表型分析，用抗鼠科表面分子(CD11b、CD11c、CD80、CD86、H-2Kb、I-Ab和合适的同种型对照)的PE-或FITC-偶联的单克隆抗体染色DC。
为进行FACS分析，将外体与5μl直径4μm的醛/硫酸盐乳胶珠在20微升终体积中室温培育15分钟。在各珠/外体样品中加入10mg牛血清白蛋白(BSA)，之后继续培育15分钟。加入1ml盐水，然后再温和振荡培育75分钟。与100mM甘氨酸培育30分钟以终止反应。外体涂布的珠用抗体染色，用FACS缓冲液(3％胎牛血清(FBS)和0.1％NaN3，用盐水配制)洗涤两次并重悬于400μl FACS缓冲液。DC和外体通过FACScan(Becton Dickenson，CA)检测。
电子显微术外体通过差速离心纯化，将10ml加载到Formvar/碳涂布网格上，用10μl中性1％磷钨酸水溶性负染，并用JEOL-1210计算机控制的高对比度120kv透射电子显微镜观察。分离骨髓衍生的DC。在第5天用Ad.FasL感染一半分离的DC。外体如上述分离。
蛋白质分析和Western印迹用12％十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离5微克外体蛋白质和DC裂解液。将蛋白质印迹到硝酸纤维素膜(Amersham)。封闭后，膜用抗体和辣根过氧化物酶显示并用X射线胶片通过增强发光检测(Perkin Elmer Life Science)。
8.1.2结果用Ad.eGFP或Ad.FasL转导一天后充分洗涤，将感染的鼠科DC培养48小时并通过差速离心从上清液分离外体。48小时后106鼠科骨髓DC产生了1-2μg外体。然后与结合到乳胶珠的抗体一起培育、随后通过流式细胞术分析DC和分离的DC-衍生的外体中MHC和共刺激分子的存在。如图4A-C所示，衍生自Ad.eGFP和Ad.FasL转导DC以及对照转导DC的外体为MHC I类和II分子、CD11c和共刺激分子CD80和CD86阳性(图4A)。此外，采用抗-FasL抗体通过Western分析显示，DC/FasL和DC/FasL-衍生的外体对约40Kda的人FasL转基因呈阳性(图4B)。这些结果证明，衍生自Ad/FasL转导DC的外体含有未蛋白酶水解的(non-proteolyzed)完整FasL和MHC、共刺激分子和CD11c。通过EM分析外体组分显示了显著数量的碟形囊泡，这是外体的特征(图4C)。
8.2局部给予呈递FasL的外体减轻了足垫肿胀试验中治疗爪和对侧爪中迟发型超敏反应(“DTH”)相关肿胀为测试经基因修饰表达FasL的DC，以及衍生自经修饰DC的外体是否能够在体内抑制炎症，采用了DTH小鼠模型。在该模型中，小鼠用特定抗原(匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA))免疫，在后足垫注射特定抗原进行免疫10-14天后诱导了Th1-介导的炎性应答。
8.2.1材料和方法从骨髓分离DC，之后用Ad.Ψ5或Ad.FasL感染。如8.1节的描述纯化外体。
给予DTH模型外体在单背侧部位注射100μg用弗氏完全佐剂(FCA)1∶1乳化的抗原(KLH或OVA)以敏化C57BL/6小鼠。10天后，在免疫小鼠的一个后足垫注射百万数量级的DC或1μg衍生自DC的外体，12小时后用抗原攻击。对侧足垫接受等体积盐水代替DC或外体。在小鼠的两个足垫内注射20μg溶于20μl盐水的抗原进行攻击。攻击24、48和72小时后测量足垫肿胀。结果表示为抗原加强注射之前和之后肿胀的差异(×0.01mm)。
统计分析用斯氏t检验和方差分析比较结果。
8.2.2结果如图5所示，给予DC/FasL或DC/FasL-衍生的外体在注射抗原后24、48和72小时时不仅明显抑制了处理爪的爪肿胀，而且明显抑制了未处理的对侧爪的肿胀。相反，注射DC/Ψ5或衍生自对照DC的外体不能抑制DTH应答。这些结果证明，表达FasL的经基因修饰的DC以及衍生自DC/FasL的外体对于抑制处理爪以及未处理的对侧爪中的DTH应答同样有效。
在一些关节炎的不同动物模型中体内和先体外后体内递送多种不同治疗基因后都观察到了对侧效应。(Kim等，J.Immunol.1641576-1581(2000)；Whalen等，J.Immunol.1623625-3632(1999)；Lechman等，J.Immunol.1632202-2208(1999)；Ghivizzani等，Proc NatlAcad Sd USA.954613-4618(1998)；Kim等，J.Immunol.1663499-3505(2001)；Ijima等，Hum Gene Ther.121063-1077(2001)；Kim等，MoI Ther.6584-590(2002)；Smeets等，Arthritis Rheum.482949-2958(2002)；Lechman等，Gene Titer.102029-2035(2003))。
8.3通过呈递FasL的同系外体抑制迟发型超敏反应8.3.1材料和方法为确定DC衍生外体通过何种机制抑制炎症，检测了观察到的效应是否是MHC依赖性和抗原特异性的。为确定外体抑制DTH应答的能力是否是MHC依赖性的，检测了同种异体外体是否能够在体内抑制DTH应答。将衍生自C57BL/6(H-2b，I-Ab)小鼠的DC用作同系外体来源，而将Balb/C(H-2d，I-Ad)的DC用作同种异体外体来源。为检测同系和同种异体DC-衍生外体在体内抑制DTH的能力，在KLH-免疫的小鼠两只后爪之一注射同系或同种异体外体，12小时后再在两只后爪注射抗原。48小时后测量足垫肿胀程度。
8.3.2结果衍生自同种异体DC的外体不能抑制DTH应答(图6)。相反，注射来自同系小鼠的Ad.FasL-转导的DC或DC/FasL-衍生的外体后观察到了DTH抑制。此外，用同系DC/FasL-衍生的外体局部处理导致处理爪和未处理的对侧爪的爪肿胀都减轻。体内结果还证实，Exo/FasL效应不是由于注射携带FasL的细胞膜而诱导的大范围凋亡。
8.4呈递FasL的外体对迟发型超敏反应的抑制是MHC II类依赖性的8.4.1材料和方法为进一步检测DC和外体的免疫调节特性，从MHC I类-和II类-缺陷型小鼠制备DC，并用Ad.FasL或Ad.Ψ5感染。将分离自MHC I类-和II类-缺陷型小鼠DC/FasL或DC/Ψ5的外体注射入KLH-免疫小鼠的后爪。
8.4.2结果注射来自I类缺陷型小鼠的基因修饰DC和DC-衍生的外体只有轻微疗效(图7A)。然而，注射来自II类MHC缺陷型小鼠的表达FasL的DC和DC-衍生外体导致治疗性抗炎症效应完全废除(图7B)。这些结果说明，DC/FasLd疗效是II类MHC而非I类依赖性的，这与CD4+T细胞调节DTH应答的主要作用一致(Ptak等，J Immunol.146469-475(1991))。此外，该结果还说明，外体与DC类似，也需要II类而非I类以调节DTH应答。
8.5外体介导的对迟发型超敏应答的抑制是抗原特异的8.5.1材料和方法为证实呈递FasL的外体能提供抗原依赖性免疫应答抑制，用KLH免疫小鼠。制备DC并用Ad.FasL或Ad.eGFP感染，然后用KLH或Ova蛋白脉冲给予(pulse)。从不同DC培养物制备外体并注射入免疫的小鼠，随后立即注射KLH以诱导DTH应答，48小时后进行测量。
8.5.2结果如图8所示，衍生自Ad.FasL感染、KLH脉冲DC的外体减轻了注射爪以及未处理的对侧爪的炎症。相反，衍生自Ova脉冲、表达FasL的DC的外体仅能适度抑制炎症，这与衍生自KLH处理过、Ad.eGFP感染的DC的外体类似。这些结果说明，衍生自表达FasL的DC的外体能够以抗原特异性方式抑制炎症。
8.6制备自FasL-缺陷型小鼠树突细胞的外体不能抑制迟发型超敏反应应答8.6.1材料和方法从野生型或gld(FasL-/-)小鼠分离DC和DC-衍生外体，并用对照腺病毒或表达FasL的腺病毒感染。将DC和DC-衍生外体注射回已用KLH免疫过的野生型小鼠足垫，12小时后向足垫注射KLH。然后测量注射抗原后的爪肿胀程度。将来自野生型和gld(FasL-/-)小鼠的外体也注射回lpr(Fas-/-)小鼠以证明外体和DC的作用需要受体小鼠内存在功能性Fas。
来自gld(FasL-/-)小鼠的DC和外体不能抑制注射爪和对侧爪的DTH应答，但如果用Ad.FasL转导gld DC和DC-衍生外体则该功能恢复(图9A)。此外，含有FasL的外体以及DC-FasL在lpr(Fas-/-)小鼠内无效(图9B)。
8.7给予携带FasL的外体缓解了胶原-诱导的关节炎模型中疾病的严重性为证实DC/FasL-衍生的外体可治疗胶原-诱导的关节炎，将外体注射入胶原诱导的关节炎的小鼠模型。
8.7.1材料和方法7-8周龄的雄性DBA/1 lacJ(H-2q)小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)，动物保存在匹兹堡大学生物技术中心无病原体的动物设备内。0.05 M乙酸中的浓度为2mg/ml的牛II型胶原(Chondrex)用等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化，然后注射入小鼠尾巴基部。
通过已有肉眼评分系统监测小鼠，按0-4评分0，正常；1，可检测到关节炎和红斑；2，明显肿胀和发红；3，从关节到足趾严重肿胀和发红；4，肿胀程度最大，关节强直并畸形。将肉眼评分的平均值表示为所有爪的累加值，每只小鼠的最大可能评分为16(n＝7)。
用Ad/FasL或Ad/Ψ5感染DC，并在第28天将分离自受感染DC的外体静脉注射入用牛II型胶原免疫的DBA1小鼠。
8.7.2结果用DC/FasL(图10A)和呈递FasL的外体(图10B)治疗在单次治疗后能延迟疾病发作并抑制关节炎发展，而Exo/Ψ5对照组相比DC对照和盐水对照显示出中等疾病抑制效应。这些结果说明，单次注射衍生自表达FasL的DC的外体能够抑制胶原-诱导的关节炎。类似地，将Exo/FasL注射入已经患病的小鼠(在第32天)也能抑制疾病。
9.实施例衍生自DC/IL-10的外体具有免疫抑制活性9.1呈递IL-10的BMDC-衍生外体的体外功能为证实BM-DC衍生的外体能够抑制T细胞增殖，检测了在混合淋巴细胞反应(MLR)中添加DC-衍生外体的功效。采用表达EB病毒编码的IL-10基因(称为病毒IL-10(vIL-10))的腺病毒转导的BMDC作为潜在的免疫抑制DC-衍生的外体的来源。已知关节内基因转移vIL-10能抑制兔抗原-诱导的关节炎(AIA)和鼠胶原-诱导的关节炎(CIA)模型中的炎症(5，6)。对照使用经表达萤光素酶的腺病毒载体(Ad.Luc)诱导的BM-DC。
9.1.1材料和方法载体构建和腺病毒产生按照已经描述的标准方法构建、增殖和滴定表达病毒IL-10的腺病毒(Ad.vIL-10)和表达增强型绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad.eGFP)(Kim等，Arthritis Res.2293-302(2000))。简言之，共转染DNA、腺病毒5-衍生的E1-和E3-删除的腺病毒主链(psi5)和腺病毒穿梭载体pAdlox之后，在293个表达Cre重组酶的细胞(CRE8细胞)内同源重组以产生重组腺病毒。在人CMV启动子控制下表达插入的cDNA序列。重组腺病毒通过CsCl梯度超速离心纯化、用无菌病毒储藏缓冲液透析、等分并储存于-80℃直到使用。CRE8细胞生长和维持在添加有10％胎牛血清的DMEM(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中。
混合淋巴细胞反应从BALB/c小鼠脾脏纯化T细胞以在圆底96孔板进行体外微量培养。在各孔中接种5×104个脾T细胞，以及对照C57BL/6衍生的DC或基因修饰的C57BL/6衍生的DC(vIL-10、rIL-10或萤光素酶)或从其中分离的外体。加入的DC与T细胞的比例为，T细胞∶DC之比为5∶1、10∶1、20∶1和40∶1。在培养的第5天，在各孔内加入1μCi3H-胸苷，16小时后收获。在微板Beta计数器(Wallac，Truku，芬兰)上测量增殖T细胞的放射性标记。
9.1.2结果通过3H胸苷掺入测量可知，当加入MLR时，用Ad.vIL-10转导的DC能够几乎完全抑制T细胞增殖，而加入非转导DC只显示出很少的作用或几乎没有作用(图11A)。用Ad.vIL-10感染的BMDC分泌的外体使T细胞增殖适度地降低4倍(图11B)。这些数据说明，分离自表达免疫抑制性vIL-10的DC的外体能够阻止T细胞增殖，而衍生自未修饰的BMDC的外体本身有具有部分抗炎症作用。
9.2呈递IL-10的外体在迟发型超敏反应模型中可抑制炎症为证实BMDC衍生外体的体内抗炎作用，采用了C57BL/6小鼠中的迟发型超敏反应模型。该模型曾经被用来显示在一个后足垫注射注射Ad.vIL-10能抑制注射足垫和对侧足垫的炎症。此外，过继性转移(adoptive transfer)试验已经显示，在DTH模型中局部递送Ad.vIL-10后观察到的对侧效应是由内源性APC造成的。在一组敏化小鼠的右后足垫注射未经处理或基因修饰的DC或衍生自这些细胞培养基的外体。对侧足垫注射相似体积的盐水。12小时后用20μgKLH攻击各足垫，并在诱导疾病24、48和72小时后监测足垫肿胀。
9.2.1材料和方法迟发型超敏反应在第0天皮下注射100μg用弗氏完全佐剂(Difco，Detroit，MI)1∶1乳化的抗原(OVA)以敏化小鼠。两周后，在预敏化小鼠的一个后足垫注射1×106经处理的DC(溶于50μl PBS)或1μg纯化的衍生自各试验DC组的外体(溶于50μlPBS)。试验DC组包括用50moi Ad.萤光素酶转导的DC和用50moi Ad.vIL-10转导的DC。对侧足垫注射等体积盐水。1天后，在两个后足垫注射20μg溶于50μl PBS的抗原以攻击小鼠，并在24小时、48小时和72小时后用弹簧卡尺(Dyer Co.Lancaster，PA)测量足垫。结果表示为由于肿胀造成的尺寸差异(mm×10-2)。
统计分析所有数据用Microsoft Excel软件分析。用斯氏t检验和ANOVA进行组比较。
9.2.2结果如图12所示，盐水对照动物的DTH应答是剧烈的，爪厚度平均增加了2mM。而接受1×106用Ad.vIL-10转导的BMDC的小鼠的注射足垫的足垫肿胀减少了50％以上。这些动物的盐水处理的对侧足垫的炎症也减低了(40％)。有趣的是，注射1微克衍生自Ad.vIL-10转导BMDC的分泌外体的保护作用更强，相比盐水对照小鼠抑制了65％爪肿胀。此外，在Ad.vIL-10/外体处理关节的对侧足垫中也观察到显著降低(图9A)。给予Ad.Luc/DC、Ad.Luc/外体、未处理DC或来自未处理DC的外体后未观察到足垫肿胀显著降低。这些数据说明，局部给予敏化小鼠衍生自Ad.vIL-10转导的BMDC的外体可抑制处理足垫和未处理的对侧足垫内的DTH。
9.3重组IL-10处理的DC-衍生外体有免疫抑制作用9.3.1材料和方法尽管上面进行的试验说明，衍生自Ad.vIL-10转导的DC的外体有免疫抑制作用，但这可能是由于外体制品内存在的低水平Ad.vIL-10或vIL-10蛋白污染造成的。为显示腺病毒感染或vIL-10蛋白污染不会造成所观察到的作用，用1μg/ml重组鼠科IL-10蛋白处理培养的BM-DC 24小时，利用实施例9所述的C57BL/6小鼠迟发型超敏反应模型体内检测产生的外体(图12B)。
9.3.2结果衍生自经重组鼠科IL-10处理的DC的外体在攻击48小时后产生强免疫抑制效应，这可由处理爪的爪肿胀降低6倍、且未处理的对侧爪的爪肿胀降低3倍得到证实。综合而言，这些结果证实，衍生自鼠科IL-10处理的BMDC的外体可抑制经处理的足垫和未处理的对侧足垫内的DTH，从而有效排除了腺病毒污染是造成这种效应的机制。重要的是，需要注意通过ELISA未测得外体制品内含有重组IL-10蛋白。
9.4膜破裂造成外体免疫抑制能力丧失9.4.1材料和方法为证实100,000×g富集团块组分中存在的外体对于在DTH模型中提供疗效是重要的，检测了这种功效对外体颗粒完整性的要求。
分离来自DC或经Ad.萤光素酶或Ad.vIL-10转导DC的外体并对它们进行4轮冻/融。通过SDS-PAGE分离5μg制品，并对其进行印迹以分析Hsc 70。
为了测试外体是否需要有完整的膜以抑制DTH应答，向KLH-免疫小鼠的一只后足垫注射1μg未处理的(完整的)或经冻/融的来自Ad-vIL-10转导DC的外体(图10C)。24小时后用KLH加强免疫各足垫并测量足垫肿胀程度。
9.4.2结果通过电子显微术证实了通过4轮冻/融能够破坏外体的完整性这一事实(图13A)。实际上，在经冻/融处理的外体组分中未测得可溶性外体相关蛋白Hsc 70(图13B)，而该蛋白与未处理的外体相关。
在用完整exo/vIL-10处理的组中观察到足垫肿胀的减轻，而注射冻/融处理的exo/vIL-10的组未显示出爪肿胀的减轻，其肿胀程度类似于用盐水或来自对照DC的外体处理的对照组。这些结果证明，多轮冻/融破坏了外体的膜结构，从而消除了外体在DTH模型中的免疫抑制能力。
9.5抑制迟发型超敏反应应答需要含II类MHC的外体下面的数据证实了耗竭II类MHC阳性外体对于抑制DTH应答的作用。
9.5.1材料和方法将来自Ad.vIL-10转导的BMDC的外体分成4组，各组用不同方法预处理之后再注射回敏化小鼠(图14A)。第一份外体样品用鼠科MHC II特异性的顺磁珠预吸附(Exo/vIL-10(MHC II IP))，第二份样品用特异于不在DC衍生外体上呈递的表面分子NK1.1的顺磁珠预吸附(Exo/vIL-10(IP对照))。第三份样品经历多轮冻/融(Exo/vIL-10(F/T))，而第四份样品未经处理。然后将外体样品注射回小鼠的后足垫，12小时后开始在接下来的72小时内测量两个后足垫的DTH诱导的足垫肿胀。
9.5.2结果来自对照DC的外体对足垫肿胀没有作用，而Ad.vIL-10/外体能够显著抑制注射足垫和未处理的对侧足垫的DTH。预吸附到NK1.1珠的外体制品显示出免疫抑制活性。然而，用II类珠预吸附Ad.vIL-10/外体样品使其体内活性几乎100％消除。重要的是，实际上，注射结合了II类阳性外体的顺磁珠导致免疫抑制活性类似于注射未吸附的Ad-vIL-10外体。来自重组小鼠IL-10蛋白处理的DC的外体在耗竭MHC II后显示出类似的DTH应答结果(图14B)。这些结果相互一致。经历几轮冻/融的来自Ad-vIL-10-或重组IL-10-处理的DC的外体制品几乎丧失活性(图13C)。这些数据说明，给予小鼠外体组分后观察到的体内抗炎症作用是II类MHC依赖的。由于II类MHC以高水平存在于外体表面，这说明在小鼠内观察到的体内活性归功于外体。此外，似乎还要求囊泡完整。这些体内抗炎症效应似乎是结构完整的II类MHC阳性外体特有的，从而有效排除了腺病毒污染起效机制。
9.6呈递IL-10的外体可在小鼠中抑制胶原-诱导的关节炎9.6.1材料和方法在4℃搅拌过夜以将牛II型胶原(Chondrex L.L.C.，Redmond，WA)以2mg/ml的浓度溶于0.05M乙酸，并用等体积弗氏完全佐剂(CFA)乳化。在尾巴基部用100μg胶原真皮内免疫小鼠。初次免疫后的第21天，对小鼠真皮内注射弗氏不完全佐剂(IFA)配制的II型胶原以加强免疫。通过已有肉眼评分系统隔天监测小鼠，按0-4评分0，正常；1，可检测到关节炎和红斑；2，明显肿胀和发红；3，从关节到足趾严重肿胀和发红；4，肿胀程度最大，关节强直并畸形。将肉眼评分的平均值表示为所有爪的累加值，每只小鼠的最大可能评分为16。再用弹簧卡尺测量每只爪的厚度，并将所有四只爪的厚度相加以计算各小鼠的爪肿胀。每组10只小鼠进行体内试验，重复两次以确保可再现性。
类风湿性关节炎(RA)是一种以末端动关节的慢性炎症和软骨组织的进行性破坏为特征的使人虚弱的全身性自身免疫疾病。可通过注射牛II型胶原在DBAl/lacJ(H-2kq)品系中诱导类似病理和关节炎症。为检测DC和DC-衍生外体治疗胶原-诱导的关节炎的能力，用Ad-vIL-10感染DC，然后将所得外体静脉注射到用牛II型胶原免疫的DBA1小鼠。注射在第28天进行，恰在疾病发作前。
9.6.2结果单次注射DC/vIL-10或来自DC/vIL-10的外体能够延迟关节炎的发作和减轻其严重性，而注射盐水的对照组疾病正常发展(图15)。该结果说明，单次注射衍生自表达IL-10的DC的外体对于自身免疫性炎性疾病的全身疗效与注射基因修饰的DC相当。
除了在疾病预防研究中分析了DC-衍生的外体，还在已经患有CIA的小鼠内测试了来自DC-IL-10的外体。将来自Ad.vIL-10-转导的或重组IL-10-处理的DC的外体静脉注射入患病小鼠(图16A-C)。虽然exo-IL-10-处理组的疾病抑制效果不及预防研究，但来自Ad.vIL-10转导的和重组IL-10-处理的DC的外体都能够减轻已有疾病的严重性(图16A)。此外，对外体进行冻/融处理消除了这种疗效(图16B)，而直接注射注射重组IL-10对疾病进展没有作用(图16C)。
10.实施例DC/IL-4衍生的外体具有免疫抑制活性10.1 DC/mbmIL-4和从其制备的外体能抑制迟发型超敏反应应答用携带膜结合形式IL-4的腺病毒载体(Ad.mbmIL-4)或阴性对照病毒(Ad.Psi5或Ψ5)转染树突细胞。从这些DC的一部分制备外体。然后在文中所述的小鼠足垫DTH模型中检测DC和外体。结果示于图17。DC/mbmIL-4和制备自DC/mbmIL-4的外体能抑制注射爪和对侧爪的DTH应答，证明了膜结合IL-4作为增强剂的功效。
10.2 DC/smIL-4和从其制备的外体能抑制迟发型超敏反应应答用携带可溶形式IL-4的腺病毒载体(Ad.sIL-4)或阴性对照病毒(Ad.Psi5或Ψ5)转染树突细胞。从这些DC的一部分制备外体。然后在文中所述的小鼠足垫DTH模型中检测DC和外体。结果示于图18。DC/smIL-4和制备自DC/smIL-4的外体能抑制注射爪和对侧爪的DTH应答，证明了可溶性IL-4作为增强剂的功效。
10.3 DC/mbmIL-4和从其制备的外体以及DC/FasL和从其制备的外体抑制迟发型超敏反应应答10.3.1材料和方法从未感染的或用Ad.eGFP对照载体、Ad.FasL或携带膜结合形式IL-4的腺病毒载体(Ad.mbIL-4)感染的C57/BL6骨髓衍生的DC分离外体。将纯化的外体(1μg总蛋白质)和不同的DC群(5×105细胞)注射入已预先对KLH免疫的小鼠的右足垫。注射外体或DC 24小时后，在右和左后足垫注射KLH抗原，并在48小时后测量治疗足垫和其左边对侧足垫的肿胀程度。
10.3.2结果为确定衍生自FasL或IL-4修饰DC的外体组分能够有效抑制DTH应答，从C57/BL6小鼠分离DC并通过腺病毒感染进行基因修饰以表达FasL或IL-4。在这些试验中，采用含有融合到IL-4的CD28跨膜区的膜结合形式的IL-4(mbmIL-4)。然后将DC和外体组分注射到右侧足垫，24小时后在两个后足垫注射抗原。有趣的是，DC和来自Ad.FasL和Ad.mbmIL-4感染DC的外体组分都能够抑制治疗爪以及对侧爪的炎性应答(图19)。该结果说明，外体及其亲本DC在局部注射后能通过抗原特异性机制发挥全身免疫抑制作用。不局限于任何特定理论，外体可在体内与引流淋巴结内的加工特定抗原的抗原呈递细胞相互作用，导致抗原特异性抑制。
10.4 DC/IL-4衍生的外体需要FasL和Fas从野生型和gld(FasL-/-)小鼠分离DC并进行修饰以表达可溶性(smIL-4)或膜结合(mbmIL-4)鼠科IL-4。将DC群体和DC-衍生外体注射回野生型或lpr(Fas-/-)小鼠的足垫，将抗原注射入足垫后测量对爪肿胀的影响。
分离自DC/IL-4(膜结合的或可溶的)的外体要求受体中含有FasL和Fas以抑制DTH应答(图20)。
10.5外体免疫抑制要求同源性(syngeneity)如图21A-B所示，仅制备自同系而非同种异体DC/mbmIL-4的外体能抑制鼠科足垫模型内的DTH应答，这与II类MHC抗原在外体-介导的免疫抑制中的作用一致。
10.6 DC/IL-4衍生的外体要求B7.1和B7.210.6.1.材料和方法从B7.1和B7.2(KO)缺陷型小鼠分离DC并用对照(Psi-5)或表达IL-4的腺病毒载体感染。然后将分离自不同DC群的外体注射入(1μg外体)KLH免疫小鼠的一只爪。测量注射和未处理爪的爪肿胀程度。
10.6.2结果如图22所示，衍生自通过腺病毒基因转移修饰以表达IL-4的野生型DC的外体能够抑制DTH应答，而衍生自B7.1/B7.2双GKO(“KO”)DC的外体对DTH应答无效。此外，B7缺陷型DC对DTH应答无效，类似于用B7缺陷型DC-衍生的外体观察到的结果。Lohr等也观察到在诱导T调节细胞以抑制糖尿病中对B7有类似需求(Lohr等，2003，Nature Immuno1.4664)。
此外，还观察到免疫抑制性DC和DC-衍生的外体能刺激可能代表调节T细胞群的CD4+CD25+T细胞群。
10.7衍生自DC/IL-4的外体在胶原-诱导的关节炎模型内能改善关节炎10.7.1材料和方法从模拟感染或用Ad.psi-5(对照)、Ad.mIL-4或Ad.mbmIL-4感染的DBA1骨髓衍生的DC分离外体。疾病发作后(第32天)将外体(1μg总蛋白质)静脉注射到DBA1小鼠。对各治疗组中每只小鼠的每只爪的关节炎严重性进行为期1个月的监测(用0-4评分，最大评分为16)。
10.7.2结果如图23所示，用制备自DC/IL-4，尤其是制备自DC/mbmIL-4的外体治疗能够阻止疾病发展(第32天时所有测试动物都显示出疾病病理征兆)。一些经治疗的小鼠似乎康复。
11.免疫抑制活性的过继性转移如图24A-B所示，用外体处理的小鼠CD11c细胞的过继性转移能阻断DTH应答，证明CD11c阳性细胞是免疫抑制性外体的调节靶点。
12.外体-介导的对糖尿病鼠类模型中高血糖的抑制12.1材料和方法从幼年NOD小鼠的骨髓产生DC并用Ad.IL-4感染或不感染。分离来自DC群的外体并将1μg外体静脉注射到5-6周龄的NOD小鼠，盐水(sale)处理作为对照。然后监测动物的高血糖情况。
12.2结果基于在CIA小鼠模型中观察到的显著疗效，还检测了免疫抑制性DC阻止低血糖发作的能力。静脉注射衍生自幼年NOD小鼠(3-4周龄)骨髓的经修饰以表达IL-4的DC，观察到如果在10周龄时开始注射，则NOD小鼠出现高血压的比例将降低。此外，还显示用来自NOD小鼠的骨髓衍生的DC处理能够抑制NOD小鼠高血糖的发作，所述DC经NF-κB抑制剂(双链NF-κB诱杀寡核苷酸)处理，这种处理可导致更加不成熟的DC表型(CD80、CD86和CD40低)。与这些观察以及CIA模型的结果一致，在胰岛炎早期给予经基因修饰以表达FasL的DC已显示可抑制NOD小鼠高血糖的发作(J.Mountz)。因此，经修饰以表达IL-4或FasL或者用NF-κB抑制剂处理的免疫抑制性DC能预防或逆转疾病。
如图25所示，在上述试验中，来自Ad.IL-4转导DC的外体能够延迟NOD小鼠高血糖的发作并能降低高血糖发作频率。
13.实施例制备自血清的外体13.1用血清抑制DTH应答13.1.1材料和方法真皮内注射KLH免疫C57BL6小鼠。两周后收集小鼠血液。样品1500g离心10分钟以分离血清。将总共50μl血清注射到KLH免疫小鼠的后爪，24小时后在两只后爪加强注射KLH抗原。KLH加强注射48小时后测量足垫肿胀。
13.1.2结果注射与珠一起培育24小时的幼稚小鼠的血清显示相比盐水处理的对照肿胀有一些减轻(见图26，组I)。注射未培育或与珠一起培育的KLH-免疫小鼠的血清显示相比盐水对照足垫肿胀有最大减轻(见图26，组II)。注射与或未与Minikin一起培育的KLH-免疫小鼠的血清显示相比盐水处理的对照肿胀有一些减轻(见图26，组III和IV)，Minikin是适合可分离自人和小鼠的血清量的小注射器(syringe)。
13.2来自血清的外体能抑制DTH应答13.2.1材料和方法通过真皮内注射KLH免疫小鼠。两周后收集小鼠血液并冰冻4小时。样品1500g离心10分钟以分离血清。然后通过差速离心分离外体。收集的血清1500g离心20分钟并3000g离心30分钟。将最后一次离心的上清液再在超速离心机中100,000g离心1小时。外体团用盐水洗涤，100,000g离心1小时，并重悬于盐水。
将1微克悬浮于50微升盐水的外体注射到KLH免疫小鼠后爪的足垫内。另一后爪给予相同量的盐水。24小时后向小鼠的两只后爪注射20微克悬浮于50微升盐水的KLH抗原。KLH加强注射48小时后测量足垫肿胀。
简言之，从各BMDC培养物回收的培养物上清在300g(5分钟)、1,200g(20分钟)和10,000g(30分钟)连续离心3次以除去细胞和碎片，然后100,000g离心1小时。为除去过剩的血清蛋白质，外体团用大体积PBS洗涤并在100,000g再离心1小时，最后(将所得团块)重悬于120μl PBS供进一步研究。
为获得微泡，在3,000g(20分钟)和10,000g(30分钟)离心血清并将团块重悬于盐水。超速离心除去外体团后得到血清上清液。上清液无需进一步离心。
13.2.2结果与给予盐水处理的对照或幼稚小鼠血清相比，给予DTH小鼠KLH-免疫小鼠的血清微泡、血清外体和全血清后产生肿胀减轻(图27)。外体产生最大肿胀减轻，比采用全血清造成的减轻更加显著(图27，组II)。来自KLH免疫小鼠的血清外体造成的肿胀减轻大于KLH-免疫小鼠的上清液、冻/融外体和经超声处理的外体，并且远大于未免疫小鼠的上清液和外体以及盐水处理对照(图28)。组VII用未免疫小鼠的全血清处理。组VIII是用盐水处理的对照组。给予来自KLH-免疫小鼠的血清外体造成的肿胀减轻大于来自OVA-免疫小鼠的血清外体(图29)。
13.3血清-衍生的外体以抗原特异的、II类MKC依赖的方式抑制迟发型超敏反应应答图30是显示纯化自小鼠血清的外体的电子显微照片。图31是用携带抗-II类MHC抗体的珠标记的血清-衍生外体的FACS分析。注意，所有II类阳性外体都是CD178(FasL)阳性的。
如图32所示，制备自经KLH免疫小鼠血清的外体可有效抑制对KLH的DLH，但制备自幼稚小鼠血清的抗体不行，这证明了抗原特异性。图33证明，携带II类MHC抗原的外体被耗竭的血清-衍生的外体制品基本丧失了所有免疫抑制活性，证明了血清衍生外体的MHCI类依赖性。图34显示，血清衍生外体的免疫抑制效应在用抗原免疫14天后达到峰值。
14.实施例制备自血清的外体在人类对象中有免疫抑制作用14.1含白细胞介素-1受体拮抗剂的血清(Orthokine)减轻了腰神经根痛进行随机双盲临床研究以评价经IL-1R拮抗剂调理的血清对于减轻84名患者腰神经根痛的作用。数据显示，衍生自如此调理的血清的外体能用来减轻疼痛感。
14.1.1材料和方法珠制备在微板(24和48孔，Nunc，丹麦)或60ml针筒(Perfusor Syringes，BectonDickinson，USA)内孵育血液。该针筒中装有200个玻璃珠。玻璃珠为直径2.5mm、表面积21mm2的医用玻璃珠。珠用无菌双蒸水洗涤直到其电导率小于0.3μS(HannaInstruments，USA)。将珠在50％v/v CrSO4(Merck，德国)中培育5分钟以修饰其表面。然后反复洗涤珠直到其pH与用来冲洗的蒸馏水相同，且电导率小于0.3μS(HannaInstruments，USA)。装有珠的微板或针筒通过高压灭菌或γ照射灭菌。
血培养技术在所有试验中，在装有珠的容器(微板或60ml针管)内填装从20-50岁健康男性或女性供体新鲜抽取的人全血，除非另有说明不加抗凝血药。在无菌层流条件(Kendro，德国)下建立全血培养物。在37℃、5％CO2(Kendro，德国)下无菌培育24小时。培育后将血清回收并离心(3500rpm，10分钟，Megafuge，Kendro，德国)。从微板回收200ml血清，从针筒回收10ml血清，这对应于原始血液总体积的约20％。将血清储存于-20℃。已知血清含有水平升高的白细胞介素-1-受体拮抗剂(IL-1Ra)以及水平升高的IL-4和IL-10(Meier等，Inflam Res.521-4(2003))。这种血清在商业上也称为Orthokine。
每周对患者作硬膜外神经周注射三次。每位患者在6个时间点(t1-t6)作主客观评价，其中包括直观类比标度(VAS)(Joyce等，Eur J Clin Pharmacol.14415-20(1975))，Oswestry疼痛问卷调查(Fairbank等，Spine，252940-2953(2000))，SF-36(健康调查摘要)(Ware等，Med.Care，30473-483(1992))，和标准化临床检查。注射入2毫升Orthokine。一组接受IL1-Ra调理的血清(Orthokine)，另一组接受10毫克去炎松，最后一组给予5毫克去炎松。去炎松是一种常用于治疗炎症、变态反应、关节炎和哮喘的甾类化合物。已经显示去炎松能有效减轻腰神经根痛(随机双盲研究，KramerEur Spine 1997)。
14.1.2结果每次注射后疼痛明显减轻(VAS)(p＜0.01)。Orthokine组和去炎松组之间有显著差别(p＜0.01)。在去炎松组中6周后(t4)疼痛增加，而在Orthokine组中疼痛持续减轻(图36)。去炎松5毫克组和10毫克组之间有显著差别。t1和t4之间的SESaff(情感性疼痛标度)明显减少，但组间没有差别(图37)。t1和t4之间的SESens(敏感性疼痛标度)明显减少，但组间没有差别(图38)。t1和t4之间的Oswestry评分明显减少，但组间没有差别(图39)。在三组中均没有显著的不良效应。
Orthokine组中观察到的结果明显优于低剂量和高剂量去炎松组所观察到的结果。
14.2 Orthokine血清含有外体14.2.1材料和方法外体组分制备自实施例16所述的血清制品。血清分离自人血。外体通过差速离心从血清富集，加载到Formvar/碳涂布网格上，用10μl中性1％磷钨酸水溶性负染，并用JEOL-1210计算机控制的高对比度120 kv透射电子显微镜观察。
14.2.2结果图40A-C清楚显示经富集的Orthokine血清中存在外体。
14.3从Orthokine血清制备浓缩的外体在经过特殊表面处理的针管(Orthokine针管)内培育全血以制造外体。在6-24小时时细胞从内质网分泌囊泡。每毫升全血添加5μg IL-1ra(IRAP)可增强该过程(下面的实施例A-D)。在实施例A-D中，培育之后在5000 g离心10分钟以将血清和血细胞分离。则血清中就含有不同量的外体。在100,000g第二次离心1小时以浓缩该囊泡。离心之后从20ml血清可得到约1ml体积的团块(在离心管底部，通过0.2μM滤膜滤入螺旋帽离心管)。之后将这1ml外体溶液注射给患者。有时单次注射较高剂量(例如，5份每份1ml浓缩的外体)。
14.4用浓缩的外体治疗人类对象14.4.1实施例A外体治疗前的状态对象是22岁的男性，患有青少年型类风湿性关节炎(Oligo-II型，伴有骶髂关节炎、髋关节炎、膝关节炎，HLA-B 27阳性)约10年。曾经用每周10mg MTX和每周5mg去氧皮质酮对他进行治疗，但他的右膝仍严重疼痛和肿胀；向其肿胀的关节注射类固醇没有任何改进。
在外体治疗前先作检查，对象血压为90/60mm Hg，肩活动性减退，外展50度。两膝都严重肿胀，伸直不足为10度。对对象膝盖进行X射线研究证明有积液但无显著软骨损伤，其髋部X射线研究显示有IV度软骨损伤并指出接受过髋关节成形术。验血显示CRP 9.9mg/dl；BSR 59；RF、CCP-AK和ANA均呈阴性。贫血11.3，血细胞511000μl。
总之，对象表现出严重的青少年型关节炎的临床症状，且常规治疗无法治愈。
外体治疗。如上文14.3所述从自体外周血制备外体。由于右膝是非常疼痛、肿胀且主要影响的关节，决定注射右关节。治疗目标是减轻右膝肿胀和疼痛以及对受到影响的其它关节产生疗效。向右膝关节内注射1ml从20ml经调理的血清制备的浓缩的外体，未出现并发症。
注射4周后两膝疼痛100％减轻，两膝的WOMAC评分显著降低，且双肩的疼痛100％减轻。CRP水平降至6mg/dl，相比治疗前的值，右膝肿胀减少3cm。患者对结果非常满意。
第一次注射浓缩的外体9周后，向右膝第二次注射1ml制备自20ml调理血清的浓缩外体，并向左肩关节和左膝关节分别关节内注射1ml制备自20ml调理血清的浓缩外体。发现右膝得到100％改善，左膝显示70％改善，肩膀显示80％改善。
第二次注射4周后(第一次注射13周后)，再用浓缩的外体治疗。
治疗后，通过独立风湿病学家的评价可以证实，患者的青少年型类风湿性关节炎得到缓解。因此，浓缩外体治疗相比MTX和类固醇在缓解疾病进程上似乎更加有效。
14.4.2实施例B外体治疗前的状态对象是65岁的男性，患有血清阳性类风湿性关节炎10年。他母亲也受该病折磨。对象有严重膝痛，Kellgreen显示有III-IV级软骨降解。MCP检查显示手关节疼痛，肩运动疼痛减轻，左膝积液，两侧髋内部旋转下降。验血显示SR 28/65；CRP 0.8mg/ml；RF 211 U/ml；ANA阴性，白细胞7900，血小板353000。X射线研究显示手有II级RA，膝盖有III-IV级RA。对象曾用金疗法治疗，在外体治疗期间继续接受金疗法。
外体治疗如14.3所述从自体外周血制备外体。两膝关节内各注射1ml制备自20ml调理血清的浓缩外体，未出现不良副作用。
注射4周后，重新检查患者，发现他在整个观察期非常良好地耐受了治疗。相比治疗前的值其症状改善了98％。WOMAC评分显示异常显著的良好测量结果(50-80％)。相比治疗前的值肿胀完全消失，外体治疗后关节直径减小了2cm。
4周后，相比外体治疗前的状态，左膝疼痛复发约50％，右膝约30％。向两膝分别第二次关节内注射1ml制备自20ml调理血清的浓缩外体。2周后，向两膝分别第三次注射1ml制备自20ml调理血清的外体，相比浓缩外体治疗前的疼痛状态，此时两膝改善了70％。
2个月后患者表示两膝疼痛相比外体治疗前改善了80％。WOMAC评分相比治疗前的值继续显著改善。
14.4.3实施例C外体治疗前的状态患者是20岁的女性，患有青少年型Morbus Still(已知8年)，伴有膝挛缩、两侧髋内假体、两侧侧膝软骨降解、骨质疏松和心包心肌炎。她曾经接受长期类固醇治疗，认为用例如抗TNF、类固醇、MTX及其组合难以治愈她的疾病。验血显示CRP 20mg/ml，BSR 98，所有其它参数都证实有严重免疫缺陷；白细胞增多为22900/nl，血小板增多为560000/nl。由于缺乏疗效，对象选择放弃她之前的治疗，之后半年血液参数基本未变。CRP值在12.3和11.5mg/ml之间，白细胞增多为22300/nl。浓缩外体治疗期间为给予其它临床治疗形式。
外体治疗。如14.3所述从自体外周血制备外体。向两膝分别关节内注射1ml制备自20ml调理血清的浓缩外体，未出现并发症。
2周后，向两肩分别关节内注射1ml制备自20ml调理血清的浓缩外体，无并发症。
第一次注射4周后，患者表示，相比治疗前的值，左肩疼痛改善100％，右肩改善70％，两膝改善100％。
第一次注射8周后，向右肩关节内注射1ml制备自20ml调理血清的浓缩外体。
第一次注射15周后，CRP从12.3mg/ml降至8.3mg/ml，对象报告说她的膝盖好转80％，肩好转60％。
第一次注射16周后，向两膝关节内注射浓缩外体。对象报告说膝和肩改善了80％，并声称其它关节也有50％以上的改善。患者表示，考虑到浓缩外体治疗后的改善，她不会再继续常规治疗。
第一次注射外体7个月后，患者经历了有益临床效果略微减退，并决定以增加外体剂量6倍。此时，CRP为8.6mg/ml，白细胞为22500/nl。向两肩分别关节内注射高剂量外体，即制备自100ml调理血清的5ml浓缩外体。
1周后，患者发现相比开始高剂量外体注射前改善了80％，肩运动得到改善，能外展30度；同时膝和手改善了50％。尽管只对肩进行了高剂量注射，但膝的WOMAC评分戏剧性地提高了50％以上。CRP降至7.2mg/dl，白细胞降至18800/ml。
14.4.4实施例D外体治疗前的状态患者49岁，有18年花粉热史并证实对草和花粉过敏。
外体治疗。如14.3所述从自体外周血制备外体。通过皮下注射给予5ml制备自100ml调理血清的浓缩外体，2周后，诸如打喷嚏和眼鼻发炎等花粉热症状显著减轻。打喷嚏的频率从每天124次降至每天0次。效果在花粉热季节持续。治疗未造成任何不良副作用。
14.5采用Orthokine血清进行的其它临床研究如上文14.1节和Meier等(Inflam Res.521-4(2003))的描述制备血清。对这些患者未使用其它外部IL-1ra，且未采用100000g离心步骤浓缩外体。因此，除未浓缩的外体群体还存在自体细胞因子和生长因子。
通过每周两次向各受影响的RA关节注射Orthokine血清(2ml/注射)、共注射4-6次来治疗56名之前用常规疗法治疗过或之前未治疗过的类风湿性关节炎和手关节改变的患者。临床随访最多持续4年。相比治疗前的值，3个月后的平均疼痛改善为65.31％SE 7.00。响应率(responder rate)为68.8％，说明3个月后，这些患者受影响关节的疼痛相比注射前的值至少改善了50％。平均而言，这些值的下降是治疗后时间的函数。向受影响的关节再同时注射类固醇相比Orthokine血清注射对3个月的疗效没有有益的、统计上显著的效果。未发生副作用。
本发明不限于这里具体描述的实施方案。实际上，除这里描述的实施方案外，通过上面的描述和附图，本发明的各种修饰是精通本领域的技术人员显见的。这种修饰在附加权利要求范围之内。
这里应用的各种公开的内容被全文纳入本文作为参考。
权利要求
1.一种在需要抑制免疫应答的对象中抑制免疫应答的方法，所述方法包括，给予所述对象有效量的从抗原呈递细胞培养物制备的外体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原呈递细胞被暴露于培养物中的增强剂。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原呈递细胞经基因工程改造以表达所述增强剂。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述抗原呈递细胞是树突细胞。
5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述增强剂是IL-4。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述增强剂是IL-4。
7.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述增强剂是IL-10。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述增强剂是IL-10。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述增强剂是FasL。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述增强剂是FasL。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答表现为关节炎。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述是类风湿性关节炎。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答是与创伤相关的炎症。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答表现为变态反应。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答表现为哮喘。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答表现为I型糖尿病。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答是自身免疫应答。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述自身免疫应答表现为选自下组的自身免疫疾病类风湿性关节炎、青少年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、舍格伦综合征、I型糖尿病、韦格纳肉芽肿病、多发性硬化、克罗恩病、银屑病、格雷夫斯病、口炎性腹泻、斑秃、中枢神经系统血管炎、桥本甲状腺炎、重症肌无力、古德帕斯丘综合征、自身免疫性溶血性贫血、格-巴二氏综合征、结节性多动脉炎、特发性血小板性紫癜、巨细胞动脉炎、原发性胆汁性肝硬变、阿狄森病、强直性脊柱炎、莱特尔综合征、大动脉炎和白癫风。
19.一种在需要抑制免疫应答的对象中抑制免疫应答的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的从血清制备的浓缩的外体。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，用于制备血清的外周血在有玻璃珠存在的条件下培育过。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，在有玻璃珠存在的条件下培育之前在所述外周血中加入增强剂。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述增强剂是白细胞介素1受体拮抗蛋白。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答表现为关节炎。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述关节炎是类风湿性关节炎。
25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答是与创伤相关的炎症。
26.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答表现为变态反应。
27.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答表现为哮喘。
28.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答表现为I型糖尿病。
29.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫应答是自身免疫应答。
30.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述自身免疫应答表现为选自下组的自身免疫疾病类风湿性关节炎、青少年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、舍格伦综合征、I型糖尿病、韦格纳肉芽肿病、多发性硬化、克罗恩病、银屑病、格雷夫斯病、口炎性腹泻、斑秃、中枢神经系统血管炎、桥本甲状腺炎、重症肌无力、古德帕斯丘综合征、自身免疫性溶血性贫血、格-巴二氏综合征、结节性多动脉炎、特发性血小板性紫癜、巨细胞动脉炎、原发性胆汁性肝硬变、阿狄森病、强直性脊柱炎、莱特尔综合征、大动脉炎和白癫风。
31.一种包含外体的组合物，所述外体通过在存在增强剂时培养抗原呈递细胞并从培养物上清收集外体而制备。
32.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述增强剂是细胞因子。
33.如权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述增强剂选自白细胞介素4或白细胞介素10。
34.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述增强剂是细胞因子抑制剂。
35.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述增强剂是白细胞介素-1受体拮抗蛋白。
36.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述增强剂是NFκB抑制剂。
37.一种包含外体的组合物，所述外体通过培养经改造以表达增强剂的抗原呈递细胞并从培养物上清收集外体而制备。
38.如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述增强剂是细胞因子。
39.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述增强剂选自白细胞介素4或白细胞介素10。
40.如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述增强剂是细胞因子抑制剂。
41.如权利要求40所述的组合物，其特征在于，所述增强剂是白细胞介素-1受体拮抗剂蛋白。
42.如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述增强剂是FasL。
43.一种包含外体的组合物，所述外体通过从血清收集外体而制备。
44.一种包含外体的组合物，所述外体通过从血清收集外体来制备，所述血清制备自外周血样品，所述外周血样品与玻璃珠一起培育过。
45.如权利要求44所述的组合物，其特征在于，在培育的外周血样品中加入增强剂。
46.如权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述增强剂是白细胞介素1受体拮抗蛋白。
全文摘要
本发明涉及用于介导免疫抑制反应的方法和组合物。本发明的组合物包含具有免疫抑制活性的外体。这种外体可衍生自各种不同细胞类型，其中包括抗原呈递细胞，如树突细胞和巨噬细胞。分离外体之前可通过基因工程改造细胞以使其表达能够增强所述外体免疫抑制活性的分子，和/或使细胞接触一种或多种试剂，如细胞因子或细胞因子抑制剂，这样也能够增强外体的免疫抑制活性。本发明还涉及这些外体在治疗与免疫系统不希望的活化有关的疾病和病症中的应用。本发明还包括直接分离自己显示被免疫抑制的血清的外体。
文档编号A61K39/38GK101022824SQ200580022591
公开日2007年8月22日 申请日期2005年7月1日 优先权日2004年7月1日
发明者P·D·罗宾斯, 金善嬉, P·韦林 申请人:匹兹堡大学联邦系统高等教育, 奥索根股份公司