专利名称：一种乌贼墨多糖硫酸化衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种新的乌贼墨多糖(又称糖胺聚糖)硫酸化衍生物及其制备方法。
背景技术：
从曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni de Rochebrune)墨中提取得到的乌贼墨多糖是一种全新结构的多糖，具有免疫调节、抗突变活性，与抗肿瘤药物合用可提高抗肿瘤药物的作用。对多糖进行结构修饰常常会增加其生物活性或者使其产生新的活性。多糖的硫酸化是一种常用的化学修饰方法，研究表明硫酸化多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抑制血管生成等生物活性。但是，经检索，未见对乌贼墨多糖进行硫酸化结构修饰的研究论文及专利报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于采用硫酸化方法对乌贼墨多糖进行修饰，提供一种具有抗肿瘤活性的新的多糖硫酸化衍生物及其制备方法。
本发明所述的乌贼墨多糖硫酸化衍生物，由乌贼墨多糖糖链上的自由羟基连接硫酸基团构成，其特征在于所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物中硫酸基的含量以重量百分比计为7％～36％；所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的取代度Ds为0.14～0.96；所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的分子量范围是3000D～45000D；其中所述乌贼墨多糖的重均分子量范围是3000D～35000D。
上述的乌贼墨多糖硫酸化衍生物优选形式是所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物中硫酸基的含量以重量百分比计为17％～30％；所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的取代度Ds为0.40～0.76；所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的分子量范围是5000D～35000D；其中所述乌贼墨多糖的重均分子量范围是4000D～30000D。
本发明所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的制备方法，由以下步骤组成(1)乌贼墨多糖的硫酸化称取乌贼墨多糖纯品，用其2～10倍重量的无水甲酰胺溶解，待用；以体积比为1∶2的比例计，将氯磺酸逐滴加入甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；将混合液逐滴加入乌贼墨多糖溶液中，于25℃～30℃下搅拌反应2～10小时，反应液取出后，立即加入2～6倍体积量无水乙醇终止反应，4℃放置过夜，过滤或离心收集沉淀；将沉淀配成5％～20％水溶液，调pH至中性，加入2～4倍体积量无水乙醇沉淀；将沉淀配成5％～20％水溶液，用碳酸氢钠溶液调pH为8～10，60℃～85℃水浴加热除氨至几无氨味，冷却，微孔滤膜过滤，得滤液；上述滤液用酸调pH至6.5，加入2～6倍体积量的无水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得乌贼墨多糖硫酸化产物；(2)乌贼墨多糖硫酸化产物的纯化将上述干燥后产物用蒸馏水溶解并对用蒸馏水透析1～3天，所用透析袋的分子量截留值为2000；对透析内液进行冷冻干燥，得到乌贼墨多糖硫酸化衍生物产品。
上述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的制备方法，优选由以下步骤组成(1)乌贼墨多糖的硫酸化称取乌贼墨多糖纯品，用其4～7倍重量的无水甲酰胺溶解，待用；以体积比为1∶2的比例计，将氯磺酸逐滴加入甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；将混合液逐滴加入乌贼墨多糖溶液中，于25℃～30℃下搅拌反应5～10小时，反应液取出后，立即加入3～5倍体积量无水乙醇终止反应，4℃放置过夜，过滤或离心收集沉淀；将沉淀配成8％～15％水溶液，调pH至中性，加入2～4倍体积量无水乙醇沉淀；将沉淀配成8％～15％水溶液，用碳酸氢钠溶液调pH为8～10，65℃～75℃水浴加热除氨至几无氨味，冷却，微孔滤膜过滤，得滤液；上述滤液用酸调pH至6.5，加入3～5倍体积量的无水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得乌贼墨多糖硫酸化产物；(2)乌贼墨多糖硫酸化产物的纯化将上述干燥后产物用蒸馏水溶解并对蒸馏水透析2～3天，所用透析袋的分子量截留值为2000；对透析内液进行冷冻干燥，得到乌贼墨多糖硫酸化衍生物产品。
本发明所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的制备方法，步骤简便、成本低廉、产率高且产品纯；本发明制得的乌贼墨多糖硫酸化衍生物经实验验证，具有一定的抗肿瘤活性和抑制新生血管生成活性。
具体实施例方式
实施例1乌贼墨多糖硫酸化衍生物的制备。
(1)乌贼墨多糖的硫酸化称取乌贼墨多糖0.5g，用无水甲酰胺3ml溶解。
将氯磺酸0.75ml逐滴加入甲酰胺1.5ml中，制得混合溶液。
将混合液逐滴加入乌贼墨多糖溶液中，于25～30℃下搅拌反应6小时，反应液取出后，立即加入3倍体积量无水乙醇终止反应，离心收集沉淀。
将沉淀配成10％溶液，调pH至中性，加入3倍体积量无水乙醇沉淀。
将沉淀配成10％溶液，加入0.5％的亚硫酸氢钠，用碳酸氢钠溶液调pH为9.5，65℃水浴加热除氨至几无氨味，冷却，微孔滤膜过滤。
上述溶液用盐酸调pH至6.5，加入3倍体积量的无水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得乌贼墨多糖硫酸化产物。
(2)乌贼墨多糖硫酸化产物的纯化将上述干燥后产物用适量水溶解，对蒸馏水透析3天，所用透析袋的分子量截留值为2000。
对透析内液进行冷冻干燥，得到乌贼墨多糖硫酸化衍生物产品。
实施例2乌贼墨多糖硫酸化衍生物的制备方法，由以下步骤组成(1)乌贼墨多糖的硫酸化称取乌贼墨多糖纯品15g，用其5倍重量的无水甲酰胺溶解，待用；以体积比为1∶2的比例计，将氯磺酸逐滴加入甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；将混合液逐滴加入乌贼墨多糖溶液中，于28℃下搅拌反应5小时，反应液取出后，立即加入4倍体积量无水乙醇终止反应，4℃放置过夜，过滤或离心收集沉淀；将沉淀配成8％水溶液，调pH至中性，加入3倍体积量无水乙醇沉淀；将沉淀配成8％水溶液，用碳酸氢钠溶液调pH为8.5，75℃水浴加热除氨至几无氨味，冷却，微孔滤膜过滤，得滤液；上述滤液用盐酸调pH至6.5，加入3倍体积量的无水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得乌贼墨多糖硫酸化产物；(2)乌贼墨多糖硫酸化产物的纯化将上述干燥后产物用蒸馏水溶解并对蒸馏水透析2天，所用透析袋的分子量截留值为2000；对透析内液进行冷冻干燥，得到乌贼墨多糖硫酸化衍生物产品。
实施例3乌贼墨多糖硫酸化衍生物的制备方法，由以下步骤组成(1)乌贼墨多糖的硫酸化称取乌贼墨多糖纯品50g，用其10倍重量的无水甲酰胺溶解，待用；以体积比为1∶2的比例计，将氯磺酸75ml逐滴加入150ml甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；将混合液逐滴加入乌贼墨多糖溶液中，于30℃下搅拌反应10小时，反应液取出后，立即加入5倍体积量无水乙醇终止反应，4℃放置过夜，过滤或离心收集沉淀；将沉淀配成15％水溶液，调pH至中性，加入4倍体积量无水乙醇沉淀；将沉淀配成15％水溶液，用碳酸氢钠溶液调pH为10，85℃水浴加热除氨至几无氨味，冷却，微孔滤膜过滤，得滤液；上述滤液用酸调pH至6.5，加入6倍体积量的无水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得乌贼墨多糖硫酸化产物；(2)乌贼墨多糖硫酸化产物的纯化将上述干燥后产物对蒸馏水溶解并用蒸馏水透析3天，所用透析袋的分子量截留值为2000；对透析内液进行冷冻干燥，得到乌贼墨多糖硫酸化衍生物产品。
权利要求
1.一种乌贼墨多糖硫酸化衍生物，由乌贼墨多糖糖链上的自由羟基连接硫酸基团构成，其特征在于所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物中硫酸基的含量以重量百分比计为7％～36％；所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的取代度Ds为0.14～0.96；所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的分子量范围是3000D～45000D；其中所述乌贼墨多糖的重均分子量范围是3000D～35000D。
2.如权利要求1所述的乌贼墨多糖硫酸化衍生物，其特征在于所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物中硫酸基的含量以重量百分比计为17％～30％；所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的取代度Ds为0.40～0.76；所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的分子量范围是5000D～35000D；其中所述乌贼墨多糖的重均分子量范围是4000D～30000D。
3.权利要求1或2所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的制备方法，由以下步骤组成(1)乌贼墨多糖的硫酸化称取乌贼墨多糖纯品，用其2～10倍重量的无水甲酰胺溶解，待用；以体积比为1∶2的比例计，将氯磺酸逐滴加入甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；将混合液逐滴加入乌贼墨多糖溶液中，于25℃～30℃下搅拌反应2～10小时，反应液取出后，立即加入2～6倍体积量无水乙醇终止反应，4℃放置过夜，过滤或离心收集沉淀；将沉淀配成5％～20％水溶液，调pH至中性，加入2～4倍体积量无水乙醇沉淀；将沉淀配成5％～20％水溶液，用碳酸氢钠溶液调pH为8～10，60℃～85℃水浴加热除氨至几无氨味，冷却，微孔滤膜过滤，得滤液；上述滤液用酸调pH至6.5，加入2～6倍体积量的无水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得乌贼墨多糖硫酸化产物；(2)乌贼墨多糖硫酸化产物的纯化将上述干燥后产物用蒸馏水溶解并对蒸馏水透析1～3天，所用透析袋的分子量截留值为2000；对透析内液进行冷冻干燥，得到乌贼墨多糖硫酸化衍生物产品。
4.如权利要求3所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的制备方法，由以下步骤组成(1)乌贼墨多糖的硫酸化称取乌贼墨多糖纯品，用其4～7倍重量的无水甲酰胺溶解，待用；以体积比为1∶2的比例计，将氯磺酸逐滴加入甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；将混合液逐滴加入乌贼墨多糖溶液中，于25℃～30℃下搅拌反应5～10小时，反应液取出后，立即加入3～5倍体积量无水乙醇终止反应，4℃放置过夜，过滤或离心收集沉淀；将沉淀配成8％～15％水溶液，调pH至中性，加入2～4倍体积量无水乙醇沉淀；将沉淀配成8％～15％水溶液，用碳酸氢钠溶液调pH为8～10，65℃～75℃水浴加热除氨至几无氨味，冷却，微孔滤膜过滤，得滤液；上述滤液用酸调pH至6.5，加入3～5倍体积量的无水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得乌贼墨多糖硫酸化产物；(2)乌贼墨多糖硫酸化产物的纯化将上述干燥后产物用蒸馏水溶解并对蒸馏水透析2～3天，所用透析袋的分子量截留值为2000；对透析内液进行冷冻干燥，得到乌贼墨多糖硫酸化衍生物产品。
全文摘要
本发明公开了一种乌贼墨多糖硫酸化衍生物，所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物由乌贼墨多糖糖链上的自由羟基连接硫酸基团构成；其中所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物中硫酸基的含量以重量百分比计为7％～36％；所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的取代度Ds为0.14～0.96；所述乌贼墨多糖硫酸化衍生物的分子量范围是3000D～45000D。本发明还公开了乌贼墨多糖硫酸化衍生物的制备方法，具有步骤简便、成本低廉、产率高且产品纯的特点；本发明制得的乌贼墨多糖硫酸化衍生物经实验验证，具有一定的抗肿瘤活性和抑制新生血管生成的活性。
文档编号A61K31/737GK101077891SQ20071001660
公开日2007年11月28日 申请日期2007年6月26日 优先权日2007年6月26日
发明者王凤山, 李玉华, 刘纯慧, 曹吉超, 刘玉红 申请人:山东大学