专利名称：作为丙型肝炎病毒抑制剂的4－甲氧基甲基－吡咯烷－2－羧酸化合物及其衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的用作抗病毒剂的C(4)-甲氧基甲基酰基吡咯烷衍生物。具体地说，本发明涉及新的丙型肝炎病毒(HCV)抑制剂。
背景技术：
HCV感染在全世界范围内是造成人肝疾病的主要原因。在美国，估算有四百五十万的美国人为慢性HCV感染者。虽然仅有30％的急性感染是有症状的，大于85％的感染个体发展成慢性的、持续感染。在1997年，美国治疗HCV感染的费用估计为54.6亿美元。全世界估计超过2亿人为慢性感染。HCV感染是造成40-60％的慢性肝病和30％的肝移植的原因。在美国，慢性HCV感染占肝硬化、晚期肝病和肝癌的30％，CDC估计，到2010年，由于HCV导致的死亡数目将最低限度地增加到38,000/年。
由于病毒表面抗原高度的差异度，存在许多病毒基因型，并且免疫性的所示特异性，近期开发成功的疫苗是不太可能的。由于它被批准用于治疗慢性HCV感染，α-干扰素(单独或与利巴韦林结合)已经被广泛使用。然而，不良副作用通常与这种治疗有关类似流感的症状，白血球减少症，血小板减少症，源于干扰素的抑郁症，以及由利巴韦林导致的贫血(Lindsay，K.L.(1997)Hepatology 26(suppl 1)71S-77S)。与由其它5种主要HCV基因型所引起的感染相比，这种治疗保留较低有效的抗由HCV基因型1所引起的感染(其在发达国家的市场中占所有HCV感染的～75％)。令人遗憾地是，仅仅～50-80％的患者对这种治疗起反应(通过减少血清HCV RNA水平和肝酶的正常化来测定)，并且50-70％的应答者在中断治疗后6个月内复发。最近，随着引入聚乙二醇化的干扰素(pegylated interferon)，初始的和持续的应答率都得到显著改善，Peg-IFN与利巴韦林的联合治疗形成了治疗的金牌标准。然而，在管理这种疾病的过程中，与联合治疗有关的副作用和基因型1患者中的损伤反应存在改善的可能。
在1989年第一次通过分子克隆确认(Choo，Q-L等(1989)Science244359-362)，丙型肝炎病毒(HCV)现在被广泛视为输血后非甲非乙型肝炎(NANBH)的最常见致病因素(Kuo，G等(1989)Science 244362-364)。由于它的基因组结构和序列同源性，这种病毒在黄病毒科族中被归为新的属。如黄病毒科的其它成员，如黄病毒(例如黄热病毒和登革热病毒类型1-4)和瘟病毒(例如牛病毒性腹泻病毒，边境病病毒和经典型猪瘟病毒)(Choo，Q-L等(1989)Science 244359-362；Miller，R.H.and R.H.Purcell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872057-2061)，HCV是一种含有正极性单链RNA分子的包膜病毒。HCV基因组约为9.6千个碱基(kb)，带约340个碱基的长的、高保守性、非戴帽的5′非翻译区(NTR)，其起内部核糖体进入位点(IRES)的作用(Wang CY等′An RNA pseudoknot is an essential structural element of theinternal ribosome entry site located within the hepatitis C virus 5′noncodingregion′RNA-A Publication of the RNA Society.1(5)526-537，1995 Jul.)。此单元接着一区域，其编码单一长的可译框架(ORF)，编码包含结构性和非结构性病毒蛋白的～3000氨基酸的多肽。
当进入到所述细胞的细胞质中时，这种RNA直接被翻译成～3000个氨基酸的多肽，其包含结构性和非结构性病毒蛋白。随后，通过宿主和病毒编码的蛋白酶的结合，这种大的多肽被加工成各个结构性和非结构性蛋白(Rice，C.M.(1996)in B.N.Fields，D.M.Knipe and P.M.Howley(eds)Virology 2ndEdition，p931-960；Raven Press，N.Y.)。在长的ORF末端的终止密码子之后，存在3′NTR，其大致由三个区域组成～40碱基区域，其在各种基因型中是较差保守性的，可变长度的聚(U)/聚嘧啶道(tract)，和高度保守性的98碱基单元，也称为″3′X-tail″(Kolykhalov，A.等(1996)J.Virology 703363-3371；Tanaka，T.等(1995)Biochem Biophys.Res.Commun.215744-749；Tanaka，T.等(1996)J.Virology 703307-3312；Yamada，N.等(1996)Virology223255-261)。3′NTR被预测形成一种稳定的次级结构，其对黑猩猩中的HCV生长是必不可少的，并且被认为是在引发和调节病毒RNA复制中起作用。
HCV的NS5B蛋白(591个氨基酸，65kDa)(Behrens，S.E.等(1996)EMBOJ.1512-22)，编码依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)活性并含有存在于其它RNA病毒聚合酶中的规范基序。该NS5B蛋白在内-型(intra-typically)(横过1b隔离群(isolate)的～95-98％氨基酸(aa)同一性)和间-型(inter-typically)(基因型1a和1b隔离群之间的～85％aa同一性)都具有相当良好的保守性。传染性子代病毒体增殖的HCV NS5B RdRp活性的本质已经在黑猩猩中得到了正式的证实((A.A.Kolykhalov等(2000)Joumal of Virology，74(4)2046-2051)。由此，预测抑制NS5B RdRp活性(抑制RNA复制)可治疗HCV感染。
虽然全世界占主要的HCV基因型是基因型1，但是它本身具有两个主要的亚型，表示为1a和1b。从Los Alamos HCV数据库(www.hcv.lanl.gov)(表1)条目中可以看出，这些亚型的分布存在地区差别基因型1a在美国最多，而欧洲和日本的多数序列(sequence)来自基因型1b。
表1
基因型1a在某些区域中的流行使得非常有希望识别一种抗病毒剂，该抗病毒剂能够同时抑制基因型1a和基因型1b。这意味着将有更广泛的患者群能够从相同的药剂治疗中获得好处。
基于上文，存在显著需要以识别合成或生物学化合物，这些化合物具有抑制HCV两种基因型1a和基因型1b复制的能力。
PCT公开号WO2004/037818一般性地公开了具有HCV抑制活性的某些化合物，包括某些酰基吡咯烷化合物。所述试验涉及1b基因型。所公开的化合物具有式(I)的结构、及其盐、溶剂合物和酯，
其中A表示羟基；
D表示芳基或杂芳基；E表示氢、C1-6烷基、芳基、杂芳基或杂环基；G表示氢或任选被一个或多个取代基取代的C1-6烷基，所述的取代基选自卤代、OR1、SR1、C(O)NR2R3、CO2H、C(O)R4、CO2R4、NR2R3、NHC(O)R4、NHCO2R4、NHC(O)NR5R6、SO2NR5R6、SO2R4、硝基、氰基、芳基、杂芳基和杂环基；R1表示氢、C1-6烷基、芳烷基或杂芳基烷基；R2和R3独立地选自氢、C1-6烷基、芳基和杂芳基；或R2和R3与它们相连的氮原子一起形式5或6员饱和环状基团；R4选自C1-6烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳基烷基；R5和R6独立地选自氢、C1-6烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳基烷基；或R5和R6与它们相连的氮原子一起形成5或6员饱和环状基团；和J表示C1-6烷基、杂环基烷基、芳烷基或杂芳基烷基；条件是当A被酯化形成-OR，其中R选自直链或支链烷基、芳烷基、芳氧基烷基或芳基时，则R不是叔丁基。
令人吃惊地，现已发现，本发明的化合物，其一般性地在WO2004/037818中公开，并且具有特定的取代型，其相对于在WO2004/037818中公开的具体化合物，表现出改善的性质。
发明概述本发明涉及下文表示的C(2′)-杂芳基甲基-C(4)-甲氧基甲基酰基吡咯烷化合物，包含这些化合物的药物组合物以及该化合物在治疗病毒感染，尤其是HCV感染中的用途。
发明的详细说明本发明提供至少一种选自式(Ia)化合物、及其盐、溶剂合物和酯的化学个体
其中A表示羟基；D表示4-叔丁基-3-甲氧基苯基；E表示1，3-噻唑-2-基或5-甲基-1，3-噻唑-2-基；G表示甲氧基甲基；J表示1，3-噻唑-2-基甲基、1，3-噻唑-4-基甲基、1，2-噻唑-3-基甲基或1H-吡唑-1-基甲基；条件是当A被酯化形成-OR，其中R选自直链或支链烷基、芳烷基、芳氧基烷基或芳基时，则R不是叔丁基。
一方面，式(Ia)的外消旋化合物的相对立体化学，由式(Ip)或(Iq)表示 其中A、D、E、G和J如上式(Ia)所定义。
另一方面，式(Ia)的手性化合物的绝对立体化学，由式(Ipp)或(Iqq)表示 其中A、D、E、G和J如上式(Ia)所定义。
对于每个式Ia、Ip、Ipp、Iq和Iqq，如果适用的话，下列取代基团是优选的一方面，A是羟基(即，没有酯化)。
一方面，J表示1，3-噻唑-4-基甲基或1H-吡唑-1-基甲基。另一方面，J表示1H-吡唑-1-基甲基。在另一方面中，J表示1H-吡唑-1-基甲基和E表示1，3-噻唑-2-基。
一方面，式(Ia)的化合物由式(Ipp)的化合物表示。
可以理解，本发明包括在此所述的所有方面、合适的、方便的和优选的组的组合。
本发明的化学个体表现出改善的抗HCV聚合酶的基因型-1a/1b特征(profile)，因此在主要患者人群的范围内具有在人体中实现效力的潜力。
术语‘基因型-1a/1b特征’是指作为1a基因型的野生型HCV中的HCV聚合酶和1b基因型的野生型HCV中的HCV聚合酶的抑制剂的效力。在两种基因型中的高效力被认为是有益的。
另一方面，本发明提供至少一种选自式(Ia)化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物或酯的化学个体在人或兽医学治疗中的用途，特别是在治疗或预防病毒感染、特别是HCV感染中的用途。
可以理解，在此所指的治疗和/或疗法包括，但不局限于疾病的防止、延迟、预防、治疗和治愈。此外，还可以理解，在此所指的治疗或预防HCV感染包括治疗或预防与HCV有关的疾病例如肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。
根据本发明的另一方面，本发明提供至少一种选自式(Ia)化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物或酯的化学个体在制备用于治疗和/或预防病毒感染、特别是HCV感染的药物中的用途。
在另一可选方面，本发明提供一种患病毒感染、特别是HCV感染的人或动物患者的治疗方法，所述方法包括给予所述人或动物患者有效量的至少一种选自式(Ia)化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物或酯的化学个体。
可以理解，本发明的化合物可以含有一个或多个不对称碳原子，并且可以以外消旋体、非对映异构体和旋光体的形式存在。所有这些外消旋化合物、对映异构体和非对映异构体都在本发明的范围内。
一方面，在本发明中使用的化学个体可以选自式(Ia)的化合物，其选自rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-2-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；和rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；及其盐、溶剂合物和酯，以及各个对映异构体。
另一方面，在本发明中使用的化学个体可以选自式(Ia)的化合物，其选自rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；及其盐、溶剂合物和酯，以及各个对映异构体。
还有另一方面，在本发明中使用的化学个体可以选自式(Ia)的化合物，其选自rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；及其盐、溶剂合物和酯，以及各个对映异构体。
在另一方面中，在本发明中使用的化学个体可以选自式(Ia)的化合物，其选自rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸；及其盐、溶剂合物和酯，以及各个对映异构体。
本发明还包括药学上可接受的盐络合物。本发明还包括式(Ia)化合物的生理学上可接受的盐。式(Ia)化合物的合适的生理学上可接受的盐包括酸式盐(acid salt)，例如钠、钾、钙、镁和四烷基铵等，或与合适的酸形成的单-或二-碱式盐(basic salt)，所述酸例如有机羧酸如乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、羟乙磺酸、乳糖酸和琥珀酸；有机磺酸如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸，以及无机酸如盐酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸等。
本发明还涉及式(Ia)化合物的溶剂合物，例如水合物。
本发明还涉及式(Ia)化合物的药学上可接受的酯，例如，羧酸酯-COOR，其中R选自直链或支链烷基，例如正丙基、正丁基、烷氧基烷基(例如，甲氧基甲基)、烷氧基羰基烷基(例如例如甲氧基羰基甲基)、酰氧基烷基(例如新戊酰氧基甲基)、芳烷基(例如苄基)、芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)、芳基(例如任选被卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基取代的苯基)。除非另有说明，存在于这些酯中的任何烷基部分优选含有1-18个碳原子，特别是1-4个碳原子。存在于这些酯中的任何芳基部分优选包含苯基。
一方面，式(Ia)的化合物是以母体化合物、盐或溶剂合物的形式存在。
在此所使用的，在组分(活性组分如活性组分，其盐或赋形剂)方面所使用的术语“药学上可接受的”，其中所述的组分可以包括在给予患者的药物制剂内，是指可接受的、与存在于所述药物制剂中的任何其它组分可配伍的并且对其接受者没有毒害的组分。
可以进一步理解，本发明的某些化合物可以以不同的互变异构形式的形式存在。所有互变异构体都在本发明的范围之内。
式(Ia)的化合物其中A是羟基可以由式(II)化合物通过脱保护反应制备， 其中A’是被保护的羟基，例如烷氧基、苄氧基或甲硅烷氧基，例如三-(C1-4烷基)-甲硅烷氧基，以及D、E、G和J如上式(Ia)所定义。合适的保护基可以在T W Greene and P G M Wuts‘Protective Groups in Organic Synthesis’，3rdEd(l999)，J Wiley and Sons中找到，但不局限于那些。
例如，当A’是叔丁氧基，以及D、E、G和J如上式(Ia)所定义时，通过用合适的酸，例如三氟乙酸或浓盐酸水溶液处理。任选地，该反应在溶剂例如在二氯甲烷或二甲氧基乙烷中进行。一方面，所述的温度在0-60℃的范围内，另一方面，所述的温度在20-30℃的范围内。
例如，当A’是苄氧基，以及D、E、G和J如上式(Ia)所定义时，通过在合适的催化剂如钯/碳存在下的氢解反应。合适地，该反应在溶剂例如在乙醇中进行。优选地，所述的温度在0-50℃的范围内。
例如，当A’是烯丙氧基，以及D、E、G和J如上式(Ia)所定义时，通过用合适的催化剂如四(三苯基膦)钯(0)和合适的质子源如苯基甲硅烷处理。该反应在合适的溶剂例如在二氯甲烷中进行。
例如，当A’是三(甲基)甲硅烷氧基，以及D、E、G和J如上式(Ia)所定义时，通过用合适的氟源如氟化四丁基铵处理。该反应在合适的溶剂例如在四氢呋喃中进行。
式(Ia)或(II)的化合物可以通过使式(III)的化合物 其中A”是羟基或烷氧基、苄氧基或三-(C1-4烷基)-甲硅烷氧基，以及E、G和J如上式(Ia)所定义；与合适的酰化剂反应来制备，例如D-C(O)-hal，其中hal是卤素原子，优选氯或溴，以及D如上式(Ia)所定义。优选地，该反应在合适的溶剂如二氯甲烷中，在合适的碱如三乙胺存在下进行。合适地，所述的温度在0-50℃的范围内，更合适地，所述的温度在20-30℃的范围内。任选地，该反应可以在所述溶剂的回流温度下进行。
式(Ia)或(II)的化合物还可以通过使用合适的碱例如氢化钠或叔丁醇钠以及合适的甲基化试剂如甲基碘使式(IV)化合物甲基化来制备， 其中A”如上式(III)所定义，以及G’表示羟甲基。一方面，该反应在合适的溶剂或其混合物中进行，例如在二甲基甲酰胺、甲基-叔丁基醚、二甲氧基乙烷和/或乙腈中进行。一方面，该反应在-30-50℃的温度范围内进行，合适地在20-30℃的温度范围内或-25℃下进行。另一方面，该反应使用甲基-叔丁基醚和二甲氧基乙烷的混合物作为溶剂并在-25℃下进行。
式(IV)化合物可以通过合适地处理式(V)化合物制备得到，
其中A”如上式(III)所定义，以及D、E和J如上式(Ia)所定义，以及L表示CHO或CO2Y其中Y表示氢或烷基。例如，使用合适的还原剂，例如硼氢化锂、三乙基硼氢化锂、硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、硼烷/二甲硫醚络合物或氢化铝锂，或其合适的组合，在合适的溶剂或其混合物例如四氢呋喃和/或甲醇中，通过还原其中L表示CHO或CO2Y，其中Y表示氢或烷基的式(V)化合物进行制备。一方面，该反应可以在-78至40℃的温度范围内进行。另一方面，该反应可以在30至40℃的温度范围内进行。另一方面，该反应使用硼氢化钠和三乙酰氧基硼氢化钠的混合物在四氢呋喃和甲醇的溶剂混合物中进行。
其中L表示CO2Y其中Y表示氢的式(V)化合物，可以由其中L表示CO2Y其中Y表示烷基的式(V)化合物制备。例如，其中L表示CO2Me的式(V)化合物可以通过水解例如碱催化水解，使用合适的碱例如甲醇钠在合适的溶剂如甲醇中，转化为其中L表示CO2H的式(V)化合物。
其中L表示CHO或CO2Y其中Y表示氢或烷基的式(V)化合物，可以由式(VI)的化合物， 其中L表示CHO或CO2Y其中Y表示氢或烷基，以及A”、E和J如上式(III)所定义；用合适的酰化剂来制备，所述酰化剂例如D-C(O)-hal，其中hal是卤素原子，优选氯或溴，以及D如上式(Ia)所定义。优选地，该反应在合适的溶剂如二氯甲烷、甲基-叔丁基醚和/或乙腈中，在合适的碱如三乙胺或吡啶存在下进行。一方面，所述的反应在0-50℃的范围内进行，合适地，所述的反应在20-30℃的范围内进行。任选地，该反应可以在回流下进行。一方面，如果吡啶被用作碱，在进行下一步合成步骤前，通过用酸水溶液，例如盐酸，和/或再用水，合适地除去所有微量的吡啶。
其中A”是羟基的式(V)化合物，通过标准羟基保护方法，可以转化为其中A”是烷氧基、苄氧基或甲硅烷氧基的式(V)化合物。类似地，其中A”是烷氧基、苄氧基或甲硅烷氧基的式(V)化合物，通过标准脱保护方法，可以转化为其中A”是羟基的式(V)化合物。合适的保护基可以在T W Greene and P GM Wuts‘Protective Groups in Organic Synthesis’，3rdEd(1999)，J Wiley andSons中找到，但不局限于那些。
式(VI)的化合物可以通过使式(VII)的化合物 其中E和J如上式(Ia)所定义以及A”如上式(III)所定义，与式(VIII)的化合物反应制备， 其中L表示CHO或CO2Y其中Y表示氢或烷基。一方面，该反应在合适的溶剂例如THF或乙腈中，任选在路易氏酸催化剂如溴化锂或乙酸银，以及碱如三乙胺、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一-7-烯(DBU)或四甲基胍存在下进行。或者，该反应在合适的溶剂例如THF或乙腈中，在酸如乙酸存在下进行，或者该反应可以通过加热式(VII)和式(VIII)的化合物在合适的溶剂如甲苯、二甲苯或乙腈中在没有催化剂的情况下进行。
式(VI)的化合物还可以在一锅合成中通过使式(X)的化合物与式(VIII)的化合物和式E-CHO的化合物反应制备。优选地，该反应在合适的溶剂例如THF或乙腈中，任选在路易氏酸催化剂如溴化锂或乙酸银，以及碱如三乙胺、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一-7-烯(DBU)或四甲基胍存在下进行。优选地，该反应在0-50℃的范围内进行，更合适地该反应在20-30℃的范围内进行。在该方法中任选使用干燥剂，例如分子筛。
式(III)的化合物可以通过合适地处理式(IX)的化合物进行制备， 其中G’表示羟甲基，以及A”、E和J如上式(III)所定义，通过首先用合适的N-保护基例如苄氧基羰基(CBZ)或叔丁氧基羰基保护吡咯烷环的N-原子。可以按类似如上所述的方式，将式(IV)化合物转化为式(II)的化合物，N-保护的式(IX)的化合物可以转化为式(III)的化合物，其中G表示甲氧基甲基以及N-原子通过甲基化被保护。通过标准方法对N-原子脱保护，得到式(III)的化合物。
式(IX)的化合物可以通过使用合适的还原剂，例如硼氢化锂或硼氢化钠，在合适的溶剂例如四氢呋喃中，还原任选N-保护的其中L表示CO2Y以及Y表示烷基的式(VI)化合物来制备。通过标准方法对N-原子脱保护，生成式(IX)的化合物。例如，当N-保护基是CBZ时，脱保护可以通过催化氢解达到。例如，当所述的N-保护基是叔丁氧基羰基时，脱保护可以通过用合适的酸如三氟乙酸处理实现。
式(VII)的化合物可以通过使式(X)的化合物 其中J如上式(Ia)所定义以及A”如上式(III)所定义，与式E-CHO的化合物反应进行制备，其中E如上式(Ia)所定义。一方面，如果式(X)以酸加成盐的形式提供，例如盐酸盐，那么该反应可以在合适的碱如三乙胺存在下进行。另一方面，该反应可以在合适的干燥剂如硫酸镁存在下进行。该反应可以在合适的溶剂例如在二氯甲烷或甲苯中进行。
其中J是1H-吡唑-1-基甲基以及A”是羟基的式(X)化合物可以通过使化合物(XI) 其中J是1H-吡唑-1-基甲基，以及M是金属阳离子，例如钾，用合适的酸，例如10％盐酸水溶液在Amberlyst 120(H+)存在下处理进行制备。
其中J是1，3-噻唑-2-基甲基或1H-吡唑-1-基甲基，以及A”是烷氧基、苄氧基或三-(C1-4烷基)-甲硅烷氧基的式(X)化合物，可以通过使其中J是1，3-噻唑-2-基甲基或1H-吡唑-1-基甲基，以及A”是羟基的式(X)化合物，通过常规的酯化或保护基方法处理进行制备。例如，式(X)的化合物其中J是1，3-噻唑-2-基甲基或1H-吡唑-1-基甲基，以及A”是叔丁氧基，可以通过使式(X)的化合物其中J是1，3-噻唑-2-基甲基或1H-吡唑-1-基甲基和A”是羟基用合适的叔丁基转移剂如乙酸叔-丁酯在合适的酸催化剂如70％高氯酸水溶液存在下处理进行制备。一方面，由此制得的式(X)的游离碱化合物其中A”是烷氧基、苄氧基或三-(C1-4烷基)-甲硅烷氧基，通过用合适的酸如盐酸在二烷中处理，可以转化为合适的盐，例如盐酸盐。
式(XI)的化合物其中J是1H-吡唑-1-基甲基，可以通过使式(XII)的化合物 与1H-吡唑，在合适的碱如碳酸钾当M是钾时存在下，以及在合适的溶剂如含水乙腈存在下，反应来制备。优选地，该反应在50-70℃的温度范围内进行，合适地在60℃下进行。
式(X)的化合物其中J是1，3-噻唑-2-基甲基、1，3-噻唑-4-基甲基或1，2-噻唑-3-基甲基以及A”是烷氧基、苄氧基或三-(C1-4烷基)-甲硅烷氧基，可以通过使式(XIII)的化合物 其中J是1，3-噻唑-2-基甲基、1，3-噻唑-4-基甲基或1，2-噻唑-3-基甲基以及A”是烷氧基、苄氧基或三-(C1-4烷基)-甲硅烷氧基，用酸如15％含水柠檬酸处理进行制备。优选地，该反应在合适的溶剂例如在THF和/或水存在下进行。
式(XIII)的化合物可以通过使式(XIV)的化合物 其中A”是烷氧基、苄氧基或三-(C1-4烷基)-甲硅烷氧基，与式J-hal的化合物其中J是1，3-噻唑-2-基甲基、1，3-噻唑-4-基甲基或1，2-噻唑-3-基甲基，以及hal是卤素原子，优选氯或溴，反应制备。优选地，该反应在合适的碱如叔丁醇钾存在下进行。优选地，该反应可以在合适的溶剂例如THF存在下进行。该反应可以在合适的催化剂如碘化锂存在下进行。优选地，该反应在-10℃至室温的温度范围内进行，合适地在0℃下进行。
式D-C(O)-hal的化合物其中D是3-甲氧基-4-叔丁基苯基，可以通过使式(XV)的化合物 与合适的酰基卤形成试剂如草酰氯或亚硫酰氯反应制备。一方面，该反应可在合适的催化剂例如二甲基甲酰胺或二乙基甲酰胺存在下进行。任选地，该反应在合适的溶剂如二氯甲烷中，在0至50℃的温度范围内进行，例如20至30℃的温度范围内进行。在一种可供选择的方面中，该反应使用亚硫酰氯在回流下进行。
式(VIII)、(XII)、(XIV)、(XV)、J-hal和E-CHO的化合物在本领域中是已知的，是市场上可买到的，或者可以通过标准文献方法制备。
其中A是酯的式(Ia)化合物可以通过酯化的标准文献方法，通过酯化其中A是羟基的式(Ia)化合物来制备。
可以理解，式(Ia)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)和/或(IX)的化合物，其以非对映异构体存在，可以任选通过本领域公知的方法分离，例如通过柱色谱。
还可以理解，本发明提供一种式(V)或(VI)的化合物的C(4)-差向异构体的相互转换方法，其中L表示CHO或CO2Y其中Y表示氢或烷基，以及A”、E和J如上式(III)所定义。例如，如果合适的话，式(V)和/或(VI)的化合物的rel-(2R，4S，5R)-非对映异构体可以转化为rel-(2R，4R，5R)-非对映异构体。这些rel-(4S，5R)-非对映异构体的这种差向异构化为相应的rel-(4R，5R)-非对映异构体可以通过用合适的碱在合适的溶剂存在下处理式(V)和/或(VI)的化合物来实现。例如，式(V)的化合物的rel-(4S，5R)-非对映异构体当L表示CO2Me时转化为rel-(4R，5R)-非对映异构体可以通过用合适的碱如甲醇钠在合适的溶剂如甲醇存在下处理rel-(4S，5R)-非对映异构体来实现。
可以理解，式(Ia)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)和/或(IX)的外消旋化合物可以任选拆分成它们的各自对映异构体。这些拆分可以方便地通过本领域已知的标准方法来实现。例如，式(Ia)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)和/或(IX)的外消旋化合物可以通过手性制备性HPLC进行拆分。或者，式(Ia)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)和/或(IX)的外消旋化合物其含有合适的酸性或碱性基团，例如羧酸基团或胺基，可以分别视情况用手性碱或酸试剂通过标准的非对映异构体盐的形成来进行拆分。这些技术在本领域中是公知的。例如，式(VI)的外消旋化合物，其中L是CO2Me，可以通过用手性酸例如(R)-(-)-1，1’-联萘-2，2’-二基-磷酸氢盐在合适的溶剂或其混合物例如二氯甲烷、异丙醇、乙酸异丙酯和/或乙腈中处理进行拆分。一方面，二氯甲烷和乙酸异丙酯的混合物被用作溶剂。然后，式(VI)的对映异构体可以通过用合适的碱如三乙胺在合适的溶剂如甲基叔丁基醚中处理该盐获得。然后，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)和/或(IX)的各个对映异构体可通过关于如上所述的外消旋化合物的化学处理，得到式(Ia)的对映异构体化合物。
还可以理解，式(III)、(VI)和/或(IX)的各个对映异构体化合物，可以通过不对称合成的一般方法制备，如果合适的话，使用手性助剂或手性催化试剂并再进行如上所述的任何合适的官能团相互转换步骤，包括加入或除去任何这些手性助剂。不对称合成的这些一般方法在本领域中是公知的并且包括，但不局限于，在”Asymmetric Synthesis，”Academic Press，1984和/或“Chiral Auxiliaries and Ligands in Asymmetric Synthesis”，Wiley，1995中所述的那些。例如，合适的一般手性助剂包括手性醇类例如薄荷醇或1-苯基乙醇；手性唑烷酮类(oxazolidinones)例如4-苄基唑烷-2-酮或4-异丙基唑烷-2-酮；手性磺内酰胺例如樟脑磺内酰胺；或手性胺例如1-苯基乙胺或2-氨基-2-苯基乙醇。合适的一般手性催化试剂包括手性碱性胺和手性配体例如N-甲基麻黄碱、1-苯基-2-(1-吡咯烷基)-1-丙醇、3-(二甲氨基)-1，7，7-三甲基双环[2.2.1]-庚烷-2-醇、3，4-双(二苯基膦基(phosphanyl))-1-(苯基甲基)-吡咯烷、辛可宁(chinchonine)、辛可尼丁(chinchonidine)、司巴丁、氢化奎宁或奎宁、BINAP或手性双(唑啉)(BOX)配体和衍生物，任选在金属盐存在下，例如MmXx其中M是银、钴、锌、钛、镁或锰，并且X是卤化物(例如氯化物或溴化物)、乙酸盐、三氟乙酸盐、对-甲苯磺酸盐、三氟甲磺酸盐、六氟磷酸盐或硝酸盐，以及m和x是1、2、3或4，以及任选在碱如三乙胺存在下。所有这些手性助剂或手性催化试剂在本领域中都是公知的。使用手性助剂或手性催化试剂通过不对称合成制备各种手性吡咯烷的一般说明性的例子包括，但不局限于，在Angew.Chem.Int.Ed.，(2002)，414236；Chem.Rev.，(1998)，98863；J.Am.Chem.Soc.，(2002)，12413400；J.Am.Chem.Soc.，(2003)，12510175；Org.Lett.，(2003)，5，5043；Tetrahedron，(1995)，51273；TetrahedronAsymm.，(1995)，62475；TetrahedronAsymm.，(2001)，121977；TetrahedronAsymm.，(2002)，132099和Tet.Lett.，(1991)，415817中所述的那些。
在一个具体方面中，式(VIa)的手性吡咯烷化合物 其中L1表示CO2Y或CO2Y1，其中Y表示氢或烷基，Y1表示手性助剂，A”、E和J如上式(VI)所定义，以及*表示对映体富集的手性中心，可以通过如上文所定义的式(VII)的化合物与式(VIIIa)的化合物反应制备 其中L1表示手性酯基CO2Y1，其中Y1表示手性助剂，然后任选通过除去手性助剂的标准方法将CO2Y1转化为CO2Y。这些手性酯CO2Y1可以通过标准酯化技术衍生自手性醇Y1OH，例如薄荷醇。优选地，式(VII)的化合物与式(VIIIa)的化合物的反应在合适的溶剂例如THF或乙腈中，任选在路易氏酸催化剂如溴化锂或乙酸银，以及碱如三乙胺、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一-7-烯(DBU)或四甲基胍存在下进行。或者，该反应在合适的溶剂例如THF或乙腈中，在酸如乙酸存在下进行，或者该反应可以在合适的溶剂如甲苯、二甲苯或乙腈中在没有催化剂的情况下通过加热式(VII)和式(VIIIa)的化合物来进行。类似于式(VIa)和(VIIIa)的那些化合物的制备描述在TetrahedronAsymm.，(1995)，62475中。
在另一方面中，式(VIb)的手性吡咯烷化合物 其中L表示CO2Y，其中Y表示氢或烷基，以及A”、E和J如上式(VI)所定义，以及*表示对映体富集的手性中心，可以通过如在此前所定义的式(VII)的化合物与式(VIII)的化合物在不对称反应条件下反应制备。本领域熟练技术人员可以理解，这些不对称反应条件例如可以通过包含在此之前所定义的手性催化试剂的反应混合物中获得。
一方面，该反应在合适的手性催化试剂例如(-)-N-甲基麻黄碱，以及合适的金属盐，例如溴化锰(II)存在下，在合适的溶剂例如在乙腈中进行。优选地，该反应在-30℃至室温的温度范围内进行，合适地在-20℃下进行。
在一种可供选择的方面中，该反应在合适的手性催化试剂例如(S)-(-)-2，2′-双(二苯基膦基)-1′1-联萘(S-BINAP)，以及合适的金属盐例如乙酸银存在下，在合适的碱例如二异丙基乙胺存在下，在合适的溶剂例如乙腈任选与甲苯组成的共溶剂中进行。优选地，该反应在-15℃至室温的温度范围内进行，合适地在-5℃下进行。
任选地，来源于这样一个不对称反应的式(VIa)或式(VIb)化合物的主要手性非对映异构体可以进一步通过本领域公知的常规提纯方法进行对映异构体富集，例如通过色谱法或通过分步结晶法。一种有利的结晶方法是该主要手性非对映异构体的盐例如盐酸盐或(R)-(-)-1，1′-联萘-2，2′-二基-磷酸氢盐的分步结晶法。
式(VIa)或式(VIb)化合物的盐酸盐可以通过使式(VIa)或式(VIb)的化合物用无水氯化氢在合适的溶剂如乙醚中进行处理来制备。优选地，该反应在-10至10℃的温度范围内进行。
式(VIa)或式(VIb)的化合物的(R)-(-)-1，1′-联萘-2，2′-二基-磷酸氢盐可以如在此之前所述的那样通过拆分式(VI)的外消旋化合物进行制备。
任选从其中L1表示CO2Y1的基团中除去手性助剂以得到其中L1表示CO2Y的基团，这可以容易地通过标准方法完成，例如用水解试剂如氢氧化钠或醇盐例如甲醇钠处理，视情况而定，在合适的溶剂如甲醇中。
任选地，式(VIa)或式(VIb)的手性化合物可以通过下面的方法转化为式(IX)的手性化合物，其中G’表示羟烷基，以及A”、E和J如上式(III)所定义用合适的试剂处理，以实现基团L或L1的官能团相互转换为基团G’。例如，其中L1表示CO2Y1以及Y1如上所定义的式(VIa)化合物，可以在合适的溶剂例如四氢呋喃中，用合适的还原剂例如氢化铝锂处理。
任选地，式(VIa)或式(VIb)的手性化合物可以通过下面的方法转化为式(IV)的手性化合物，其中G’表示羟烷基首先按照如上所述的酰化吡咯烷氮原子，将式(VI)的化合物转化为式(V)的化合物，然后用合适的试剂处理以实现上述将基团L或L1的官能团相互转换为基团G’，从而将式(VIa)或式(VIb)的化合物转化为式(IX)的手性化合物。
可以理解，用如上所述的合适的额外转化步骤，式(Ia)、(II)、(IV)和/或(V)的手性化合物可以由式(III)、(VI)和(IX)的手性化合物制备。
任何化学官能团的合适操作和保护、式(I)化合物的合成通过与上述方法和实验部分中所述的方法相类似的方法完成。合适的保护基可以在T WGrcene and P G MWuts′Protective Groups in Organic Synthesis′，3rdEd(1999)，JWiley and Sons中找到，但不局限于此。
实施例本领域熟练技术人员可以理解，当在反应中使用溶剂时，最好使用无水溶剂。此外，如果合适的话，希望反应在惰性气氛中进行，例如在氮气或氩气中进行。
中间体12-[N-(二苯亚甲基)氨基]-3-(1，3-噻唑-4-基)丙酸叔丁酯 部分A在氮气氛中，向冷却下(冰浴)的2-[N-(二苯亚甲基)氨基]乙酸叔丁酯(J.Org.Chem.，1982，47，2663；42.3g，143mmol)在干燥THF(450mL)中的溶液中，在25分钟内滴加(滴液漏斗)1M叔丁醇钾在THF(146mL)中的溶液。将所述的混合物在冰浴中再搅拌45分钟。
部分B在这个时候，独立地如下将4-(氯甲基)-1，3-噻唑盐酸盐(25.5g，150mmol)刚被转化为游离碱盐酸盐与二氯甲烷(500mL)混合并用5％w/v碳酸氢钠水溶液(375mL)洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥并小心地蒸发(旋转蒸发仪；80托，水浴25℃)，得到游离碱。
部分C将4-(氯甲基)-1，3-噻唑(在部分B中制备)溶于THF(100mL)中并在30分钟内滴加(滴液漏斗)到部分A的反应混合物中，同时将反应保持在冰浴温度下。开始加入烷基化试剂后5分钟，向反应混合物中直接加入固体无水碘化锂(1g，7.5mmol)。所述的滴液漏斗用另外的干燥THF(50mL)漂洗，然后将洗涤物加入到反应中。将反应在冰浴温度下搅拌45分钟，在30分钟内温热至室温并在室温下再搅拌2.5小时，接着在饱和盐水(400mL)、水(200mL)的混合物和乙酸乙酯(800mL)之间进行分配。分离有机层，水层用另外的乙酸乙酯(2×300mL)反萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，蒸发，得到标题化合物(57.8g，粗产物)，其在没有进一步提纯的情况下就使用。
1H NMR(CDCl3)δ8.65(d，1H)，7.55-7.62(m，2H)，7.2-7.55(m，6H)，7.05(d，1H)，6.78-6.87(m，2H)，4.36-4.41(m，1H)，3.47-3.54(m，1H)，3.36-3.44(m，1H)和1.44(s，9H)。
中间体22-氨基-3-(1，3-噻唑-4-基)丙酸叔丁酯 在氩气中，向2-[N-(二苯亚甲基)氨基]-3-(1，3-噻唑-4-基)丙酸叔丁酯(按类似中间体1中所述的方法制备；20g)在THF(150mL)中的溶液中加入柠檬酸在水(15％w/v，150mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌6小时，放置过夜，然后在减压下除去大部分THF(旋转蒸发仪；25℃水浴)，接着加入1M盐酸水溶液(60mL)。混合物用乙醚(2×200mL)萃取，合并的乙醚萃取液用水(50mL)反萃取。合并的水层用另外的乙醚(100mL)萃取。弃去所有的乙醚层。然后，用碳酸钾将水层小心地调节到pH9.5，加入盐水(100mL)，接着将混合物用乙醚(4×200mL)萃取。将这些合并的乙醚层用硫酸钠干燥。在减压下除去溶剂，得到标题化合物，一种油。
1H NMR(CDCl3)δ8.77(d，1H)，7.08(d，1H)，3.77-3.85(m，1H)，3.22-3.32(m，1H)，3.02-3.13(m，1H)和1.42(s，9H)。没有观察到胺质子。
中间体32-[[N-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)亚甲基]氨基]-3-(1，3-噻唑-4-基)丙酸叔丁酯
将2-氨基-3-(1，3-噻唑-4-基)丙酸叔丁酯(中间体2；2.90g，12.7mmol)、5-甲基-1，3-噻唑-2-甲醛(1.62g，12.7mmol)和硫酸镁(约1g)在二氯甲烷(70mL)中的混合物在室温下搅拌18小时。反应混合物过滤，蒸发除去溶剂，得到油状的标题化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.75(d，1H)，8.11(s，1H)，7.55(br，1H)，7.02(d，1H)，4.45(dd，1H)，3.56(dd，1H)，3.33(dd，1H)，2.50(br s，3H)和1.44(s，9H)。
中间体4rel-(2R，4S，5R)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 将2-[[N-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)亚甲基]氨基]-3-(1，3-噻唑-4-基)-丙酸叔丁酯(中间体3，4.3g，12.75mmol)在四氢呋喃(125mL)中的溶液在氮气中进行搅拌。依次加入丙烯酸甲酯(2.15g，25mmol)、溴化锂(2.20g，25mmol)和三乙胺(1.73mL，12.5mmol)，接着将所得混合物搅拌18小时。加入饱和氯化铵溶液(100mL)，接着将混合物用乙酸乙酯(2×150mL)萃取。合并的萃取液用水(100mL)和饱和盐水(100mL)洗涤，用硫酸镁干燥并蒸发。残余物用硅胶色谱提纯，使用乙酸乙酯-环己烷(1∶1v/v然后2∶1v/v)作为洗脱液，得到油状的标题化合物。
MS计算值(C19H25N3O482+H)+424.
MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝424中间体5
rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 在氮气中，将rel-(2R，4S，5R)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)-吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯(中间体4，3.90g，9.2mmol)、3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰氯1(3.28g，15.6mmol)和三乙胺(3.52mL)在二氯甲烷(50mL)中的混合物在室温下搅拌3天。混合物用水(100mL)和盐水(50mL)洗涤，通过疏水性玻璃料干燥并蒸发。残余物用硅胶色谱提纯，使用环己烷-乙酸乙酯(3∶1v/v)作为洗脱液，得到泡沫状的标题化合物。
MS计算值(C31H39N3O6S2+H)+614MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝614。
Ref.(1)由3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酸合成(J.Org.Chem.，26，1961，1732-1737)。
中间体6rel-(2R，4S，5R)-4-(羟甲基)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯 将rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯(中间体5，4.80g，7.82mmol)在四氢呋喃(200mL)中的溶液在氮气中搅拌，接着冷却至-78℃。滴加氢化铝锂在乙醚(8.1mL)中的1.0M溶液。当加毕时，将混合物温热至-45℃并在此温度下保持3.5小时。混合物用1M碳酸钾水溶液(100mL)淬灭，接着用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。萃取液用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤，用硫酸镁干燥并蒸发。残余物用硅胶色谱提纯，使用环己烷-乙酸乙酯(最初2∶1v/v然后1∶2v/v)作为洗脱液，得到泡沫状的标题化合物。
MS计算值(C30H39N3O5S2+H)+586MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝586中间体7rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯 将rel-(2R，4S，5R)-4-(羟甲基)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯(中间体6，0.585g，1mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液在氮气中搅拌并冷却至-10℃。加入氢化钠在矿物油中的60％分散体(69mg，1.72 mmol)，接着将所得混合物低于0℃下搅拌30min。加入碘甲烷(0.425mL)，混合物再搅拌4小时，将反应混合物的温度保持在0℃至20℃之间。混合物用甲醇(10mL)淬灭并蒸发。将残余物在水(50mL)和乙酸乙酯(100mL)之间进行分配。收集有机层，用水和盐水洗涤，用硫酸镁干燥，接着蒸发。残余物用硅胶色谱提纯，使用环己烷-乙酸乙酯(最初2∶1v/v然后1∶1v/v)作为洗脱液，得到泡沫状的标题化合物。
MS计算值(C31H41N3O5S2+H)+600MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝600中间体82-[N-(1，3-噻唑-2-基亚甲基)氨基]-3-(1，3-噻唑-4-基)丙酸叔丁酯
该标题化合物以类似于中间体3的方法制备，使用1，3-噻唑-2-甲醛代替5-甲基-1，3-噻唑-2-甲醛。
1H NMR(CDCl3)δ8.75(d，1H)，8.23(s，1H)，7.90(d，1H)，7.43(dd，1H)，7.03(d，1H)，4.50(dd，1H)，3.58(dd，1H)，3.34(dd，1H)和1.45(s，9H)。
中间体9rel-(2R，4S，5R)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体4的方法制备，使用中间体8代替中间体3。将混合物冷却至0℃，接着加入丙烯酸甲酯，然后温热至RT，最后猝灭。
MS计算值(C18H23N3O4S2+H)+410MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝410中间体10rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体5的方法制备，使用中间体9代替中间体4。环己烷-乙酸乙酯(梯度洗脱从50∶1到1∶1)被用作色谱洗脱液。
MS计算值(C30H37N3O6S2+H)+600MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝600中间体11rel-(2R，4S，5R)-4-(羟甲基)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体6的方法制备，使用中间体10代替中间体5。环己烷-乙酸乙酯(梯度洗脱从50∶1到2∶3)被用作色谱洗脱液。
MS计算值(C29H37N3O5S2+H)+572MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝572中间体12rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体7的方法制备，使用中间体11代替中间体6。环己烷-乙酸乙酯(梯度洗脱从50∶1到1∶1)被用作色谱洗脱液。
MS计算值(C30H39N3O5S2+H)+586MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝586中间体13
2-[N-(二苯亚甲基)氨基]-3-(1，2-噻唑-3-基)丙酸叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体1的方法制备，使用3-(溴甲基)-1，2-噻唑代替4-(氯甲基)-1，3-噻唑。
1H NMR(CDCl3)δ8.51(d，1H)，7.61-7.18(m，8H)，7.08(dd，1H)，6.83(m，2H)，4.38(dd，1H)，3.48(d，2H)和1.43(s，9H)。
中间体142-氨基-3-(1，2-噻唑-3-基)丙酸叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体2的方法制备，使用中间体13代替中间体1。
1H NMR(CDCl3)δ8.60(d，1H)，7.13(d，1H)，3.84(dd，1H)，3.29(dd，1H)，3.15(dd，1H)和1.43(s，9H)。没有看到胺质子。
中间体152-[N-(1，3-噻唑-2-基亚甲基)氨基]-3-(1，2-噻唑-3-基)丙酸叔丁酯 该标题化合物以类似于中间体3的方法制备，使用中间体14代替中间体2，以及1，3-噻唑-2-甲醛代替5-甲基-1，3-噻唑-2-甲醛。将反应在回流下加热1.5小时。
1H NMR(CDCl3)δ8.54(d，1H)，8.34(s，1H)，7.92(d，1H)，7.44(dd，1H)，7.10(d，1H)，4.54(dd，1H)，3.60(dd，1H)，3.42(dd，1H)和1.43(s，9H)。
中间体16
rel-(2R，4S，5R)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体4的方法制备，使用中间体15代替中间体3。环己烷-乙酸乙酯(3∶2v/v)被用作色谱洗脱液，接着蒸除溶剂，得到泡沫状的标题化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.58(d，1H)，7.66(d，1H)，7.24(d，1H)，7.22(d，1H)，4.85(d，1H)，3.46(s，3H)，3.34(d，1H)，3.28-3.22(m，1H)，3.20(d，1H)，2.85(dd，1H)，2.31(dd，1H)和1.43(s，9H)。没有看到胺质子。
中间体17rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体5的方法制备，使用中间体16代替中间体4。盐水洗涤后，搅拌下加入饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌25分钟。环己烷-乙酸乙酯(4∶1v/v)被用作色谱洗脱液。
MS计算值(C30H37N3O6S2+H)+600MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝600中间体18rel-(2R，4S，5R)-4-(羟甲基)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯
该标题化合物用类似于中间体6的方法制备，使用中间体17代替中间体5，以及氯化铵代替碳酸钾水溶液。
MS计算值(C29H37N3O5S2+H)+572MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝572中间体19rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体7的方法制备，使用中间体18代替中间体6。
1H NMR(CDCl3)δ8.66(d，1H)，7.42(d，1H)，7.32(d，1H)，7.15(d，1H)，7.10(d，1H)，6.71(d，1H)，6.52(s，1H)，5.17(d，1H)，4.18(d，1H)，3.61(d，1H)，3.63(s，3H)，2.94(s，3H)，2.76(dd，1H)，2.66(dd，1H)，2.45(dd，1H)，2.34(t，1H)，2.02-1.91(m，1H)，1.64(s，9H)和1.29(s，9H)。
中间体202-氨基-3-(1H-吡唑-1-基)丙酸叔丁酯 向搅拌下的2-氨基-3-(1H-吡唑-1-基)丙酸(10.2g，65.9mmol)在醋酸叔丁酯(400mL)中的悬浮液中加入70％高氯酸的水溶液(15.7mL)。所述混合物在室温下搅拌30分钟，然后静置20小时。反应混合物用乙酸乙酯稀释，然后使用饱和碳酸氢钠水溶液和固体碳酸氢钠的组合进行中和。分开水相并用乙酸乙酯萃取。合并有机相，用硫酸钠干燥，蒸发，得到油状的标题化合物。
MS计算值(C10H17N3O2+H)+212MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝212。
中间体212-[N-(1，3-噻唑-2-基亚甲基)氨基]-3-(1H-吡唑-1-基)丙酸叔丁酯 该标题化合物以类似于中间体3的方法制备，使用1，3-噻唑-2-甲醛代替5-甲基-1，3-噻唑-2-甲醛以及使用中间体20代替中间体2。
1H NMR(CDCl3)δ8.09(s 1H)，7.90(d，1H)，7.5 1(d，1H)，7.42(d，1H)，7.33(d，1H)，6.12(t，1H)，4.78(dd，1H)，4.50(dd，2H)，1.46(s，9H)。
中间体22rel-(2R，4S，5R)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体4的方法制备，使用中间体21代替中间体3。环己烷-乙酸乙酯(1∶2然后1∶1v/v)被用作色谱洗脱液。
MS计算值(C18H24N4O4S+H)+393MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝393中间体23rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯
该标题化合物用类似于中间体5的方法制备，使用中间体22代替中间体4。
MS计算值(C30H38N4O6S+H)+583MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝583中间体24rel-(2R，4S，5R)-4-羟甲基-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体6的方法制备，使用中间体23代替中间体5。环己烷-乙酸乙酯(梯度洗脱从50∶1到1∶2v/v)被用作色谱洗脱液。
MS计算值(C29H38N4O5S+H)+555MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝555中间体25rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯
该标题化合物用类似于中间体7的方法制备，使用中间体24代替中间体5。环己烷-乙酸乙酯(梯度洗脱从50∶1到3∶2v/v)被用作色谱洗脱液。
MS计算值(C30H40N4O5S+H)+569MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝569中间体262-氨基-3-(1，3-噻唑-2-基)丙酸叔丁酯 将70％高氯酸水溶液(1.47 mL)滴加到搅拌下的2-氨基-3-(1，3-噻唑-2-基)丙酸(1.077g，6.25mmol)在醋酸叔丁酯(34mL)中的悬浮液中。将悬浮液在氮气中在室温下搅拌过夜。加入乙酸乙酯(100mL)，混合物用饱和碳酸氢钠溶液和固体碳酸氢钠碱化至～pH8。分离有机溶液，用硫酸镁干燥，浓缩，得到无色油状的标题化合物。
1H NMR(CDCl3)δ7.75(d，1H)，7.27(d，1H)，3.88(dd，1H)，3.50(dd，1H)，3.32(dd，1H)，1.47(s，9H)。
中间体272-[[N-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)亚甲基]氨基]-3-(1，3-噻唑-2-基)丙酸叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体3的方法制备，使用中间体26代替中间体2。
1H NMR(CDCl3)δ8.28(s，1H)，7.69(d，1H)，7.60(d，1H)，7.19(d，1H)，4.46(m，1H)，3.75(dd，1H)，3.58(dd，1H)，2.50(s，3H)和1.42(s，9H)。
中间体28
rel-(2R，4S，5R)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-2-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体4的方法制备，使用中间体27代替中间体3。
MS计算值(C19H25N3O4S2+H)+424MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝424中间体29rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-2-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体5的方法制备，使用中间体28代替中间体4。
MS计算值(C31H39N3O6S2+H)+614MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝614中间体30rel-(2R，4S，5R)-4-(羟甲基)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-2-基甲基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯
该标题化合物用类似于中间体6的方法制备，使用中间体29代替中间体5。
MS计算值(C30H39N3O5S2+H)+586MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝586中间体31rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-2-基甲基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体7的方法制备，使用中间体30代替中间体6。
MS计算值(C31H41N3O5S2+H)+600MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝600中间体322-[[N-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)亚甲基]氨基]-3-(1，2-噻唑-3-基)丙酸叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体3的方法制备，使用中间体14代替中间体2。
1H NMR(CDCl3)δ8.53(d，1H)，8.23(d，1H)，7.56(d，1H)，7.08(d，1H)，4.50(dd，1H)，3.57(dd，1H)，3.39(dd，1H)，2.50(d，3H)和1.44(s，9H)。
中间体33
rel-(2R，4S，5R)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体4的方法制备，使用中间体32代替中间体3。
MS计算值(C19H25N3O4S2+H)+424MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝424中间体34rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体5的方法制备，使用中间体33代替中间体4。
MS计算值(C31H39N3O6S2+H)+614MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝614中间体35rel-(2R，4S，5R)-4-(羟甲基)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯
该标题化合物用类似于中间体6的方法制备，使用中间体34代替中间体5。
MS计算值(C30H39N3O5S2+H)+586MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝586中间体36rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体7的方法制备，使用中间体35代替中间体6。
MS计算值(C31H41N3O5S2+H)+600MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝600中间体372-[[N-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)亚甲基]氨基]-3-(1H-吡唑-1-基)丙酸叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体3的方法制备，使用中间体20代替中间体2。
1H NMR(CDCl3)δ7.98(s，1H)，7.56(bd，1H)，7.50(bd，1H)，7.34(d，1H)，6.13(t，1H)，4.82-4.73(m，1H)，4.50-4.43(m，2H)，2.51(s，3H)和1.47(s，9H)。
中间体38
rel-(2R，4S，5R)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体4的方法制备，使用中间体37代替中间体3。
MS计算值(C19H26N4O4S+H)+407MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝407中间体39rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯，4-甲酯 该标题化合物用类似于中间体5的方法制备，使用中间体38代替中间体4。
MS计算值(C31H40N4O6S+H)+597MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝597中间体40rel-(2R，4S，5R)-4-(羟甲基)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯
该标题化合物用类似于中间体6的方法制备，使用中间体39代替中间体5。
MS计算值(C29H38N4O5S+H)+569MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝569中间体41rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2，4-二羧酸，2-叔丁酯 该标题化合物用类似于中间体7的方法制备，使用中间体40代替中间体6。
MS计算值(C31H42N4O5S+H)+583MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝583实施例1rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸 将rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯(中间体7，0.205g，0.34mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液用三氟乙酸(3mL)在室温下处理4小时。混合物蒸发，残余物用乙醚研制，得到白色固体的标题化合物。
MS计算值(C27H33N3O5S2+H)+544
MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5441H NMR(CD3OD)δ9.09(d，1H)，8.31(d，1H)，7.53(d，1H)，7.51(d，1H)，7.21(d，1H)，6.79(dd，1H)，6.55(d，1H)，5.05(d，1H)，4.07(d，1H)，3.70(s，3H)，3.55(d，1H)，2.98(s，3H)，2.95(dd，1H)，2.50(t，1H)，2.40(dd，1H)，2.36(d，3H)，2.13(t，1H)和1.32(s，9H)。
实施例2rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基-甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸的对映异构体A rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸(实施例1)通过在Chiralpak AD柱上制备性手性HPLC拆分，使用含有0.1％三氟乙酸的庚烷-乙醇(75∶25v/v)作为洗脱液，得到第一种和第二种洗脱对映异构体。第二种洗脱对映异构体用乙醚研制，得到标题化合物。
MS计算值(C27H33N3O5S2+H)+544MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5441H NMR(CD3OD)δ9.09(d，1H)，8.31(d，1H)，7.53(d，1H)，7.51(d，1H)，7.21(d，1H)，6.79(dd，1H)，6.55(d，1H)，5.05(d，1H)，4.07(d，1H)，3.70(s，3H)，3.55(d，1H)，2.98(s，3H)，2.95(dd，1H)，2.50(t，1H)，2.40(dd，1H)，2.36(d，3H)，2.13(t，1H)和1.32(s，9H)。
实施例3rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸
此化合物按类似于实施例1的方法制备，使用中间体12代替中间体7并用硅胶柱色谱提纯，开始用环己烷-乙酸乙酯(梯度洗脱从5∶2-2∶3v/v)，接着用二氯甲烷洗脱，然后用二氯甲烷-甲醇(梯度洗脱从60∶1-19∶1v/v)洗脱，得到标题化合物。
MS计算值(C26H31N3O5S2+H)+530MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5301H NMR(CDCl3)δ8.87(d，1H)，7.79(d，1H)，7.25(dd，2H)，7.10(d，1H)，6.61(dd，1H)，6.40(d，1H)，5.18(d，1H)，4.22(d，1H)，3.70(d，1H)，3.62(s，3H)，3.11(dd，1H)，3.01l(s，3H)，2.48(dd，1H)，2.31(m，1H)，2.16(m，2H)，1.89(br，1H)和1.30(s，9H)。
实施例4rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2-羧酸 该化合物按类似实施例1的方法制备，使用在纯三氟乙酸中的中间体19代替在三氟乙酸和二氯甲烷中的中间体7，以及用二氯甲烷重蒸发代替用乙醚研制。在C18柱上通过反相HPLC提纯，使用双溶剂梯度洗脱，其中(A)含甲酸(0.1％)的水和(B)含甲酸(0.05％)的乙腈-水(95∶5v/v)作为洗脱液，通过电喷射质谱分析级分，得到标题化合物。
MS计算值(C26H31N3O5S2+H)+530MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝530
1H NMR(CDCl3)δ8.70(1H，d)，7.78(1H，d)，7.31(1H，d)，7.27(1H，d)，7.12(1H，d)，6.63(1H，dd)，6.45(1H，d)，5.19(1H，d)，4.22(1H，d)，3.73(1H，d)，3.64(3H，s)，3.08(1H，dd)，3.00(3H，s)，2.42(1H，dd)，2.31(1H，t)，2.17(1H，t)，2.04-1.94(1H，m)和1.29(9H，s)。没有看到酸质子。
实施例5rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基-甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2-羧酸的对映异构体A rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2-羧酸(实施例4)通过在ChiralPak AD柱上制备性手性HPLC拆分，使用含0.1％三氟乙酸的庚烷-乙醇(85∶15v/v)作为洗脱液，得到第一种和第二种洗脱对映异构体。将所述的第二种洗脱对映异构体溶于二氯甲烷中，用碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(疏水性玻璃料)并除去溶剂，得到标题化合物。
MS计算值(C26H31N3O5S2+H)+530MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5301H NMR(CDCl3)δ8.70(d，1H)，7.78(d，1H)，7.31(d，1H)，7.27(d，1H)，7.12(d，1H)，6.63(dd，1H)，6.45(d，1H)，5.19(d，1H)，4.23(d，1H)，3.74(d，1H)，3.64(s，3H)，3.08(dd，1H)，3.00(s，3H)，2.43(dd，1H)，2.31(t，1H)，2.17(t，1H)，2.06-1.94(m，1H)，1.29(s，9H)。没有看到酸质子。
实施例6rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸
该标题化合物按类似于实施例1的方法制备，使用中间体25代替中间体7。通过硅胶柱色谱提纯，开始用环己烷-乙酸乙酯(梯度洗脱从50∶1v/v-1∶9v/v)洗脱，接着进一步用二氯甲烷-甲醇(9∶1v/v)洗脱，得到标题化合物。
MS计算值(C26H32N4O5S+H)+513MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5131H NMR(CD3OD)δ7.81(m，2H)，7.66(d，1H)，7.56(d，1H)，7.17(d，1H)，6.71(dd，1H)，6.62(d，1H)，6.42(m，1H)，5.20(m，2H)，4.83(m，1H)，3.70(s，3H)，2.96(s，3H)，2.91(m，1H)，2.45(m，2H)，2.14(t，1H)，1.49(m，1H)和1.31(s，9H)。
实施例7(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸[rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基-甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸的对映异构体A] 可选方法Arel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸(实施例6)通过在SumichiralOA4900柱上制备性手性HPLC拆分，使用含0.1％三氟乙酸的庚烷-乙醇(70∶30v/v)作为洗脱液，得到第一种和第二种洗脱对映异构体。将所述的第二种洗脱对映异构体溶于二氯甲烷中，用水(x4)洗涤；用盐水洗涤，然后干燥(硫酸钠)并除去溶剂，得到标题化合物。
MS计算值(C26H32N4O5S+H)+513
MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5131H NMR(CD3OD)δ7.81(m，2H)，7.66(d，1H)，7.57(d，1H)，7.17(d，1H)，6.70(dd，1H)，6.61(d，1H)，6.42(m，1H)，5.20(m，2H)，4.85(m，1H)，3.70(s，3H)，2.97(s，3H)，2.91(m，1H)，2.44(m，2H)，2.15(t，1H)，1.47(m，1H)和1.31(s，9H)。
可选方法B部分1rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基-甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸，2-叔丁酯(可以按类似于中间体25所述的方法制备；1.95g)通过在Chiralpak AD柱上制备性手性HPLC拆分，使用庚烷-异丙醇(90∶10v/v)作为洗脱液。将含第一种洗脱对映异构体(保留时间7.25分钟)的级分溶于二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，蒸除二氯甲烷，得到对映异构体A(0.76g)，直接用于下面的部分2中。较迟的洗脱对映异构体(保留时间10分钟)不再需要。
可以按类似方法重复该手性HPLC拆分，使用另外的等分试样rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基-甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸，2-叔丁酯(1.55g)，得到另外一批快速洗脱对映异构体A(0.55g)，其直接用于下面的部分2中。
部分2将两批合并的rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基-甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-吡咯烷-2-羧酸，2-叔丁酯的对映异构体A(上面部分1；合并的1.31g，2.32mmol)溶于三氟乙酸(20mL)中，接着将所得溶液在室温下搅拌3小时。将混合物蒸发，接着将残余物在二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液之间进行分配。使用疏水性玻璃料除去水相，有机溶液蒸发，得到胶状物。将该胶状物溶于带塞烧瓶的中的乙醚中，并让其缓慢地结晶过夜。滤出晶体，用少量乙醚洗涤，接着在真空中干燥，得到标题化合物。
MS计算值(C26H32N4O5S+H)+513MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5131H NMR(CD3OD)δ7.83(m，2H)，7.66(d，1H)，7.57(d，1H)，7.19(d，1H)，6.72(dd，1H)，6.63(d，1H)，6.45(t，1H)，5.21(m，2H)，4.86(m，1H)，3.70(s，3H)，2.97(s，3H)，2.94(m，1H)，2.44(m，2H)，2.16(t，1H)，1.48(m，1H)和1.31(s，9H)。
这种化合物的绝对立体化学通过X-射线晶体衍射进行确定并且被证明是(2R，4S，5R)，如图那样。
实施例8rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-2-基甲基)吡咯烷-2-羧酸 该标题化合物用类似于实施例1的方法制备，使用中间体31代替中间体7。将不纯产物溶于二氯甲烷中，用碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(疏水性玻璃料)并除去溶剂。残余物用乙醚研制，得到标题化合物。
MS计算值(C27H33N3O5S2+H)+544MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5441H NMR(CDCl3)δ7.85(d，1H)，7.42(d，1H)，7.38(d，1H)，7.1 5(d，1H)，6.80(dd，1H)，6.43(d，1H)，5.08(d，1H)，4.34(d，1H)，3.95(d，1H)，3.64(s，3H)，3.10(dd，.1H)，3.01(dd，1H)，3.01(s，3H)，2.49(dd，1H)，2.43-2.33(m，4H)，2.13(t，1H)，1.92-1.80(m，1H)和1.31(s，9H)。
实施例9rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2-羧酸 该标题化合物用类似于实施例1的方法制备，使用在纯三氟乙酸中的中间体36代替在三氟乙酸和二氯甲烷中的中间体7。将不纯产物用C18柱上的反相HPLC提纯，使用两-溶剂梯度洗脱，其中(A)含甲酸(0.1％)的水和(B)含甲酸(0.05％)的乙腈-水(95∶5v/v)作为洗脱液。级分通过电喷射质谱分析，得到标题化合物。
MS计算值(C27H33N3O5S2+H)+544MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5441H NMR(CDCl3)δ8.69(d，1H)，7.41(s，1H)，7.30(d，1H)，7.14(d，1H)，6.66(dd，1H)，6.42(d，1H)，5.04(d，1H)，4.22(d，1H)，3.72(d，1H)，3.65(s，3H)，3.08(dd，1H)，3.02(s，3H)，2.46-2.39(m，2H)，2.36(s，3H)，2.14(t，1H)，1.99-1.88(m，1H)和1.31(s，9H)。没有看到酸质子。
实施例10rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2-羧酸 该标题化合物用类似于实施例1的方法制备，使用中间体41代替中间体7。将不纯产物用C18柱上的反相HPLC提纯，使用两-溶剂梯度洗脱，其中(A)含甲酸(0.1％)的水和(B)含甲酸(0.05％)的乙腈-水(95∶5v/v)作为洗脱液。级分通过电喷射质谱分析，得到标题化合物。
MS计算值(C27H34N4O5S+H)+527MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5271H NMR(CDCl3)δ7.62(d，1H)，7.54(d，1H)，7.41(d，1H)，7.16(d，1H)，6.66(dd，1H)，6.41(d，1H)，6.38(t，1H)，5.31(d，1H)，5.03(d，1H)，4.92(d，1H)，3.65(s，3H)，3.11(dd，1H)，3.04(s，3H)，2.54(dd，1H)，2.41(t，1H)，2.36(s，3H)，2.11(t，1H)，1.84-1.73(m，1H)和1.31(s，9H)。没有看到酸质子。
实施例11rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基-甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2-羧酸的对映异构体A
rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2-羧酸(实施例10)通过在Chiralpak AD柱上制备性手性HPLC拆分，使用含有0.1％三氟乙酸的庚烷-乙醇(80∶20v/v)作为洗脱液，得到第一个和第二个洗脱对映异构体。将所述的第二个洗脱对映异构体溶于二氯甲烷中，用碳酸氢钠溶液洗涤；干燥(疏水性玻璃料)并除去溶剂，得到标题化合物。
MS计算值(C27H34N4O5S+H)+527MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5271H NMR(CDCl3)δ7.62(d，1H)，7.54(d，1H)，7.41(d，1H)，7.15(d，1H)，6.66(dd，1H)，6.40(d，1H)，6.38(t，1H)，5.31(d，1H)，5.03(d，1H)，4.92(d，1H)，3.64(s，3H)，3.11(dd，1H)，3.04(s，3H)，2.54(dd，1H)，2.40(t，1H)，2.36(d，3H)，2.11(t，1H)，1.83-1.72(m，1H)和1.31(s，9H)。没有看到酸质子。
实施例12rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基-甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸的对映异构体A rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基-甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸(按类似于实施例3中所述的方法制备；0.530g)通过在Sumichiral OA-4900柱上制备性手性HPLC拆分，使用含0.1％三氟乙酸的庚烷-乙醇(65∶35v/v)作为洗脱液，得到第一个和第二个洗脱对映异构体。将该第二个洗脱对映异构体在二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液之间进行分配。该二氯甲烷溶液使用疏水性玻璃料进行分离，在真空中蒸发，得到泡沫状的标题化合物。
MS计算值(C26H31N3O5S2+H)+530MS实测值(电喷雾)(M+H)+＝5301H NMR(CDCl3)δ14.59(1H，s)，8.88(1H，s)，7.80(1H，d)，7.29-7.28(2H，被氯仿信号部分遮蔽)，7.12(1H，d)，6.63(1H，d)，6.42(1H，s)，5.17(1H，d)，4.24(1H，d)，3.73(1H，d)，3.63(3H，s)，3.16-3.08(1H，m)，3.01(3H，s)，2.55-2.45(1H，m)，2.36-2.26(1H，m)，2.24-2.10(2H，m)和1.30(9H，s)。
本发明的化合物可以配制成任何方便给药的形式，因此，本发明还包括在治疗上使用的药物组合物，其包含式(Ia)的化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物以及与其混合在一起的一种或多种生理上可接受的稀释剂或载体。
本发明的化合物可以通过不同的途径给药，包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、口服、局部、经皮或经粘膜(transmucosal)给药。对于全身性给药，口服给药是优选的。对于口服给药，例如，所述的化合物可以配制成常规的口服剂型例如胶囊、片剂和液体制剂例如糖浆、酏剂和浓缩滴剂。
或者，可以使用注射(肠胃外给药)，例如，肌内、静脉内、腹膜内和皮下注射。至于注射，可以将本发明的化合物配制在液体溶液中，优选配制在生理学相容的缓冲液或溶液中，例如盐水溶液、Hank′s液或林格溶液。此外，所述的化合物可以配制成固体形式，并在使用前立即再溶解或悬浮。还可以制成冷冻干燥形式。
全身性给药还可以通过经粘膜或经皮方法。对于经粘膜或经皮给药，适合渗透过屏障的渗透剂可以在该制剂中使用。这些渗透剂通常是本领域已知的，并且包括，例如，对于经粘膜给药，胆盐和夫西地酸衍生物。此外，洗涤剂可以用来促进渗透。例如可以通过鼻喷雾剂、直肠栓剂或阴道栓剂经粘膜给药。
对于局部给药，本发明化合物可以配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳剂，如通常本领域已知的那样。
所给药的各种化合物的数量可以通过标准方法确定，考虑因素例如所述化合物(IC50)的效力、(EC50)效力、以及生物半衰期(所述化合物的生物半衰期)、患者的年龄、大小和体重，以及与该患者有关的疾病或障碍。本领域常规熟练技术人员知道所考虑的这些以及其它因素的重要性。
给药数量还取决于给药途径和口服生物利用度。例如，对于低口服生物利用度的化合物，将必须给予相对较高的剂量。对于本发明的化合物，口服给药是一种优选的给药方法优选地，该组合物以单位剂型的形式存在。对于口服应用，例如，可以给予片剂或胶囊，对于鼻内应用，可以给予计量气雾剂剂量，对于经皮应用，可以给予局部制剂或贴片，对于经粘膜给药，可以给予口腔贴片。在每种情况下，给予患者的剂量为单次剂量。
对于口服给药，以游离碱的形式计算，每一剂量单位合适地含有0.01-500mg/kg，以及优选地含有0.1-50mg/kg的式(Ia)化合物或其药学上可接受的盐。对于肠胃外、鼻内、口腔吸入、经粘膜或经皮途径给药，所述的日剂量合适地含有0.01mg-100mg/kg的式(Ia)的化合物。局部制剂合适地含有0.01-5.0％的式(Ia)的化合物。该活性组分可以每日给药1-6次，优选一次，足够表现出所需的活性，这一点对本领域熟练技术人员来说是很容易明白的。
当口服给予时，有效的式(Ia)以及它们药学上可接受的盐的组合物可以被配制成糖浆、片剂、胶囊和锭剂。糖浆制剂通常由化合物或盐在液体载体与调味剂或着色剂中的悬浮液或溶液组成，所述的液体载体例如是乙醇、花生油、橄榄油、甘油或水。如果所述的组合物是以片剂的形式，那么可以使用通常被用来制备固态剂型的任何药物载体。这些载体的实例包括硬脂酸镁、石膏粉、滑石粉、明胶、阿拉伯胶、硬脂酸、淀粉、乳糖和蔗糖。如果所述的组合物是以胶囊的形式，那么任何常规胶囊化是合适的，例如使用上述载体在一种硬胶囊壳中。如果所述的组合物是以软明胶壳胶囊的形式，那么可以考虑通常被用来制备分散体或悬浮液的任何药物载体，例如含水树胶、纤维素、硅酸酯或油，并且混入到软胶胶囊壳中。
典型的肠胃外组合物由化合物或盐在无菌含水或无水载体中的溶液或悬浮液组成，其任选含有胃肠外可接受的油，例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油。
吸入给药的典型组合物是以溶液、悬浮液或乳液的形式，其可以以干粉或以气雾剂的形式给药，使用常规的非CFC推进剂例如1，1，1，2-四氟乙烷或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷。
典型的栓剂制剂包含当以这种方式给药时是有效的式(Ia)化合物或其药学上可接受的盐，以及粘合剂和/或润滑剂，例如聚乙二醇、明胶、可可脂或其它低熔点植物蜡或脂肪或它们的合成类似物。
典型的皮肤以及经皮制剂包含常规含水或无水赋形剂，例如乳剂、软膏剂、洗液或糊剂或为含药膏、贴片或膜的形式。
当本发明的化合物根据本发明给药时，预计不会出现无法接受的毒性作用。
试验例如，本发明的化学个体抑制NS5B野生型基因型1a和基因型1b的HCV聚合酶活性的效力可以使用下列体外试验进行证实HCV RNA依赖的RNA聚合酶活性的抑制剂的体外检测将[33P]-GMP掺入RNA，接着通过含SPA珠的链霉抗生物素蛋白吸收生物素标记的RNA聚合物。由与polyrC杂交的生物素化13mer-oligoG组成的合成模板被用作同聚物底物。
a)基因型1a C-末端截短的(delta21)酶HCV RNA聚合酶[重组体NS5B，其中C-末端21氨基酸缺失以及C-末端6His-tag(Ferrari等J.Virol.73(2)，1999，1649.‘Characterization of solublehepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase expressed in Escherichiacoli.’)用大肠杆菌表达并提纯至均一]加至25nM最终浓度。基因型1a的聚合酶来自菌株H77(Yanagi，M.，Purcell，R.H.，Emerson，S.U.&Bukh，J.(1997)，Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 94，8738-8743)其含有在位置180从缬氨酸变化至异亮氨酸的序列。
反应条件是25nM酶，1.5μg/ml oligo-rG13/poly-rC和0.2μCi-α-33P-GTP在0.5μM GTP(20Ci/mMol)中，20mM Tris pH7.5，23mM NaCl，3mM DTT，5mM MgCl2，1mM MnCl2。
酶在20mM Tris-HCl，pH7.5，25mM NaCl和3mM DTT中稀释至500nM浓度。
使用1M Tris-HCl，pH7.5(1mL)，5M NaCl(0.25mL)，1M DTT(0.12mL)和水(8.63mL)，制备4x浓缩的试验缓冲液混合物，总共10mL。
使用4x浓缩的试验缓冲液混合物(5μL)，40u/μL RNasin(0.1μL)，20μg/mL polyrC/生物素化的-oligorG(1.6μL)，500nM酶(1μL)和水(2.3μL)，制备2x浓缩的第一试剂，总共10μL/孔。
使用1M MgCl2(0.1μL)，1M MnCl2(0.02μL)，25μM GTP(0.4μL)，α-[33P]-GTP(10μCi/μL，0.02μL)和水(9.5μL)，制备2x浓缩的第二试剂，总共10μL/孔。
使用化合物(1μL在100％DMSO中)，第一试剂(10μL)以及第二试剂(10μL)，进行该试验，总共21μL。
该反应在U型底的、白色96孔板中进行。反应物在板-摇床中混合，加入酶后，在22℃培养1小时。此后，通过加入在PBS中的0.1M EDTA中的60μL 1.5mg/ml链霉抗生物素蛋白SPA珠(Amersham)，停止反应。所述的珠与反应混合物一起在22℃培养1小时，然后加入在PBS中的100μL 0.1MEDTA。将板密封，混合离心，并通过在Trilux(Wallac)或Topcount(Packard)闪烁计数器计数来测定掺入的放射性。
在减去没有酶的背景值后，与不存在化合物的相比，存在化合物引起放射性数量的任何减少，被作为抑制水平的量度。十个浓度的化合物在三-或五倍稀释液中进行测试。从每分钟的次数，使用GraFit 3、GraFit 4或GraFit5(Erithacus Software Ltd.)于XLFit软件(IDBS)的Excel的软件包或数据评价宏来计算化合物在所测试最高浓度的抑制百分比或IC50s。
b)基因型1b全长酶反应条件是0.5μM[33P]-GTP(20Ci/mMol)，1mM二硫苏糖醇，20mMMgCl2，5mM MnCl2，20mM Tris-HCl，pH7.5，1.6μg/mL polyC/0.256μM生物素化的oligoG13，10％甘油，0.01％NP-40，0.2u/μL RNasin和50mMNaCl。
HCV RNA聚合酶(重组体全长NS5B(Lohmann等，J.Virol.71(11)，1997，8416.‘Biochemical properties of hepatitis C virus NS5B RNA-dependent RNApolymerase and identification of amino acid sequence motifs essential forenzymatic activity’)用杆状病毒表达并提纯至均一)加至4nM最终浓度。
使用1M MnCl2(0.25mL)，甘油(2.5mL)，10％NP-40(0.025mL)和水(7.225mL)，总共10mL，制备5x浓缩的试验缓冲液混合物。
2x浓缩酶缓冲液含有1M-Tris-HCl，pH7.5(0.4mL)，5M NaCl(0.2mL)，1M-MgCl2(0.4mL)，甘油(1mL)，10％NP-40(10μL)，1M DTT(20μL)和水(7.97mL)，总共10mL。
使用5x浓缩试验缓冲液混合物(4μL)，[33P]-GTP(10μCi/μL，0.02μL)，25μM GTP(0.4μL)，40u/μL RNasin(0.1μL)，20μg/mL polyrC/生物素化的-oligorG(1.6μL)和水(3.94μL)，总共10μL，制备底物混合物。
通过加入1mg/ml全长NS5B聚合酶(1.5μL)到2.81mL 2x-浓缩酶缓冲液中，制备酶混合物。
使用化合物(1μL)，底物混合物(10μL)以及酶混合物(最后加入以开始反应)(10μL)，总共21μL进行测定。
该反应在U型底的、白色96孔板中进行。反应物在板-摇床中混合，加入酶后，在22℃培养1小时。此后，通过加入在0.1M EDTA中的40μL 1.875mg/ml链霉抗生物素蛋白SPA珠，停止反应。所述的珠与反应混合物一起在22℃培养1h，然后加入在PBS中的120μL 0.1M EDTA。将板密封，混合离心，并通过Trilux(Wallac)或Topcount(Packard)闪烁计数器计数来测定掺入的放射性。
在减去没有酶的背景值后，与不存在化合物的相比，存在化合物引起放射性数量的任何减少，被作为抑制水平的量度。十个浓度的化合物在三-或五倍稀释液中进行测试。从每分钟的次数，使用GraFit 3、GraFit 4或GraFit5(Erithacus Software Ltd.)基于XLFit软件(IDBS)的Excel的软件包或数据评价宏来计算化合物在所测试最高浓度的抑制百分比或IC50s。
本发明化合物抑制NS5B野生型基因型1a和基因型1b的HCV聚合酶的活性效力例如可以使用下列细胞试验来证实复制子ELISA基于细胞的分析方法将100μL的含有10％FCS的培养基加入到透明、平底96孔微板的每孔中，首行孔除外。将测试化合物在分析培养基中稀释，从在DMSO中的40mM储备液稀释至两倍于最终的所需开始浓度。将200μL开始稀释液引入到首行中的每两个孔，并在充分混合下，将二倍稀释液通过依次转移100μL等分试样到孔中；弃去最终的100μL。两个底部行没有用于化合物稀释液。接近汇合的Huh-7 HCV复制子细胞单层从含有依地酸-胰蛋白酶溶液的生长瓶中剥离，接着将细胞以2×105细胞/mL(亚系5-15；基因型1b；Lohmann，V.，Korner，F.，Koch，J-O.，Herian，U.，Thielmann，L.and Bartenschlager，R.，1999，Science，285，pp110-113)或以3×105细胞/mL(基因型1a；Gu，B.，Gates，A.T.，Isken，O.，Behrens，S.E.and Sarisky，R.T.，J.Virol.，2003，77，5352-5359)再悬浮在分析培养基中。100μL细胞悬浮液加入到所有孔中，将板在37℃在5％CO2气氛中培养72小时。
培养后，分析培养基从板中吸出。细胞层通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中温和浸渍进行洗涤，然后，将其吸出，用丙酮∶甲醇(1∶1)固定5分钟。再用PBS洗涤后，将100μLELISA稀释剂(PBS+0.05％v/v吐温20+2％w/v脱脂奶粉)加入到所有孔中，接着将板在37℃在定轨平台上培养30分钟。除去稀释剂，然后，每孔中接受50μL 1/200稀释度的抗-HCV特异性、鼠科单克隆抗体(或Virostat#1872或#1877)，除了不含化合物的对照行之一的孔仅接受稀释剂以作为阴性对照。将板在37℃培养2小时，用PBS/0.05％吐温20洗涤3次，然后将50μL辣根过氧化物酶共轭的抗-小鼠兔多克隆血清(Dako#P0260)稀释1/1000加入到所有孔中。将该板再培养1小时，除去抗体，将细胞层用PBS/吐温洗涤5次并吸干。将50μL在脲/柠檬酸盐缓冲液中的邻-苯二胺/过氧化物酶底物(SigmaFast，Sigma#P-9187)加入到每孔中，色料展开高达15分钟。通过加入25μL/孔的2M硫酸停止反应，将所述的板在490nm在Fluostar Optima分光光度计上读数。
除去底物溶液，所述板用自来水洗涤，吸干，用5％石炭酸品红的水溶液染色30分钟。弃去染色剂并将细胞板洗涤，干燥，在显微镜下检查以评价细胞毒性。
数据分析将已经接受第一抗体和第二抗体的所有不含化合物孔的吸光度值平均得到阳性对照值。没有接受第一抗体的无化合物孔的平均吸光度值被用作阴性(背景)对照值。在每个化合物浓度下，将两份孔的读数取平均，在减去所有平均背景值后，用阳性对照信号的百分比来表示。在药物存在下通过ELISA检测的受表达蛋白的可计量的和特异性减少可以用作复制子抑制的量度。Grafit软件(Erithacus Software Ltd.)用来绘制抑制百分比对化合物浓度的曲线，并从中获得化合物的50％抑制浓度(IC50)。
结果
1这种化合物没有在5-15细胞系中测试；作为替代，含有一种附加基因的11-7细胞系(NS2-5B)被用于此试验中，得到可比较的结果(Lohmann，V.等，1999，Science，285，pp110-113)。
化合物A相当于WO2004/037818的实施例11中公开的外消旋化合物，rel-(2S，4S，5R)-2-异丁基-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-甲氧基甲基-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸。
化合物B相当于WO2004/037818的实施例15中公开的对映异构体化合物，(2S，4S，5R)-2-异丁基-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-甲氧基甲基-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸。
化合物C相当于WO2004/037818的实施例24中公开的外消旋化合物，rel-(2S，4S，5R)-2-异丁基-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-甲氧基甲基-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸。
化合物D相当于WO2004/037818的实施例中公开的对映异构体化合物，rel-(2S，4S，5R)-2-异丁基-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-甲氧基甲基-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸的对映异构体A。
化合物E相当于WO2004/037818的实施例33中公开的外消旋化合物，rel-(2R，4S，5R)-2-苄基-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-甲氧基甲基-5-(1，3-噻唑-2-基)-吡咯烷-2-羧酸。
化合物A、B、C、D和E可以根据WO2004/037818中所述的方法制备。
为了避免怀疑，化合物A-E的结构如下所示。
与化合物A-E相比，已经测试的本发明的化合物显示出令人吃惊优越的基因型-1a/1b性质，如通过酶中的IC50值所示以及在HCV 1a和1b基因型之间的基于细胞的试验。因此，本发明的化合物在治疗和预防HCV中具有很大的潜在治疗效益。
本发明的药物组合物还可以与其它治疗剂联合用药，例如免疫治疗(例如干扰素)、治疗性疫苗、抗纤维变性药、抗炎药、如皮质甾类或NSAIDs，支气管扩张药如β-2肾上腺素能激动剂和黄嘌呤(例如1，3-二甲基黄嘌呤)、溶粘蛋白剂、抗毒蕈碱、抗白细胞三烯、细胞粘着抑制剂(例如ICAM拮抗剂)、抗氧化剂(例如N-乙酰半胱氨酸)、细胞因子激动剂、细胞因子拮抗剂、肺表面活性物质和/或抗微生物和抗病毒剂(例如利巴韦林和amantidine)。本发明的组合物还可以与基因替代疗法一起使用。
因此，另一方面，本发明提供一种组合，其包含至少一种选自式(Ia)的化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物的化学个体以及至少一种其它治疗活性剂。
上述组合可以方便地以药物制剂的形式使用，因此，包含上述组合以及至少一种药学上可接受的稀释剂和载体的药物制剂也构成本发明的另一方面。
这些组合的各个组分可以依次或同时在单个药物制剂或混合药物制剂中给药。本领域熟练技术人员可以很容易地知道已知药物的适宜剂量。
在本说明书中引用的所有出版物，包括但不局限于专利和专利申请，在此将它们整个引入作为参考，就象每个单独的出版物具体地和单独地在此被完全引入作为参考。
权利要求
1.选自式(Ia)化合物、及其盐、溶剂合物和酯的至少一种化学个体 其中A表示羟基；D表示4-叔丁基-3-甲氧基苯基；E表示1，3-噻唑-2-基或5-甲基-1，3-噻唑-2-基；G表示甲氧基甲基；J表示1，3-噻唑-2-基甲基、1，3-噻唑-4-基甲基、1，2-噻唑-3-基甲基或1H-吡唑-1-基甲基；条件是当A被酯化形成-OR，其中R选自直链或支链烷基、芳烷基、芳氧基烷基或芳基时，则R不是叔丁基。
2.选自式(Ia)化合物的至少一种化学个体，选自rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-4-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)-5-(1，3-噻唑-2-基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，3-噻唑-2-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1，2-噻唑-3-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；和rel-(2R，4S，5R)-1-(3-甲氧基-4-叔丁基苯甲酰基)-4-(甲氧基甲基)-5-(5-甲基-1，3-噻唑-2-基)-2-(1H-吡唑-1-基甲基)吡咯烷-2-羧酸；及其盐、溶剂合物和酯，以及各个对映异构体。
3.治疗或预防病毒感染的方法，所述方法包括给予需要的患者有效量的至少一种选自如权利要求1所述的式(Ia)的化合物及其盐、溶剂合物和酯的化学个体。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述的病毒感染是HCV。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述的化学个体以口服剂型给药。
6.用于医学治疗的选自式(Ia)化合物、及其盐、溶剂合物和酯的至少一种化学个体， 其中A表示羟基；D表示4-叔丁基-3-甲氧基苯基；E表示1，3-噻唑-2-基或5-甲基-1，3-噻唑-2-基；G表示甲氧基甲基；J表示1，3-噻唑-2-基甲基、1，3-噻唑-4-基甲基、1，2-噻唑-3-基甲基或1H-吡唑-1-基甲基；条件是当A被酯化形成-OR，其中R选自直链或支链烷基、芳烷基、芳氧基烷基或芳基时，则R不是叔丁基。
7.权利要求6所述的至少一种选自式(Ia)化合物及其盐、溶剂合物和酯的化学个体，其中所述的医学治疗是病毒感染的治疗。
8.权利要求7所述的至少一种选自式(Ia)化合物及其盐、溶剂合物和酯的化学个体，其中所述的病毒感染是HCV。
9.选自式(Ia)化合物、及其盐、溶剂合物和酯的至少一种化学个体在制备用于治疗病毒感染的药物中的用途， 其中A表示羟基；D表示4-叔丁基-3-甲氧基苯基；E表示1，3-噻唑-2-基或5-甲基-1，3-噻唑-2-基；G表示甲氧基甲基；J表示1，3-噻唑-2-基甲基、1，3-噻唑-4-基甲基、1，2-噻唑-3-基甲基或1H-吡唑-1-基甲基；条件是当A被酯化形成-OR，其中R选自直链或支链烷基、芳烷基、芳氧基烷基或芳基时，则R不是叔丁基。
10.权利要求9所述的用途，其中所述的病毒感染是HCV。
11.药物制剂，其包含至少一种选自如权利要求1中所述的式(Ia)的化合物及其盐、溶剂合物和酯的化学个体以及至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。
12.如权利要求1所定义的式(Ia)化合物的制备方法，所述方法包括将式(II)的化合物脱保护， 其中A’是被保护的羟基，例如烷氧基、苄氧基或甲硅烷氧基；D表示4-叔丁基-3-甲氧基苯基；E表示1，3-噻唑-2-基或5-甲基-1，3-噻唑-2-基；G表示甲氧基甲基；以及J表示1，3-噻唑-2-基甲基、1，3-噻唑-4-基甲基、1，2-噻唑-3-基甲基或1H-吡唑-1-基甲基。
全文摘要
式(Ia)的抗病毒剂，其中A表示羟基；D表示4－叔丁基－3－甲氧基苯基；E表示1，3－噻唑－2－基或5－甲基－1，3－噻唑－2－基；G表示甲氧基甲基；J表示1，3－噻唑－2－基甲基、1，3－噻唑－4－基甲基、1，2－噻唑－3－基甲基或1H－吡唑－1－基甲基；及其盐、溶剂合物和酯；条件是当A酯化形成－OR时，其中R选自直链或支链烷基、芳烷基、芳氧基烷基或芳基，则R不是叔丁基；它们的制备方法以及它们在HCV治疗中的用途。
文档编号A61K31/427GK101087785SQ200580044701
公开日2007年12月12日 申请日期2005年10月24日 优先权日2004年10月25日
发明者罗塞尔拉·吉德蒂, 戴维·黑格, 查尔斯·D·哈特利, 彼得·D·豪斯, 法布里齐奥·尼罗兹, 斯蒂芬·A·史密斯 申请人:葛兰素集团有限公司