抗体以及其利用的制作方法

专利名称：抗体以及其利用的制作方法
技术领域：
本发明涉及与淀粉样蛋白球体(amylospheroid)具有高反应性的抗体以及其利用。
背景技术：
现在，“异常结构蛋白”作为产生随年龄增长出现的许多神经变性疾病的共同机制引起注目，所述疾病诸如阿尔茨海默病，帕金森氏病，亨廷顿舞蹈病，以及朊病毒病，所述蛋白的分子性质也得到了研究。两种类型的纤维聚集体在脑内的沉积即主要由淀粉样β蛋白(Aβ)组成的老人斑的沉积(Selkoe，D.J.，Annu.Rev.Neurosci.，12，463-490，(1989)；和Glenner，G.G.and Wong，C.W.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，120(3)，885-890，(1984))；以及以磷酸化的tau蛋白为主要成分的神经原纤维变性的沉积(配对的螺旋纤丝(PHF))(Ihara，Y.et al.，J.Biochem.，99，1807-1810，(1986)；and Grundke-Iqbal，I.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83，4913-4917，(1986))已经作为阿尔茨海默病的病理特征被报道。在最近对被认为是由于多种病因导致的阿尔茨海默病的研究中，淀粉样β蛋白沉积已经被认为是出现所有此类疾病的共同途径。淀粉样β蛋白是从其前体物质(即淀粉样前体蛋白(APP))切割为40(Aβ1-40)或42(Aβ1-42)个残基组成的分子种类的肽，其在正常人中保持动态平衡的同时不断进行产生和分解。但是阿尔茨海默病中淀粉样β蛋白的过量沉积被认为是切割或分解过程中的失调的结果。本说明书中，前一种蛋白(Aβ1-40)可称为“淀粉样蛋白(amyloid)β40，”“淀粉样蛋白β40单体，”或“单体淀粉样β40蛋白”，后一种蛋白(Aβ1-42)可称为“淀粉样蛋白β42，”“淀粉样蛋白β42单体，”或“单体淀粉样β42蛋白”。少量的淀粉样蛋白被切割为43(Aβ1-43)个残基组成的分子种类，所述蛋白可称为“淀粉样蛋白β43，”“淀粉样蛋白β43单体，”或“单体淀粉样B43蛋白”。
沉积的淀粉样β蛋白作为神经毒素作用于神经元，导致突触变性以及随后的神经元细胞死亡。该机制被认为可导致选择性神经元脱落，从而导致阿尔茨海默病的进行性痴呆。还报道淀粉样淀粉样β蛋白在细胞外作为水溶性肽释放时不显示神经元细胞死亡活性(下文中术语“神经元细胞死亡活性”也称为“毒性”)，并且淀粉样β蛋白本身聚集并形成淀粉样蛋白β纤维，由此它们获得毒性(Lorenzo，A.and Yankner，B.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，12243-12247，(1994))。当含有包含淀粉样β纤维的毒性淀粉样β蛋白的溶液以高浓度加入培养的神经元时，已知导致所述神经元死亡。因此，淀粉样β纤维被认为是诱导阿尔茨海默病中神经元细胞死亡的物质。
因此，认为其中通过添加包含淀粉样蛋白β纤维的毒性淀粉样β蛋白来诱导神经元细胞死亡的实验系统反应了阿尔茨海默病中的神经元细胞死亡，并且通常用于筛选神经元细胞死亡抑制物等。但最近几年中，报道了以下事实，提示淀粉样β蛋白的毒性物质不是淀粉样β纤维。即，(1)诱导神经元细胞死亡所需的含毒性淀粉样β蛋白溶液中的淀粉样蛋白β纤维的浓度是数十μM(Yankner，B.A.，et al.，Science，250，279-282，(1990))，其为阿尔茨海默病患者脑中浓度的1,000以上；(2)阿尔茨海默病患者脑中沉积的淀粉样蛋白β纤维的量不总与高级功能(诸如记忆或认知功能)受损相关，并且即使大量淀粉样蛋白β纤维沉积临床也可无症状出现；(3)淀粉样蛋白β沉积的位点不总是与脑内神经元脱落的位点一致；(4)在APP-过表达型小鼠的脑中出现淀粉样蛋白β纤维的沉积之前或不出现沉积的情况下，观察到学习行为异常；和(5)阿尔茨海默病患者的脑中水溶性淀粉样β蛋白含量的增加在其沉积之前10年或更多年出现。
本发明人提供了一种溶液，其中含有的高毒性自聚集型淀粉样β蛋白在与存在于阿尔茨海默病或其它疾病患者的机体内的自聚集型淀粉样β蛋白的浓度相等的浓度下诱导神经元细胞死亡，还提供制备所述溶液的方法(JP专利公开(Kokai)No.2001-247600 A)。本发明人还发现分离上述含有自聚集型淀粉样β蛋白的溶液中所含的神经毒素并分析神经毒素的方法。结果，发现所述神经毒素是直径大约10nm-20nm的颗粒形式的自聚集型淀粉样β蛋白，并且这些颗粒称为淀粉样蛋白球体。根据所述称谓，直径大约10nm-20nm的颗粒形式的自聚集型淀粉样β蛋白在本文称为“淀粉样蛋白球体”。
淀粉样蛋白球体在浓度等于存在阿尔茨海默病患者脑内的淀粉样β蛋白的浓度时诱导神经元细胞死亡，并且使得tau蛋白磷酸化，其是淀粉样蛋白球体导致神经死亡的过程中的另一病理标志。由于这些机制与阿尔茨海默病的病理情况一致，淀粉样球体被认为是脑内淀粉样β蛋白的毒素。如果获得(1)抑制淀粉样球体形成的抗体或(2)抑制淀粉样球体对神经元细胞的毒性的抗体，相应地，所述抗体可用作阿尔茨海默病的治疗或预防性药剂。如果获得(3)与淀粉样球体的反应性高于与淀粉样蛋白β单体或淀粉样蛋白β纤维的反应性的抗体，所述抗体可用于诊断阿尔茨海默病的实验中。
制备与淀粉样蛋白球体抗原反应的抗体的方法是已知的。但是，具有前述性质(1)-(3)的抗体目前还没有获得，原因如下。即，(a)淀粉样蛋白球体是淀粉样β蛋白的聚集体，并且通常难以获得与聚集型蛋白反应的抗体，(b)淀粉样蛋白球体聚集的机制或结构与功能之间的关系不清楚，并且抗体的功能(1)和(2)所需的必需抗原部分不清楚。因此，获得与淀粉样蛋白球体特异性反应并抑制该蛋白对神经元细胞的毒性的抗体尤其困难。

发明内容
本发明要解决的问题本发明涉及获得与淀粉样蛋白球体的反应性高于与淀粉样蛋白β纤维的反应性的抗体，具有对淀粉样蛋白球体的高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体对神经元细胞的毒性或者抑制淀粉样蛋白球体形成的活性的抗体，以及具有对单体淀粉样β蛋白的高反应性和抑制淀粉样蛋白球体形成的活性的抗体。此外，本发明涉及提供产生前述任意抗体的杂交瘤。此外，本发明涉及提供利用前述任意抗体筛选阿尔茨海默病的治疗和/或预防药剂以及检测患有阿尔茨海默病的个体的方法。此外，本发明涉及提供使用上述任意抗体的药物，诸如神经元保护剂，淀粉样蛋白球体形成抑制剂，阿尔茨海默病检测剂，以及阿尔茨海默病的治疗和/或预防药剂。此外，本发明涉及提供用于检测上述任意抗体的固相支持物。
解决本发明问题的方法本发明人进行了集中的研究以实现解决上述目的。具体地，他们用淀粉样蛋白球体皮下免疫了新西兰白兔，并且利用不同类型的佐剂重复该方法9次。他们通过点印迹分析或电子显微镜观察分析了从这些兔获得的血清与淀粉样球体的亲和力，以获得多克隆抗体。它们发现所述抗体对淀粉样球体的反应性高于对淀粉样蛋白β纤维的反应性，并具有抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性，和抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。此外，他们成功地从用淀粉样蛋白球体免疫的BALB/c小鼠的脾细胞建立了识别的表位类似于前述多克隆抗体所识别表位的单克隆抗体。本发明已经基于所述发现完成。
具体地，本发明提供以下发明(1)具有任何一种或一种以上的以下性质的抗体(i)与淀粉样蛋白球体的反应性高于与淀粉样蛋白β纤维的反应性；(ii)与淀粉样蛋白球体高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性；(iii)与淀粉样蛋白球体高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体形成的活性；和(iv)与单体淀粉样β蛋白高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。
(2)项(1)的抗体，在实验系统中其显示与淀粉样蛋白球体的反应性是其与淀粉样蛋白β纤维的反应性的至少2倍，所述实验系统中抗体与淀粉样蛋白球体的反应性和其与淀粉样蛋白β纤维的反应性在相同抗体浓度、抗体量、抗原蛋白浓度以及抗原蛋白量的条件下进行比较。
(3)项(1)或(2)的抗体，在实验系统中其显示与淀粉样蛋白球体的反应性是其与淀粉样蛋白β纤维的反应性的至少10倍，所述实验系统中抗体与淀粉样蛋白球体的反应性和其与淀粉样蛋白β纤维的反应性在相同抗体浓度、抗体量、抗原蛋白浓度以及抗原蛋白量的条件下进行比较。
(4)项(1)-(3)之一的抗体，在实验系统中其显示与淀粉样蛋白球体的反应性是其与单体淀粉样β蛋白的反应性的至少2倍，所述实验系统中抗体与淀粉样蛋白球体的反应性和其与单体淀粉样β蛋白的反应性在相同抗体浓度、抗体量、抗原蛋白浓度以及抗原蛋白量进行比较。
(5)项(1)-(4)之一的抗体，在实验系统中其显示与淀粉样蛋白球体的反应性是其与单体淀粉样β蛋白的反应性的至少5倍，所述实验系统中抗体与淀粉样蛋白球体的反应性和其与单体淀粉样β蛋白的反应性在相同抗体浓度、抗体量、抗原蛋白浓度以及抗原蛋白量的条件下进行比较。
(6)项(1)-(5)之一的抗体，其利用淀粉样蛋白球体作为抗原获得。
(7)项(1)-(6)之一的抗体，其是多克隆抗体。
(8)项(1)-(7)之一的抗体，其是单克隆抗体。
(9)项(8)的单克隆抗体，其与淀粉样蛋白球体的解离常数不超过10-9。
(10)项(1)-(9)之一的抗体，其识别单体淀粉样β蛋白的N末端作为表位。
(11)单克隆抗体，其通过具有任意以下保藏号(接收编号)的杂交瘤产生FERM ABP-10392，FERM ABP-10393，或FERMABP-10394。
(12)具有任意以下保藏号(接收编号)的杂交瘤FERMABP-10392，FERM ABP-10393，或FERM ABP-10394。
(13)筛选阿尔茨海默病的治疗和/或预防药剂的方法，其包括使得分析物以及项(1)-(11)之一的抗体接触淀粉样蛋白球体，通过利用分析物与淀粉样蛋白球体的亲和力作为指标选择候选物。
(14)检测患有阿尔茨海默病的个体的方法，包括使从阿尔茨海默病的疑似个体获得的生物样品与根据项(1)-(11)之一的抗体接触，并检测所述样品中与该抗体反应的物质的有无。
(15)神经元保护剂，其包含根据项(1)-(11)之一的抗体。
(16)淀粉样蛋白球体形成的抑制剂，其包含根据项(1)-(11)之一的抗体。
(17)检测阿尔茨海默病的药剂，其包含根据项(1)-(11)之一的抗体。
(18)药物，其包含根据项(1)-(11)之一的抗体。
(19)阿尔茨海默病的治疗和/或预防药剂，其包含根据项(1)-(11)之一的抗体。
(20)用于检测根据项(1)-(11)之一的抗体的固相支持物，其用淀粉样蛋白球体包被。
此外，本发明涉及利用上述抗体，筛选阿尔茨海默病的治疗性和/或预防性药剂的方法，检测患有阿尔茨海默病的个体的方法，以及诸如阿尔茨海默病的治疗和/或预防剂的药物。这些将在下文详细描；但是以下组成部分仅仅是本发明的实施方案(代表性实例)并不意图限制本发明的范围。
(1)抗-淀粉样蛋白球体抗体根据本发明的第一方面，本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体与淀粉样蛋白球体的反应性高于与淀粉样蛋白β纤维的反应性。术语“与淀粉样蛋白球体的反应性”指与通过下述方法形成的淀粉样蛋白球体反应的抗体。所述抗体的反应性可利用普通技术测定。如果利用所述技术测定活性的情况中该抗体与淀粉样蛋白球体的反应性高于其与淀粉样β纤维的反应性，该感兴趣的抗体在本发明的范围内。根据优选的实施方案，抗体与淀粉样蛋白球体的反应性大约是其与淀粉样β纤维的反应性的至少2倍，并优选至少10倍。本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体也包括与淀粉样蛋白球体特异性反应但不与淀粉样蛋白β纤维反应的抗体。此外，本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体也包括与淀粉样蛋白球体的反应性高于与单体淀粉样β蛋白的反应性的抗体。在所述情况中，抗淀粉样蛋白球体抗体与淀粉样蛋白球体的反应性优选为其与单体淀粉样β蛋白的反应性的大约至少2倍，更优选大约至少5倍(比较利用相同抗体浓度，抗体量，抗原蛋白浓度，以及抗原蛋白量获得的反应性)。如下文所述，与淀粉样蛋白球体的反应性高于与单体淀粉样β蛋白的反应性的抗体中，具有大约至少5-10倍更高反应性的抗体具有更高水平的抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。
本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体对其显示高反应性的“淀粉样蛋白球体”是自聚集的单体淀粉样β蛋白，其为粒状形式。“粒状形式”可为任何粒状形式，并且其包括颗粒，细粒，晶体和聚集体。粒径通常为约10-20nm，优选约10-15nm，更优选约10-12nm，具体优选约12nm。淀粉样蛋白球体在蛋白浓度为1μg/ml或更低优选约0.45μg/ml或更低时具有高水平的诱导神经元细胞死亡的活性。当经由甘油密度梯度离心时，具有所述性质的淀粉样蛋白球体获自甘油含量为大约15％或更高的级分。
本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体与抗原的反应性可经由例如常规免疫测定技术，诸如Western印迹，点印迹或ELISA，或电子显微镜观察测定。在所述情况中，对照淀粉样β蛋白单体是由大约40个氨基酸残基组成的蛋白，并且其通过蛋白酶在体内的加工从淀粉样前体蛋白(APP)产生。根据蛋白酶类型或以后的修饰，已知存在多种所述蛋白。分泌后即刻，根据C末端氨基酸残基的长度差异，主要存在淀粉样β40(Aβ1-40SEQ ID NO1)和淀粉样β42(Aβ1-42SEQ ID NO2)，存在较少量的淀粉样β43(Aβ1-43SEQ IDNO3)，并且淀粉样β蛋白单体包括两种所述蛋白，其部分多肽，以及其衍生物。术语“淀粉样蛋白β纤维”指淀粉样β蛋白自聚集形成的纤维体，并且其具有神经元死亡活性。例如，所述淀粉样蛋白β纤维获自生物体或通过Lorenzo，A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，12243-12247，(1994)所述的方法制备。
根据第二方面，本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体具有与淀粉样蛋白球体的高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性。术语“淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡”指通过前述方法或下文所述方法制备的淀粉样蛋白球体具有诱导神经元细胞死亡的活性，并且诱导的细胞死亡可为凋亡或坏死。神经元细胞没有具体限制，并且可使用获自哺乳动物(例如人，大鼠，小鼠，猴或猪)的神经元细胞。原代细胞的实例包括获自前述动物的海马、基底前脑以及大脑皮质的细胞。原代培养细胞也包括通过培养前述动物的器官诸如海马获得的细胞。例如，具有所述活性的抗淀粉样球体抗体与淀粉样球体的反应性高于其与淀粉样β纤维或单体淀粉样β蛋白的反应性。优选使用与淀粉样蛋白球体的反应性高于与单体淀粉样β蛋白的反应性大约10-20倍的抗淀粉样球体抗体.
本发明的抗淀粉样球体蛋白抗体抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性指完全抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的能力。根据抗体剂量，所述活性还可包括部分抑制。测定抑制活性的具体方法在下文描述。
根据本发明的第三方面，本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体具有与淀粉样蛋白球体的高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。“具有抑制淀粉样蛋白球体形成的活性”的情况指适当量的本发明抗-淀粉样蛋白球体抗体的存在导致在单体淀粉样β蛋白经过自聚集形成淀粉样蛋白球体的条件下阻断淀粉样蛋白球体形成。在所述情况中，抗淀粉样蛋白球体抗体的丰度根据每种抗体与单体淀粉样β蛋白的反应性而不同。例如，抗-淀粉样蛋白球体抗体的量优选为单体淀粉样β蛋白的量的大约2-20倍(摩尔比)。所述抗-淀粉样蛋白球体抗体的实例是与单体淀粉样β蛋白的反应性特别高的抗体。具有抑制淀粉样蛋白球体形成的活性的抗体的实例包括具有与淀粉样蛋白球体和单体淀粉样β蛋白的高反应性以及与淀粉样蛋白球体的反应性超过与单体淀粉样β蛋白的反应性大约5-10倍的抗体。
不形成淀粉样蛋白球体的情形可通过任何方法确定，条件是所述方法可观察出淀粉样蛋白球体不显示任何前述活性。具体地，可通过例如电子显微镜观察，原位原子力显微镜观察(in-situ atomicforce microscope observation)，筛分(sieve)分析，层析或沉降来分析淀粉样蛋白球体的颗粒大小的分布和粒径。电子显微镜观察是尤其优选的。产生本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体的具体方法以及分析前述性质的方法在下文详细描述。
根据第四方面，本发明的抗体与单体淀粉样β蛋白具有高反应性并具有抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。
(2)淀粉样蛋白球体(抗原)的制备本发明的抗体可利用具有以下性质的淀粉样蛋白球体作为抗原获得。本发明中，淀粉样蛋白球体是颗粒形式的淀粉样β蛋白的自聚集体。“颗粒形式”可为任何粒状形式，并且其包括颗粒状、细粒状、结晶、凝集块等。粒径通常为约10-20nm，优选约10-15nm，更优选约10-12nm，具体优选约12nm。淀粉样蛋白球体在以下浓度具有高水平的诱导神经元细胞细胞死亡的活性约1μg/ml以下，更优选约0.45μg/ml以下。当经由甘油密度梯度离心分级时，具有所述性质的淀粉样蛋白球体获自甘油含量大约15％以上的级分。
所述淀粉样蛋白球体可通过首先使含有淀粉样β蛋白的含水溶液对流(第一步)来制备。为了有效制备含有淀粉样蛋白球体的溶液，将经对流的含水溶液中的淀粉样蛋白球体分级(第二步)。任何上述含有淀粉样蛋白球体的溶液可用作抗原来制备本发明的抗体。
上文中，术语“淀粉样β蛋白“指大约40个氨基酸残基组成的蛋白，其通过蛋白酶在体内从淀粉样前体蛋白(AP)产生。根据蛋白酶类型以及以后的修饰，已知存在多种这样的蛋白。分泌后即刻，根据C末端氨基酸残基长度的不同，主要存在淀粉样β40(Aβ1-40SEQ ID NO1)和淀粉样β42(Aβ1-42SEQ ID NO2)，以及较少量的淀粉样β43(Aβ1-43SEQ ID NO3)。例如，淀粉样蛋白球体优选利用分泌后即刻的淀粉样β蛋白全长分子种类AβX-40，AβX-42，或AβX-43，其突变体，或其衍生物制备。其中尤其优选Aβ1-40或Aβ1-42。可以使用任何淀粉样β蛋白，例如，利用肽合成物合成的淀粉样β蛋白，出售的淀粉样β蛋白，或从生物样品提取并纯化的淀粉样β蛋白。合成的肽用作淀粉样β蛋白的情况下，所述肽可经由常用技术合成、提取或纯化。合成的肽可纯化到可通过高效液相色谱获得单个峰的程度。纯化通过例如凝胶过滤或高效液相色谱进行。术语“淀粉样β蛋白”在本文可称为“淀粉样蛋白β单体”或“单体淀粉样β蛋白”。例如，由此获得的淀粉样β蛋白溶于无菌纯化水，并利用所得溶液制备含有淀粉样蛋白球体的溶液。用于溶解的无菌纯化水的量可适宜地确定，只要淀粉样β蛋白可溶解于其中。例如，含水溶液中淀粉样β蛋白的含量优选为约50nM-约2mM，更优选约1μM-约1mM，更优选约50-约700μM。优选调节所述溶液使其具有适宜盐浓度。盐浓度可为任何水平，只要淀粉样β蛋白可溶于其中。例如，最终pH水平为约3-约11，优选约5.5-约8.5，更优选约7.5，盐浓度优选大约1M以下。盐浓度可通过例如将PBS(-)加入等量的淀粉样β蛋白水溶液来调节。淀粉样β蛋白可通过任何方法溶解而没有特别限制，只要淀粉样β蛋白可以以适宜盐浓度完全溶于等量的溶液。
制备含淀粉样蛋白球体的溶液的第一步根据例如JP专利公开(Kokai)No.2001-247600 A公开的方法进行。由此获得的含淀粉样蛋白球体的溶液具有诱导神经元细胞死亡的活性并且在该状态下可用作本发明的抗原。可进行分级作为第二个步骤来获得具有较高神经元细胞死亡活性的级分。分级可根据例如JP专利公开(Kokai)No.2002-105099 A中描述的方法进行。如需要，由此获得的含淀粉样蛋白球体的溶液可经过诸如浓缩的处理然后在以下免疫步骤中用作抗原。
淀粉样蛋白球体形成可通过例如下文所述的分析神经元细胞死亡活性的方法或通过在电子显微镜下进行检查来证实。电子显微镜检查可通过任何方法进行，只要可分析淀粉样蛋白球体的粒径并且可观察淀粉样蛋白球体的自体聚集而没有任何损伤。具体地，例如将30℃-40℃的蒸馏水引入直径大约18mm的培养皿，将大约30μl 1.5％(W/V)火棉胶的乙酸异戊酯溶液逐滴施加于溶液表面，立即获得溶剂蒸发产生的薄膜。将该支持膜加于栅格并干燥，碳真空蒸镀，利用辉光放电亲水化装置对表面进行亲水化处理。随后，将支持膜置于其上的栅格表面朝下放置，与制备的含淀粉样蛋白球体的溶液的液滴接触，随后立即用滤纸擦去多余水分，加入乙酸铀的溶液进行观察。电子显微镜观察优选在100-120kV的稳定高压加速的条件下，通过利用栅格边缘校正散光等防止样品受到电子光束的破坏，减少电子线导致的损伤来进行。
(3)利用淀粉样蛋白球体作为抗原制备抗体上文(2)记载的利用淀粉样蛋白球体作为抗原获得抗体的方法不受具体限制，条件是所述方法可产生具有以下性质的抗体(a)与淀粉样蛋白球体的反应性高于与淀粉样蛋白β纤维的反应性；(b)与淀粉样蛋白球体高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性；和(c)与单体淀粉样β蛋白和/或淀粉样蛋白球体高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。具体地，下文详细描述的方法是优选的。
结合用作载体的蛋白诸如KLH(匙孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin))、BSA(牛血清白蛋白)或OVA(卵白蛋白)，或聚合物或与其聚合的上文(2)中描述的淀粉样蛋白球体，通常用作免疫用抗原，但是载体不是必需使用的。免疫用抗原可通过混合经由不同载体结合法制备的数种类型的抗原来制备。
免疫使用的动物没有特定限制，可使用兔、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠和鸡中的任何一种。经皮下、肌内或腹腔内利用免疫用抗原对动物进行免疫接种，所述免疫用抗原通过利用完全或不完全弗氏佐剂充分混合抗原来制备。每2-5周进行接种并持续到通过接种抗原免疫的动物的抗体反应性充分升高。只要经免疫的动物的抗体反应性充分提高，待接种的抗原的量就没有特定限制。具体地，所述剂量优选约1到约100μg。另外，优选重复进行免疫，直到作为从经免疫的动物获取血样并如下文所述测定血液中所含抗体与抗原的反应性的结果，与淀粉样蛋白球体的反应性超过与单体淀粉样β蛋白的反应性。具体地，优选重复免疫5-20次。为了获得本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体，优选在第一次免疫中使用完全弗氏佐剂并在随后的免疫中使用不完全弗氏佐剂。
血液，腹水或其它样品在最后的免疫后7-10天自动物提取。优选，例如，对经免疫的动物进行放血，通过离心或其它方法制备血清。血清中所含本发明抗-淀粉样蛋白球体抗体的反应性可经由任何方法分析，只要与上文(2)中制备的淀粉样蛋白球体的反应性可进行分析。例如，淀粉样蛋白球体利用荧光物质标记，允许标记的淀粉样蛋白球体与血清反应，并测定与抗体结合的标记用物质的活性。所述方法的具体实例包括上述电子显微镜观察，酶联免疫测定，诸如下文所述的ELISA，Western印迹和斑点印迹。当本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体与淀粉样蛋白β纤维的反应性将被测定或比较时，经由电子显微镜观察的方法是优选的。在单体淀粉样β蛋白和其自聚物淀粉样蛋白球体的反应性将被测定并比较时，优选点印迹或酶联免疫测定法诸如ELISA。可比较与淀粉样蛋白β纤维，单体淀粉样β蛋白或其部分多肽特异性反应的抗体的反应性以选择并获得本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体。
抗体可通过用于分离和纯化免疫球蛋白的常规方法来分离和纯化。所述方法的具体实例包括盐析法，醇沉淀法，等电点沉淀法，电泳，在离子交换物上吸附，超速离心，凝胶过滤，和利用抗原-抗体偶联物或活性吸附剂经由吸附选择性分离特定抗体。
由此制备的抗体是多克隆抗体，其可主要由IgG组成并含有其它免疫球蛋白诸如IgM或IgA。
制备单克隆抗体的情况中，通常仅仅将淀粉样蛋白球体作为抗原经静脉内注射到待免疫的动物，2-5天优选3后提取被认为含有产抗体细胞的脾或淋巴结，然后将脾细胞或淋巴细胞与肿瘤细胞融合。随后，分离经由细胞融合永生化的产抗体细胞(杂交瘤)。通常，本发明所用肿瘤细胞优选与自经免疫的动物制备的脾细胞或淋巴细胞的物种相同。获自其它动物的肿瘤细胞也可使用。
可使用的肿瘤细胞的实例包括骨髓瘤细胞，诸如p3(p3/x63-Ag8)，P3U1，NS-1，MPC-11，SP2/0-Ag14，FO，x63.6.5.3，S194，和R210。细胞融合可根据常用技术进行，诸如例如“单克隆Antibody Experimentation Manual”(Kodansha Scientific，1987)中描述的方法或G.KHLER and C.MILSTEIN，Nature，256，495，(1975)中描述的方法。细胞融合可通过将细胞融合促进剂加入包含悬浮在其中的目的细胞的融合培养基来进行。细胞融合促进剂的实例包括日本凝血病毒和平均分子量1,000-6,000的聚乙二醇。为了进一步提高融合效率，可将辅助药剂诸如二甲基亚砜或细胞因子诸如IL-6加入融合培养基。肿瘤细胞与免疫的脾细胞或淋巴细胞的混合比例可为大约1∶1-1∶10。
各种类型的常用培养基诸如ERDF，RPMI-1640，MEM，或GIT培养基可用作所述融合培养基。在融合时，通常优选从培养基去除血清诸如胎牛血清(FBS)。融合通过将给定量的经免疫的脾细胞或淋巴细胞与肿瘤细胞在培养基中充分混合，加入已经预先加热到37℃的聚乙二醇溶液，使其在培养基中的浓度达到约25％-约50％，允许这些细胞在优选30℃-37℃相互反应约1-10分钟。然后，重复包括逐次添加合适的培养基，离心以及去除上清的步骤。
将目的杂交瘤培养在普通的选择培养基中，诸如HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基)。在HAT培养基中，培养可进行一段时间，其足够长以使得除目的杂交瘤以外的细胞(例如未融合的细胞)死亡。通常，培养可持续数天到数周。
所得杂交瘤产生的抗体包含在杂交瘤的培养上清中。抗体的反应性，反应特异性或其它性质可以与测定多克隆抗体的方法相同的方式进行测定，从而可选择性获得产生本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体的杂交瘤。
可经由有限稀释克隆获得的杂交瘤以获得产生单一单克隆抗体的杂交瘤。这些杂交瘤克隆培养在含有大约1-大约10％ FBS并事先去除了牛抗体(IgG)的培养基中或无血清培养基中，所得的培养物上清用作用于纯化目的单克隆抗体的起始物质。可选，所得的杂交瘤克隆可植入事先给药了姥鲛烷的Balb/c或Balb/c(nu/nu)小鼠的腹腔，10-14天后，取样含有高浓度单克隆抗体的腹水，并且可利用腹水样品作为起始物质作为纯化目的单克隆抗体。单克隆抗体可通过用于纯化免疫球蛋白的常规方法来纯化。所述方法的实例包括硫酸铵分级法，聚乙二醇分级法，乙醇分级法，阴离子交换层析，以及涉及使用结合了蛋白A、蛋白G、抗小鼠免疫球蛋白抗体等的柱的亲和层析。
由此获得的本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体可以所述状态使用，或其可作为通过常规木瓜蛋白酶消化获得的Fab的形式或通过常规胃蛋白酶消化获得的F(ab′)2或F(ab′)的形式使用。此外，本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体包括人源化的抗体，其通过获得含有该抗体H链和L链的两个可变区中的互补决定区(CDR)或者高变区等的片段，通过常规技术获得编码所述片段的基因，以及人源化所述抗体来获得。此外，本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体包括通过噬菌体展示技术或利用产生人抗体的小鼠制备的完全人抗体。此外，本发明包括前述产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
(4)测定抗-淀粉样蛋白球体抗体与抗原的反应性下文中，提供了用于测定本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体与抗原的反应性的具体方法ELISA和点印迹的实例。ELISA的实例包括固相ELISA和液相ELISA。可测定本发明的抗淀粉样球体蛋白抗体与抗原的解离常数。抗体的解离常数可利用利用诸如BIACore(BIACORE)或经由与其一致的方法来测定。
(a)利用淀粉样蛋白球体包被的固相支持物以及固相淀粉样蛋白球体ELISA利用淀粉样蛋白球体包被的固相支持物，可测定抗淀粉样球体蛋白与抗原的反应性来检测所述抗淀粉样蛋白球体抗体。固相支持物的实例包括球形、杆状、以及板状支持物，其可由塑料诸如聚苯乙烯或聚丙烯来制备，优选塑料板状支持物。固相支持物利用淀粉样蛋白球体经由常规技术包被，所述技术诸如吸附或涉及利用交联剂的方法。从方便的角度考虑，优选淀粉样蛋白球体的物理吸附。
涉及使用淀粉样蛋白球体包被的固相支持物的测定技术的具体实例是淀粉样蛋白球体ELISA。开始的时候，ELISA板(Nunc)用上文(2)所述制备的淀粉样蛋白球体包被。在这种情况中，可使用任何溶剂，只要所述溶剂不允许淀粉样球状蛋白的解聚。优选溶剂的实例是PBS(-)。利用适宜溶液诸如含有表面活性剂诸如0.05％Tween 20的生理盐水洗涤板，用牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲的盐水(PBS))或诸如此类的物质封闭，然后允许其与上述获得的抗体反应。然后，进一步洗涤板，并与作为第二抗体同经免疫动物的免疫球蛋白反应的抗体接触。以相同方式洗涤板之后，结合于板的第二抗体通过利用标记物质的活性作为标记进行检测。所述标记物质的这种活性可利用例如ELISA读板器测定。本发明抗-淀粉样蛋白球体抗体的抗原决定区(表位)可经由淀粉样蛋白球体ELISA测定。具体地，对单体淀粉样B蛋白片段与抗-淀粉样蛋白球体抗体之间结合的竞争性抑制可通过淀粉样蛋白球体ELISA确定表位来测定。多种单体淀粉样β蛋白片段可联合使用。此外，可以利用淀粉样蛋白球体ELISA测定具有已知表位的抗体与抗-淀粉样蛋白球体抗体之间结合的竞争性抑制，从而确定该表位。所述表位可通过实验指南诸如″AntibodiesA Laboratory Manual，″EdHarlow et al.，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988))中所述的方法或根据其的方法确定。
(b)液相淀粉样蛋白球体ELISA允许淀粉样蛋白球体与含有与淀粉样蛋白球体反应的抗体的样品诸如杂交瘤的培养物上清反应，室温混合至少1小时。将给定量的混合物加于ELISA板，所述板已经预先用适当量的兔抗-淀粉样蛋白球体IgG包被并用例如牛血清白蛋白/PBS封闭，允许所述反应在室温持续至少1小时。然后，进一步洗涤板，并使其与作为第二抗体与样品中的免疫球蛋白反应的抗体反应，所述抗体诸如抗小鼠IgG抗体，抗小鼠IgM抗体，或抗小鼠免疫球蛋白。以相同方式洗涤板以后，通过利用标记物质的活性作为指标检测结合于板的第二抗体。所述标记物质的活性可利用例如ELISA读板器测定。
(c)淀粉样β单体ELISA将包含结合于其N末端的生物素的单体淀粉样β蛋白或包含结合于其C末端的生物素的单体淀粉样β蛋白与含有抗体的样品混合，诸如杂交瘤的培养物上清，并使得所述混合物在室温反应至少1小时。将所述混合物施加于链霉抗生物素ELISA板，该板已经预先利用牛血清白蛋白/PBS封闭，允许反应在室温进行至少30分钟。然后，洗涤板并使其与作为第二抗体与样品中的免疫球蛋白反应的抗体接触，所述抗体诸如抗小鼠IgG抗体，抗小鼠IgM抗体，或抗小鼠免疫球蛋白。以相同方式洗涤板以后，通过利用标记物质的活性作为指标检测结合于板的第二抗体。所述标记物质的活性可利用例如ELISA读板器测定。
(d)点印迹测定本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体与抗原的反应性的点印迹法的具体实例在下文提供。开始，利用购得的点样器(BioRad制造)等将适当量的上文(2)中制备的淀粉样蛋白球体点在硝酸纤维素膜等上。在这种情况中，可使用任何溶剂，只要所述溶剂不允许淀粉样蛋白球体的解聚。例如，优选使用PBS(-)。除了淀粉样蛋白球体以外，也优选点样单体淀粉样β蛋白，其部分肽，或仅仅溶剂作为对照实例。膜用适宜缓冲液洗涤，诸如磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲的盐水(PBS))，用脱脂奶/TTBS(Tween-Tris缓冲的盐水)等封闭，与上文获得的抗体接触，用TTBS等进一步洗涤，与作为第二抗体与经免疫的动物的免疫球蛋白反应的抗体接触，并以相同方式洗涤。然后，结合于膜的第二抗体通过利用标记物质的活性作为指标进行检测。作为对照，优选使用与单体淀粉样β蛋白反应的抗体。所述抗体的实例是6E10(Senetek)。
(5)抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性的分析分析本发明抗-淀粉样蛋白球体抗体抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性(下文所述活性可称为“中和神经元细胞毒性的活性”或“抑制对神经元细胞死亡的诱导的活性”)的方法的实例在下文提供。
开始，利用淀粉样蛋白球体对神经元细胞死亡的诱导可通过将淀粉样蛋白球体加入神经元细胞培养溶液并根据常规技术培养所得物来进行。本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体是否具有中和神经元细胞毒性的活性可通过在抗淀粉样蛋白球体抗体的存在下培养神经元和淀粉样蛋白球体，并证实没有诱导神经元死亡来进行分析。淀粉样蛋白球体诱导的细胞死亡可为凋亡或坏死。神经元细胞没有具体限制，获自哺乳动物(例如人、大鼠、小鼠、猴或猪)的神经元细胞是优选的。原代培养细胞也是优选的。原代培养细胞的实例包括获自前述动物的海马、基底前脑以及大脑皮质的细胞。原代培养细胞也包括通过培养前述动物的器官诸如海马获得的细胞。经诱导从E S细胞分化的神经元也可使用。
这些细胞或器官可根据常规技术培养。具体地，神经元细胞的原代培养物和建立的神经元细胞系的培养物可根据例如Hoshi，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93，2719-2723，(1996)或Schubert，D.et al.，Nature，249(454)，224-227，(1974)中描述的方法进行。器官培养可根据例如Gary Banker and Kimbery Goslin，Culturing nerve cells，2nd Edition，MIT Press，Cambridge，(1998)中描述的方法进行。用于诱导所述培养的神经元细胞和器官的细胞死亡而添加的淀粉样蛋白球体的量可适当确定。通常，淀粉样蛋白球体能在等同于存在于阿尔茨海默患者脑内的毒性淀粉样β蛋白的浓度条件下诱导细胞死亡。如上文所述，例如，在培养溶液中淀粉样β蛋白的浓度为大约1μg/ml以下、优选大约0.45μg/ml以下的条件下，上文(2)中获得的淀粉样蛋白球体能诱导原代培养细胞的细胞死亡。应注意所述浓度是为了举例而并非意图限制本发明的范围。
培养溶液中本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体的量根据抗体与抗原的反应性适宜确定。具体地，所述量优选为例如大约0.0001mg/ml-大约1mg/ml。将抗-淀粉样蛋白球体抗体添加到培养溶液中的时机没有具体限制，只要可确定中和神经元细胞毒性的活性即可。由于神经元细胞死亡是由淀粉样蛋白球体在培养后大约6小时诱导的，在培养之前优选在培养的初始阶段加入抗淀粉样球体蛋白抗体。作为对照，优选使用不与淀粉样蛋白球体反应的抗体或与淀粉样蛋白球体的反应性非常低以至于所述反应性不影响对神经元细胞死亡的诱导的抗体。例如，优选使用与单体淀粉样β蛋白反应的抗体，具体实例是6E10(Senetek)。
通常，神经元细胞死亡在加入有效量的淀粉样蛋白球体大约6小时之后诱导。明显的细胞死亡可在添加后大约48小时观察到。在该分析性方法中，神经元细胞死亡的诱导优选在培养开始大约20小时后测定；然而，所述时机根据所用淀粉样蛋白球体的细胞死亡活性适宜确定。
神经元细胞死亡活性可通过检测细胞死亡的常规技术来测定。所述技术的具体实例包括MTT活性测定(Mossman，T.，J.Immunol.Methods，65，55，(1983))，碘化丙锭染色(Ankarcrona，M.et al.，Neuron，15，961，(1995))，锥虫蓝染色排除(Woo，K.B.，Funkhouser，W.K.，Sullivan，C.，and Alabaster，O.，Cell Tissue Kinet.，13(6)，591-604，(1980))，TUNEL，以及检测断裂DNA的ELISA(Roche)。利用碘化丙锭等染色以及检测断裂DNA的ELISA是尤其优选的。利用碘化丙锭等的染色可以是仅仅利用碘化丙锭的单染色，其选择性染色死亡细胞。可选，碘化丙锭染色可与多种其它染料一起进行。具体地，优选联用的染料包括选择性染色生活细胞的钙荧光素-AM(Molecular Probes)以及染色任何细胞的Hoechst 33258(H33258Bisbenzimide H33258)。
本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体抑制神经元细胞死亡的活性可通过将本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体直接给药个体动物来分析。淀粉样蛋白球体诱导的细胞死亡可为凋亡或坏死。所用动物没有特别限制，只要所述动物具有神经元细胞即可，所述动物诸如哺乳动物，包括小鼠、大鼠和灵长类。优选，使用其中特别出现神经元细胞死亡的阿尔茨海默病的动物模型。除了直接给药神经元细胞存在的位点诸如脑，还可采用常规给药方法，诸如口服给药，静脉内注射，或腹腔内给药。对于大鼠、小鼠或其它动物的脑的情况，直接给药神经元细胞存在位点诸如脑的具体实例包括这样的方法，其中利用渗透压泵将本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体给药到靶位点附近的区域的脑室内或利用微量加液器等经由微量溶入(microfusion)靶位点的脑实质。给药持续给定的时间后，脑功能的改变经由PET/MRI测定，立即提取给药位点周围的组织，制备组织切片以检测神经元细胞死亡的出现。神经元细胞死亡的出现可通过组织学染色、Western印迹等检测。组织学染色可通过例如TUNEL染色或利用抗caspase抗体的免疫染色进行。
(6)抑制淀粉样蛋白球体形成的活性的分析作为分析本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体抑制淀粉样蛋白球体形成的活性的方法，在上文制备淀粉样蛋白球体的方法的第一步中，将如上文所述获得的抗淀粉样蛋白球体抗体与溶于水中的单体淀粉样β蛋白混合，如上文(2)所述进行制备淀粉样蛋白球体的步骤，基于上文(2)所述的诱导神经元细胞死亡的活性或电子显微镜检查来检查所得溶液的淀粉样蛋白球体形成。加入的本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体的量优选与淀粉样β蛋白的量相同或更多(摩尔比)。通常，优选进行足够长的一段时间的对流以形成淀粉样蛋白球体。具体地，所述持续时间至少约4小时。淀粉样蛋白球体形成可通过例如上文(2)中所述的方法分析。
如果该测定法证实没有形成淀粉样蛋白球体，可确定抗-淀粉样蛋白球体抗体具有抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。
(7)筛选阿尔茨海默病的治疗性和/或预防性药剂的方法将淀粉样蛋白球体加入培养的神经元细胞时，淀粉样蛋白球体可诱导所述细胞死亡。因此，淀粉样β蛋白的自聚体淀粉样蛋白球体也被认为诱导阿尔茨海默病中的神经元变性。
本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体具有与淀粉样蛋白球体的高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性。因此，阿尔茨海默病的治疗和/或预防药剂可通过使待分析物和本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体与淀粉样蛋白球体竞争结合，并利用所述反应性作为指示来选择物质，从而进行筛选。本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体也可为阿尔茨海默病的治疗和/或预防性药剂的活性成分。
筛选所述物质的方法的具体实例在下文提供。待分析物的实例包括肽，蛋白，非肽化合物，合成化合物，发酵产物，细胞提取物，植物提取物，以及动物组织提取物。所述化合物可为新的或已知的化合物。与淀粉样蛋白球体的反应性通过上文(4)中描述的用于分析抗淀粉样蛋白球体抗体与淀粉样蛋白球体的反应性的方法来测定，其中将所述待分析物加入反应溶液。淀粉样蛋白球体、抗淀粉样蛋白球体抗体以及将混合的待分析物的量可适宜选择。
所述分析物优选利用标记物质进行标记。通过该分析，结合淀粉样蛋白球体的物质可确定为阿尔茨海默病的治疗和/或预防药剂的活性成分。优选，使用所选物质替代上文(5)中所述的方法中所用的抗淀粉样蛋白球体抗体以检测所述物质是否能抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡。
由此选出的物质以及本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体可用作用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药剂的活性成分。也可使用生理上可接受的盐，水化物，溶剂化物等。附加了金属离子诸如Fe或Zn离子，糖链，或糖蛋白的物质也是优选的。生理上可接受的盐的实例包括无机酸盐，诸如盐酸盐或硫酸盐；有机酸盐，诸如柠檬酸盐，草酸盐，以及对甲苯磺酸盐；和氨基酸盐诸如甘氨酸盐。通过前述方法经修饰成为人源化的类型或完全人抗体的抗淀粉样蛋白球体抗体是优选使用的。抗体可通过几种常规技术的适宜组合转化成适合给药人的形式。本领域技术人员可轻易进行所述转化。
本发明提供的药物包括已经通过本发明的筛选方法确定为能抑制神经元细胞死亡的物质作为活性成分，以及所述药物可用作阿尔茨海默病的预防和/或治疗药剂。已经通过本发明的筛选方法确定能抑制神经元细胞死亡的物质以及抗淀粉样蛋白球体抗体可作为药物给药患者。通常，优选制备包含至少一种所述活性成分的药物组合物并给药患者。所述药物组合物的实例包括口服制剂，诸如片剂，胶囊，颗粒剂，细粒剂，粉末剂，丸剂，药片，舌下药剂，以及液剂；和经胃肠外给药的制剂，诸如注射剂，栓剂，油膏以及贴剂。
用于口服给药的片剂或胶囊通常以单位剂型提供，所述剂型可通过添加常用药物载体诸如粘合剂，填充剂，稀释剂，打锭剂，润滑剂，崩解剂，着色剂，香味剂以及湿润剂来制备。片剂可利用例如肠溶包衣剂根据本领域已知的方法进行包被。片剂可利用例如填充剂，崩解剂，润滑剂或湿润剂来制备。
用于口服给药的液体制剂可以以水性或油性悬液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式提供。液体制剂也可以脱水制剂的形式提供，其在使用前重新溶于水或适当介质。常用添加剂，诸如助悬剂，乳化剂，防腐剂，如果需要常用香味剂和着色剂可加入所述液体制剂。
口服给药的制剂可通过本领域已知的方法制备，诸如混合，填充或打锭。活性成分也可利用大量填充剂等通过反复配合操作分布到制备物中。胃肠外给药的制剂通常以含有活性物质和无菌介质的液体载体介导的制剂的形式提供。胃肠外给药的溶剂通常通过将作为活性成分的物质溶解于介质，对所得溶液进行无菌过滤，以及将滤出物填充在适宜小瓶或安瓿中，然后封口来制备。为了提高稳定性，所述组合物可经冻干，填充在小瓶中，并可在真空下去除水分。胃肠外用悬液以与胃肠外用液体基本相同的方式制备。胃肠外悬液优选通过将活性成分悬浮在介质并通过环氧乙烷等使得悬液无菌化来制备。如需要，可加入表面活性剂，湿润剂等以使得活性成分均匀分散。
作为有效成分的物质的给药量根据物质的活性水平，治疗或预防的目的，或患者的症状、体重、年龄或性别适宜确定。优选，每天分一或数次给药。当本发明的抗淀粉样蛋白球体抗体是活性物质时，例如，其剂量通常为单次给药约1μg-约100mg，优选约10μg-约50mg每kg体重。
(8)利用抗-淀粉样蛋白球体抗体检测患有阿尔茨海默病的个体的方法以及检测药剂将淀粉样蛋白球体加入培养的神经元细胞时，淀粉样蛋白球体可诱导所述细胞死亡。因此，淀粉样β蛋白自聚集体淀粉样蛋白球体也被认为诱导阿尔茨海默病中的神经元变性。本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体与淀粉样蛋白球体具有高反应性。因此，患有阿尔茨海默病的个体可通过利用所述抗体检测生物样品中的淀粉样蛋白球体来鉴定。
生物样品的实例包括体液，诸如血液，脑脊液，以及尿液，尤其优选血液，其获自可能患有阿尔茨海默病的个体。例如，血液样品可通过利用取血管从可能患有阿尔茨海默病的个体的肘静脉取血，通过离心分离血浆和血清来获得。脑脊液样品可通过例如经由麻醉下的腰穿从可能患有阿尔茨海默病的个体取脑脊液样品，然后进行离心来获得。为了防止淀粉样蛋白球体变性或所得生物样品中的血液凝固，优选在取样时或取样后将酶抑制剂加入生物样品。蛋白酶抑制剂，诸如抑肽酶，抗蛋白酶，抑胃酶肽，亮抑肽酶，EGTA，PMSF(苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride))，或TLCK(甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮(tosyllysine chloromethyl ketone))，用作酶抑制剂。如需要，所得生物样品可经过浓缩或其它加工，使得检测淀粉酶蛋白球体的敏感性提高。
利用抗-淀粉样蛋白球体抗体检测生物样品中的淀粉样蛋白球体可通过常规免疫测定技术进行。所述技术的具体实例包括，夹心测定，竞争测定，免疫测定，和比浊法。在夹心测定中，生物样品与结合于固相的本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体接触，允许标记的抗-淀粉样蛋白球体抗体与其反应，测定结合于固相的标记物质的信号。因此，可测定生物样品中的淀粉样蛋白球体水平。当生物样品中的淀粉样蛋白球体水平通过所述免疫测定法测定时，所述水平优选基于利用含有已知量的淀粉样蛋白球体的标准溶液制备的标准曲线来算出。具体地，免疫测定法可根据实验指南诸如Seikagaku Jikkenhou 11，“Enzyme Immunoassay，”(Tijssen，P.，TokyoKagaku Dojin，Co.，Ltd.)or″AntibodiesA Laboratory Manual，″(EdHarlow et al.，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988))进行。多种实验技术可以以适宜的组合方式进行。本发明还包括用于检测患有阿尔茨海默病个体的含有抗淀粉样蛋白球体抗体的药剂，所述药剂用于所述的实验技术。
实施例本发明在下文将参考实施例进行描述，但本发明的范围不限于这些实施例。在以下实施例和说明中，PBS指磷酸盐缓冲的盐水，TTBS指吐温-Tris缓冲的盐水，HRP指辣根过氧化物酶。
实施例1制备含有淀粉样蛋白球体的溶液(1)制备淀粉样β40(SEQ ID NO1)树脂将Fmoc-Val树脂(342mg，胺含量0.73mmol/g树脂)加载在A433自动肽合成仪(Perkin Elmer Applied Biosystems)上。将Fmoc-Val-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Arg(Pmc)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，和Fmoc-Asp(OtBu)-OH加于其上，利用HBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基脲六氟磷酸盐[2-(1H-benzotriaol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluronium-(hexafluorophosphate)]作为缩合剂连续缩合这些树脂，获得侧链保护的淀粉样蛋白β40树脂1.515g。
(2)利用三氟乙酸进行处理从(1)中获得的侧链保护的淀粉样蛋白β40树脂分离树脂级分(304mg)，将0.75ml苯酚，0.5ml苯甲硫醚，8.25ml三氟乙酸，0.25ml乙二硫醇，和0.5ml蒸馏水加入其中，允许反应在冰上冷却的条件下继续5分钟，然后在室温1.5小时。完成反应后，加入200ml冰冷的乙醚使得肽沉淀。所有成分通过玻璃滤器过滤，滤出物利用冷的乙醚洗涤，利用大约200ml含有35％乙腈的0.1％三氟乙酸进行提取，得到191mg粗肽，其表示为H-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH。
(3)肽的纯化将粗肽溶解于40ml含有35％乙腈的0.1％三氟乙酸中，然后利用含有结合于硅胶(内径2cm；长度25cm)的ODS(十八烷基硅氧烷(octadecylsiloxane))反相柱通过HPLC纯化。通过在20分钟内将在0.1％三氟乙酸中的乙腈含量从22％线性提高到42％进行洗脱。纯化产物的产量为35mg。该物质的结构通过MALDI-TOF质量分析来检查。测定的值为[M+H]+4330.99，计算值为(C194H295N53O58S1+H)4330.89。利用根据前述方法合成并产生的淀粉样蛋白42β以及购自Bachem的淀粉样蛋白β42进行以下试验。
(4)制备含有淀粉样蛋白球体的溶液将上文(3)中纯化的淀粉样蛋白β40(10nmol)引入1.5mleppendorf管，相继加入500μl超纯水和500μlDulbecco磷酸盐缓冲液(-)(下文称为PBS(-)，Nippon Suisan Kaisha，Ltd.制造)，以便完全溶解淀粉样β蛋白。将含有淀粉样β蛋白水溶液的eppendorf管加载在Duck旋转仪(RT50，TAITEC)上，37℃、35rpm旋转7天获得淀粉样蛋白球体40。上文(3)中纯化的或Bachem生产的淀粉样蛋白β42也根据上述方法旋转大约10小时来制备淀粉样蛋白球体42。
实施例2抗-淀粉样蛋白球体抗体的制备(1)兔抗-淀粉样蛋白球体多克隆抗体的制备实施例1中制备的淀粉样蛋白球体40和淀粉样蛋白球体42与完全弗氏佐剂混合并作为抗原经皮下给药新西兰白兔，使得可给药每只新西兰白兔60μg前述淀粉样蛋白球体。然后，将相同量的淀粉样β蛋白与不完全弗氏佐剂混合，并每2周给药一次、一共给药8次。最后一次免疫之后10天进行放血。
放血后，允许血液在37℃保持1小时，产生的血凝块通过离心去除，回收血清。然后，将血清在57℃灭活30分钟。加入ProClin300(Sigma-Aldrich)使其浓度为1ppm，保存。IgG以以下方式自血清分离。将蛋白G Sepharose(2ml，Amersham Biosciences)填充到适宜的柱中并用PBS(-)平衡。加入血清(2-3ml)，利用20mlPBS(-)洗涤未吸附的级分。吸附的级分通过将各2ml的0.1M甘氨酸-HCl，和0.15M NaCl(pH2.5)加于柱来洗脱。洗脱的级分收集在含有0.1M Tris-HCl(pH8.5)(其量为洗脱的级分的十分之一)的试管中，并立即中和。洗脱物用PBS(-)透析获得纯化的IgG。纯化程度通过凝胶过滤HPLC利用G3000SWsL(TosohCorporation)、以0.1M乙酸钠和0.3MNaCl作为展开缓冲液进行分析。
(2)制备小鼠单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体PBS中制备的淀粉样蛋白球体42与等量完全弗氏佐剂(WAKO)混合并乳化混合物。所得溶液(0.2ml)经皮下给药BALB/c雌性小鼠背部用于免疫(1-8μg/0.2ml/小鼠)。利用不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)乳化的淀粉样蛋白球体也每隔两周给药。定期从眼底或尾静脉取血获得血清和血浆。将血清和血浆在1％牛血清白蛋白(BSA，级分A；Sigma-Aldrich)(PBS中)中连续稀释，通过以下固相淀粉样蛋白球体ELISA测定抗-淀粉样蛋白球体抗体与淀粉样蛋白球体的反应性。
对于由于8-10次免疫措施显示足够的反应性提高的个体，最后将8μg淀粉样蛋白球体(0.1ml PBS中)经静脉给药用于增强。增强后3天回收脾细胞，通过涉及利用聚乙二醇4000的常规技术，与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14)融合，其数目是脾细胞的一半。融合的细胞悬于含有10％胎牛血清、10％ BM condimed H-1(Roche Diagnostics)以及HAT(Sigma-Aldrich)的GIT培养基(WAKO)，并将细胞悬液铺于96孔板(FALCON)上，使得每个孔含有5×104个骨髓瘤细胞/0.1ml培养溶液。3天后加入培养溶液，7天后交换培养溶液，培养再持续2-3天，回收上清。上清中的抗淀粉样蛋白球体抗体通过下文所述的ELISA分析，产生特异性抗体的细胞在24孔板(IWAKI)上扩增。当通过有限稀释进行克隆时，将杂交瘤铺于96孔板，使得200μl培养溶液中的密度为0.3细胞/孔，继续培养，每周交换一半的培养溶液。
由此建立的小鼠单克隆抗体的三个克隆显示于表1。这些抗体的亚类通过利用小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Amersham BioSciences)来确定。产生抗体MASD1，MASD2，和MASD3的杂交瘤分别称为小鼠-小鼠杂交瘤MASD1，小鼠-小鼠杂交瘤MASD2，和小鼠-小鼠杂交瘤MASD3。2005年8月3日将小鼠-小鼠杂交瘤保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏号FERM ABP-10392，FERMABP-10393，和FERM ABP-10394。
按照以下方式从杂交瘤MASD1，MASD2，和MASD3分离并纯化抗体。杂交瘤培养在大约11CD杂交瘤培养基(Invitrogen)中1周，通过离心回收培养上清。回收的上清通过0.45μM滤器过滤，滤出物加入PBS(-)平衡的2ml蛋白G Sepharose，以与实施例2(1)相同的方式分离并纯化IgG抗体。
表1小鼠单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体


实施例3分析抗体性质(1)固相淀粉样蛋白球体ELISA(确定与淀粉样蛋白球体的反应性)将在磷酸盐缓冲的生理盐水(不含有Ca或Mg，pH7.2，PBS)中稀释到1μg/ml的淀粉样蛋白球体40或42(50μl)加于96孔ELISA板(MaxiSorp，Nunc)，板在4℃包被过夜。将含有1％牛血清白蛋白(BSA，级分V；Sigma-Aldrich)的PBS溶液加入其中，室温至少1小时，封闭非特异性结合位点，用水洗涤板。加入在含1％牛血清白蛋白的PBS溶液中稀释的抗血清或杂交瘤培养物上清(50μl)，允许反应在室温继续至少1小时。用含有0.05％ Tween 20的生理盐水洗涤板5次，加入同样稀释到1μg/ml的过氧化物酶标记的第二抗体(抗小鼠IgG抗体(Zymed)，抗小鼠IgM(Biosource)，和抗小鼠免疫球蛋白(DAKO))，允许反应在室温继续1小时。洗涤板5次后，加入底物溶液使得生色反应持续给定时间，利用读板器测定吸光度。
比较实施例2中确定的小鼠单克隆抗体以及市售的抗体，结果显示于

图1。实施例2中建立的所有抗体都显示在市售抗体6E10(Sigma-Aldrich)或IBL10027(Immuno-Biological Laboratories Co.，Ltd.)的浓度的大约1/100时具有强反应性。
(2)点印迹分析(确定与淀粉样蛋白球体和淀粉样蛋白β单体的反应性)利用点样器(BioRad)，将含有溶于溶剂1，1，1，3，3，3，-六氟-2-丙醇(Sigma-Aldrich)的单体淀粉样β40蛋白或实施例1中制备的淀粉样蛋白球体40的溶液，以及对照溶剂(各2ng)点在硝酸纤维素膜(0.2μ，Schleicher&Schuell)上，用PBS(-)洗涤该膜，并从点样器分离该膜。
点有蛋白样品的膜利用5％脱脂奶/0.05％ TTBS封闭1小时，将膜浸在实施例2中所得的抗体中，其已经被调节到0.1μg/ml，允许反应在4℃、湿盒中过夜。然后，用0.05％ TTBS洗涤膜，并允许膜与作为第二抗体的抗兔IgG或抗小鼠IgG(Zymed)反应1小时，所述第二抗体已经结合了辣根来源的过氧化物酶。然后利用0.05％TTBS洗涤膜，去除未反应的第二抗体，并将膜浸润在SuperSignalWest-Femto(Pierce)中，然后保温5分钟。随后利用图像分析仪LAS-1000 plus(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)检测化学荧光信号并输入图像数据。作为检测抗体反应性的对照，使用0.5μg/ml抗淀粉样蛋白β抗体6E10(Senetek)作为第一抗体。
结果显示于图2和图3。图2中，“淀粉样蛋白球体”表示实施例1中制备的含有淀粉样蛋白球体40的溶液的点，溶剂表示对照的点，Aβ表示单体淀粉样β40蛋白(Bachem)的点。从图2明显可见，市售的抗淀粉样蛋白β抗体6E10与实施例1中制备的淀粉样蛋白球体40反应并且以大约相等的水平与单体淀粉样β40蛋白(Bachem)反应。反之，比较发现，上文获得的抗体与淀粉样蛋白球体40的反应性高于其与淀粉样β40蛋白(Bachem)的反应性。作为利用LAS-1000plus进行定量分析的结果，本发明制备的抗体与淀粉样蛋白球体的反应性是其与未聚集的淀粉样蛋白β单体反应性的10倍以上。使用纯化的淀粉样蛋白球体40时获得类似的结果。这些与淀粉样蛋白球体具有高反应性的多克隆抗体在下文称为“抗-淀粉样蛋白球体抗体”或“多克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体”。
图3A和3B中，40SR和42SR分别表示实施例1中制备的含有淀粉样蛋白球体40的溶液以及含有淀粉样蛋白球体42的溶液(42SR)的点，B表示用作对照蛋白的牛血清白蛋白的点，M表示淀粉样β40蛋白的点。当发现市售抗淀粉样蛋白β抗体6E10和4G8与实施例1中制备的淀粉样蛋白球体40、淀粉样蛋白球体42和淀粉样β40蛋白中任何一种反应，发现实施例2中建立的小鼠单克隆抗体与淀粉样蛋白球体40以及淀粉样蛋白球体42选择性高反应。发现其与淀粉样蛋白球体高反应性的这些单克隆抗体在下文称为“抗-淀粉样蛋白球体抗体”或“单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体”。
(3)免疫电子显微镜观察(证实与淀粉样蛋白球体和淀粉样蛋白β纤维的反应性)
淀粉样β40在高浓度(至少100μM)发生聚集，纤维经由沉淀或离心选择性收集。实施例2中获得的多克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体和市售的抗-淀粉样β抗体4G8(Senetek)(各5μl)与1μg如此制备的淀粉样蛋白β纤维混合，允许反应在4℃进行过夜。然后，将山羊抗-小鼠IgG-6 nm-Gold(Orion)加入反应溶液，允许反应在4℃进行1小时。反应产物通过利用乙酸铀负染色检测，降低电子射线导致的损伤的同时进行观察和拍照。如图4A所示，与单体淀粉样β蛋白反应的市售的抗体4G8完全可以识别淀粉样蛋白β纤维；但实施例2中获得的抗-淀粉样蛋白球体抗体不识别淀粉样蛋白β纤维。对单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体MASD3进行相似实验。结果，发现该抗体不识别淀粉样蛋白β纤维，如图4B所示。
(4)测定解离常数在50mM乙酸盐缓冲液中将浓度为10μg/ml的淀粉样蛋白球体偶联于CM5传感器芯片(BIA Core 3000，BIAcore)。利用已经在缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，0.15 M NaCl，3mM EDTA，0.005％Surfactant P20)从最大浓度100nm进行2倍连续稀释的抗体溶液，测定结合速率常数和解离速率常数。利用这些常数，通过以下公式求出解离常数。
解离常数＝解离速率常数/结合速率常数表2显示小鼠单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体和市售的抗体与淀粉样蛋白球体的解离常数


实施例4测定抗-淀粉样蛋白球体抗体的抗原决定区(表位)(1)抗-淀粉样蛋白球体抗体的抗原决定区(表位)为了确定抗-淀粉样蛋白球体抗体的表位，对分别包含从单体淀粉样β蛋白部分序列的N末端起的5个残基的片段依次进行化学合成，获得38种不同类型的肽的部分序列，其包含淀粉样β5残基(下文简称为“5PA，”并按照从N末端的顺序称为5PA1，5PA2...5PA38，见表3)。每个5PA都利用HPLC纯化直到获得单个峰，分成一定的量冻干，产物保存在-20℃直到即将使用之前。
表3



上述5PA的每一种都溶解于无菌超纯水，制备5PA抗体混合溶液，所述溶液包含的每种5PA肽的量为IgG-纯化的抗-淀粉样蛋白球体抗体的量的100-1,000,000倍(摩尔比)。将5PA稀释物加于实施例3(1)制备的淀粉样蛋白球体40固相板，在4℃震摇板过夜，利用0.01％ Tween 20-PBS(-)溶液洗涤板，加入1/10,000倍稀释的、结合了过氧化物酶的第二抗体(对于多克隆抗体为抗兔抗体，对于单克隆抗体为抗小鼠抗体；Jackson Laboratories)，然后震摇1小时。所得物利用0.01％ Tween 20-PBS(-)溶液洗涤，并利用TMB底物试剂盒(Pierce)进行显色反应。终止显色反应后，利用读板器(Benchmark；BioRad)测定450nm的吸光度。结果，发现本发明所得的多克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体受到单体淀粉样β蛋白(5PA1)的N末端肽的最有效的竞争抑制，并发现单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体受到N末端肽(5PA2)的最有效的竞争抑制。反之，与淀粉样蛋白β单体反应的市售N-末端抗体6E10受到N末端肽(5PA5)的最有效的抑制，市售N-末端抗体82E1(IBL)受到N-末端肽(5PA1)的最为有效的抑制，该抗体与淀粉样β单体反应的程度为其与淀粉样蛋白球体的反应性的大约2倍。
(2)竞争检测单克隆抗体和兔多克隆抗体利用0.1M碳酸氢钠透析。将NHS-LC-生物素(Pierce Chemical)加入1mg抗体，其量就摩尔比而言是抗体量的十倍以上，允许反应在4℃持续2小时。反应产物相对于PBS透析，所得产物用作生物素标记的抗体。
进行固相淀粉样蛋白球体竞争ELISA。将生物素化的抗-淀粉样蛋白球体抗体(终浓度0.1μg/ml)和连续稀释的非标记的抗体(终浓度0.1-10μg/ml)的混合溶液(50μl)加于ELISA板，所述板上已经固定了淀粉样蛋白球体，允许所述反应在室温进行1小时。洗涤板之后，加入稀释到1μg/ml的过氧化物酶标记的亲和素D，允许反应在室温进行1小时。洗涤板，加入底物溶液(Sumiron Co.，Ltd.)进行给定时间的显色反应，吸光度利用读板器测定。
实施例2中制备的兔多克隆抗体以及小鼠单克隆抗体以及市售抗体的竞争实验的结果总结在表4中。结果提示两种类型的兔多克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体(ASD2和ASD3)以及三种类型的小鼠单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体相互竞争并识别共同的表位。结果还提示这些抗体不与市售抗体6E10，4G8，或IBL10027竞争，并且这些抗体将识别与市售抗体所识别表位不同的表位。
表4 相对于对照吸光度的降低率(单克隆10μg/mL，多克隆50μg/mL)+++75％以上++75-50％+50-25％±25％以下，有降低趋势(生物素化的抗体的浓度单克隆0.1μg/mL，多克隆1μg/mL)实施例5抗-淀粉样蛋白球体抗体对淀粉样蛋白球体形成的抑制
(1)在存在抗-淀粉样蛋白球体抗体的条件下制备淀粉样蛋白球体根据实施例1中所述的方法，制备含有淀粉样蛋白球体40的溶液。在所述情况中，将抗-淀粉样蛋白球体抗体加入其中使抗体浓度为0.1mg/ml，持续转动7天。利用相同方法，用相同浓度的市售抗-单体淀粉样β抗体6E10(Senetek)制备对照溶液。
(2)抗-淀粉样蛋白球体抗体对淀粉样蛋白球体形成的抑制(电子显微镜)含有淀粉样蛋白球体40的溶液在存在各种抗体的条件下如实施例1中所述制备。利用乙酸铀对每种溶液的液滴(数μl)进行负染色，减小电子射线导致的损伤的同时进行观察和照相。所得显微照片就在每种条件下球形淀粉样蛋白球体的形成进行分析，粒径和颗粒大小分布通过颗粒分析确定。结果，淀粉样蛋白球体，10-15nm的球形蛋白，在存在多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体的条件下不形成。抑制颗粒形成的所述效果在6E10的情况中没有观察到。这表明抑制颗粒形成的效果不能利用识别非聚集的单体淀粉样β蛋白的现有抗体实现。
(3)通过三重染色评估神经元细胞死亡中的活性来分析对淀粉样蛋白球体形成的抑制通过分散培养从18日龄的大鼠的基底前脑制备原代培养细胞。制备的原代培养细胞以细胞密度2×105细胞/cm2接种于利用聚乙烯亚胺(Sigma)包被的培养板，然后培养细胞。细胞在含有5％肽牛血清(HyClone)，5％马血清(Equitech)，1mM丙酮酸盐，和50μg/ml庆大霉素(Invitrogen)的DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen)中培养3天后，培养基更换为含有0.5mM L-谷氨酰胺，50μg/ml庆大霉素(Invitrogen)，B27补充剂(Invitrogen)，和Neurobasal培养基(Invitrogen)的无血清培养基。将在存在(1)中制备的各种抗体的条件下制备的淀粉样蛋白球体溶液加入培养的细胞的每个孔，使得其最终浓度为1μM(就单体淀粉样β蛋白而言)，检测神经毒性。神经毒性通过与没有添加制备的淀粉样蛋白球体溶液时的毒性进行比较来评估。作为背景，将相同体积的溶剂加入孔。添加后，继续培养40小时，板利用PBS(-)洗涤，然后用钙荧光素-AM(终浓度1μg/ml)和碘化丙锭(终浓度5μg/ml)(20mM Hepes，pH7.3，130mM NaCl，5.4mM KCl，5.5mM葡萄糖，2mM CaCl)染色30分钟。然后，4℃将细胞固定于10％中性福尔马林中30分钟，随后利用PBS(-)洗涤板，然后与1μg/ml Hoechst 33258(Molecular Probes)反应5分钟用于三重染色。
样品利用激发激光在荧光显微镜(Zeiss)下照射，激发的荧光利用冷却CCD照相机(CoolSNAP HQRoper)输入图像来检测，输入的图像保存为图像数据。这些过程在以下条件下进行激发光波长460-490nm、荧光染料钙荧光素-AM，510-550nm、碘化丙锭，以及364nm、H33258。获得的图像数据就被Hoechst 33258染色的总细胞数和被碘化丙锭染色的死亡细胞数进行分析。每个样品中计数的细胞总数为平均大约1,000-1,200。所得死亡细胞数除以细胞总数然后乘以100，将所得数值确定为细胞死亡活性(％)。显示类似凋亡改变诸如细胞核断裂或萎缩的、被碘化丙锭染色的细胞称为“死亡细胞”。
结果，发现在多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体存在的条件下旋转的淀粉样β蛋白不显示神经元细胞死亡活性，如图5所示。反之，存在市售抗淀粉样β蛋白抗体6E10的存在下旋转的淀粉样β蛋白显示神经元细胞死亡活性，其与不加入抗体时形成蛋白的情况一样强。
结合实施例5(2)中所述的电子显微镜照相结果，相应地，实施例2中获得的抗淀粉样蛋白球体抗体具有抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。反之，识别市售非聚集的淀粉样β单体的抗体6E10没有抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。
实施例6评估中和淀粉样蛋白球体细胞毒性的活性(1)利用多克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体中和淀粉样蛋白球体毒性事先将实施例2中获得的多克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体(各0.4mg)加入通过实施例5所述方法制备的大鼠基底前脑来源的原代培养神经元(1.1×106细胞/ml)。向其中加入根据实施例1中所述方法制备的含有淀粉样蛋白球体的溶液(10ml)。通过实施例4所描述的三重染色，评估40小时后的神经元细胞死亡活性。作为对照，评估仅仅添加淀粉样蛋白球体抗体所得的神经元细胞死亡活性并与加入溶剂的背景进行比较。同时进行其中事先给予市售淀粉样蛋白β抗体6E10的实验用于比较。如图6所示，抗淀粉样蛋白球体抗体或市售抗体6E10单独给药时不显示神经毒性。但是，当事先给予抗淀粉样蛋白球体抗体时，淀粉样蛋白球体的神经毒性被抑制到接近背景水平。当事先添加市售抗体6E10时，淀粉样蛋白球体的神经毒性不受影响。具体地，发现实施例2所得的抗淀粉样蛋白球体抗体具有中和淀粉样蛋白球体神经毒性的活性。但是，发现识别非聚集的淀粉样β蛋白单体的市售抗体6E10不具有中和活性。与基底前脑一样，自在其中观察到原发病变的阿尔茨海默病患者的海马和大脑皮质制备原代培养细胞，进行类似实验。结果，获得与图6所示结果相同的结果。具体地，抗淀粉样蛋白球体抗体是唯一抑制淀粉样蛋白球体神经毒性到背景水平的抗体。因此，发现淀粉样蛋白球体抗体可保护在脑中可能经历阿尔茨海默病主要损伤的每个位点的神经元免受淀粉样蛋白球体神经毒性。
(2)市售的N-末端抗体中和淀粉样蛋白球体毒性将抗-淀粉样蛋白球体抗体或市售的抗-N-末端抗体预先加入实施例5所述方法制备的源自大鼠基底前脑的原代培养神经元，如实施例6(1)所示。然后，将事先根据实施例1制备的给定量的含有淀粉样蛋白球体42的溶液加入其中。通过实施例5所示的三重染色，40小时后评估神经元细胞死亡活性。通过定量氨基酸分析确定加入神经元的溶液中的淀粉样蛋白β含量，来确定神经元细胞死亡比活性。如图7所示，发现市售的N-末端抗体(IBL)不抑制淀粉样蛋白球体毒性。N-末端抗体(Cell Signaling)也不中和淀粉样蛋白球体神经毒性。如实施例3所示，抗-淀粉样蛋白球体抗体的最有效的表位存在N末端。但利用N末端部分肽制备的市售N-末端抗体，诸如N-末端抗体6E10(Senetek)，N-末端抗体(IBL)，和N-末端抗体(Cell Signaling)，都不能抑制淀粉样蛋白球体的神经毒性，仅仅利用淀粉样蛋白球体作为抗原制备的抗-淀粉样蛋白球体抗体显示明显的中和活性。发现抗-淀粉样蛋白球体抗体对淀粉样蛋白球体40和淀粉样蛋白球体42显示保护效应。
(3)单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体对淀粉样蛋白球体毒性的中和利用实施例2(2)所得的单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体，评估中和淀粉样蛋白球体毒性活性。评估以两种不同方式进行(a)经由三重染色利用来自大鼠基底前脑的原代培养的神经元以及源自大鼠大脑皮质的原代培养细胞根据实施例5所示的方法进行评估；和(b)利用大鼠大脑皮质经由夹心ELISA用抗组蛋白抗体和抗DNA抗体检测凋亡产生的断裂核小体(DNA和组蛋白的混合物)。夹心ELISA测定利用细胞死亡ELISA试剂盒(Cell Death ELISAKit)(Roche)进行，并根据包含在该试剂盒中的方案进行评估。大脑皮质的原代培养以与实施例4所述涉及基底前脑的情况基本上相同的方式进行，但是，细胞以细胞密度1.5×105细胞/cm2接种，2小时后将培养基与不含血清的培养基交换。使用根据实施例2描述的方法制备的淀粉样蛋白球体40和淀粉样蛋白球体42。
单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体MASD1，MASD2，和MASD3显示中和来自前脑和大脑皮质的原代培养神经元细胞中的淀粉样蛋白球体神经毒性的效果。
图8显示利用淀粉样蛋白球体42的细胞死亡ELISA结果。在源自大脑皮质的原代培养神经元中的浓度为1.2mg/ml时，多克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体几乎完全抑制神经毒性，浓度0.15mg/ml的单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体MASD2显示等同的抑制效果。单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体MASD1和MASD3显示等同于MASD2的抑制效果。因此，发现单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体的效果为多克隆抗体效果的大约10倍以上。
(4)单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体消除淀粉样蛋白球体对神经毒性的抑制利用单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体对淀粉样蛋白球体进行免疫沉淀。免疫沉淀根据AntibodiesA Laboratory Manual(EdHarlow & David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)进行。具体地，将淀粉样蛋白球体42与各种类型的单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体在1％ BSA-PBS(-)中混合，允许所得混合物在室温反应1小时，加入量为混合物的四分之一的蛋白G Sepharose(AmershamBioSciences)，在室温再搅动30分钟。抗体-蛋白G Sepharose聚集物通过离心去除。作为对照，使用相同量的正常小鼠血清，进行类似的实验。
利用由此制备的上清分析残余淀粉样蛋白球体的量和神经元细胞死亡活性。残余的淀粉样蛋白球体的量通过夹心ELISA测定法利用多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体和市售的β淀粉样抗体(IBL10027)分析。具体地，回收的上清利用1％ BSA-PBS(-)适宜稀释，加入已经预先吸附了多克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体的96-孔ELISA板(MaxiSorp，Nunc)，允许反应在室温继续1小时，板利用0.05％ Tween 20-PBS(-)洗涤去除未反应的物质，加入市售的β淀粉样蛋白抗体(IBL10027)，允许反应在室温再进行1小时。如实施例3所述通过显色反应进行定量分析，加入辣根过氧化物酶标记的抗-小鼠IgG抗体作为第二抗体。图9显示的量是相对于免疫沉淀以前包含在溶液中的淀粉样蛋白球体42的量的百分比。上清中包含的神经元细胞死亡活性通过根据实施例6(1)所述的方法定量凋亡活性来测定。
图9显示利用抗体MASD3所得的结果，利用抗体MASD2获得基本相同的结果。如图9所示，95％以上的淀粉样蛋白球体42成功地利用单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体去除。使用正常小鼠血清时，大约40％的淀粉样蛋白球体42由于在蛋白G Sepharose上的非特异性吸附而丢失，与其相关的神经元细胞死亡活性也降低，但是仍可检测到强的神经毒性。但是，在通过抗淀粉样蛋白球体抗体基本完全去除淀粉样蛋白球体的溶液中没有观察到神经毒性。因此，发现淀粉样蛋白球体42是神经毒素，本发明的抗-淀粉样蛋白球体抗体能通过特异性地有效消除淀粉样蛋白球体42来抑制神经毒性。
实施例7通过抗-淀粉样蛋白球体抗体抑制钙动力学异常根据实施例4中所述的方法，通过分散培养从18天大鼠胚胎的海马制备原代培养的神经元。制备的原代培养细胞以细胞密度1.0×105细胞/cm2接种，培养开始后5或6天的细胞用于实验。用fura-PE3/AM(800μM，TEF Labs)在平衡盐溶液(130mM NaCl，5.4mM KCl，5.5mM葡萄糖，20mM HEPES，pH7.3；简称为“BSS(+)”)中对神经元进行彻底染色，所述溶液含有2mM CaCl2，细胞的钙动力学改变在倒置型荧光显微镜(Olympus)下实时观察。具体地，激发滤光器连续切换以连续测定F340(激发光340nm时480nm附近的荧光强度)和F380(激发光380nm时480nm附近的荧光强度)，所得数据经由冷却CCD照相机输入，利用AquaCosmos求出F340/F380比，使得细胞内钙浓度的改变得到监测。从图10显示的结果明显可见，将含淀粉样蛋白球体42的溶液施用于源自海马的原代培养神经元细胞时，细胞内钙浓度立即急剧升高。在这种情况中，发现将多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体以可中和神经元细胞死亡的足够高的浓度预先给药原代培养的神经元可抑制所述急剧的细胞内钙流入。抗淀粉样蛋白球体对细胞内钙流入的抑制对于含有淀粉样蛋白球体的含自聚集淀粉样β蛋白溶液而言是特异性的，并且给药谷氨酸导致的快速细胞内钙流入根本不受到抑制。单克隆抗淀粉样蛋白球体抗体MASD1，MASD2，和MASD3都有抑制细胞内钙流入的倾向。
工业实用性本发明的抗体与淀粉样蛋白球体的反应性高于其与淀粉样蛋白β纤维的反应性，并具有抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性和/或抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。所述抗体也与单体淀粉样β蛋白高反应性并具有抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。淀粉样蛋白球体在等同于存在阿尔茨海默病患者脑内的淀粉样β蛋白的浓度条件下诱导神经元细胞死亡。如果获得(1)抑制淀粉样蛋白球体形成的抗体或(2)抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的抗体，相应地，所述抗体可用作阿尔茨海默病的治疗或预防药剂。如果获得(3)与淀粉样蛋白球体的反应性高于与淀粉样蛋白β单体或淀粉样蛋白β纤维的反应性的抗体，所述抗体可用于检测患有阿尔茨海默病的个体。
附图简述图1图示了固相淀粉样蛋白球体ELISA的结果，其分析本发明的单克隆抗-淀粉样蛋白球体抗体的反应性。
图2显示分析本发明多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体的反应性的点印迹的结果。
图3A显示分析本发明单克隆抗淀粉样蛋白球体抗体和多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体的反应性的点印迹的结果。图3B图示图A所示点的强度的定量结果；其中ASD2表示多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体。
图4A显示免疫电子显微镜照片，其显示本发明的多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体与淀粉样蛋白β纤维的反应性；其中条代表20nm。图4B显示分析多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体MASD3与淀粉样β蛋白纤维的反应性的免疫电子显微镜照片，其中条表示50nm。
图5图示了本发明的多克隆抗淀粉样球体蛋白抗体对淀粉样蛋白球体形成的抑制的分析结果。
图6图示了本发明的多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体抑制淀粉样蛋白球体抗体诱导的神经元细胞死亡的活性的分析结果。
图7图示市售的N末端抗体抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性的分析结果。
图8图示本发明的多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体与本发明的单克隆抗淀粉样蛋白球体抗体抑制神经元细胞死亡的诱导作用的活性的比较。
图9图示本发明的单克隆抗淀粉样蛋白球体抗体的免疫沉淀结果；其中上图显示在免疫沉淀后剩余的淀粉样蛋白球体的量，下图显示免疫沉淀后溶液中神经元细胞死亡的活性。
图10图示本发明的多克隆抗淀粉样蛋白球体抗体抑制淀粉样蛋白球体导致的异常细胞内钙流入的效果。
序列表<110>三菱化学株式会社(Mitsubishi Chemical Corporation)三菱制药株式会社(Mitsubishi Pharma Corporation)<120>抗体以及其利用<130>A51616A<160>3<210>1<211>40<212>PRT<213>人<400>1Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val35 40<210>2<211>42<212>PRT<213>人<400>2Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>3<211>43
<212>PRT<213>人<400>3Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr35 40
权利要求
1.具有任何一种或一种以上的以下性质的抗体(i)与淀粉样蛋白球体的反应性高于与淀粉样蛋白β纤维的反应性；(ii)与淀粉样蛋白球体高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体诱导的神经元细胞死亡的活性；(iii)与淀粉样蛋白球体高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体形成的活性；和(iv)与单体淀粉样β蛋白高反应性以及抑制淀粉样蛋白球体形成的活性。
2.权利要求1的抗体，在实验系统中其显示与淀粉样蛋白球体的反应性是其与淀粉样蛋白β纤维的反应性的至少2倍，所述实验系统中抗体与淀粉样蛋白球体的反应性和其与淀粉样蛋白β纤维的反应性在相同抗体浓度、抗体量、抗原蛋白浓度以及抗原蛋白量的条件下进行比较。
3.权利要求1或2的抗体，在实验系统中其显示与淀粉样蛋白球体的反应性是其与淀粉样蛋白β纤维的反应性的至少10倍，所述实验系统中抗体与淀粉样蛋白球体的反应性和其与淀粉样蛋白β纤维的反应性在相同抗体浓度、抗体量、抗原蛋白浓度以及抗原蛋白量的条件下进行比较。
4.权利要求1-3之一的抗体，在实验系统中其显示与淀粉样蛋白球体的反应性是其与单体淀粉样β蛋白的反应性的至少2倍，所述实验系统中抗体与淀粉样蛋白球体的反应性和其与单体淀粉样β蛋白的反应性在相同抗体浓度、抗体量、抗原蛋白浓度以及抗原蛋白量进行比较。
5.权利要求1-4之一的抗体，在实验系统中其显示与淀粉样蛋白球体的反应性是其与单体淀粉样β蛋白的反应性的至少5倍，所述实验系统中抗体与淀粉样蛋白球体的反应性和其与单体淀粉样β蛋白的反应性在相同抗体浓度、抗体量、抗原蛋白浓度以及抗原蛋白量的条件下进行比较。
6.权利要求1-5之一的抗体，其利用淀粉样蛋白球体作为抗原获得。
7.权利要求1-6之一的抗体，其是多克隆抗体。
8.权利要求1-7之一的抗体，其是单克隆抗体。
9.权利要求8的单克隆抗体，其与淀粉样蛋白球体的解离常数不超过10-9。
10.权利要求1-9之一的抗体，其识别单体淀粉样β蛋白的N末端作为表位。
11.单克隆抗体，其通过具有任意以下保藏号(接收编号)的杂交瘤产生FERM ABP-10392，FERM ABP-10393，或FERMABP-10394。
12.具有任意以下保藏号(接收编号)的杂交瘤FERMABP-10392，FERM ABP-10393，或FERM ABP-10394。
13.筛选阿尔茨海默病的治疗和/或预防药剂的方法，其包括使得分析物以及权利要求1-11之一的抗体接触淀粉样蛋白球体，通过利用分析物与淀粉样蛋白球体的亲和力作为指标选择候选物。
14.检测患有阿尔茨海默病的个体的方法，包括使从阿尔茨海默病的疑似个体获得的生物样品与根据权利要求1-11之一的抗体接触，并检测所述样品中与该抗体反应的物质的有无。
15.神经元保护剂，其包含根据权利要求1-11之一的抗体。
16.淀粉样蛋白球体形成的抑制剂，其包含根据权利要求1-11之一的抗体。
17.检测阿尔茨海默病的药剂，其包含根据权利要求1-11之一的抗体。
18.药物，其包含根据权利要求1-11之一的抗体。
19.阿尔茨海默病的治疗和/或预防药剂，其包含根据权利要求1-11之一的抗体。
20.用于检测根据权利要求1-11之一的抗体的固相支持物，其用淀粉样蛋白球体包被。
全文摘要
本发明涉及提供与淀粉样蛋白球体的反应性高于与淀粉样蛋白β纤维的反应性的抗体等。这些抗体中的一些具有抑制淀粉样蛋白球体形成的活性或者抑制淀粉样蛋白球体对神经元细胞死亡的诱导作用的活性。所述抗体可用于阿尔茨海默病的治疗或预防药剂，或者用于筛选这些药物，检测患有阿尔茨海默病的个体的方法和试剂等。
文档编号A61P43/00GK101080421SQ20058003463
公开日2007年11月28日 申请日期2005年8月11日 优先权日2004年8月11日
发明者星美奈子, 内藤幸嗣, 井手野祥次 申请人:三菱化学株式会社, 三菱制药株式会社