专利名称：用作pde5抑制剂的吡唑并[4,3,-d]嘧啶-5-基衍生物的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸及其盐。本发明进一步涉及包括此化合物或其盐的药物组合物、采用此化合物及其盐的治疗方法，和制备此化合物或其盐的方法。一般而言，该化合物及其盐能抑制环鸟苷酸单磷酸盐特异性5型磷酸二酯酶(“PDE5”)酶。
背景技术：
高血压是在其他生理问题中与中风高风险、心肌梗塞、心房纤维颤动、心脏衰竭、外周血管疾病及肾功能损伤相关的病症。尽管在各种药理学类别中有大量药物可用于治疗高血压及相关生理问题，但并非所有患者均如所需的那样有效或安全地对此等药物发生反应。仍需其他用于治疗高血压和/或相关病症的治疗剂。
在文献中报道用于治疗高血压的一类治疗剂是PDE5酶的抑制剂(“PDE5抑制剂”)。一般而言，血管内皮细胞分泌对血管平滑肌细胞起作用且导致鸟苷酸环化酶活化及环鸟苷酸单磷酸盐(“cGMP”)积聚的一氧化氮。cGMP的积聚引起肌肉松弛及血管扩张，致使血压下降。cGMP经cGMP特异性磷酸二酯酶被水解成鸟苷5’-单磷酸(“GMP”)而被灭活。涉及cGMP的灭活的一种cGMP磷酸二酯酶为PDE5酶。PDE5酶的抑制剂使cGMP水解速率下降。此cGMP水解的减少促进了一氧化氮的作用，导致血压下降。
作为PDE5抑制剂的化合物在文献中已有报道。例如，WO2005049616报道了一类吡唑并[4，3，-d]嘧啶基化合物。WO2005049617报道了另一类吡唑并[4，3，-d]嘧啶基化合物。WO2004096810报道了另一类吡唑并[4，3，-d]嘧啶基化合物。EP1348707报道了另一类吡唑并[4，3，-d]嘧啶基化合物。
需鉴别其他作为PDE5抑制剂的化合物。此类化合物可用于治疗患有或易患高血压和/或相关生理问题的受试者且进一步扩大了用于此类受试者的治疗选择范围。
发明内容
在一个实施方案中，本发明包括1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸及其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明包括一种药物组合物，其包括1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明包括医药组合物，其包括1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸或其药学上可接受的盐、一种或多种其他的治疗剂和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明包括通过给予受试者以治疗有效量的1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸或其药学上可接受的盐来治疗该受试者的病症的方法。可根据本发明治疗的病症包括心血管疾病、代谢性疾病、中枢神经系统疾病、肺病、性功能障碍、疼痛及肾功能不全。
在另一个实施方案中，本发明包括通过给予受试者以治疗有效量的1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸或其药学上可接受的盐、一种或多种治疗剂和药学上可接受的载体来治疗该受试者的病症的方法。可根据本发明治疗的病症包括心血管疾病、代谢性疾病、中枢神经系统疾病、肺病、性功能障碍、疼痛及肾功能不全。
在另一个实施方案中，本发明包括1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸或其药学上可接受的盐在制备用于治疗受试者的病症的药物中的用途。此类病症包括心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、肺病、性功能障碍、疼痛和肾功能不全。
在另一个实施方案中，本发明包括用于制备1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸或其药学上可接受的盐的方法。
图1显示了在清醒自发性高血压大鼠模型中重复口服给予1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸(每天口服用药量为1mg/kg)，单独给药和与依拉普利(enalapril)联合给药对血压的作用。
图2显示了在清醒自发性高血压大鼠模型中重复口服给予1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸(每天口服用药量为1mg/kg)，单独给药和与依拉普利(enalapril)联合给药对24小时尿cGMP的作用。
具体实施例方式 下面对实施方案的详细描述仅用于使申请人的发明的领域中其他的专业技术人员理解其原理及其实践应用以使得其他专业技术人员可以根据最适合特殊应用的需要的多种形式以改变和应用本发明。因此，这些发明并不限于本说明书中所描述的实施方案且可进行各种修改。
A.缩写及定义 如1H NMR中所用，符号“δ”是指1H NMR化学位移。
如1H NMR中所用，缩写“br”是指宽1H NMR信号。
如1H NMR中所用，缩写“d”是指双重1H NMR峰。
如1HNMR中所用，缩写“m”是指多重1HNMR峰。
如1H NMR中所用，缩写“q”是指四重1H NMR峰。
如1H NMR中所用，缩写“s”是指单1H NMR峰。
如1H NMR中所用，缩写“t”是指三重1H NMR峰。
缩写“BSA”是指牛血清白蛋白。
缩写“CDI”是指碳化二亚胺。
缩写“DMSO”是指二甲亚砜。
缩写“DBAD”是指偶氮二羧酸二苄基酯。
缩写”EDTA”是指乙二胺四乙酸。
缩写“HEPES”是指4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
缩写“HRMS”是指高分辨率质谱法(电喷雾电离正向扫描)。
缩写“iPrOAc”是指乙酸异丙酯。
缩写“LCMS”是指液相层析质谱法。
缩写“m/z”是指质谱峰。
缩写“NaN(TMS)2”是指六甲基二硅基氨基钠。
缩写“pfu”是指空斑形成单位。
缩写“Pt/e”是指载铂碳。
缩写“PMSF”是指苯甲磺酰氟。
缩写“SPA”是指闪烁迫近分析法。
缩写“THF”是指四氢呋喃。
缩写“Tris·HCl”是指三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐。
术语“cGMP介导的病症”是指由cGMP介导的任何病症，无论是通过cGMP直接调节，或通过cGMP作为信号传导通路的成员而间接调节。
术语“PDE-介导的病症”是指经PDE5酶介导的任何病症。
术语“高血压受试者”是指患有高血压、遭受高血压影响或若不治疗以预防或控制此高血压，则易患高血压征兵的受试者。
术语“药学上可接受的载体”是指与组合物中的其他成分相容且对受试者无害的载体。这些载体可以是用于运载或转运化学药剂的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。优选的组合物取决于给药方法。
术语“治疗有效量”是指研究者或临床医生所寻求的将发生组织、系统或动物的生物学或医学反应的药物或药学试剂的用量。
术语“治疗”(和对应的术语“治疗”)包括受试者的姑息性、恢复及预防性治疗。术语“姑息性治疗”是指减轻或降低受试者病症的作用或强度，而没有治愈该病症的治疗。术语“预防性治疗”(和对应的术语“预防治疗”)是指完全防止受试者的临床前明显病症的发作或防止受试者病症的临床前明显阶段的发作。术语“恢复性治疗”是指中止受试者病症的进展、减少其病理表现或完全将其消除的治疗。
B.羧基哌啶化合物 在一个实施方案中，本发明包括具有以下结构的化合物
及该化合物的盐(尤其药学上可接受的盐)。此化合物的相应名称为1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸。除非另外说明，否则此化合物、该化合物之所有互变异构形式及该化合物的药学上可接受的盐及其互变异构形式在本申请中均总称为“羧基哌啶化合物”。该羧基哌啶化合物用作，例如PDE5酶抑制剂。
在一个实施方案中，本发明针对羧基哌啶化合物的游离酸形式。
在另一个实施方案中，本发明针对羧基哌啶化合物的药学上可接受的盐。
W92904096810报道了一类从类别上包括羧基哌啶化合物的化合物。尽管WO2004096810提供该类中具体化合物的实例，但其并未公开羧基哌啶化合物本身。然而，该羧基哌啶化合物具有至少一种或多种特性不同于WO2004096810中所描述的具体化合物。这些特性包括，例如，功效(例如，更大的体外、离体和/或体内效力)、安全性(例如，更大的选择性和/或更低的毒性)、药物动力学特性(例如Cmax，更长的半衰期和/或更低的清除率)和制造特性(例如，易于合成和/或起始材料的可利用度)。
C.盐 如上所述，羧基哌啶化合物可呈游离酸形式或盐形式。羧基哌啶化合物的不同盐形式可相对于彼此具有不同的物理特性。因此，羧基哌啶化合物的具体盐形式的选择可以影响，例如，化合物稳定性(诸如在一定温度和/或湿度范围内)、化合物溶解性和其他可影响药品的化合物物理特性。另外，羧基哌啶化合物的盐通常比相应游离酸形式将具有更大水溶性。
若向人类或动物受试者给予羧基哌啶化合物的盐(与，例如，用于体外测定相反)，则该盐优选为药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指通常认为适合于人类消费的盐(尤其是无毒的盐)。药学上可接受的盐包括相应游离酸的碱加成盐和酸加成盐。这些盐通常可通过传统的方法由羧基哌啶化合物的游离酸制备。
羧基哌啶化合物之的说明性碱加成盐包括金属盐和有机盐。金属盐包括碱金属(第Ia族)盐(诸如锂盐、钠盐及钾盐)、碱土金属(第IIa族)盐(诸如钙盐及镁盐)，及其他生理学可接受的金属盐(诸如铝盐和锌盐)。有机盐包括由仲胺、叔胺和季胺(诸如缓血酸胺、二乙胺、三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、N，N’-二苄基乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、普鲁卡因、氯普鲁卡因和胆碱)制得的盐及由阳离子氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)制得的盐。
适当的酸加成盐的实例包括氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、氢碘酸盐、硼酸盐、氟硼酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、甘油磷酸盐、六氟磷酸盐、偏磷酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、重硫酸盐、硫酸盐、十二烷基硫酸盐、磺酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、三氟甲烷磺酸盐、甲苯磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、环己基氨基磺酸盐、2-萘磺酸盐、樟脑磺酸盐、乙酸盐、己二酸盐、邻氨基苯甲酸盐、天冬氨酸盐、抗坏血酸盐、海藻酸盐、三氟乙酸盐、苯基乙酸盐、苯甲酸盐、对羟基苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、β-羟基丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、双羟萘酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、二葡糖酸盐、乙醇酸盐、甲基葡萄酸盐(glucamate)、葡萄糖醛酸盐、葡庚糖酸盐、庚酸盐、葡糖庚酸盐、己酸盐、羟苯酰苯酸盐、羟乙基磺酸盐、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟碱酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、环戊烷丙酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酮酸盐、糖二酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、磺胺酸盐、酒石酸盐、半乳糖酸盐(galactarate)、甲苯磺酸盐、糖醛酸盐、半乳糖醛酸盐、硫氰酸盐和十一酸盐。
对于适当的盐的综述，参见Stahl和Wermuth的“Handbook ofPharmaceutical SaltsProperties，Selection，and Use”(Wiley-VCH，Weinheim，Germany，2002)。
D.互变异构体 如本申请中所用的术语羧基哌啶化合物(以及相应结构)是指包括1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸的所有互变异构体。羧基哌啶化合物的代表性互变异构体显示在下面
互变异构体(1) 互变异构体(2) 互变异构体(3) E.治疗方法 本发明进一步包括通过向患有或易患病症的受试者给予治疗有效量的羧基哌啶化合物而治疗该受试者的此病症的方法。在一个实施方案中，该治疗为预防性治疗。在另一个实施方案中，该治疗为姑息性治疗。在另一个实施方案中，该治疗为恢复性治疗。
在另一个实施方案中，该病症为PDE5介导的病症。
在另一个实施方案中，该病症为cGMP介导的病症。因此将认为其中，例如，不足的cGMP为主要组份且其产生或作用根据对PDE5酶的反应而被调节的病症为cGMP介导的病症。
在另一个实施方案中，该病症选自心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、肺病、性功能障碍、疼痛和肾功能不全。
在另一个实施方案中，该病症为心血管疾病，其选自高血压(包括原发性高血压、肺高血压、肺动脉高血压、继发性高血压、单纯收缩性高血压、糖尿病相关性高血压、动脉粥样硬化相关性高血压和肾血管性高血压)；与高血压相关的并发症(包括血管器官损害、充血性心脏衰竭、心绞痛、中风、青光眼及肾功能受损)瓣膜关闭不全；稳定、不稳定及变异型(Prinzmetal)心绞痛；外周血管疾病；心肌梗塞；中风(包括中风康复)；血栓栓塞性疾病；再狭窄；动脉硬化；动脉粥样硬化；旁路后血管狭窄；血管成形术(包括经皮经管腔血管成形术及经皮经管腔冠状动脉血管成形术)高脂血症；低氧性血管收缩；血管炎(包括川崎氏综合症(Kawasaki′s syndrome))；心脏衰竭(包括充血性心脏衰竭、失代偿性心脏衰竭、收缩性心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、左心室心脏衰竭、右心室心脏衰竭及左心室肥厚)；雷诺氏现象(Raynaud′sphenomenon)；先兆子痫；妊娠诱发的高血压；心肌病；及动脉阻塞性疾病。
在另一个实施方案中，该病症为高血压。
在另一个实施方案中，该病症为肺高血压。
在另一个实施方案中，该病症为肺动脉高血压。
在另一个实施方案中，该病症为心脏衰竭。
在另一个实施方案中，该病症为舒张性心脏衰竭。
在另一个实施方案中，该病症为收缩性心脏衰竭。
在另一个实施方案中，该病症为心绞痛。
在另一个实施方案中，该病症为血栓症。
在另一个实施方案中，该病症为中风(包括中风康复)。
在另一个实施方案中，该病症为与内皮功能异常相关的病症(包括选自下列的病症动脉粥样硬化病变、心肌缺血、外周缺血、瓣膜关闭不全、肺动脉高血压、心绞痛、凝血块、血管旁路术后血管并发症、血管扩张、血管再灌注和心脏移植)。
在另一个实施方案中，该病症是选自下列的代谢疾病X综合征；糖尿病(包括I型及II型糖尿病)；胰岛素抵抗症；胰岛素抵抗综合征(包括胰岛素受体功能障碍、Rabson-Mendenhall综合征、矮妖精貌综合征、Kobberling-Dunnigan综合征、塞普综合征(Seip syndrome)、劳伦斯综合征(Lawrence syndrome)、库欣综合征(Cushing syndrome)、肢端肥大症、嗜铬细胞瘤、胰高血糖素素瘤、原发性醛固酮增多症、生长抑素瘤、脂肪缺乏性糖尿病、β-细胞毒素诱导糖尿病、格雷夫氏病(Grave’sdisease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)及自发性艾迪森氏病(idiopathic Addison’s disease)；葡萄糖耐量降低；糖尿病性并发症(包括糖尿病性坏疽、糖尿病性关节病、糖尿病性肾病、糖尿病性肾小球硬化症、糖尿病性皮肤病、糖尿病性神经病、末梢糖尿病性神经病、糖尿病性白内障及糖尿病性视网膜病)；高血糖症；及肥胖。
在另一个实施方案中，该病症为胰岛素抵抗症。
在另一个实施方案中，该病症为肾病。
在另一个实施方案中，该病症为选自下列的中枢神经系统疾病血管性痴呆；颅脑创伤；大脑梗塞；脑血管意外、痴呆；集中障碍；阿耳茨海默氏病(Alzheimer′s disease)；帕金森氏病；肌侧索硬化症(amyolateral sclerosis)；亨廷顿氏病(Huntington′s disease)；多发性硬化症；克-雅二氏病(Creutzfeld-Jacob disease)；焦虑症；抑郁症；睡眠障碍；及偏头痛。
在另一个实施方案中，该病症为阿耳茨海默氏病。
在另一个实施方案中，该病症为帕金森氏病。
在另一个实施方案中，该病症为肌侧索硬化症。
在另一个实施方案中，该病症为集中障碍。
在另一个实施方案中，该病症为选自下列的肺病哮喘；急性呼吸窘迫；囊性纤维化；慢性阻塞性肺病；支气管炎；及慢性可逆性肺阻塞。
在另一个实施方案中，该病症为疼痛。在另一个实施方案中，该病症为急性疼痛。急性疼痛的实例包括与损伤或手术有关的急性疼痛。在另一个实施方案中，该病症为慢性疼痛。慢性疼痛的实例包括神经性疼痛(包括带状疱疹后神经痛和末梢、癌症或糖尿病性神经病有关的疼痛)、腕管综合征、背痛(包括与椎间盘突出或椎间盘破裂或与腰椎小关节、骶髂关节、脊椎旁肌肉或后纵韧带的异常有关的疼痛)、头痛、癌性疼痛(包括肿瘤相关疼痛，如骨痛、头痛、面部疼痛或内脏疼痛)或与癌症治疗相关的疼痛(包括化疗后综合征、慢性术后疼痛综合征、辐射综合征、与免疫疗法有关的疼痛或与激素疗法有关的疼痛)、关节炎疼痛(包括骨关节炎及类风湿性关节炎疼痛)、慢性术后疼痛、疱疹后神经痛、三叉神经痛、HIV神经病、幻肢痛、中风后中枢性疼痛及与慢性酒精中毒、甲状腺功能低下、尿毒症、多发性硬化症、脊髓损伤、帕金森氏病、癫痫以及维生素缺乏症有关的疼痛。在另一个实施方案中，该病症为伤害性疼痛(包括来自中枢神经系统损伤、劳损/扭伤、烧伤、心肌梗塞及急性胰腺炎的疼痛、术后疼痛(任何类型手术操作后的疼痛)、创伤后疼痛、肾绞痛、癌性疼痛及背痛)。在另一个实施方案中，该病症为与炎症有关的疼痛(包括关节炎疼痛(诸如骨关节炎及类风湿病疼痛)、强直性脊椎炎、内脏疼痛(包括炎性肠病、功能性肠紊乱、胃食管返流、消化不良、肠应激综合征、功能性腹痛综合征、克隆氏病、回肠炎、溃疡性结肠炎、痛经、膀胱炎、胰腺炎及骨盆疼痛)。在另一个实施方案中，该病症为由肌-骨骼疾病产生的疼痛(包括肌痛、纤维肌痛、脊椎炎、血清阴性(非类风湿性)关节病、非关节风湿病、营养不良、糖原分解、多发性肌炎及脓性肌炎)。在另一个实施方案中，该病症选自由心脏及血管疼痛(包括由心绞痛、心肌梗塞、二尖辫狭窄、心包炎、雷诺氏现象、硬化病及骨骼肌缺血所引起的疼痛)。在另一个实施方案中，该病症选自头痛(包括偏头痛，诸如伴先兆的偏头痛和不伴先兆的偏头痛)、从集性头痛、紧张型头痛、混合型头痛及与血管疾病有关的头痛；口面疼痛，包括牙痛、耳痛、口腔烧灼综合征及颞下颌肌筋膜痛。
在另一个实施方案中，该病症为性功能障碍(包括选自下列的性功能障碍阳痿(器质性或精神性)；男性勃起机能障碍；阴蒂功能障碍；脊髓损伤后性功能障碍；女性性唤起障碍；女性性高潮功能障碍；女性性交痛障碍；及女性机能减退性的性欲障碍)。
在另一个实施方案中，该病症为男性勃起机能障碍。
在另一个实施方案中，该病症为肾功能不全(包括选自下列的肾功能不全急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭；肾病(诸如糖尿病性肾病)；肾小管间质性疾病；肾小球病；及肾炎)。在另一个实施方案中，该病症为选自癌性恶病质；肿瘤转移及肿瘤形成的癌症病症。
在另一个实施方案中，该病症为骨质疏松症。
在另一个实施方案中，该病症为选自尖嘴钳样食管；肛裂消化道动力障碍；肠应激综合征及痔疮的胃肠病。在另一个实施方案中，该病症为选自膀胱出口梗阻；失禁及良性前列腺增生的泌尿系病症。
在另一个实施方案中，该病症为皮肤病，其选自牛皮癣；荨麻疹及皮肤坏死。
在另一个实施方案中，该病症为眼病，其选自视网膜疾病、黄斑变性及青光眼。
在另一个实施方案中，该病症为硝酸盐不耐受症。
在另一个实施方案中，该病症为秃发症。
在另一个实施方案中，该病症为选自痛经(原发性和继发性)；不育症及早产的妇科病症。在另一个实施方案中，该病症为继发性痛经。
在另一个实施方案中，本发明进一步包括通过给予受试者以治疗有效量的羧基哌啶化合物而诱发受试者体重减轻或保持重量减轻的方法。
F.受试者 羧基哌啶化合物(包括相应治疗方法及药物组合物)适用于，例如，哺乳动物受试者如人类、其他灵长类动物(例如，猴、黑猩猩)、伴侣动物(例如，狗、猫、马)、家畜(例如，山羊、绵羊、猪、牛)、实验动物(例如，小鼠、大鼠)及野生与动物园动物(例如，狼、熊、鹿)。在一个实施方案中，受试者为哺乳动物受试者。在另一个实施方案中，受试者为人。
G.假设的机制 不希望限制于特殊的理论，假设羧基哌啶化合物为PDE5酶抑制剂。进一步假设羧基哌啶化合物抑制PDF5酶的作用，导致细胞内cGMP水平增加。细胞内cGMP含量的此种增加降低细胞内钙的信号传递，其接着导致血管平滑肌松弛及血压降低。
H.给药及定量给药 羧基哌啶化合物通常以治疗有效量给药。在一个实施方案中，羧基哌啶化合物以抑制PDE5酶的用量给药。羧基哌啶化合物可通过任何适当途径以适合于此途径的药物组合物形式且以对于所要进行的治疗有效的剂量给药。预防或中止医学病症的进展，或治疗医学病症所需的羧基哌啶化合物的治疗有效剂量能由本领域普通技术人员使用医药领域中所熟悉的临床前及临床方法来很容易地确定。
此类化合物和/或包含此类化合物的组合物的给药方案基于多种因素，包括患者的类型、年龄、体重、性别及医学病症；病症的严重程度；给药途径；和所用特定化合物的活性。因此该给药方案可根据具体情况而变化。每日每千克体重约0.001毫克至约100毫克的羧基哌啶化合物的剂量水平用于治疗上面所示的病症。在一个实施方案中，羧基哌啶化合物的总日剂量(以单一或分次剂量给药)通常为约0.001毫克/千克至约20毫克/千克(亦即，毫克化合物/千克体重)。在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物的总日剂量为约0.005毫克/千克至约10毫克/千克。另一个实施方案中，总日剂量为约0.005毫克/千克至约5毫克/千克。在另一个实施方案中，总日剂量为0.01毫克/千克至约1毫克/千克。这些剂量基于具有约65千克至约75千克体重的平均体重人类受试者。内科医师将很容易地确定体重在该范围之外的受试者，如婴儿的用药剂量。一天内羧基哌啶化合物的给药可重复复数次(通常不大于4次)以达到所需日剂量。
为方便起见，羧基哌啶化合物可以单位剂型给药。如果需要，则可使用单位剂量的每天多次给药来增加总日剂量。单位剂型可以是，例如，含有约0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250或500毫克的羧基哌啶化合物的片剂或胶囊。在一个实施方案中，单位剂型含有约0.01毫克至约500毫克的羧基哌啶化合物。在另一个实施方案中，单位剂型含有约0.05毫克至约250毫克的羧基哌啶化合物。在另一个实施方案中，单位剂型含有约0.1毫克至约100毫克的羧基哌啶化合物。在另一个实施方案中，单位剂型含有约0.5毫克至约50毫克的羧基哌啶化合物。
I.在制备药物中的应用 在另一个实施方案例中，本发明包括用作药物(如单位剂量片剂或单位剂量胶囊)的羧基哌啶化合物。
本发明进一步包括羧基哌啶化合物在制造用于治疗前面在讨论治疗方法的上述章节中已鉴定的一种或多种病症的药物(诸如单位剂量片剂或单位剂量胶囊)中的应用。在一个实施方案中，该病症是高血压。
J.药物组合物 为治疗上面提到的病症，羧基哌啶化合物可作为游离酸化合物本身来给药。在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可作为游离酸化合物本身的一种或多种药学上可接受的盐来给药。在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可作为游离酸化合物本身和该游离酸化合物本身的一种或多种药学上可接受的盐的混合物来给药。
本发明进一步包括包含羧基哌啶化合物的药物组合物。在一个实施方案中，该药物组合物包括游离酸形式的羧基哌啶化合物。在另一个实施方案中，该药物组合物包括羧基哌啶化合物的一种或多种药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，该药物组合物包括游离酸形式的羧基哌啶化合物和羧基哌啶化合物的一种或多种药学上可接受的盐的混合物。在一个实施方案中，该药物组合物包括羧基哌啶化合物和至少一种药学上可接受的载体。该载体可以是固体、液体或两者，且可与羧基哌啶化合物一起配制成单位剂型，例如片剂，其可含有0.05％-95wt％的羧基哌啶化合物。也可存在其他药理学活性物质。
羧基哌啶化合物可通过任何适当的途径给药，优选以适于该种途径的药物组合物形式且以对所要进行的治疗有效的剂量给药。羧基哌啶化合物和相应组合物可，例如，经口、经直肠、胃肠外或局部给药。
固体剂型的口服给药可以，例如，以离散单位提供，如硬或软胶囊、丸剂、扁囊剂、锭剂或片剂，其各含有预定量的至少一种本发明的化合物。在另一个实施方案中，该口服给药可以粉末或颗粒的形式。在另一个实施方案中，该口服剂量形式为舌下形式，如锭剂。在此种固体剂型中，羧基哌啶化合物通常与一种或多种佐剂组合。在胶囊、片剂及丸剂的情况下，此类剂型也可包括缓冲剂或可用肠溶衣进行制备。
在另一个实施方案中，口服给药可以液体剂量形式。用于口服给药的液体剂型包括，例如，药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆及通常含有本领域中普遍使用的惰性稀释剂(例如，水)的酏剂。此类组合物也可包含佐剂，如润湿剂、乳化剂、悬浮剂、调味剂(例如，甜味剂)和/或芳香剂。
在另一个实施方案中，本发明包括胃肠外剂量形式。“胃肠外给药”包括，例如，皮下注射、静脉注射、腹膜内、肌肉注射、胸骨内注射和输液。可注射制剂(例如，无菌可注射水性或油性悬浮液)可根据已知技术使用适当分散剂、润湿剂和/或悬浮剂来配制。
在另一个实施方案中，本发明包括局部剂型。“局部给药”包括，例如，透皮给药，如经透皮贴片或离子透入装置；眼内给药；或鼻内或吸入给药。用于局部给药的组合物也包括，例如，局部凝胶、喷雾剂、软膏和乳膏。局部制剂可包括增强活性成份经皮肤或其他受感染区域吸收或穿透的化合物。当本发明的化合物通过透皮装置给药时，将使用贮器和多孔膜类型或固体基质种类的贴片来实现给药。适用于向眼局部给药的制剂包括，例如，滴眼剂，其中本发明的化合物溶解或悬浮于适当的载体中。对于鼻内给药或经吸入给药，本发明的活性化合物方便地以溶液或悬浮液形式自泵喷雾容器(由受试者挤压或泵送)来递送，或作为气溶胶喷雾制剂使用适当的推进剂自加压容器或雾化器来递送。
在另一个实施方案中，本发明包括直肠剂型。此直肠剂型可以，例如，栓剂的形式。
也可使用制药学领域中已知的其他载体物质和给药方式。本发明的药物组合物可通过药剂学的任何公知技术来制备，如有效制剂和给药操作。上述关于有效制剂及给药操作的考虑事项为本领域所公知且描述于标准教科书当中。药物制剂的论述见，例如，Hoover，John E.，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania，1975；Liberman等人，Eds.，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；和Kibbe等人，Eds.，Handbook ofPharmaceutical Excipients(第三版)，American Pharmaceutical Association，Washington，1999。
K.组合及联合疗法 羧基哌啶化合物也可与其他治疗剂联合给药以治疗上面先前所论述的各种病症。羧基哌啶化合物及其他治疗剂可同时(以相同剂型或独立剂型)或序贯给药。因此，在一个实施方案中，本发明包括通过向患有或易患病症的受试者给予治疗有效量的羧基哌啶化合物和一种或多种其他的治疗剂而治疗该受试者的病症的方法。在另一个实施方案种，本发明包括药物组合物，其包括羧基哌啶化合物、一种或多种其他的治疗剂和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与阿斯匹林一起给药。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种利尿剂共同给药。适当的利尿剂的实例包括氢氯噻嗪(如MICROZIDETM和ORETICTM)、氢氟噻嗪(如SALURONTM)、bemetanide(如BUMEXTM)、托塞米(torsemide)(如DEMADEXTM)、甲苯喹唑酮(如ZAROXOLYNTM)、氯噻嗪(如DIURILTM、ESIDRIXTM和HYDRODIURILTM)、氨苯喋啶(如DYRENIUMTM)、利尿酸(如EDECRINTM)、氯噻酮(如HYGROTONTM)、呋塞米(furosemide)(如LASIXTM)、吲达胺(如LOZOLTM)、和氨氯吡咪(amiloride)(如MIDAMORTM和MODURETICTM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种血管紧张素转化酶抑制剂共同给药。适当的血管紧张素转化酶抑制剂的实例包括喹那普利(如ACCUPRILTM)、哌道普利(如ACEONTM)、卡托普利(如CAPOTENTM)、依那普利(如VASOTECTM)、依那普里拉TM(ENALAPRILATTM)、雷米普利(如ALTACETM)、西拉普利、地拉普利、福辛普利(fosenopril)(如MONOPRILTM)、佐诺普利、吲哚普利、贝那普利(如LOTENSINTM)、赖诺普利(lisinopril)(如PRINIVILTM和ZESTRILTM)、螺普利(spirapril)、群多普利(trandolapril)(如MAVIKTM)、perindep、喷托普利(pentopril)、莫昔普利(moexipril)(如UNIVASCTM)、法西多曲(fasidotril)、S-丙烯基巯基卡托普利(S-allymercaptocaptopril)和匹伏普利(pivopril)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种血管紧张素II受体阻断剂共同给药。适当血管紧张素II受体阻断剂的实例包括坎地沙坦(如ATACANDTM)、依普沙坦(如TEVETENTM)、依贝沙坦(如AVEPROTM)、氯沙坦(如COZAARTM)、奥美沙坦、奥美沙坦酯(olmesartanmedoxomil)(如BENICARTM)、他索沙坦、替米沙坦(如MICARDISTM)、缬沙坦(如DIOVANTM)、佐拉沙坦(zolasartan)、FI-6828K、RNH-6270、UR-7198、Way-126227、KRH-594、TAK-536、BRA-657和TA-606。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种钙离子通道阻断剂共同给药。适当的钙离子通道阻断剂的实例包括硝苯地平(如ADALATTM、ADALATCCTM和PROCARDIATM)、维拉帕米(如CALANTM、COVERA-HSTM、ISOPTIN SRTM和VERELANTM)、地尔硫卓(如CARDIZEMTM、CARDIZEM CDTM、CARDIZEM LATM、CARDIZEM SRTM、DILACORTM、TIAMATETM和TIAZACTM)、依拉地平(如DYNACIRCTM和DYNACIRC CRTM)、氨氯地平(如NORVASCTM)、费乐地平(felodipine)(如PLENDILTM)、尼索地平(如SULARTM)、苄普地尔(bepridil)(如VASCORTM)、伐尼地平(vatanidipine)、氯维地平(clevidipine)、乐卡地平(lercanidipine)、硫氮卓酮(dilitiazem)和NNC-55-0396。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种β阻断剂共同给药。适当的β阻断剂的实例包括噻吗洛尔(如BLOCARDENTM)、喹酮心安(如CARTROLTM)、卡维洛尔(carvedilol)(如COREGTM)、纳多洛尔(如CORGARDTM)、普萘洛尔(如INNOPRAN XLTM)、倍他洛尔(如KERLONETM)、喷布洛尔(penbutolol)(如LEVATOLTM)、美托洛尔(metoprolol)(如LOPRESSORTM和TOPROL-XLTM)、阿替洛尔(如TENORMINTM)、吲哚洛尔(如VISKENTM)和比索洛尔。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种α阻断剂共同给药。适当的α阻断剂的实例包括哌唑嗪、多沙唑嗪(doxazosin)(如CARDURATM)、酚苄明(如DIBENZYLINETM)、特拉唑嗪(terazosin)(如HYTRINTM)、CDRI-93/478和CR-2991。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种α-β阻断剂共同给药。适当的α-β阻断剂的实例是拉贝洛尔(如NORMODYNETM或TRANDATETM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种醛固酮受体拮抗剂共同给药。适当的醛固酮受体拮抗剂的实例包括依普利酮(如INSPRATM)和螺内酯(如ALDACTONETM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种肾素抑制剂共同给药。适当的肾素抑制剂的实例包括阿利吉仑(aliskiren)(SPP100)、SPP-500/600和YS-004-39。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种中枢性抗肾上腺素能药物共同给药。适当的中枢性抗肾上腺素能药物的实例包括甲基多巴(如ALDOMETTM)、可乐定(如CATAPRESTM或CATAPRES-TTSTM)、胍法辛(guanfacine)(如TENEXTM)和胍那苄(guanabenz)(如WYTENSINTM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种糖苷/正性肌力药共同给药。适当的糖苷/正性肌力药的实例是地高辛(digoxin)(如LANOXINTM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种人类B型利尿钠肽共同给药。适当的人类B型利尿钠肽的实例为奈西立肽(nesiritide)(如NATRECORTM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种有机硝酸盐或氧化氮供体共同给药。“氧化氮供体”是指提供、释放和/或直接或间接传递一氧化氮物种，和/或在体内刺激内源性产生氧化氮或内皮细胞衍生舒张因子(EDRF)和/或在体内升高氧化氮或EDRF内源性水平的化合物。其也包括作为氧化氮合成酶的底物的化合物。适当的氧化氮供体的实例包括S-亚硝基硫醇、亚硝酸盐、硝酸盐、N-氧代-N-亚硝胺、SPM 3672、SPM 5185、SPM5186及其类似物、硝普钠、硝酸甘油、异山梨醇硝酸酯、异山梨醇单硝酸酯、吗多明(molsidomine)、SIN-1及氧化氮合成酶的各种同工酶的底物。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种缓激肽促效剂共同给药。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种可溶性鸟苷酸环化酶活化剂共同给药。适当的可溶性鸟苷酸环化酶活化剂的实例为BAY-41-8543。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种中性肽链内切酶抑制剂共同给药。适当的中性肽链内切酶抑制剂的实例包括奥马曲拉(omapatrilat)、法西多曲(fasidotril)、mixanpril、山帕曲拉(sampatrilat)、Z 13752A，
BMS-189921，和 BMS-189921。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种内皮素拮抗剂共同给药。适当的内皮素拮抗剂的实例包括ambrisentan、达卢生坦(darusentan)、J-104132、SPP-301、TBC-3711、YM-62899、YM-91746和BMS-193884。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂共同给药。适当的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂的实例包括氟伐他汀(如LESCOLTM)、阿伐他汀(如LIPITORTM)、洛伐他汀(如ALTOCORTM或MEVACORTM)、帕伐他汀(如PRAVACHOLTM)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)(如CRESTORTM)和斯伐他汀(simvastatin)(如ZOCORTM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与烟酸或一种或多种烟酸衍生物共同给药。适当的烟酸或烟酸衍生物的实例包括NIACORTM、NIASPANTM、NICOLARTM和SLO-NIACINTM。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种纤维酸衍生物共同给药。适当的纤维酸衍生物的实例包括氯贝特(clofibrate)(如ATROMID-STM)、吉非贝齐(gemfibrozil)(如LOPIDTM)和非诺贝特(fenofibrate)(如TRICORTM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种胆汁酸隔离剂(bile acid sequestant)共同给药。适当的胆汁酸隔离剂的实例包括考来替泊(colestipol)(如COLESTIDTM)、消胆胺(如LOCHOLESTTM、PREVALITETM、QUESTRANTM和QUESTRAN LIGHTTM)、考来维仑(colesevelam)(如WELCHOLTM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种胆固醇吸收抑制剂共同给药。适当的胆固醇吸收抑制剂的实例为依泽替米贝(ezetimibe)(如ZETIATM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种胆固醇酯转运蛋白抑制剂共同给药。适当的胆固醇酯转运蛋白抑制剂的实例为torcetrapib。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种顶端(apical)钠依赖型胆汁酸协同转运蛋白抑制剂共同给药。适当的顶端钠依赖型胆汁酸协同转运蛋白抑制剂的实例包括SD-5613、AZD7806和264W94SD。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种α葡萄糖苷酶抑制剂共同给药。适当的α葡萄糖苷酶抑制剂的实例包括米格列醇(miglitol)(如GLYSETTM)和阿卡波糖(acarbose)(如PRECOSETM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种双胍类药物共同给药。适当的双胍类药物的实例包括罗格列酮(rosiglitazone)(如AVANDAMETTM)和二甲双胍(如GLUCOPHAGETM和GLUCOPHAGEXRTM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种胰岛素类药物共同给药。适当的胰岛素类药物的实例包括HUMALOGTM、HUMALOG 50/50TM、HUMALOG 75/25TM、HUMULIN 50/50TM、HUMALIN 75/25TM、HUMALIN LTM、HUMALIN NTM、HUMALIN RTM、HUMALIN R U-500TM、HUMALIN UTM、ILETIN II LENTETM、ILETINII NPHTM、ILETIN II REGULARTM、LANTUSTM、NOVOLIN 70/30TM、NOVILIN NTM、NOVILIN RTM、NOVOLOGTM、VELOSULIN BRTM、和EXUBERATM。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种meglitnide共同给药。适当的meglitnide的实例包括瑞格列奈(repaglinide)(如PRANDINTM)和那格列奈(nateglinide)(如STARLIXTM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种磺酰脲类药物共同给药。适当的磺酰脲类药物的实例包括格列美脲(如AMARYLTM)、格列本脲(glyburide)(如DIABETATM、GLYNASEPRESTABTM或MICRONASETM)和格列吡嗪(glipizide)(如GLUCOTROLTM和GLUCOTROL XLTM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种噻唑烷二酮类药物共同给药。适当的噻唑烷二酮类药物的实例包括匹格列酮(pioglitazone)(如ACTOSTM)和罗格列酮(rosiglitazone)(如AVANDIATM)。
在另一个实施方案中，羧基哌啶化合物可与一种或多种α-δ配体共同给药。适当的α-δ配体的实例包括加巴喷丁(gabapentin)、普瑞巴林(pregabalin)(如LYRICATM)、[(1R，5R，6S)-6-(氨基甲基)二环[3.2.0]庚-6-基]乙酸、3-(1-氨基甲基-环己基甲基)-4H-[1，2，4]噁二唑-5-酮、C-[1-(1H-四唑-5-基甲基)-环庚基]-甲胺、(3S，4S)-(1-氨基甲基-3，4-二甲基-环戊基)-乙酸、(1α，3α，5α)-(3-氨基-甲基-二环[3.2.0]庚-3-基)-乙酸、(3S，5R)-3-氨基甲基-5-甲基-辛酸、(3S，5R)-3-氨基-5-甲基-庚酸、(3S，5R)-3-氨基-5-甲基-壬酸、和(3S，5R)-3-氨基-5-甲基-辛酸)、(2S，4S)-4-(3-氯苯氧基)干果糖(praline)和(2S，4S)-4-(3-氟苄基)干果糖。
L.试剂盒 本发明进一步包括适用于实施上述治疗方法的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒包括第一剂型，其包括羧基哌啶化合物；和用于该第一剂型的容器。在另一个实施方案中，该试剂盒包括第一剂型，其包括羧酸化合物；和第二剂型，其包括第二治疗剂。
在另一个实施方案中，该试剂盒包括第一剂型，其包括羧基哌啶化合物；和第二剂型，其包括血管紧张素转化酶抑制剂。
在另一个实施方案中，该试剂盒包括第一剂型，其包括羧基哌啶化合物；和第二剂型，其包括血管紧张素II受体拮抗剂。
在另一个实施方案中，该试剂盒包括第一剂型，其包括羧基哌啶化合物；和第二剂型，其包括醛固酮受体拮抗剂。
在另一个实施方案中，该试剂盒包括第一剂型，其包括羧基哌啶化合物；和第二剂型，其包括氧化氮供体。
M.化合物合成 羧基哌啶化合物可使用合成示意图中所说明的方法和下面所述的实验步骤来制备。提供了通用合成示意图用于说明且其并非要进行限制。用于制备羧基哌啶化合物的起始物质为市售的或可通过本领域普通技术人员所熟知的常规方法(如标准参考书如COMPENDIUM OFORGANIC SYNTHETIC METHODS，Vol.I-VI(Wiley-Interscience出版)中所公开的那些方法)来制备。
示意图1 示意图1概述了制备羧基哌啶化合物的游离酸的通用步骤。
示意图2 示意图2概括了制备羧基哌啶化合物的游离酸的替代通用步骤。
以下实施例说明了羧酸化合物的游离酸的合成 实施例1
1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-甲酸 步骤1制备1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-4-硝基-1H-吡唑-5-甲酰胺
将3-乙基-4-硝基吡唑-5-甲酰胺(如EP 1176142的18页所述制备)(15.0g，81mmol)、三苯膦(25.6g，97.8mmol)和四氢呋喃(120mL)装入1L烧瓶中。通过将该烧瓶置于0℃浴中而将所得混合物冷却，且向烧瓶中添加2-乙氧基乙醇(9.5ml，98mmol)。然后经2.5小时向烧瓶中添加偶氮二羧酸二叔丁酯(22.5g，97.8mmol)在四氢呋喃(90mL)中的溶液。在冷却条件下将该混合物再搅拌1小时，且随后升温至室温并再搅拌1小时。将混合物再次冷却至0℃，以6M盐酸(40ml)处理，且加热至40℃1小时。部分浓缩混合物且在乙酸乙酯和水之间萃取。以乙酸乙酯反萃取水层。将合并的有机层用水洗涤，以盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，且随后浓缩。用2-丙醇处理所得粘稠的油状物，然后浓缩此混合物。以2-丙醇处理所得物质且加热。冷却后，过滤所得晶体，以冷2-丙醇冲洗，且干燥以得到16.5g标题化合物。
步骤2制备4-氨基-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑-5-甲酰胺
来自步骤1的1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-4-硝基-1H-吡唑-5-甲酰胺(15.0g，58mmol)、5％载铂碳(0.75g)及乙酸异丙酯(150mL)合并，且在80psi的氢气下将该混合物搅拌约50小时。然后经硅藻土过滤混合物，以乙腈冲洗硅藻土，冰浓缩滤液。最后使物质结晶得到13.7g的标题化合物的水合物。
步骤31-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5，7(4H，6H)-二酮
使羰基二咪唑(12.3g，76.1mmol)在乙腈(123mL)中的混合物升温至50℃。经1小时向该混合物中添加步骤3中所制备的4-氨基-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑-5-甲酰胺(13.2g，58mmol)，且在添加期间使混合物的温度升高至75℃，然后冷却混合物并搅拌过夜。在冰浴中冷却混合物并过滤。以水冲洗滤饼并干燥得到12.8g标题化合物。
步骤4制备5，7-二氯-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶
用PhPOCl2(195g，1000mmol)处理来自步骤3的1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5，7(4H，6H)-二酮(25.2g，100mmol)的混合物，且在N2中在135℃下加热20h，并搅拌。冷却该混合物，然后在140℃下再加热20h。冷却该混合物且缓慢添加至冰(600g)/水(200ml)混合物中。将此物搅拌3h且通过过滤收集所得固体并以水冲洗(2×100mL)。将固体悬浮在乙酸乙酯(300ml)中。添加水(200ml)并将pH值调节为1-2。然后添加10％NaHCO3(125ml)(使得pH为约7)并分离各层。以水(400ml)和饱和氯化钠溶液(150mL)连续洗涤有机层。然后干燥有机溶液并浓缩得到23g标题化合物。
步骤5制备N-[5-氯-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-基]-4-甲基吡啶-2-基胺
以THF(25mL)处理2-氨基-甲基吡啶(4.32g，40mmol)和来自步骤4的5，7-二氯-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶(5.78g，20mmol)的混合物并冷却至0℃。搅拌该混合物并用THF(25mL)中的1MLiN(TMS)2在使得温度保持在5℃以下的速率下处理。将混合物搅拌30分钟，然后用10％柠檬酸溶液处理直至达到pH 6-7。在减压下部分浓缩混合物。然后在5℃下将混合物搅拌1h。通过吸滤收集所得固体且用水(40mL)洗涤。在真空烘箱中在小于60℃的温度下干燥团体得到了7.0g标题化合物。
步骤6制备1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-甲酸
在125℃下，加热来自步骤5的N-[5-氯-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-基]-4-甲基吡啶-2-基胺(5.42g，166mmol)、异哌啶甲酸(85.9g，665mmol)、碳酸铯(85.9g，665mmol)和DMSO(55mL)的混合物并进行搅拌。20h后，将该混合物冷却至20℃并添加水(165mL)。将混合物搅拌15分钟并用乙酸乙酯(55mL)。分离各层，并用另一份乙酸乙酯(55mL)处理水层。再次分离各层并使用6M HCl使水层的pH值为约5。搅拌1h后，将所得固体过滤，用水(20mL)洗涤并在真空中干燥，得到5.5g标题化合物。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)
1.10(t，3H)，1.30(t，3H)，1.49-1.60(m，2H)，1.84-1.95(m，2H)，2.32-2.36(m，3H)，2.52-2.57(m，1H)，2.78(q，2H)，2.99-3.08(m，2H)，3.52(q，2H)，3.78(t，2H)，4.45-4.53(m，2H)，4.56-4.64。
可选的是，可将来自步骤5的N-[5-氯-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-基]-4-甲基吡啶-2-基胺的混合物与异哌啶甲酸(1至10当量之间)和碱合并，并在100-125℃之间在溶剂中加热直至反应完成。适当的碱包括碳酸铯、碳酸钠和碳酸钾。适当的溶剂包括DMSO和N，N-二甲基甲酰胺。冷却后，可添加水并用如乙酸乙酯的有机溶剂萃取(1-3次之间)碱性溶液。用HCl将剩余碱性层酸化至pH 5。将混合物搅拌约1小时。将固体滤出，用水洗涤，并在真空中干燥以得到标题化合物。
实施例2
1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-甲酸 步骤1制备1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-4-硝基-1H-吡唑-5-甲酰胺
根据实施例1的步骤1制备1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-4-硝基-1H-吡唑-5-甲酰胺。
步骤2制备4-氨基-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑-5-甲酰胺
用不等的四份甲酸铵(7.01g，111mmol)以约10分钟的间隔处理来自步骤1的1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-4-硝基-1H-吡唑-5-甲酰胺(5.70g，22mmol)和氢氧化钯(1.0g)在乙醇(110mL)中的混合物。在回流下将所得混合物加热2小时，然后冷却。通过硅藻土过滤该混合物并浓缩。通过柱色谱在硅胶上使用乙酸乙酯和己烷的混合物作为洗脱剂来纯化所得残余物以得到2.45g标题化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.17(t，3H)，1.21-1.32(m，3H)，2.60(q，2H)，3.53(q，2H)，3.79-3.95(m，2H)，4.38-4.52(m，2H)。MS(ESI)m/z 227。
步骤31-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5，7(4H，6H)-二酮
用羰基二咪唑(1.92g，11.9mmol)处理来自步骤2的4-氨基-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑-5-甲酰胺(2.44g，10.8mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(40mL)中的混合物并在80℃下加热过夜。真空浓缩该混合物并通过柱色谱在硅胶上使用乙酸乙酯和己烷的混合物作为洗脱剂来纯化残余物以得到1.04g标题化合物。MS(ESI)m/z 253。
步骤4制备5，7-二氯-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶
在回流下，将步骤3中所制备的1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5，7(4H，6H)-二酮(7.2g)和磷酰氯(200mL)与1滴N，N-二甲基甲酰胺的混合物加热过夜。冷却该混合物且减压蒸发磷酰氯。向所得残余物中添加冰，然后用氟仿萃取该混合物。将有机层经硫酸镁干燥，过滤并蒸发得到2.09g呈油状的5，7-二氯-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶，其静置后凝固。LCMS m/z 289。
步骤5制备1-(1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-甲酸
将步骤4中制备的5，7-二氯-1-(2-乙氧基乙基)-3-乙基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶(1mmol)、2-氨基-4-甲基吡啶(2mmol)、N，N-二异丙基乙胺(3mmol)和N-甲基吡咯啶酮(1mL)添加至2个反应容器的每一个中。在150℃下，将各容器在CEM Diseover微波炉中照射15分钟。向各反应容器中添加异哌啶甲酸(3mmol)，并在180℃下将所得混合物照射15分钟。合并两个反应容器的内容物。向混合物中添加水及乙酸乙酯，并震荡该混合物。向混合物中添加盐酸(1M)并再次震荡混合物。分离各层。用水洗涤有机层，添加盐酸(1M)，并分离各层。将有机层经硫酸镁乾燥，过滤并蒸发。通过添加饱和碳酸钠将水层的pH值升高至约6，然后用以乙酸乙酯萃取水层。将有机层经硫酸镁干燥，过滤，添加至上述有机残余物中并蒸发。在15分钟内，以10-95％乙腈/水(盐酸)梯度在Varian Dynamax C-18柱(250×41.4mm)上分两次进行RP-HPLC来纯化溶液。合并各馏分并蒸发以得到0.26g标题化合物。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)
1.10(t，3H)，1.30(t，3H)，1.49-1.60(m，2H)，1.84-1.95(m，2H)，2.32-2.36(m，3H)，2.52-2.57(m，1H)，2.78(q，2H)，2.99-3.08(m，2H)，3.52(q，2H)，3.78(t，2H)，4.45-4.53(m，2H)，4.56-4.64(m，2H)，6.91(d，1H)，8.05(s，1H)，8.18(d，1H)，9.63(s，1H)，12.18(s，1H)。LCMS m/z 454。
试验方案 N.功效和选择性测定 方法1人血小板PDE5酶抑制闪烁迫近分析测定法 可使用体外测定法来评价测试化合物对PDE5酶活性的抑制。如下面更为具体的描述，此测定法测量了该测试化合物的PDE5IC50值(即，相对于未受抑制对照的活性，抑制50％的经PDE5酶催化的cGMP水解成为GMP所需的测试化合物的浓度)。
如Ballard SA等人；J.Urology 159(6)，2164-2171，1998所述，通过对Thompson，WJ等人；Biochemistry 18(23)，5228-5237，1979的方法进行适当改良可从人血小板获得用于测定的PDE5酶。从人血小板获得的PDE5酶可用来催化[3H]cGMP(Amersham Biosciences)水解为5’核苷酸[3H]GMP。[3H]GMP与硅酸钇SPA珠(Amersham Biosciences)结合并通过闪烁计数法来检测。更具体来说，在底物(未标记的和[3H]-标记的cGMP或cAMP的比例为3∶1)的存在下，通过使该化合物与固定量的PDE5酶接触可在测定中评价不同浓度下测试化合物的作用。可如上所述使用闪烁计数法来测定相对PDE5酶活性。然后相对于未受抑制对照的总PDE5酶活性，计算出PDE5酶活性的抑制。
PDE5IC50测定96孔微量滴定板形式 试剂 缓冲液A20mM Tris-HCl，5mM MgCl2，pH 7.4 缓冲液B在缓冲液A中2mg/ml BSA(酶缓冲液) cGMP底物在测定中终浓度为500nM 加入的3H标记的底物量取决于[3H]cGMP的比活性，并将cGMP底物用在缓冲液A中的10mM冷cGMP储存液稀释至测定中的500nM最终底物浓度。
PDE酶在缓冲液B中制备。通过酶活性来确定稀释因子。
SPA珠在dH2O中制备的20mg/ml悬液。
阳性对照阴性对照标准品/测试化合物 2μl 100％DMSO 2μl 100％DMSO 2μl标准品/测试化合物 25μl缓冲液A25μl缓冲液A25μl缓冲液A 25μl酶 25μl缓冲液B25μl酶 50μl底物 50μl底物 50μl底物 50μl SPA来终止 50μl SPA来终止 50μl SPA来终止 在100％DMSO中制备5mM的标准品和测试化合物储存液。使用10点1/2log稀释形式将化合物在稀释板中连续稀释。将2μl化合物稀释液分两份添加至检测板的孔中。向指定对照孔中添加2μl的100％DMSO。向所有孔中添加25μl缓冲液A。向阴性对照孔中添加25μl缓冲液B。向剩余孔中添加25μl酶。向各孔中添加50μl底物。将盘密封并在在测定板震荡器上在30℃下孵育60分钟。添加50μl SPA珠粒以终止反应。再次将板密封并震荡15分钟以使珠结合GMP产物。使珠沉降30分钟，然后在NXT TopCount闪烁计数器上读数。以用于基于板筛选的曲线拟合应用来分析数据。此测定的抑制百分数计算如下抑制(％)＝[(平均最大值-化合物值)/(平均最大值-平均最小值)]×100。
从酶活性对化合物浓度的S形剂量反应曲线确定IC50值。
根据方法1检测羧基哌啶化合物。所测量的相应PDE5IC50值报告在表A中。
表A 根据方法1检测WO2004096810的实施例中公开的化合物。所测量的相应PDE5IC50值报告在表B中。
表B
方法1A可选的人血小板PDE5酶抑制闪烁迫近分析测定法 测试化合物也可以一种可选的如下所述的与方法1不同的体外测定法来测量PDE5IC50值 PDE5IC50测定96孔微量滴定板形式 试剂 缓冲液A20mM Tris-HCl，5mM MgCl2，pH 7.4 缓冲液B在缓冲液A中2mg/ml BSA (酶缓冲液) cGMP底物在测定中终浓度为500nM 加入的3H标记的底物量取决于[3H]cGMP的比活性，且其在缓冲液A中稀释。
PDE酶在缓冲液B中制备。通过酶活性来确定稀释因子。
SPA珠在dH2O中制备的4mg/ml悬液。
阳性对照阴性对照标准品/测试化合物 3μl 100％DMSO 3μl 100％DMSO 3μl标准品/测试化合物 27μl缓冲液A27μl缓冲液A27μl缓冲液A 30μl酶 30μl缓冲液B30μl酶 30μl底物 30μl底物 30μl底物 30μl SPA来终止 30μl SPA来终止 30μl SPA来终止 在100％DMSO中制备以2mM的标准品和测试化合物储存液。使用10点1/5log稀释形式将化合物在稀释板中连续稀释，使得测定中用于初始IC50筛选的起始浓度为2μM；使用10点1/3log稀释液完成确认性IC50。向测定板的各孔中添加27μl缓冲液A。从稀释板，3μl稀释化合物以两份加入或加入3μl 100％DMSO(对于阳性和阴性对照)。加入30μl酶。对于阴性对照孔，用缓冲液B代替酶。向所有孔中添加30μl标记底物。
在室温下孵育60分钟后，添加30μl硅酸钇珠以终止反应。这些珠是密集的，且需要在加入至板中时持续搅拌。将板密封并在测定板震荡器上震荡15分钟以使珠与GMP产物结合。
在珠沉降30分钟后，在NXT TopCount闪烁计数器上读数并如下分析数据。使用各板上0％和100％对照的均数来计算抑制百分比值。然后使用该化合物的优良水平抑制百分比值计算逻辑S形剂量反应模型的4参数估计值。4参数逻辑模型的公式可表示为Y＝((a-d)/(1+(X/c)^b))+d，其中Y为反应值，X为浓度，a为下渐进线(最小反应值)，d为上渐进线(最大反应值)，c为模型IC50值(单位与X相同)，且b为斜率(如De Lean，A.，P.J.Munson，和D.Rodbard(“Simultaneousanalysis of families of sigmoidal curvesapplication to bioassay，radioligand assay，and physiological dose-response curves.”Am.J.Physiol.235(2)E97-E102，1978中所述)。这些估计值用于计算对应于50％抑制的浓度。
根据方法1a检测羧基哌啶化合物。所测量的相应PDE5IC50值报告在表C中。
表C 根据方法1a检测先前在WO2004096810的实施例中所公开的的化合物。所测量的相应PDE5IC50值报告在表D中。
表D 方法2人视网膜PDE6酶抑制闪烁迫近分析测定法 可根据方法1的体外检测法来测量测试化合物对PDE6酶活性的抑制作用，但取而代之的是使用从人、牛或犬视网膜分离的半纯化PDE6酶来代替PDE5酶。此测定测量测试化合物的PDE6IC50值(即，相对于未受抑制对照的活性，抑制50％的经PDE6酶催化[3H]cGMP水解成5’核苷酸[3H]GMP所需的测试化合物浓度)。[3H]GMP与硅酸钇SPA珠结合并通过闪烁计数法探测。
PDE6纯化PDE6可从下列各物分离及纯化来自牛眼的可溶性杆状细胞PDE6/杆状细胞外节PDE6(Charles River Ltd，France)；来自犬眼的视锥细胞PDE6(LAS)；或来自人眼的可溶性杆状细胞和视锥细胞PDE6(I.I.A.M.)。
匀浆缓冲液 20mM Hepes(Sigma) 2.383克 1mM EDTA(Sigma)0.186克 溶解于300ml HPLC(Acros)或二次去离子水中。
100mM PMSF(Sigma) 0.174克/10毫升乙醇 向缓冲液中缓慢添加5ml PMSF溶液以避免沉淀。
添加250mM蔗糖(Fisher) 42.78克。
将体积调节为500ml，搅拌直至溶解。
使用1MNaOH将pH值调节为7.2。
在4℃下储存。
制备视网膜使眼睛复温直至变软并直至角膜和晶状体透明。当以最上部角膜支撑眼睛时，穿过虹膜水平下的结膜作一小切口。该切口应足以使体液自切口流出。使用精细手术剪在角膜周围切开使其能以活瓣形式被提起。使用小钩，钩住晶状体并将其轻轻拉出眼眶外，须小心以免同时拉出视网膜。使视网膜自动向下移动至眼眶的底部。
小心提起视网膜并确定视神经的位置。切断视神经并将视网膜转移至含有数毫升匀浆缓冲液的小皿中。轻轻地使视网膜浮在缓冲液的表面上，并从虹膜去除任何明显的有色物质。将视网膜置于具有清洁缓冲液的第二皿中以去除最后的微量色素，然后转移至50ml CorningCoster离心管(Sigma)中，并保持在冰上。
从视网膜分离及纯化PDE6每片牛视网膜使用2ml匀浆缓冲液，且对于犬和人，每片视网膜使用1ml匀浆缓冲液。使用手持匀浆器以3×5秒脉冲匀浆，每次脉冲之间在冰上冷却。经2层手术纱布过滤匀浆物。在4℃下以100,000g旋转60分钟。若体积足够，则经0.22μM Steril-D包过滤胞质溶胶，或经0.22μM注射器末端过滤器(例如，
-GV)过滤胞质溶胶。经FPLC(Pharmacia FPLC LKB/FRAC-100，Pharmacia)操作或根据需要等分并储存在液氮中。
方法2A可选的人视网膜PDE6酶抑制闪烁迫近分析测定法(SPA) 也可根据方法1A的体外测定法测量测试化合物对PDE6酶活性的抑制，但取而代之的是使用从人、牛或犬视网膜分离的半纯化PDE6酶代替PDE5酶。此测定测量测试化合物的PDE6IC50值(即，相对于未受抑制对照的活性，抑制50％的经PDE6酶催化[3H]cGMP水解成5’核苷酸[3H]GMP所需的测试化合物浓度)。[3H]GMP与硅酸钇SPA珠结合并通过闪烁计数法探测。
方法3人重组PDE11酶抑制闪烁迫近分析测定法(SPA) 可根据方法1的体外测定法测量测试化合物对PDE11酶活性的抑制，但取而代之的是使用在Sf9昆虫细胞中表达的PDE11酶代替PDE5酶。此测定测量测试化合物的PDE11IC50值(即，相对于未受抑制对照的活性，抑制50％的经PDE11酶催化[3H]cGMP水解成5’核苷酸[3H]GMP所需的测试化合物浓度)。[3H]GMP与硅酸钇SPA珠结合并通过闪烁计数法探测。
PDE11表达和纯化 (a)表达使用含有转位的PDE11A1(SEQ ID NO1)(pFastBac system，Invitrogen)(4×107pfu/ml)的杆状病毒表达载体以2的感染复数感染200ml Sf9昆虫细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)(1×106/ml)。在27℃下以220rpm震荡孵育48小时。通过在4℃下以2000rpm离心10分钟收集感染的细胞。在-80℃下储存感染的细胞沉淀团直至准备纯化。将经复温的细胞团再悬浮成1×107个细胞/毫升(＝由20mM Hepes(pH 7.2)、1mM EDTA、20mM蔗糖、150mM NaCl及蛋白酶抑制剂片剂组成的20ml缓冲液)。充分混合并使其在冰上静置10分钟。在冰上超声波处理5×5秒。在4℃下以12,000rpm使混合物在SS34中旋转10分钟。在-80℃下保存不溶的小球并继续进行可溶物质的纯化。
(b)纯化通过用TBS冲洗空柱2次制备柱子(直径1.0cm，Kontes)。然后将珠(抗FLAG M2Agarose，Sigma)与TBS混合，并加入至柱-使珠沉降。以3柱体积的0.1M甘氨酸(pH 3.5)洗涤柱子。然后用5柱体积的TBS(不允许无液运转)洗涤柱子。将萃取物施加至柱中且使萃取物通过重力流进入。再次流通。以15柱体积的TBS洗涤柱子。用5×1ml等分试样的FLAG肽(Sigma)(即，100μg/ml在TBS中)洗脱蛋白质。用1ml 0.1M甘氨酸洗脱剩余的蛋白质，并立即添加25μl 1M Tris pH 8进行中和。
方法3A可选的人重组PDE11酶抑制闪烁迫近分析测定法(SPA) 可根据方法1A的体外测定法测量测试化合物对PDE11酶活性的抑制，但取而代之的是使用在Sf9昆虫细胞中表达的PDE11酶代替PDE5酶。此测定测量测试化合物的PDE11IC50值(即，相对于未受抑制对照的活性，抑制50％的经PDE11酶催化[3H]cGMP水解成5’核苷酸[3H]GMP所需的测试化合物浓度)。[3H]GMP与硅酸钇SPA珠结合并通过闪烁计数法探测。
根据方法2、方法2A、方法3及方法3A检测羧基哌啶化合物。测量的相应PDE6和PDE11IC50值报告在表E中。
表E 根据方法2、方法2A、方法3及方法3A检测先前在WO2004096810的实施例中公开的化合物。测量的相应PDE6和PDE11IC50值报告在表F中。
表F 可用来评价测试化合物的有效性的其他测定法包括下面所述的方法4、方法4A、方法5和方法6 方法4主动脉环测定法 可使用离体测定法来测量暴露于测试化合物的大鼠主动脉环的直接舒张。如下文更为具体的描述，测试化合物通过增强当主动脉环暴露于稳定的外源性一氧化氮供体，如二乙基三胺NONOate(偶氮-1-烯翁-1，2-二醇盐(diazen-1-ium-1，2-diolate)，也称为“DETA-NO”)时诱发的cGMP信号(即，通过抑制经PDE5酶催化的cGMp水解成GMP)来引起主动脉环的舒张。该测定法测量测试化合物的EC50值(即，对测试化合物产生50％的最大可能有效反应的测试化合物浓度)。
使用CO2气体使雄性Sprague-Dawley大鼠(250-350g)窒息，小心地切开其胸主动脉并置于Krebs缓冲液中。然后，小心地切除主动脉的结缔组织并分成8段，每段长3-4mm。
将主动脉环悬浮于1克静息张力下、水套循环的(37℃)、15mL组织浴中的平行不锈钢线之间。使用等长张力传感器测量张力，并使用Ponemah组织平台系统记录。在化合物检测前，使用每个制备物平衡至少60分钟。在此期间，组织也与200μM NG-单甲基L-精氨酸(“L-NMMA”)孵育，并每15-20分钟更换一次孵育培养基(每次洗涤后添加L-NMMA以在每一组织浴中维持200μM的终浓度)。
平衡期后，记录每一组织的基线张力。评估去氧肾上腺素(phenylepherine)(1μM)的血管收缩反应，并当对去氧肾上腺素的反应达到最大时，随后通过乙酰胆碱(1μM)的激发评估血管反应性。另一洗涤时段后，在向每一浴中添加血管收缩剂去甲肾上腺素(25nM)并将组织孵育足以使组织达到稳定张力的一段时间(约15分钟)后记录第二基线值。使用稳定的一氧化氮供体DETA-NO供应外源性一氧化氮驱动源。滴定DETA-NO的浓度(以半对数增量累积)以达到去甲肾上腺素引起的预收缩的约5-15％舒张。通常使用5剂量/环且在每次添加之间间隔15分钟，用单环构建累积浓度-反应曲线。
方法4A可选的主动脉环测定法 方法4可经改良以提供用于测量暴露于测试化合物的大鼠主动脉环的直接舒张的可选试验方案。此可选方法与方法4的不同如下所述 对于可选方法，首先在制备环(裸露环)之前通过在手指之间轻轻将血管内腔摩擦来去除内皮。静息张力设定在2克且评估对最大浓度去氧肾上腺素(1μM)的血管收缩反应，然后(在冲洗时段后)进一步暴露于300nM去氧肾上腺素2次。在每一组织中在0.1-300nM浓度范围内构建对去甲肾上腺素的浓度-反应关系。另一冲洗时段后，对于化合物检测，用去甲肾上腺素的EC90浓度来收缩组织。
方法5CulexTM测定法 测试化合物对全身动脉血压的影响可在清醒的预插管自发性高血压大鼠(“SHR”)模型中评估。使用自动血液采样机(“ABS”)系统进行此测定。CulexTMABS系统(Bioanalytical System，Inc.，West Lafayette，IN)包括一台膝上型电脑、四个控制单元和代谢笼。此ABS系统允许从单只大鼠收集多个血样，而不会对动物引起过度的应激。此外，ABS系统允许收集可潜在地用于生物标记物鉴别的尿液样品。通过此方法，在清醒的不受限制的SHR大鼠中同时进行功效及标准药物动力学研究，以确定血浆游离药物浓度或潜在(多个)生物标记物与药理学作用(平均动脉血压降低)之间的关系。
12-16周龄、体重约300g的SHR大鼠经颈静脉与右侧颈动脉进行手术插管。手术恢复后，将动物置于CulexTM笼中，并将其栓在移动反应臂上，该移动反应臂带有当动物移动时能控制笼移动以防止导管扭曲的传感器。在右侧颈静脉导管和设定用于血液采样的CulexTM无菌管，和用于化合物给药的左侧颈静脉导管之间建立连接，并将右侧颈动脉导管与用于监测血压的压力传感器连接。为保持导管的开放，通过CulexTM的“维护(tend)”功能维持右侧颈静脉，该功能每12分钟或在采样事件之间用20μl肝素生理盐水(10单位/毫升)冲洗导管，且左侧颈静脉套管充满肝素生理盐水(20单位/毫升)。右侧颈动脉套管的开放通过在未记录到血压时直接向延伸管中缓慢地灌注肝素生理盐水或在血压监控期间经压力传感器来维持。在化合物评价之前，使动物适应至少2小时。测试化合物可经静脉内或经口服管饲给药。血液采样方案(采样时间及体积)使用CulexTM软件的程序设计来进行。从每只动物抽取的血液总量应不超过750μL/24hr和在两周内不超过10mL/kg。监测心率、血压及药物浓度。根据实验方案，通过PONEMAH(GouldInstrument System，Valley View，OH)、经数据采集系统用于记录血压和心律的压力传感器来记录全身动脉血压和心律6至24小时。分析平均动脉血压(主要终点)以评价化合物的功效。
使用下面所述的LC/MS/MS法来分析血样以测量血浆药物浓度，并评价潜在的生物标记物。
LC/MS/MS法 样品制备血浆样品(50μl未知、对照或空白)和10μl乙腈∶水或测试化合物的标准溶液和150μl内标准溶液(100ng/mL测试化合物在乙腈中的溶液)。混合物以3000rpm离心5分钟，并将125μl上清液转移至96孔板中。在氮气流下蒸发溶剂，并用80μl乙腈/0.1％甲酸水溶液(20∶80v/v)重新溶解残余物。
将20μl体积的每个制备的样品注射至Phenomenex Synergi 4μmMAX-RP 2.0×75mm柱上，并以0.4mL/min使用0.1％甲酸水溶液(流动相A)至乙腈(流动相B)的梯度洗脱液进行洗脱。梯度程序的组成为初始施加90％流动相A，然后在注射后0.2-1.15min线性梯度至75％流动相B，并保持在25％流动相B直至2.0min。从2.00-2.10分钟，流动相线性变化回90％流动相A，且下次注射在3.00分钟时发生。通过质谱法使用阳离子电喷射(ESI)以m/z 454.00(MH+测试化合物)→m/z 408.00，m/z 466.24(MH+测试化合物)→409.33转变的多个反应监测来进行监测。离子喷射电压设定在5000。使用分析物相对于内标准的峰面积比来构建校正曲线。通过其峰面积比相对于校正曲线的反向预测来测定受试者浓度。
方法6在自发性高血压大鼠中植入无线电发射器并随后通过遥测术来筛查血压 测试化合物对全身动脉血压的影响可在自发性高血压大鼠(“SHR”)模型中使用遥测术来评估。SHR大鼠用异氟烷气体经异氟烷麻醉机来进行麻醉，该麻醉机被校准在氧气流经机器的内腔时递送一定百分比范围内的异氟烷。将动物置于诱导室中并以4-5％给予异氟烷以达到手术麻醉水平。然后在手术操作过程中经鼻锥将其保持在1-2％，经手术台上的小型异氟烷麻醉装置递送异氟烷。
麻醉给药后，使用无菌操作用市售无菌无线电遥测装置(DataSciences，International，Roseville，MN 55113-1136)将发射器植入大鼠。手术前，将手术野刮毛，用DialTM牌抗菌溶液(含有4％葡萄糖酸洗必太和4％异丙醇)擦洗，然后应用碘(10％)喷雾溶液。作2.5-3.0cm剖腹手术，并将无线电遥测装置植入腹部，其中导管尖端插入腹部主动脉中。使用Baby Weitlaner牵拉器来撑开软组织。部分地切开腹主动脉的1cm部分，并暂时地将该部分十字钳闭，用21号针穿孔内将发射器导管尖端导入至血管中，并用单根4.0丝质缝合线锚定在邻近的腰肌上而固定。然后将发射器体插入腹腔中，并同时固定至腹部肌肉壁，同时用连续4.0丝质缝合线关闭。皮层用皮下连续4.0可吸收缝合线关闭。在关闭后，分别在缝合线内及周围皮下(s.c.)给予布比卡因(marcaine)，然后局部施用碘。在恢复意识之前，所有大鼠接受术后皮下注射0.05mg/kg丁丙诺啡叔丁啡(buprenorphine)。对于0.300kg大鼠的典型剂量体积为0.050ml。在给予丁丙诺啡叔丁啡之前大鼠必须完全从其手术麻醉中恢复。然后其可连续2天接受每天1次的相同剂量，除非该动物证明其术后疼痛缓解。
手术后，使大鼠返回笼中，并分开圈养在笼内放有纸垫的坚硬底部上。实验操作开始前允许不少于7天的时间用于恢复。已观察到手术后数天大鼠通常具有高血压并在手术后约第7天返回至“正常血压”水平。在整个实验时间线中它们饲以标准大鼠饲料并随意进水。
测试化合物经管饲使用具有球状未端的不锈钢21/2英寸、18号管饲针胃内给药(i.g.)。对于每日单次给药，目标体积为3.33ml/kg，i.g.。测试化合物的剂量体积为约1毫升/只大鼠。给予测试化合物的载体为在50mM柠檬酸盐缓冲液pH＝5中的甲基纤维素(0.5％)+Tween 80(0.1％)。
使用Data Sciences International的数据采集程序(3.0版)获得血压数据。以1.5-3分钟的时间间隔，历时5秒，在24小时内每天记录整个研究的血压样品。通过Data Science的数据分析软件将此数据处理成所需时间间隔的平均值。所有其他数据归纳在Microsoft ExcelTM电子表格中进行。
O.毒性测定 方法7微核测定 体外微核测定可用于测定测试化合物的致突变性。此测定通过测量分裂间期细胞的细胞质中小膜结合DNA片段如微核的形成来检测由于暴露于测试化合物所致的染色体异常。
使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在不同测试条件下在有或无代谢活化时进行该测定。此筛选测定与体外细胞遗传学的结果之间的一致性为约85％。使用24小时或3小时连续处理进行直接(-S9)检测，而代谢活化(+S9)的检测则涉及3小时的处理。通过暴露后(在细胞质分裂被阻滞的双核细胞中)后第一间期中微核细胞数量的增多来指示染色体诱裂性。将结果与测试化合物产生的细胞毒性水平(通过双核细胞的比例来测量)的水平相比较。为了证明检测的有效性，需要阴性(载体处理)和阳性(已知反应剂)对照在已确立的有根据范围内反应。
阴性-阴性结果确定为由测定的特定终点所定义的无遗传毒性危害(例如，体外微核阴性)。显示阴性反应的测试化合物不满足测定的特定评价标准，该标准可包括以下之一或两者1)当与阴性(载体)对照相比时，特定测定终点的再现性浓度依赖性增加；和/或2)一个或多个测试浓度达到特定终点中超过对照的最小倍数增加。
阳性-阳性结果确定为由测定的特定终点所定义的遗传毒性危害(例如，体外微核阳性)。显示阳性反应的测试化合物满足测定的特定评价标准，该标准可包括以下之一或两者1)当与阴性(载体)对照相比时，特定测定终点的再现性浓度依赖性增加；和/或2)在特定终点中一个或多个测试浓度达到超过对照的最小倍数增加。
可疑-对于测试化合物已在一个或多个有效测定试验(即满足测定可接受标准)中被评价的情况下，保留可疑结果，但该结果不能显示由所建立的评价标准所定义的阴性或阳性结果。此结果可报告有弱阳性反应的存在，需要其他的重复测试或最终的逐例确认测试。
不确定-对于测试化合物已在无效测定试验(即，出于技术因素而不满足测定可接受标准，例如，阴性或阳性对照不能正确的反应)中被评价的情况下，保留不确定结果。推荐重复测试以建立有效测定试验结果。
根据方法7测试羧基哌啶化合物并得到可疑结果。
根据方法7测试先前在WO2004096810的实施例中所公开的化合物。相应的微核测定结果报告于表G中 表G 其他可用于评价测试化合物(例如，其中微核测定得到可疑结果)毒性的测定包括下面所述的方法8、方法9和方法10。
方法8体外人外周淋巴细胞中染色体结构异常 体外染色体结构异常测定可用于评价人外周淋巴细胞中在有或无哺乳动物代谢活化的情况下测试化合物诱导染色体结构及数目异常的能力。
浓度计算基于相应的部分因子1.000。将测试化合物溶解并稀释于DMSO中，DMSO将作为载体对照，其体积与用于递送测试化合物的体积相同(1％终浓度)。
将来自健康男性志愿者的肝素化人外周静脉血添加至培养基中，随后添加植物凝血素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)以刺激淋巴细胞的细胞分裂。在用测试化合物处理之前，将原代培养物孵育至少46小时。
采用以下阳性对照 表1.阳性对照
采用以下处理 表2.处理条件
选择以下剂量水平用于测定 表3.剂量水平
向各浓度和载体对照的细胞单一培养物给药。在收获前使细胞培养物暴露于0.1μg/mL
(Ciba，Switzerland)2小时。通过离心收获细胞，在低渗溶液中膨胀，然后固定在甲醇∶冰乙酸固定液中。将固定的细胞悬浮液滴加至显微镜载玻片上、干燥并用姬姆萨(Giemsa)染色。对于所测试药物的每个浓度，每一培养物制备至少2个载玻片。
通过评估染色体形态学及有丝分离抑制(有丝分裂指数)来测量细胞毒性。通过对于分裂中期细胞部分，每一条件下对1000个细胞评分，从而对所有处理条件确定有丝分裂指数。
选择用于染色体异常评分的最大浓度为在该剂量下预期有足够数目的可分析分裂中期细胞的最高剂量。如果可能，则所选的最高剂量应抑制有丝分裂指数约50％，但不超过减少70％。
在每一测试条件下选择至少一个浓度用于与共存载体和阳性对照一起分析。不以设盲方式分析载玻片。在研究负责人的判断下，在初始评估完成后可评估其他测试浓度以进一步阐明效果(即异常的增加或缺如)。
所选择用于分析的最高测试浓度应满足以下标准中之一(1)使有丝分裂指数与载体对照相比降低约50％；(2)显示不完全溶解的证据，或(3)等于5000μg/mL或10mM(无论哪一个较低)的最大浓度。如果可能，则评估来自每一培养物的100个可接受的二倍体中期细胞的染色体损伤。一个例外是数据收集期间异常细胞的频率明显增加(即在前50个可接受细胞中总计＞10个异常细胞)，在此情况下中止进一步分析。所选择用于分析的中期细胞必须完整(即具有46±2个染色体)，并具有最少量的重叠染色体。此外，染色体应表现为狭长，使得个别臂和着丝粒区可易于鉴别。根据记录的每个细胞的异常类型及数目，将每个中期细胞分类为正常或异常。对于异常细胞，记录载玻片的X及Y级游标坐标。结构染色体异常分类为染色单体断裂(Ct brk)、染色单体碎片(Ct Frg)、染色单体损害(包括交换、环、双中心粒和易位(R))、染色体断裂(CsBrk)、染色体碎片(Cs Frg)和多重断裂(M)。此外，将具有粉碎染色体(PV)的细胞收集在总异常计数中。记录含有缺口的细胞，但其不包括在总异常计数中。通过评估多倍体及核内复制细胞的数量，确定每个处理条件和共存载体对照的染色体数目异常。对(当可能时)1000个中期细胞/培养物评分，同时将为多倍体或核内复制的中期细胞数制表来获得多倍体指数。
与阴性对照的总异常细胞相比较，使用Fisher精确单尾检验(Fisher′s Exact 1-tailed test)对每一处理组的异常细胞总数作统计学分析5。p-值≤0.05被认为统计学显著。
若满足以下标准，则认为测定有效 1.当与共存载体对照相比时，阳性对照诱导具有染色体异常的细胞百分数在统计学上显著增加，且所诱发的频率与已发表或历史的数据相当。
2.载体对照培养物具有≤3％的具有异常的细胞或其比例被认为与已发表的或历史的数据相当。
3.在最高剂量水平下，观察到有丝分裂指数约50％的抑制。此要求并不适用于在最大可溶浓度或最高可容许剂量下没有明显细胞毒性的测试化合物。
方法9雄性SD/IGS大鼠的7天口服管饲毒性研究 可在大鼠模型中评估测试化合物的毒性。当通过口服管饲每日1次，连续7天向6至8周龄体重在175g-200g之间的Charles RiverSD/IGS雄性大鼠给药时，此研究测定了测试化合物的潜在毒性和其的全身暴露。此研究使用Xybion Path/Tox系统(Xybion Medical SystemsCorporation，Cedar Knolls，NJ)来进行。
将测试化合物以每千克体重10mL的体积通过管饲经口7天给药1次。将测试化合物给药至3组大鼠(n＝5)，用药量分别为30毫克/千克/天、100毫克/千克/天及500毫克/千克/天。对照组(n＝5)接受载体(在50mM磷酸盐缓冲液中的0.5％甲基纤维素(w/v)和0.1％聚山梨醇酯80(v/v))。使用口服途径，因为它是人的预期暴露途径。将适当量的测试化合物悬浮于50mM柠檬酸盐缓冲液中的0.5％甲基纤维素(w/v)和0.1％聚山梨醇酯80(v/v)中。给药悬浮液的pH维持在3和9之间。
在第一天给药后的1、3、8和24小时时，将每一动物连续放血。收集约24小时的尿液用于代谢分析。在预处理时段期间每日一次进行存活和垂死观察。每日给药后1-3小时观察临床征象。7天后通过放血使动物安乐死。将发现死亡的动物冷冻并在尽可能早的时间(在工作时间内)进行尸检。不从发现死亡的动物获取最终体重、血样及器官重量。被处死的濒死动物/未计划动物/计划动物立即进行尸检，并获取体重、血样和除尿液样品之外的所有临床病理样品。
将各种组织(肾上腺、股骨、脑、盲肠、结肠、十二指肠、附翠、心脏、回肠、空肠、肾、肝脏、胰腺、股二头肌骨胳肌、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、腰脊髓及肠系膜淋巴结)称重，快速冷冻染色并固定。肉眼检查后，将所收集的肉眼观察到异常的组织保留在福尔马林中。将所收集的肉眼观察到异常的所有组织处理并由病理学家进行显微镜检。将组织修整、包埋、切片并用苏木精和伊红染色，并在病理学家的判断下由病理学家进行显微镜检。制备骨髓涂片并用瑞氏染液(Wright’s stain)进行染色。为阐明个别动物组织变化的性质，根据病理学家的要求进行其他的组织收集、切片、染色和显微镜检。
将临床观察、体重、大体尸检观察和组织病理学结果直接输入至Xybion Path/Tox系统。
方法10BioLumAmes基因突变测定 沙门氏菌致突变试验(也称为Ames试验)可用来确定测试化合物的致突变性。此试验测量了暴露于测试化合物的细菌的突变速率。参见，例如，Ames，B.N.，Durston，W.E.，Yamasaki，E.和Lee，F.D.(1973)Carcinogens are mutagensa simple test system combining liverhomogenates for activation and bacteria for detection.Proc.Natl Acad.Sci.USA，70，2281-2285)。当一些致癌物质被酶促转化成能够与DNA共价结合的亲电子物种时，其被活化。在Ames试验中，从用苯巴比妥(PB)/5，6-苯并黄铜(BF)或Aroclor 1254预处理的大鼠肝脏制备S9(9000g上清液)馏分以诱导这种药物代谢酶活性。
BioLum Ames测定为标准细菌(Ames)基因突变测定的高通量筛选形式。为证明试验的有效性，需要有阴性(载体处理)和阳性(已知反应剂)对照来在已确立的有根据范围内发生反应。
阴性-阴性结果确定为由测定的特定终点所定义的无遗传毒性危害(例如，体外微核阴性)。显示阴性反应的测试化合物不满足测定的特定评价标准，该标准可包括以下之一或两者1)当与阴性(载体)对照相比时，特定测定终点的再现性浓度依赖性增加；和/或2)一个或多个测试浓度达到特定终点中超过对照的最小倍数增加。
阳性-阳性结果确定为由测定的特定终点所定义的遗传毒性危害(例如，体外微核阳性)。显示阳性反应的测试化合物满足测定的特定评价标准，该标准可包括以下之一或两者1)当与阴性(载体)对照相比时，特定测定终点的再现性浓度依赖性增加；和/或2)在特定终点中一个或多个测试浓度达到超过对照的最小倍数增加。
可疑-对于测试化合物已在一个或多个有效测定试验(即满足测定可接受标准)中被评价的情况下，保留可疑结果，但该结果不能显示由所建立的评价标准所定义的阴性或阳性结果。此结果可报告有弱阳性反应的存在，需要其他的重复测试或最终的逐例确认测试。
不确定-对于测试化合物已在无效测定试验(即，出于技术因素而不满足测定可接受标准，例如，阴性或阳性对照不能正确的反应)中被评价的情况下，保留不确定结果。推荐重复测试以建立有效测定试验结果。
P.药物代谢动力学/药效学研究 方法11静脉内和口服给药后雄性Sprague-Dawley大鼠中的单一剂量药物代谢动力学和口服生物利用度 可使用体内模型来评价测试化合物的单一剂量药物代谢动力学特性和绝对口服生物利用度。如下更为具体的描述，在交叉研究设计中，向Sprague-Dawley(SD)大鼠静脉内或口服给予测试化合物并测量所得药物代谢动力学特性和口服生物利用度。
向雄性大鼠(n＝2)通过管饲口服给予2.0mg/kg的悬浮液(蒸馏水中的0.5％甲基纤维素/0.1％Tween 80)形式的剂量。72小时冲洗时段后，向相同大鼠(n＝2)静脉内推注2.0mg/kg的溶液(70％PEG 400/20％0.05M柠檬酸盐缓冲液pH3/10％乙醇)形式的剂量。在每一途径给药后24小时内，对每只大鼠收集连续血样(用于血浆)。使用定量下限(LLOQ)为1.2(对于-534)ng/mL的LC/MS/MS法测定测试化合物的血浆浓度。使用无房室法(non-compartmental method)从血浆浓度-时间数据确定测试化合物的药物代谢动力学参数。
LC/MS/MS1)柱Hyperso；AQUASIL C-182.1×20mm，3.0μm；2)流动相具有0.1％甲酸的液态水，有机物乙腈；电离+ESI(API 4000)。MRMm/z 494.4→m/z 394.0(WO2004096810中的实施例261)，m/z509.44→m/z 409.80(WO2004096810的实施例263)，m/z 495.33→m/z 395.20(WO2004096810的实施例262)。检测限度为0.12ng/mL(WO2004096810的实施例261)、1.3ng/mL(WO2004096810的实施例263)和0.11ng/mL(WO2004096810的实施例262)。
Watson(6.4.0.04版)用于计算平均测试化合物浓度、相应的标准差(SD)、和变异系数百分数(％CV)，并评估药物代谢动力学参数(由无房室法推算)和相关的(如果适用的话)相关统计学(均数、SD和eV％)。(由于n＝2，因此未计算SD或eV？)。定量限度以下(BLQ)的浓度报告为零(0)，并用于评价平均浓度和估计AUC。峰值血浆浓度(Cmax)和达到峰值浓度的时间(tmax)直接从个别的血浆浓度-时间曲线进行记录。通过数据点的线性回归鉴别血浆浓度-时间曲线的终末对数-线性期。终末半衰期(t1/2)计算为ln(2)除以终末对数-线性期的斜率的绝对值。使用线性梯形法确定从零时刻至最后一个可定量浓度的时刻(t)的血浆浓度-时间曲线下面积[AUC(0-t)]。从零时刻至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积[AUC(0-∞)]确定为[AUC(0-t)]加推知面积。推知面积通过最后观察到的血浆浓度除以终末对数-线性期的斜率来确定。全身血浆清除率(CL)计算为剂量/AUC(0-∞)，而稳态分布容积(Vdss)计算为CL×MRT，其中MRT(平均滞留时间)定义为AUMC(0-∞)/AUC(0-∞)。绝对PO生物利用度(F)计算为PO给药后个体动物的剂量标准化AUC(0-∞)与由交叉研究涉及所指定的IV给药后个体动物的剂量标准化AUC(0-∞)的比例。峰值血浆浓度(Cmax)、达到峰值浓度的时间(tmax)、终末半衰期(t1/2)、从零时刻至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积[AUC(0-∞)]、稳态分布容积(Vdss)、全身血浆清除率(CL)和绝对PO生物利用度(F)显示在表C中。
根据方法11测试羧基哌啶化合物，结果报告在表H中。根据方法11测试先前在WO2004096810的实施例中所公开的化合物。这些化合物的结果报告在表H中。
Q.生物学试验方案-与血管紧张素转化酶抑制剂共同给药 方法12SHR大鼠联合治疗 进行研究以评价重复口服给予羧基哌啶化合物对降低血压的作用，以及评价羧基哌啶化合物与血管紧张素转化酶抑制剂依那普利的共同给药是否能进一步使血压降低。该研究由以下方案组成用羧基哌啶化合物(1mg/kg每天口服一次)和依那普利(在饮用水中0.007％)单独和联合治疗如方法F中所述的被遥测的自发性高血压大鼠(SHR)7天(图1)(n＝12/组)。与载体处理组相比，羧基哌啶化合物在第一天将血压从前剂量(pre-dose)基线值降低了11±1mmHg。血压的降低维持了7天的时间，在第7天仍保持在前剂量基线之下9±1mmHg。
与载体处理组相比较，依那普利在第7天将血压从前剂量基线值降低了最大的降低值22±2mmHg。在所有天数内羧基哌啶化合物加依那普利的组合降低的血压大于每一药剂单独使用所降低的血压。
在第9天评价24小时时段内尿液cGMP机制的生物标记物的变化。与载体处理组相比，在0-24小时尿收集物中在羧基哌啶化合物和羧基哌啶化合物+依那普利组合组中cGMP均是升高的(图2)(n＝12/组)。
本申请中所提到的所有文献均如同全部详尽地阐述那样明确地引入本文作为参考文献。当提到本发明的要素或其优选实施方案时，冠词“一”、“该”和“所述”是指存在有一个或多个要素。术语“包括”、“包含”和“具有”是包括在内的，并可以存在有所列要素之外的其他要素。
序列表
<110>辉瑞产品有限公司(Pfizer Products Inc.)
<120>用作PDE5抑制剂的吡唑并[4，3，-D]嘧啶-5-基)衍生物
<130>CPUSS80598
<140>PCT/IB2006/003132
<141>2006-10-31
<150>60/735320
<151>2005-11-10
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1518
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>1
atggactaca aggacgacga cgacaaggga tcccggtccg agatgtcccc aaagtgcagt 60
tgatgctg agaacagttt caaagaaagc atggagaaat catcatactc cgactggcta120
ataaataaca gcattgctga gctggttgct tcaacaggcc ttccagtgaa catcagtgat 180
gcctaccagg atccgcgctt tgatgcagag gcagaccaga tatctggttt tcacataaga 240
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attcattttg atgacttttc tctcgacgtt gatgccatga tcacagctgc tctccggatg 600
ttcatggagc tggggatggt acagaaattt aaaattgact atgagacact gtgtaggtgg 660
cttttgacag tgaggaaaaa ctatcggatg gttctatacc acaactggag acatgccttc 720
aacgtgtgtc agctgatgtt cgcgatgtta accactgctg ggtttcaaga cattctgacc 780
gaggtggaaa ttttagcggt gattgtggga tgcctgtgtc atgacctcga ccacagggga 840
ccaacaatg ccttccaagc taagagtggc tctgccctgg cccaactcta tggaacctct 900
gctaccttgg agcatcacca tttcaaccac gccgtgatga tccttcaaag tgagggtcac 960
aatatctttg ctaacctgtc ctccaaggaa tatagtgacc ttatgcagct tttgaagcag 1020
tcaatattgg caacagacct cacgctgtac tttgagagga gaactgaatt ctttgaactt 1080
gtcagtaaag gagaatacga ttggaacatc aaaaaccatc gtgatatatt tcgatcaatg 1140
ttaatgacag cctgtgacct tggagccgtg accaaaccgt gggagatctc cagacaggtg 1200
gcagaacttg taaccagtga gttcttcgaa caaggagatc gggagagatt agagctcaaa 1260
ctcactcctt cagcaatttt tgatcggaac cggaaggatg aactgcctcg gttgcaactg 1320
gagtggattg atagcatctg catgcctttg tatcaggcac tggtgaaggt caacgtgaaa 1380
ctgaagccga tgctagattc agtagctaca aacagaagta agtgggaaga gctacaccaa 1440
aaacgactgc tggcctcaac tgcctcatcc tcctcccctg ccagtgttat ggtagccaag 1500
gaagacagga actaataa 1518
权利要求
1.一种具有下列结构的化合物和所述化合物的药学上可接受的盐
2.根据权利要求1所述的化合物，其是游离酸。
3.根据权利要求1所述的化合物的药学上可接受的盐。
4.一种药物组合物，其包括具有下列结构的化合物或所述化合物的药学上可接受的盐
和
药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其包括所述化合物的游离酸。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其包括所述化合物的药学上可接受的盐。
7.根据权利要求4所述的药物组合物，其进一步包括血管紧张素转化酶抑制剂。
8.根据权利要求4所述的药物组合物，其进一步包括血管紧张素II受体拮抗剂。
9.一种治疗受试者病症的方法，所述方法包括给予受试者以治疗有效量的具有下列结构的化合物或其药学上可接受的盐
其中所述病症选自心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、肺病、性功能障碍、疼痛及肾功能不全。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的病症是心血管疾病。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的心血管疾病是高血压。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述的心血管疾病是心脏衰竭。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述的心血管疾病是心绞痛。
14.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括给予受试者以治疗有效量的血管紧张素转化酶抑制剂。
15.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括给予受试者以治疗有效量的血管紧张素II受体拮抗剂。
16.具有下列结构的化合物或其药学上可接受的盐
在制备用于治疗病症的药物中的应用，所述病症选自心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、肺病、性功能障碍、疼痛及肾功能不全。
17.根据权利要求16所述的应用，其中所述的病症是心血管疾病。
18.根据权利要求17所述的应用，其中所述的心血管疾病是高血压。
19.根据权利要求17所述的应用，其中所述的心血管疾病是心脏衰竭。
20.根据权利要求18所述的应用，其中所述的心血管疾病是心绞痛。
21.一种制备具有下列结构的第一化合物的方法
所述方法包括将具有下列结构的第二化合物
与异哌啶甲酸接触以提供第一化合物。
全文摘要
本发明包括(I)1-(1-(2-乙氧基乙基-3-乙基-7-(4-甲基吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑并[4，3，-d]嘧啶-5-基)哌啶-4-羧酸及其盐。本发明进一步包含关于式(I)的药物组合物、治疗方法和合成方法。式(I)用来抑制PDE5酶。
文档编号A61P25/00GK101305007SQ200680041698
公开日2008年11月12日 申请日期2006年10月31日 优先权日2005年11月10日
发明者M·B·托尔夫森 申请人:辉瑞产品有限公司