抗猪生殖和呼吸疾病的多核苷酸疫苗制剂的制作方法

专利名称：抗猪生殖和呼吸疾病的多核苷酸疫苗制剂的制作方法
抗猪生殖和呼吸疾病的多核苷酸疫苗制剂本申请是申请号为97196558. 7、申请日1997年7月15日、发明 名称为"抗猪生殖和呼吸疾病的多核苷酸疫苗制剂"的申请的分案申请。本发明涉及可特别地接种猪以抗生殖和呼吸疾病的疫苗制剂，还涉 及相应的接种方法。在过去几十年里，生产猪的方法发生了根本性的变化。在被包围的 空间内集中繁殖已被推广，但其必然后果是呼吸疾病也随之迅速发展。猪呼吸病理学的症状范围一般被归纳为复杂的猪呼吸疾病名称，并 涉及多种致病因子，其中包括病毒以及细菌和支原体。参与呼吸疾病的主要因子是大叶性肺炎放线杆菌 (Actino-baci 1 lus pleuropneumoniae)， 不育和呼吸综合征病毒 (PRRS)，也被称为神秘病病毒，Aujeszkey病病毒(PRV)和猪流感病毒。其它病毒导致生殖疾病，所述疾病导致流产，胎儿干瘪和不育。主 要病毒是PRRS，细小病毒和典型猪瘋病毒(HCV)。其次，猪流感病毒PRV 和大叶性肺炎放线杆菌也可导致这种疾病。大叶性肺炎放线杆菌、HCV 和PRV可导致死亡。另外，微生物之间的相互关系在猪呼吸综合征中非常重要。实际上， 大多数细菌病原体是鼻咽区和幼小动物扁桃体的习惯性宿主。来自大母 猪的这些病原体经常被出生仅几个小时、初乳免疫力尚未起效之前的小 猪吸入。当宿主的呼吸防御机制被诸如大叶性肺炎放线杆菌的前体因子 或病毒损坏时，在上呼吸道中生存的生物体可入侵下呼吸道。对肺的入 侵非常快，尤其是在诸如大叶性肺炎放线杆菌的前体病原体的情况下更 是如此，所述病原体可产生强有力的细胞毒素，该毒素能损害呼吸道上 皮细胞的纤毛和肺泡巨噬细胞。除了具有呼吸道趋向性的细菌和支原体外，主要的病毒感染，如流 感病毒，呼吸道冠状病毒和Aujeszkey病病毒的感染对呼吸道综合征的 致病性可能也起到了 一定的作用。最后， 一些因子既有呼吸效应也有生殖效应。从生殖病理学的角度
看，也会出现相互作用.因此，似乎需要试着开展针对猪生殖和呼吸疾病的主要致病因子的 有效防治作用.迄今为止发展起来的方法是用灭活疫苗或活疫苗，及可能为这种疫 苗的混合物。它们的发展提出了效价和稳定性之间相容性的问题。实际 上不论是从所用的不同抗原的角度，还是从制剂本身的角度，尤其是在 联合使用灭活疫苗和活疫苗的情况下，都必需确保不同疫苗效价之间的相容性。另外还存在的问题是这种联合疫苗的保存及其安全性，尤其 是存在佐剂时的安全性。这些疫苗一般十分昂贵。专利申请WO-A誦卯11092 ， WO-A-92 19183 ， WO-A-94 21797 和WO-A-95 20660利用了最近兴起的多核苷酸疫苗技术。已知这些疫 苗使用了质粒，所述质粒能在宿主细胞中表达插入其中的抗原。已提出 所有的施用途径(腹膜内，静脉内，肌内，经皮，皮内，轱膜等等)。也 可以使用不同的接种方式，如将DNA沉积在金粒表面并投射之以穿入 动物皮肤(Tang等，自然(Nature), 356, 152-154， 1992)，可以 同时转染皮肤，肌肉，脂肪组织和乳房组织的液体喷射注射器(Furth 等，分析生物化学(Analytical Biochemistry ) ， 205， 365-368, 1992)。多核苷酸疫苗也可以使用棵DNA和经配制的DNA，如阳离子脂 质脂质体内的DNA。M-F Le Potier等人(第二届消灭Aujeszkey病(假狂犬病)病毒国际研讨 会论文集，1995年8月6日至8日，哥本哈根，丹麦)和M. Monteil 等人(Les Journees (T Animation Scientifique du Departement de Pathologie Animale[动物病理学部门组织的科学会议，INRA-ENV, Ecole Nationale Veterinaire de LYON (里昂国家畜医学校)，13-14 , 1994年12月13 - 14日)借助于可在强启动子，即2型腺病毒主要晚期 启动子的控制下表达gD基因的质粒，试着接种了猪以抗Aujeszkey病 病毒。尽管抗体反应水平良好，但未显示保护作用.不过，用其中插入 了 gD基因和相同启动子的重组腺病毒接种猪之后，记录了有关保护作
用的令人满意的结果，证明gD糖蛋白应足以在猪中诱导保护作用。现有技术中通过多核苷酸接种方法在猪中未获得保护性结果.因此，本发明打算提供多价的疫苗制剂，所迷制剂可以确保接种猪 能抵抗特别是涉及呼吸疾病和/或生殖疾病的多种致病因子，本发明的另 一 目的是提供包含有不同效价并满足彼此相容性和效 价稳定性所需的所有标准的疫苗制剂。本发明的另一目的是提供可以在相同栽体中含有不同效价的疫苗 制剂。本发明的另一目的是提供使用简单且便宜的疫苗制剂。本发明的另一目的是提供这样一种疫苗制剂和接种猪的方法，所述 疫苗和接种可以得到高效、长期以及安全性良好又不留后患的保护作 用，包括多价保护作用。因此，本发明的目的是特别地针对猪生殖和/或呼吸疾病的疫苗制 剂，所述制剂含有至少3种效价的多核苷酸疫苗，每种含有一个整合质 粒，其可在宿主细胞中体内表达一种猪病原体效价的基因，这些效价逸 自Aujeszkey病病毒(PRV或假狂犬病病毒)，猪流感病毒(SIV)，猪神 秘病病毒(PRRS病毒)，细小病毒病病毒(PPV病毒)，典型猪痘病毒 (HCV病毒)和引起放线杆菌病的细菌(大叶性肺炎放线杆菌)，对于每种 效价而言，质粒含有一种或多种基因，该基因对于Aujeszkey病病毒选 自gB和gD，对于猪流感病毒选自HA、 NP和N，对于PRRS病毒 选自ORF5(E), ORF3, ORF6(M)，对于细小病毒病病毒选自VP2 , 对于典型猪痘病毒选自El、 E2,对于大叶性肺炎放线杆菌选自apxl、 apxll和apxIII 。本发明中的效价应理解成至少一种可提供抗所研究病原体病毒的 保护作用的抗原，效价可含有得自 一抹或多抹所研究病原体的一个或多 个经修饰的天然基因作为亚效价。病原性因子的基因应理解成不仅指完整的基因，也指不同的多种核 苷酸序列，包括保持了诱导保护性反应之能力的片段。基因的概念覆盖 了等价于实施例中详细描述的序列的核苷酸序列，也就是说，有所不同
但编码相同蛋白质的序列.此概念也覆盖了被研究的其它抹病原体的核 苷酸序列，它可以提供交叉保护作用或特异于抹或抹群的保护作用.此 概念也覆盖了已被修饰以便于由宿主动物在体内表达，但编码相同蛋白 质的核苷酸序列.优选本发明的疫苗制剂含有Aujeszkey和猪流感效价，在其中可加 入优选选自PRRS和大叶性肺炎放线杆菌(放线杆菌病)效价的其它效 价，任选在其中进入选自细小病毒病和典型猪瘟效价的其它效价，当然，效价的所有联合都是可以的，然而，在本发明的范围内， Aujeszkey和猪流感，接下来是PRRS和大叶性肺炎放线杆菌的效价被 认为是优选的。从更特异地针对猪呼吸疾病的接种角度看，优选效价选自 Aujeszkey 、猪流感、PRRS和放线杆菌病。从特异地针对猪生殖疾病的接种角度看，优选效价选自PRRS、细 小病毒病、典型猪瘟和Aujeszkey病。至于Aujeszkey效价，可使用gB或gD基因，优选使用这两种基 因，此时所述基因位于不同质粒或一个相同质粒上。至于猪流感效价，优选使用HA和NP基因，可以使用这两个基因 中的一个，也可以同时使用这两个基因，此时所述基因位于不同质粒或 一个相同质粒上。优选在同一疫苗中联合得自一种以上流感病毒抹，尤 其是得自在自然界发现的不同抹的HA序列。另一方面，NP提供了交 叉保护作用，因此得自单个病毒抹的序列能令人满意。至于PRSS效价，优选使用E和ORF3或M基因，可以单独或联 合使用这些基因；联合使用时，基因可位于分离的质粒上，或位于联合 有2或3个这种基因的质粒中。得自至少两抹，尤其是得自欧洲抹和美 洲抹的基因利于在同一疫苗中联合。至于典型猪瘟效价，可使用E1和E2基因中的任一种或E1和E2 基因，后情形下它们可在两个不同质粒或任选在一个相同质粒中联合。至于放线杆菌病效价，可使用上述3种基因中的一个或位于不同质 粒或混合质粒上的这些基因中2个或3个基因的联合以提供针对不同血
清型大叶性肺炎放线杆菌的保护作用.对于apxl， II和III而言，可 以设想修饰编码序列以得到解毒的抗原，具体方法见实施例.
特別对于经肌内途径接种而言，本发明疫苗制剂一般以0.1-lOml, 特别是l-5ml的剂量体积形式提供.
剂量一般为每种质粒类型10ng-lmg，优选为100ng-5(Hig ，优选 为lpg-!250ng 。
优选使用筒单地置于接种载体， 一般为生理盐水(0.9 % NaCl),超 纯水，TE緩冲液等中的棵质粒。当然也可以使用现有技术中已描述的 任何多核苷酸疫苗形式。
每个质粒都含有启动子，在其控制下可确保插入基因在宿主细胞中 的表达。所述启动子一般是强的真核生物启动子，尤其是来源于人或 鼠，或任选来源于其它动物如大鼠、猪和豚鼠的巨细胞病毒早期 CMV-IE启动子。启动子更一般地讲是来源于病毒或细胞。至于病毒启动子，可提到 SV40病毒早期或晚期启动子或Rous肉瘤病毒LTR启动子。也可以是 基因来源病毒的启动子，例如基因自身的启动子。
至于细胞启动子，可提到细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动 子(Bolmont等，亚显微镜细胞学和病理学(Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology ) ， 1990， 22, 117-122;和Zhenlin等， 基因(Gene ) ， 1989， 78, 243-254)或者肌动蛋白启动子。
当相同质粒中存在几个基因时，它们会存在于相同的转录单位或两 个不同的单位中。
优选通过混合表达各种效价之抗原的多核苷酸质粒来达到本发明 不同疫苗效价的联合，但也可以设想使几种效价的抗原由相同质粒表 达。
本发明的目的还在于单价疫苗制剂，所述制剂含有一个或多个编码 得自选自PRV， PRRS, PPV， HCV的病毒之一和大叶性肺炎放线 杆菌的一个或多个基因的质粒，所述基因为上述的那些。除了它们的单 价特征外，这些制剂可具有上述有关基因选择，基因联合，质粒组成，
剂量体积，剂量等方面的特征.单价疫苗制剂也可用于(i)制备上迷的多价疫苗制剂，(ii)各对抗自 己的疾病，(iii)与针对另一种疾病的另一类型(活的或灭活的完整的，重 组的，亚单位)的疫苗联合，或(iv)按下述作为疫苗的加强剂.实际上本发明另 一个目的是使用一种或多种本发明的质粒以制备 用于接种猪的疫苗，该猪首先已用第一种已知类型的常规疫苗接种，所 述第一种疫苗特别选自活的完整疫苗，灭活的完整疫苗，亚单位疫苗和 重组疫苗，所述第一种疫苗(单价或多价)具有(也就是说含有或能表达) 由所迷质粒编码的抗原或提供交叉保护作用的抗原。值得注意的是，该 多核苷酸疫苗具有强有力的加强效果，可导致免疫应答的增强并可获得 长期的免疫力。一般讲，第一接种疫苗可选自可从不同的兽用疫苗生产商处购得的 疫苗.本发明的另一目的是接种试剂盒，所述试剂盒将上述第一接种疫苗 和用于加强免疫的本发明的疫苗制剂组配在一起。本发明还涉及附带有 说明书的本发明疫苗制剂，所述说明书指明该制剂可作为上述第 一 次接 种的加强剂来使用。本发明的另 一 目的是接种猪以抵抗猪生殖疾病和/或呼吸疾病的方 法，所述方法包括施用有效量的上述疫苗制剂。此接种方法包括施用一 剂或更多剂疫苗制剂，这些剂量可以在短时间内连续施用和/或以较长 的间隔期连续施用。在这种接种方法中，通过现有技术中建议的用于多核苷酸接种的不 同施用途径并利用已知的施用技术施用本发明的疫苗制剂。特别可借助 于液体注射器经液体喷射优选多个液体喷射经由皮内途径进行接种，尤 其是使用具有几个孔或喷嘴，特别是具有5或6个孔或喷嘴的注射头的 注射器，如法国里昂Endoscoptic公司制造并销售的Pigjet装置。对于这种装置而言，优选剂量体积降低为0.1-0.9ml，特別是0.2-0.6ml ，更优选为0.4-0.5ml,可以1次或几次，优选为2次施用该剂 量体积。
本发明的另一目的是一种接种方法，所述方法包括按上述进行第一 次接种，并用本发明的疫苗制剂加强接种.在本发明方法的优选实施方 案中，首先给动物施用有效剂量的常规疫苗，尤其是灭活的、活的、减 毒的或重组的、或亚单位的疫苗以提供第一次接种， 一段时间后，优选为2至6周后，施用本发明的多价或单价疫苗。本发明也涉及一种制备疫苗制剂的方法，即制备不同效价及其混合 物的方法，如从此说明书中看到的方法。下面参照附图，借助于本发明的实施方案更详细地描述本发明。


图l:质粒pVR1012图2:PRV gB基因的序列(NIA3抹)图3:质粒pAB090的构建图4:PRV gD基因的序列(NIA3抹)图5:质粒pPB098的构建图6:猪流感HA基因的序列(H1N1抹)图7:质粒pPB143的构建图8:猪流感NP基因的序列(H1N1抹)图9:质粒pPB42的构建图10:猪流感HA基因的序列(H3N2抹)图11:质粒pPB144的构建图12:猪流感NP基因的序列(H3N2抹)图13:质粒pPB132的构建图14:质粒pAB025图15:质粒pABOOl图16:质粒pAB091图17:质粒pAB092图18:质粒pAB004图19:质粒pAB069
图20:质粒pAB061图21:质粒pPB162图22:质粒pPB163图23:质粒pPB174，图24:质粒pPB189图25'质粒pPB190序列表SEQ ID NO:SEQ ID NO:l : PRV gB基因的序列(NIA3株) SEQIDNO:2:寡核苷酸AB166 SEQIDNO:3:寡核苷酸AB167 SEQIDNO:4:寡核苷酸AB168 SEQIDNO:5:寡核苷酸AB169 SEQ ID NO:6 : PRV gD基因的序列(NIA3抹) SEQIDNO:7:寡核苷酸PB101 SEQIDNO:8:寡核苷酸PB102 SEQIDNO:9:寡核苷酸PB107 SEQIDNO:10:寡核苷酸PB108 SEQIDNO:ll:猪流感HA基因的序列(H1N1抹) SEQIDNO:12:寡核苷酸PB097 SEQIDNO:13:寡核苷酸PB098 SEQIDNO:14:猪流感NP基因的序列(H1N1抹) SEQIDNO:15:寡核普酸PB095 SEQIDNO:16:寡核苷酸PB096 SEQ ID NO:17 :猪流感HA基因的序列(H3N2抹) SEQIDNO:18:猪流感NP基因的序列(H3N2抹) SEQIDNO:19:寡核苷酸AB055 SEQIDNO:20:寡核苷酸AB056 SEQIDNO:21:寡核苷酸AB001SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23 SE(J ID NO:24 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46 SE(J ID NO:47 SEQ ID NO:48实施例寡核苷酸AB002 寡核苷酸AB170 寡核苷酸AB171 寡核苷酸AB172 寡核苷酸AB173 寡核苷酸AB007 寡核苷酸ABOIO 寡核苷酸AB126 寡核苷酸AB127 寡核普酸AB118 寡核苷酸AB119 寡核苷酸PB174 寡核普酸PB189 寡核苷酸PB1卯 寡核苷酸PB175 寡核苷酸PB176 寡核苷酸PB191 寡核苷酸PB192 寡核苷酸PB177 寡核苷酸PB278 寡核苷酸PB279 寡核香酸PB280 寡核苷酸PB307 寡核苷酸PB303 寡核苷酸PB306 寡核苷酸PB304 寡核苷酸PB305
实施例1:病毒的培养在适当的细胞系统中培养病毒直至得到细胞病变效应.本领域技术 人员熟知每种病毒所用的细胞系统。筒单地说，用感染复数为l的被研 究的病毒抹接种对所用病毒敏感的细胞，所述细胞在Eagle最低基本培 养基(MEM培养基)或另一种适当的培养基中培养。然后于37 r保温被 感染的细胞直至出现完全的细胞病变效应(平均为36小时)。实施例2:细菌的培养和细菌DNA的提取按A. Rycroft等人(普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)， 1991, 137， 561-568)所述培养大叶性肺炎放线杆菌菌抹。根据J. Sambrook等人(分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室，冷泉 港，纽约，1989)所述的标准技术制备高分子量的DNA(染色体DNA)。实施例3:提取病毒基因组DNA培养后，收获上清液和被裂解的细胞，于4 X:, 1000g将全部的病 毒悬浮液离心IO分钟以除去细胞碎片，然后通过于4t:， 400，000g超 速离心1小时以收获病毒颗粒。将沉淀物溶解于最少量的緩冲液(10mM Tris， lmMEDTA; pH8.0)中，于37"C，在十二烷基硫酸钠(SDS) 的存在下(终浓度为0.5 %)，用蛋白酶K(终浓度为100ng/ml)将上述浓 缩的病毒悬浮液处理2小时。然后用笨酚/氯仿混合物提取病毒DNA， 再用2倍体积的无水乙醇沉淀之。于-20 "C放置过夜后，于4 t: ， 10，000g 将DNA离心15分钟，干燥DNA沉淀物，然后将它溶于最少量的无菌 超纯水中，接着可以用限制性酶消化所述DNA。实施例4:分离病毒基因组RNA根据本领域技术人员熟知的技术纯化RNA病毒，然后使用P. Chromczynski和N. Sacchi所述的"硫氰酸胍/笨酚-氯仿"提取技术(分 析生物化学，1987， 162, 156-159)分离各个病毒的基因组病毒 RNA。
实施例5:分子生物学技术使用J.Sambrook等人(分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港 实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的标准分子生物学技术进行所有的 质粒构建。使用"Geneclean"试剂盒(BIO 101 Inc. La Jolla , CA)分离用于本发明的所有限制性片段。实施例6: RT國PCR技术合成多个特异性的寡核苷酸(在其5，末端含有限制性位点以便于克 隆经扩增的片段)以使其完全覆盖欲被扩增的基因的编码区(见具体的 实施例)。根据标准技术(J. Sambrook等人，分子克隆实验室手册， 第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)进行逆转录(RT)反应和 聚合酶链反应(PCR).用 一对特异性的扩增引物进行一种RT-PCR反 应，所迷反应的模板是提取出的病毒基因组RNA。用笨酚/氯仿/异戊 醇(25:24:1)提取经扩增的互补DNA ，然后用限制性酶消化。实施例7 :质粒pVR1012质粒pVR1012(图l)得自Vical Inc.， San Diego， CA， USA .其构建 描述于J. Hartikka等人(人类基因疗法(Human Gene Therapy )， 1996 ， 7, 1205-1217)'实施例8 :构建质粒pABO卯(PRV gB基因)用Apal和Nael消化质粒pPR2.15(M. Riviere等，病毒学杂志 (J.Virol ) ， 1992， 66， 3424-3434)，以释放出含有编码Aujeszky 病病毒(NIA3抹)gB糖蛋白之基因(图2和SEQ ID NO:l)的2665 bp的 ApaI-NaeI片段(片段A)。通过下列2个寡核苷酸的杂交 AB166(33聚体)(SEQ ID NO:2)<formula>formula see original document page 13</formula>AB167(33聚体)(SEQ ID NO:3)5， ACGTCTACGGGCGACCACCGCCAGAAACCGCGC 3'重新构建含有gD基因序列，始于起始的ATG密码子直至Apal位点的33bp的片段(片段B),该片段在5，端产生了 Pstl位点。通过下列2个寡核苷酸的杂交 AB168(45聚体)(SEQ ID NO:4) 5，GGCACTACCAGCGCCTCGAGAGCGAGGACCCCGACGCCCTG TAGG 3，AB169(49聚体)(SEQ ID NO:5) 5，GATCCCTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTCGAGGCGCTG GTAGTGCC 3'重新构建含有gD基因序列，始于Nael位点直至TAG终止密码子的45 bp的片段(片段C)，该片段在3，端产生了 BamHI位点。将片断A ， B和C 一起连接到预先经Pstl和BamHI消化的载体 pVR1012(实施例7)中，得到质粒pAB090(7603 bp)(图3)。实施例9 :构建质粒pPB098(PRV gD基因)用Sail和BglII消化质粒pPR29(M. Riviere等，病毒学杂志， 1992, 66， 3424-3434)，以释放出含有编码Aujeszky病病毒(NIA3 抹)gD糖蛋白之基因的3，部分(图4和SEQ ID NO:6)的711 bp的Sall-BglII片段(片段A)。用Eco47IH和Sail消化质粒pPR29以释放出含有编码Aujeszky 病病毒(NIA3抹)gD糖蛋白之基因的5，部分的498 bp的Eco47III-SalI 片段(片段B)。通过下列2个寡核苷酸的杂交 PB101(15聚体)(SEQ ID NO:7) 5' GATGCTGCTCGCAGC 3'PB102(19聚体)(SEQ ID NO:8)5， GCTGCGAGCAGCATCTGCA 3'重新构建含有gD基因5，序列，始于起始的ATG密码子直至Eco47IH 位点的15bp的片段(片段C),该片段在5，端产生了 Pstl位点。纯化之后，将片段A， B和C一起连接到预先经PstI和BglII消 化的载体pVR1012(实施例7)中，得到质粒pPB098(6076 bp)(图5)。实施例10:构建质粒pPB143(猪流感HA基因，H1N1抹)用根据实施例4所述技术制备的猪流感病毒(SIVH1N1 " SW"抹) 基因组RNA，和下列寡核苷酸 PB107(32聚体)(SEQ ID NO:9)5， GTTCTGCAGCACCCGGGAGCAAAAGCAGGGGA 3' PB108(33聚体)(SEQ ID NO:IO)5， ATTGCGGCCGCTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTT 3' 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从SIVH1N1中精确地分 离1803 bpPCR片段形式的编码HA蛋白的基因(图6和SEQ ID NO:ll)。纯化之后，将此片段与载体PCRII-direct(Invitrogen Reference K2000-01)连接，得到载体pPB137(5755bp)。用EcoRV和Notl消化 载体pPB137以释放1820 bp的含有HA基因的EcoRV-NotI片段。将 此片段与预先经EcoRV和Notl消化的栽体pVR1012(实施例7)连接， 得到质粒pPB143(6726 bp)(图7)。实施例ll:构建质粒pPB142(猪流感NP基因，H1N1抹)用根据实施例4所迷技术制备的猪流感病毒(SIVH1N1 " SW "抹) 基因组RNA，和下列寡核苷酸 PB097(36聚体)(SEQ ID NO: 12)5， CCGGTCGACCGGGATAATCACTCACTGAGTGACATC 3' PB098(33聚体)(SEQ ID NO: 13)5' TTGCGGCCGCTGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT 3' 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从SIVH1N1中精确地分 离SalI-NotI片段形式的编码NP蛋白的基因(图8和SEQ ID NO:14). 纯化之后，将1566 bp的RT-PCR产物与载体PCRII-direct(Invitrogen Reference K2000-01)连接，得到载体pPB127(5519 bp).用Sail和NotI消化载体pPB127以释放1560 bp的含有NP基因 的Sall-Notl片段。将此片段与预先经Sail和NotI消化的载体pVR1012 (实施例7)连接，得到质粒pPB142(6451 bp)(图9)。实施例12:构建质粒pPB144(猪流感HA基因，H3N2抹)用根据实施例4所述技术制备的猪流感病毒(SIVH3N2抹，Cotes du Nord 1987)基因组RNA ，和下列寡核苷酸 PB095(31聚体)(SEQ ID NO: 15)5， GTTCTGCAGGCAGGGGATAATTCTATCAACC 3' PB096(36聚体)(SEQ ID NO: 16)5， TTGCGGCCGCAAGGGTGTTTTTAATTACTAATATAC 3' 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从SIVH3N2中精确地分 离PstI-NotI片断形式的编码HA蛋白的基因(图IO和SEQ ID NO:17)。纯化之后，将1765 bp的RT-PCR产物与载体PCRII-direct(Invitrogen Reference K2000画01)连接，得到载体pPB120(5716 bp)。用NotI消化载体pPB120以释放1797 bp的含有HA基因的NotI -NotI片段。将此片段与预先经Notl消化的载体pVR1012(实施例7)连 接，得到质粒pPB144(6712bp)，该质粒在相对于启动子正确的方向上 含有H3N2 HA基因(图11)。实施例13:构建质粒pPB132(猪流感NP基因，H3N2抹)用根据实施例4所述技术制备的猪流感病毒(SIVH3N2祙，Cotes du Nord 1987)基因组RNA ，和下列寡核苷酸 PB097(36聚体)(SEQ ID NO: 12) 5， CCGGTCGACCGGGATAATCACTCACTGAGTGACATC 3' PB098(33聚体)(SEQ ID NO: 13)5， TTGCGGCCGCTGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT 3' 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从SIVH3N2中精确地分 离SalI-NotI片段形式的编码NP蛋白的基因(图12和SEQ IDNO:18)。 纯化之后，将1564 bp的RT-PCR产物与载体PCRII-direct(Invitrogen Reference K2000-01)连接，得到载体pPB123(5485 bp)。
用Sail和Notl消化栽体pPB123以释放1558 bp的含有NP基因 的Sail-NotI片段。将此片段与预先经SalI和NotI消化的载体 pVR1012 (实施例7)连接，得到质粒pPB132(6449 bp)(图13)。
实施例14 :构建质粒pAB025(PRRSV ORF5基因，Lelystad株)
用根据实施例4所述技术制备的PRRSV病毒(Lelystad抹)基因组 RNA(丄Meulenberg等，病毒学(Virology ) ， 1993， 19， 62-72), 和下列寡核苷酸 AB055(34聚体)(SEQ ID NO: 19)
5， ACGCGTCGACAATATGAGATGTTCTCACAAATTG 3' AB056(33聚体)(SEQ ID NO:20)5' CGCGGATCCCGTCTAGGCCTCCCATTGCTCAGC 3' 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从PRRS病毒Lelystad抹 中精确地分离编码包膜糖蛋白E(gp25)的"ORF5"基因。纯化之后， 用Sail和BamHI消化630 bp的RT-PCR产物以分离617 bp的Sall-BamHI片段。将此片段与预先经SalI和BamHI消化的载体pVR1012 (实施例7)连接，得到质粒pAB025(5486 bp)(图14)。
实施例15:构建质粒pAB001(PRRSVORF5基因，USA株)
用根据实施例4所述技术制备的PRRSV病毒(ATCC VR2332抹) 基因组RNA(M. Murtaugh等，Arch Virol ， 1995， 140， 1451-1460)，和下列寡核苷酸
AB001(30聚体)(SEQ ID NO:21)5， AACTGCAGATGTTGGAGAAATGCTTGACCG 3' AB002(30聚体)(SEQ ID NO:22)5， CGGGATCCCTAAGGACGACCCCATTGTTCC 3' 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从PRRS病毒ATCC陽 VR2332抹中精确地分离编码包膜糖蛋白E(gp25)的基因。纯化之后， 用Pstl和BamHI消化620 bp的RT-PCR产物以分离606 bp的Pstl画 BamHI片断。将此片段与预先经Pstl和BamHI消化的载体pVR1012 (实施例7)连接，得到质粒pABO01(5463 bp)(图15)。实施例16 :构建质粒pAB091(PRRSV ORF3基因，Lelystad抹)用根据实施例4所述技术制备的PRRSV病毒(Lelystad抹)基因组 RNA(J. Meulenberg等，病毒学，1993, 19， 62-72),和下列寡核苷 酸AB170(32聚体)(SEQ ID NO:23)5， AAACTGCAGCAATGGCTCATCAGTGTGCACGC 3' AB171(30聚体)(SEQ ID NO:24)5， CGCGGATCCTTATCGTGATGTACTGGGGAG 3' 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从PRRS病毒Lelystad抹 中精确地分离编码包膜糖蛋白"gp45"的"ORF3"基因。纯化之后， 用Pstl和BamHI消化818 bp的RT-PCR产物以分离802 bp的Pstl-BamHI片断。将此片段与预先经PstI和BamHI消化的载体pVR1012 (实施例7)连接，得到质粒pAB091(5660 bp)(图16)。实施例17 :构建质粒pAB092(PRRSV ORF3基因，USA抹)用根据实施例4所述技术制备的PRRSV病毒(ATCC VR2332抹) 基因组RNA(M. Murtaugh等，Arch Virol ， 1995， 140， 1451-1460)，和下列寡核苷酸 AN172(32聚体)(SEQ ID NO:25)5， AAACTGCAGCAATGGTTAATAGCTGTACATTC 3' AB173(32聚体)(SEQ ID NO:26)5， CGCGGATCCCTATCGCCGTACGGCACTGAGGG 3' 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从PRRS病毒ATCC-VR2332抹中精确地分离编码包膜糖蛋白"gp45"的"ORF3"基因。 纯化之后，用Pstl和BamHI消化785 bp的RT-PCR产物以分离769 bp 的Pstl-BamHI片段。将此片段与预先经PstI和BamHI消化的栽体 pVR1012 (实施例7)连接，得到质粒pAB092(5627 bp)(图17)。实施例18 :构建质粒pAB004(猪细小病毒VP2基因)用根据实施例4所述技术制备的猪细小病毒(NADL2抹)基因组 RNA(J. Vasudevacharya等，病毒学，19卯，178， 611-616)，和下列寡核苷酸AB007(33聚体)(SEQ ID NO:27)5， AAAACTGCAGAATGAGTGAAAATGTGGAACAAC 3， AB010(33聚体)(SEQ ID NO:28)5， CGCGGATCCCTAGTATAATTTTCTTGGTATAAG 3" 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以扩增含有编码猪细小病毒 VP2蛋白之基因的1757bp的片段。纯化之后，用Pstl和BamHI消化 RT-PCR产物，得到1740bp的Pstl-BamHI片段。将此片段与预先经 Pstl和BamHI消化的载体pVR1012 (实施例7)连接，得到质粒pAB004 (6601bp)(图18)。实施例19 :构建质粒pAB069(猪痘HCV El基因)用根据实施例4所述技术制备的猪瘟病毒(HCV)(Alfort抹)基因组 RNA(G. Meyers等，病毒学，1989 ， 171 ， 18-27)，和下列寡核苷酸 AB126(36聚体)(SEQ ID NO:29)5， ACGCGTCGACATGAAACTAGAAAAAGCCCTGTTGGC 3' AB127(34聚体)(SEQ ID NO:30)5， CGCGGATCCTCATAGCCGCCCTTGTGCCCCGGTC 3' 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从HCV病毒中分离1363 bp的RT-PCR片段形式的编码El蛋白的序列.纯化之后，用SalI和 BamHI消化此片段，得到1349 bp的SalI-BamHI片段。将此片段与 预先经Sail和BamHI消化的载体pVR1012 (实施例7)连接，得到质 粒pAB069(6218 bp)(图19)。实施例20:构建质粒pAB061(猪痘HCVE2基因)用根据实施例4所述技术制备的猪瘟病毒(HCV)(Alfort抹)基因组 RNA(G. Meyers等，病毒学，1989 ， 171 ， 18-27),和下列寡核普酸 AB118(36聚体)(SEQ ID NO:31)5" ACGCGTCGACATGTCAACTACTGCGTTTCTCATTTG 3， AB119(33聚体)(SEQ ID NO:32)5， CGCGGATCCTCACTGTAGACCAGCAGCGAGCTG 3， 根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从HCV病毒中分离1246bp 的RT-PCR片段形式的编码E2蛋白的序列。纯化之后，用SalI和 BamHI消化此片段，得到1232 bp的SalI-BamHI片段。将此片段与 预先经Sail和BamHI消化的载体pVR1012 (实施例7)连接，得到质 粒pAB061 (6101bp)(图20)。实施例21 :构建质粒pPBl^(缺失的大叶性肺炎放线杆菌apxl基因) 克隆大叶性肺炎放线杆菌apxl基因以缺失氨基酸719-846之间富含甘氨酸的氨基酸区域(涉及钙离子的结合)。用根据实施例2和3所述技术制备的大叶性肺炎放线杆菌(血清型l)的基因组DNA(J. Frey等，感染和免疫(Infect. Immun.)， 1991,59, 3026-3032),和下列寡核苷酸PB174(32聚体)(SEQ ID NO:33)5， TTGTCGACGTAAATAGCTAAGGAGACAACATG 3' PB189(29聚体)(SEQ ID NO:34)
5， TTGAATTCTTCTTCAACAGAATGTAATTC 3' 进行PCR反应以扩增SalI-EcoRI片段形式的编码大叶性肺炎放线杆菌 溶血素I蛋白之apxI基因的5，部分。纯化之后，用SalI和EcoRI消化 2193 bp的PCR产物以分离2183 bp的Sall-EcoRI片段(片段A)。用大叶性肺炎放线杆菌(血清型l)的基因组DNA(J. Frey等， Infect. Immun., 1991， 59, 3026-3032)，和下列寡核苷酸 PB1卯(32聚体)(SEQ ID NO:35)5， TTGAATTCTATCGCTACAGTAAGGAGTACGG 35 PB175(31聚体)(SEQ ID NO:36)5， TTGGATCCGCTATTTATCATCTAAAAATAAC 3' 进行PCR反应以扩增EcoRI-BamHI片段形式的编码大叶性肺炎放线 杆菌溶血素I蛋白之apxI基因的3，部分。纯化之后，用EcoRI和BamHI 消化576 bp的PCR产物以分离566 bp的EcoRI-BamHI片段(片段 B)。将片段A和B与预先经SalI和BamHI消化的载体pVR1012(实 施例7)连接，得到质粒pPB162(7619 bp)(图21)。实施例22 :构建质粒pPB163(缺失的大叶性肺炎放线杆菌apxll基因) 克隆大叶性肺炎放线杆菌apxll基因以缺失氨基酸716-813之间富含甘氨酸的氨基酸区域(涉及钙离子的结合)。用根据实施例2和3所述技术制备的大叶性肺炎放线杆菌(血清型9)的基因组DNA(M. Smits等，感染和免疫(Infection andImmunity), 1991, 59， 4497-4504)，和下列寡核苷酸PB176(31聚体)(SEQ ID NO:37)5， TTGTCGACGATCAATTATATAAAGGAGACTC 3'PB191(30聚体)(SEQ ID NO:38)5， TTGAATTCCTCTTCAACTGATTTGAGTGAG 3"进行PCR反应以扩增Sall-EcoRI片段形式的编码大叶性肺炎放线杆菌溶血素II蛋白之apxll基因的5，部分.纯化之后，用Sail和EcoRI消化21卯bp的PCR产物以分离2180 bp的Sall-EcoRI片段(片段A). 用大叶性肺炎放线杆菌(血清型9)的基因组DNA(M. Smits等，感 染和免疫，1991， 59， 4497-4504),和下列寡核苷酸 PB192(29聚体)(SEQ ID NO:39) 5， TTGAATTCGTAAATCTTAAAGACCTCACC 3' PB177(30聚体)(SEQ ID NO:40) 5， TTGGATCCACCATAGGATTGCTATGATTTG 3' 进行PCR反应以扩增EcoRI-BamHI片段形式的编码大叶性肺炎放线 杆菌溶血素II蛋白之apxII基因的3，部分.纯化之后，用EcoRI和 BamHI消化473 bp的PCR产物以分离463 bp的EcoRI-BamHI片段 (片段B)。将片段A和B与预先经Sail和BamHI消化的载体pVR1012 (实 施例7)连接，得到质粒pPB163(7513 bp)(图22)。实施例23 :构建质粒pPB174'， pPB189和pPBl卯(缺失的大叶性肺炎放线杆菌apxIII基因)apxIII缺失的第一个实施例(质粒pPBl74，)克隆大叶性肺炎放线杆菌apxIII基因以缺失氨基酸733-860之间 富含甘氨酸的氨基酸区域(涉及钙离子的结合)。用根据实施例2和3所述技术制备的大叶性肺炎放线杆菌(血清型 8)的基因组DNA(M. Smits ， 1992 ， Genbank序列登记号为 X68815),和下列寡核苷酸 PB278(30聚体)(SEQ ID NO:41)5, TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG 3' PB279(28聚体)(SEQ ID NO:42) 5， TTTATCGATTCTTCTACTGAATGTAATTC 3' 进行PCR反应以扩增Sall-Clal片段形式的apxIII基因(编码大叶性肺 炎放线杆菌溶血素III蛋白)的5，部分。纯化之后，用Sail和aai消化 2216 bp的PCR产物以分离2205 bp的Sall-Clal片段(片段A)。 用大叶性肺炎放线杆菌(血清型8)的基因组DNA(M. Smits ， 1992， Genbank序列登记号为X68815),和下列寡核苷酸 PB280(33聚体)(SEQ ID NO:43)5' TTTATCGATTTATGTTTATCGTTCCACTTCAGG 3， PB307(32聚体)(SEQ ID NO:44)5， TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3" 进行PCR反应以扩增Clal-BamHI片段形式的apxIII基因(编码大叶性 肺炎放线杆菌溶血素III蛋白)的3，部分。纯化之后，用ClaI和BamHI 消化596 bp的PCR产物以分离583 bp的Clal-BamHI片段(片段B), 将片段A和B与预先经Sail和BamHI消化的栽体pVR1012 (实施例7) 连接，得到质粒pPB174，(7658 bp)(图23)。apxIII缺失的第二个实施例(质粒pPB189)克隆大叶性肺炎放线杆菌apxIII基因以缺失氨基酸705-886之间 富含甘氨酸的氨基酸区域(涉及钙离子的结合)。用根据实施例2和3所述技术制备的大叶性肺炎放线杆菌(血清型8) 的基因组DNA(M. Smits ， 1992 ， Genbank序列登记号为 X68815),和下列寡核苷酸PB278(30聚体)(SEQ ID NO:41)5， TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG 3， PB303(32聚体)(SEQ ID NO:45)5' TTTATCGATTTCTTCACGTTTACCAACAGCAG 3' 进行PCR反应以扩增Sall-Clal片段形式的apxIII基因(编码大叶性肺 炎放线杆菌溶血素III蛋白)的5，部分。纯化之后，用SalI和ClaI消化 2133 bp的PCR产物以分离2122 bp的Sall-Clal片段(片段A)。 用大叶性肺炎放线杆菌(血清型8)的基因组DNA(M. Smits , 1992， Genbank序列登记号为X68815),和下列寡核苷酸 PB306(31聚体)(SEQ ID NO:46)5， TTTATCGATTCTGATTTTTCCTTCGATCGTC 3， PB307(32聚体)(SEQ ID NO:44)
5， TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3， 进行PCR反应以扩增ClaI-BamHI片段形式的apxIII基因(编码大叶性 肺炎放线杆菌溶血素III蛋白)的3，部分.纯化之后，用ClaI和BamHI 消化518 bp的PCR产物以分离506 bp的ClaI-BamHI片段(片段B), 将片段A和B与预先经Sail和BamHI消化的栽体pVR1012 (实施例7) 连接，得到质粒pPB189(7496 bp)(图24)。apxIII缺失的第三个实施例(质粒pPB190)克隆大叶性肺炎放线杆菌apxIII基因以缺失氨基酸718-876之间 富含甘氨酸的氨基酸区域(涉及钙离子的结合)。用根据实施例2和3所述技术制备的大叶性肺炎放线杆菌(血清型8) 的基因组DNA(M. Smits ， 1992 ， Genbank序列登记号为 X68815),和下列寡核普酸PB278(30聚体)(SEQ ID NO:41)5， TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG 3' PB304(33聚体)(SEQ ID NO:47)5， TTTATCGATACCTGATTGCGTTAATTCATAATC 3' 进行PCR反应以扩增Sall-Clal片段形式的apxIII基因(编码大叶性肺 炎放线杆菌溶血素III蛋白)的5'部分。纯化之后，用Sail和Clal消化 2172 bp的PCR产物以分离2161 bp的Sall-Clal片段(片段A)。 用大叶性肺炎放线杆菌(血清型8)的基因组DNA(M. Smits , 1992， Genbank序列登记号为X68815),和下列寡核苷酸 PB305(31聚体)(SEQ ID NO:48)5' TTTATCGATAAATCTAGTGATTTAGATAAAC 3' PB307(32聚体)(SEQ ID NO:44)5， TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3' 进行PCR反应以扩增Clal-BamHI片段形式的apxIII基因(编码大叶性 肺炎放线杆菌溶血素III蛋白)的3，部分 纯化之后，用Clal和BamHI 消化548 bp的PCR产物以分离536 bp的Clal-BamHI片段(片段B)。 将片段A和B与预先经Sail和BamHI消化的载体pVR1012 (实施例 7)连接，得到质粒pPBl卯(7565 bp)(图25).实施例24:制备和纯化质粒为了制备欲接种动物的质粒，可使用能得到超螺旋形式占优势的纯 化质粒悬浮液的任何技术，这些技术是本领域技术人员所熟知的。这里 可特别提到J. Sambrook等人(分子克隆实验室手册，第2版，冷泉 港实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的碱裂解技术，接着再在溴化乙 锭的存在下，在氯化铯梯度中进行2次连续的超速离心。也可参照专利 申请PCT WO 95/21250和PCT WO 96/02658 ，它们描述了工业化规 模生产可用于接种之质粒的方法。为了制备疫苗(见实施例17)，可重新 悬浮纯化的质粒以得到适于储存的高浓度溶液(〉2mg/ml)。为此，将质 粒重新悬浮于超纯水或TE緩冲液(10mM Tris-HCl; lmM EDTA ， pH8.0)中。实施例25:制备联合疫苗从其浓缩溶液(实施例16)开始混合制备联合疫苗所需的多种质 粒。制备混合物以使各个质粒的终浓度相当于各个质粒的有效剂量。可 被用于调节疫苗终浓度的溶液可以是0.9 %的NaCl溶液，也可以是PBS緩冲液。也可以将特殊的制剂，如脂质体，阳离子脂质用于制备疫苗。实施例26 :对猪的接种以每种质粒100 ， 250或500pg的剂量接种猪。 通过肌内途径用针头进行注射。此时，以2ml的体积施用疫苗剂量。也可使用在5个点分送0.2ml剂量(每个注射点0.04ml)的液体喷射 注射器装置(不带针头)(如"PIGJET"装置)，经由皮内途径进行注射. 此时，施用的疫苗剂量体积为0.2或0.4ml,这分别相应于注射l次或 2次.当利用PIGJET装置进行2次连续的注射时，应将注射区间隔开 以使2个注射区彼此间隔约l-2cm的距离. 序列表<110>梅瑞尔公司<120>抗猪生殖和呼吸疾病的多核苷酸疫苗制剂 <130> 454313-2230. 1<140> 09/784,984 <141> 2001-02-16<150〉 FR 96/09338 <151> 1996-07-19<150> PCT/FR97/01313 <151> 1997-07-15<150> US 6,207, 165 <151> 2001-03-27<160> 54<170〉 Patentln version 3-1<210〉 1<211> 2742<212> DNA <213>假狂犬病病毒<220><221> CDS<222> (1)..(2742) <223><400> 1atg ccc get ggt ggc Met Pro Ala Gly Gly 1 5ggg cac cac ggc ggt Gly His His Gly Gly 20cac get gca get gcg His Ala Ala Ala Ala 35ggt ctt tgg cgc ggg Gly Leu Trp Arg Gly 10ccc egg ggg cat egg ccc Pro Arg Gly His Arg Pro 1548get ggc etc gga cgt Ala Gly Leu Gly Arg 25ctt tgg cct get cca cac Leu Trp Pro Ala Pro His 3096egg ggc gcc gtc gcg Arg Gly Ala Val Ala 40eta gcg ctg ctg ctg ctg Leu Ala Leu Leu Leu Leu 45 gcg etc gcc gcg gcc ccg ccg tgc ggc gcg gcg gcc gtg acg egg gcc Ala Leu Ala Ala Ala Pro Pro Cys Gly Ala Ala Ala Val Thr Arg Ala 50 55 60192gcc tcg gcc tcg ccg acg ccc ggg acg ggc gcc acc ccc aac gac gtc Ala Ser Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Gly Ala Thr Pro Asn Asp Val 65 70 75 80240tec gcc gag gcg tec etc gag gag ate gag gcg ttc tec ccc ggc ccc Ser Ala Glu Ala Ser Leu Glu Glu lie Glu Ala Phe Ser Pro Gly Pro 85 90 95288tcg gag gcc ccc gac ggc gag tac ggc gac ctg gac gcg egg acg gcc Ser Glu Ala Pro Asp Gly Glu Tyr Gly Asp Uu Asp Ala Arg Thr Ala 100 105 110336gtg cgc gcg gcc gcg acc gag egg gac cgc ttc tac gtc tgc ccg ccg Val Arg Ala Ala Ala Thr Glu Arg Asp Arg Phe Tyr Val Cys Pro Pro 115 120 125384ccg tec ggc tec Pro Ser Gly Ser 130acg gtg gtg egg ctg gag ccc gag cag gcc tgc ccc Thr Val Val Arg Uu Glu Pro Glu Gin Ala Cys Pro 135 140432gag tac tcg cag Glu Tyr Ser Gin 145ggg'cgc aac ttc acg gag ggg ate gcc ctg etc ttc Gly Arg Asn Phe Thr Glu Gly lie Als Uu Leu Phe 150 155 160480aag gag aac ate Lys Glu Asn liegcc ccg cac aag ttc aag gcc cac Ala Pro His Lys Phe Lys Ala His 165 170ate tac tac aag lie Tyr Tyr Lys 175528aac gtc ate gtc Asn Val lie Val 180acg acc gtg tgg tec ggg age acg tac gcg gcc ate Thr Thr Val Trp Ser Gly Ser Thr Tyr Ala Ala lie 185 190576acg aac cgc ttc Thr Asn Arg Phe 195aca gac cgc gtg ccc gtc ccc gtg cag gag ate acg Thr Asp Arg Val Pro Val Pro Val Gin Glu lie Thr 200 205624gac gtg ate gac Asp Val lie Asp 210cgc cgc ggc aag tgc gtc tec aag gcc gag tac gtg Arg Arg Gly Lys Cys Val Ser Lys Ala Glu Tyr Val 215 220672<formula>formula see original document page 29</formula>Ala Leu Gly Ala Ser Phe Val Ser Asp Val Thr Gin Leu Asp Leu Gin 405 410 415cgc gtg celc ctg Arg Val His Leu 420ggc gac tgc gtc ctc cgc gag gcc teg gag gcc ate Gly Asp Cys Val Uu Arg Glu Ala Ser Glu Ala lie 425 4301296gac gcc ate tac egg egg cgc tac aac age acg cac gtg ctg gcc ggc Asp Ala lie Tyr Arg Arg Arg Tyr Asn Ser Thr His Val Leu Ala Gly 435 440 4451344gac agg ccc gag gtg tac ctc gcc cgc ggg ggc ttc gtg gtg gcc ttc Asp Arg Pro Glu Val Tyr Leu Ala Arg Gly Gly Phe Val Val Ala Phe 450 455 4601392cgc ccg ctg ate teg aac gag ctg gcg cag ctg tac gcg cgc gag ctc Arg Pro Leu lie Ser Asn Glu Leu Ala Gin Leu Tyr Ala Arg Glu Leu 465 470 475 4801440gag cgc ctc ggc ctc gcc ggc gtc gtg ggc ccc gcg gcc ccc gcg gcc Glu Arg Leu Gly Leu Ala Gly Val Val Gly Pro Ala Ala Pro Ala Ala 485 490 4951488gcc cgt egg gcc egg cgc tec ccc ggc ccg gcg ggg acg ccc gag ccg Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Gly Pro Ala Gly Thr Pro Glu Pro 500 505 5101536ccg gcc gtc Pro Ala Val 515幼c Asnggc Glyacg Thrggg cac Gly His 520ctg Leucgc Argate acc acg lie Thr Thr 525ggcGlyteg gcg Ser Ala1584gag ttt gcg cgc ctg cag ttc acc tac gac cac ate cag gcg cac gtg Glu Phe Ala Arg Leu Gin Phe Thr Tyr Asp His lie Gin Ala His Val 530 535 5401632aac gac atg ctg ggc cgc ate gcg gcc gcc tgg tgc gag ctg cag aac Asn Asp Met Leu Gly Arg lie Ala Ala Ala Trp Cys Glu Leu Gin Asn 545 550 555 5601680aag gac cgc acc ctg tgg age gag atg teg cgc ctg aac ccc age gcc Lys Asp Arg Thr Leu Trp Ser Glu Met Ser Arg Leu Asn Pro Ser Ala 565 570 5751728gtg gcc acg gcc gcg ctc ggc cag cgc gtc tgc gcg cgc atg ctc ggc Val Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gin Arg Val Cys Ala Arg Met Leu Gly1776
580585590gac gtg atg gcc ate teg egg tgc gtg gag gtg cgc ggc ggc gtg tac Asp Val Met Ala lie Ser Arg Cys Val Glu Val Arg Gly Gly Val Tyr5956006051824gtg cag aac tec atg cgc gtg ccc ggc gag cgc ggc acg tgc tac age Val Gin Asn Ser Met Arg Val Pro Gly Glu Arg Gly Thr Cys Tyr Ser 610 615 6201872cgc ccg ctg gtc acc ttc gag cac aac ggc acg ggc gtg ate gag ggc Arg Pro Leu Val Thr Phe Glu His Asn Gly Thr Gly Val lie Glu Gly 625 630 635 6401920cag etc ggc Gin Leu Glygac gac aac Asp Asp Asn 645gag etc etc ate Glu Leu Leu lie 650teg cgc gac etc ate gag Ser Arg Asp Leu lie Glu 6551968ccc tgc acc Pro Cys Thrggc aeic esc Gly Asn His 660egg cgc tac ttt Arg Arg Tyr Phe 665aag ctg ggg age Lys Leu Gly Ser 670ggg tac Gly Tyr2016gtg tac tac Val Tyr Tyr 675g3g g8C t3CGlu Asp Tyraac tac gtg cgc Asn Tyr Val Arg 680atg gtg gag Met Val Glu 685gtgValccc gag Pro Glu2064acg ate age acg egg gtt acc ctg aac ctg acg ctg ctg gag gac cgc Thr lie Ser Thr Arg Val Thr Uu Asn Leu Thr Leu Leu Glu Asp Arg 690 695 7002112gag ttc ctg Glu Phe Uu 705ccc etc gag Pro Leu Glu 710gtg tac acg cgc Val Tyr Thr Arggag gag Glu Glu 715etc Leugcc Alagac acg Asp Thr 7202160ggc etc ctg gac tac age gag ate cag cgc cgc aac cag ctg cac gcg Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu lie Gin Arg Arg Asn Gin Leu His Ala 725 730 7352208etc aag ttc tac gac ate gac cgc gtg gtc aag gtg gac cac aac gtg Leu Lys Phe Tyr Asp lie Asp Arg Val Val Lys Val Asp His Asn Val 740 745 7502256gtg ctg ctg VbI Leu Leu 755cgc ggc ate Arg Gly liegcc aac ttc ttc cag ggc Ala Asn Phe Phe Gin Gly 760etc ggc gac gtg Leu Gly Asp Val 7652304
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200 205200710127053.X说明书第55/69页Asp Val lie Asp Arg Arg Gly Lys Cys Val Ser Lys Ala Glu Tyr Val 210 215 220Arg Asn Asn His Lys Val Thr Ala Phe Asp Arg Asp Glu Asn Pro Val 225 230 235 240Glu Val Asp Leu Arg Pro Ser Arg Leu Asn Ala Leu Gly Thr Arg Ala 245 250 255Trp His Thr Thr Asn Asp Thr Tyr Thr Lys lie Gly Ala Ala Gly Phe 260 265 270Tyr Gin Thr Gly Thr Ser Val Asn Cys lie Val Glu Glu Val Glu Ala 275 280 285Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Ser Phe Ala Leu Ser Thr Gly Asp lie 290 295 300Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Uu Arg Glu Gly Ala His Gly Glu 305 310 315 320Gin lie Gly Tyr Ala Pro Gly Arg Phe Gin Gin Val Glu His Tyr Tyr 325 330 335Pro lie Asp Leu Asp Ser Arg Leu Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Arg 340 345 350Asn Phe Leu Arg Thr Pro His Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Ala Pro 355 360 365Lys Thr Arg Arg Val Cys Ser Leu Ala Lys Trp Arg Glu Ala Glu Glu 370 375 380Met Thr Arg Asp Glu Thr Arg Asp Gly Ser Phe Arg Phe Thr Ser Arg 385 390 395 400Ala Leu Gly Ala Ser Phe Val Ser Asp Val Thr Gin Leu Asp 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<210> 52 <211〉 498 <212> PRT <213〉猪流感病毒
<400> 52
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202530His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr lie Thr Asn A印 35 40 45Gin lie Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gin Ser Phe Ser Met 50 55 60Gly Lys lie Cys Asn Asn Pro His Arg Val Leu Asp Gly Ala Asn Cys 65 70 75 80Thr Leu lie Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly Phe Gin 85 90 95Asn Glu Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Cys Phe Ser Asn 100 105 110Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu lie 115 120 125Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe lie Asn Glu Gly Phe Asn Trp Thr 130 135 140Gly Val Thr Gin Asn Gly Gly Ser Asn Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asp 145 150 155 160Ser Gly Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Tyr Lys Ser Gly Asn Thr 165 170 175Tyr Pro Met Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Ser Asp Asn Phe Asp Lys 180 185 190Leu Tyr lie Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Arg Glu Gin Thr 195 200 205Asn Leu Tyr Val Gin Val Ser Gly Lys Ala Thr Val Phe Thr Lys Arg 210 215 220Ser Gin Gin Thr lie lie Pro Asn Ser Arg Ser Arg Pro Trp Val Arg 225 230 235 240Gly Leu Ser Ser Arg lie Ser lie His Trp Thr lie Val Lys Pro Gly 245 250 255Asp lie Leu lie lie Asn Ser Asn Gly Asn Leu lie Ala Pro Arg Gly260265270Tyr Phe Lys Met His Asn Gly Arg Ser Ser lie Met Arg Ser Asp Ala 275 280 285Pro lie Gly Thr Cys Ser Ser Glu Cys lie Thr Pro Asn Gly Ser lie 290 295 300Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Lys lie Thr Tyr Gly Ala 305 310 315 320Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 325 330 335Arg Asn lie Pro Glu Lys Gin Thr Arg Gly lie Phe Gly Ala lie Ala 340 345 350Gly Phe lie Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin Ala Ala Asp Leu Lys 370 375 380Ser Thr Gin Ala Ala lie Asp Gin lie Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 385 390 395 400lie Glu Lys Thr Asn Gly Lys Phe His Gin lie Glu Lys Glu Phe Ser 405 410 415lie Val Glu Gly Arg lie Gin Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr 420 425 430Lys lie Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 435 440 445Asn Gin His Thr lie Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Ser Lys Leu Phe 450 455 460Glu Lys Thr Arg Arg Gin Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 465 470 475 480Gly Cys Leu Gin lie Tyr His Lys Cys A印Asn Ala Cys lie Glu Ser 485 490 495lie Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Glu Tyr Arg Asp Glu Ala Leu 500 505 510Asn Asn Arg Phe Gin lie Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 515 520 525Asp Trp lie Leu Trp lie Ser Ser Ala lie Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535 540Val Val Leu Uu Gly Phe lie Met Trp Ala Cys Gin Lys Gly Asn lie 545 550 555 560Arg Cys Asn lie Cys lie 565<210〉 54 <211> 498 <212> PRT <213〉猪流感病毒<400〉 54Met Ala Ser Gin Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gin Met Glu Thr Gly 15 10 15Gly Glu Arg Arg Asn Ala Thr Glu lie Arg Ala Ser Val Gly Gly Met 20 25 30Val Gly Gly lie Gly Arg Phe Tyr lie Gin Met Cys Thr Lys Leu Lys 35 40 45Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu lie Gin Asn Ser lie Thr lie Glu 50 55 60Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 65 70 75 80Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro lie 85 90 95Tyr Arg Lys Arg Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu lie Met Tyr Asp 100 105 110Lys Glu Glu lie Arg Arg lie Trp Arg Gin Ala Asn Asn Gly Glu Asp 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met lie Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140Asp Ala Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gin Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 165 170 175Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu 180 185 190Leu lie Arg Met lie Lys Arg Gly lie Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg 195 200 205Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg lie Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220lie Leu Lys Gly Lys Phe Gin Thr Ala Ala Gin Arg Ala Thr Met Asp 225 230 235 240Gin Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu lie Glu Asp Leu 245 250 255lie Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu lie Leu Arg Gly Ser Val Ala His 260 265 270Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Val Val Ala Ser Gly 275 280 285Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Uu Val Gly lie Asp Pro Phe 290 295 300Arg Leu Leu Gin Asn Ser Gin Val Phe Ser Leu lie Arg Pro Asn Glu 305 310 315 320Asn Pro Ala His Lys Ser Gin Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala 325 330 335Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe lie Arg Gly Thr Lys Val 340 345 350Val Pro Arg Gly Gin Leu Ser Thr Arg Gly Val Gin lie Ala Ser Asn 355 360 365 Glu Asn Met Glu Thr Met Asp Ser lie Thr Leu Glu Leu Arg Ser Lys 370 375 380Tyr Trp Ala lie Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gin Gin Arg 385 390 395 400Ala Ser Ala Gly Gin lie Ser Val Gin Pro Thr Phe Ser Val Gin Arg 405 410 415Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr lie Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn 420 425 430Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu lie lie Arg Met Met 435 440 445Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gin Gly Arg Gly Val Phe 450 455 柳Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro lie Val Pro Ser Phe Asp 465 470 475 480Val Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr 485 490 495Asn Asn
权利要求
1. 一种猪疫苗，其包含含有典型猪瘟病毒基因的质粒，所述基因选自El和E2。
2. 根据权利要求l的疫苗，其中所述质粒包含E1和E2基因二者。
3. 根据权利要求l的疫苗，其中所述质粒包含E1基因。
4. 根据权利要求l的疫苗，其中所述质粒包含E2基因。
5. 根据权利要求l的疫苗，其包含含有El基因的质粒和含有 E2基因的质粒。
全文摘要
抗猪生殖和/或呼吸疾病的猪疫苗制剂，所述制剂含有至少3种效价的多核苷酸疫苗，含有一个整合质粒，其可在宿主细胞中体内表达一种猪病原体效价的基因。这些效价选自两组，即Aujeszkey病病毒、猪流感病毒、猪神秘病病毒、细小病毒病病毒、典型猪瘟病毒和引起放线杆菌病的细菌。对于每种效价而言，质粒含有一种或多种基因，该基因对于Aujeszkey病病毒选自gB和gD，对于猪流感病毒选自HA，NP和N，对于神秘病病毒选自E、ORF3、M，对于细小病毒病病毒选自VP2，对于瘟病毒病病毒选自E1、E2，对放线杆菌病选自apxI、apxII和apxIII。
文档编号A61P31/14GK101121023SQ20071012705
公开日2008年2月13日 申请日期1997年7月15日 优先权日1996年7月19日
发明者A·布萨都恩, J-C·奥都尼特, M·里威尔, P·保杜 申请人:梅瑞尔公司