一种治疗心血管疾病药物组合物在制备对保护内皮细胞损伤药物中的应用的制作方法

专利名称：一种治疗心血管疾病药物组合物在制备对保护内皮细胞损伤药物中的应用的制作方法
一种治疗心血管疾病药物组合物在制备对保护内皮细胞损伤药物中的应用
本发明属医药领域，具体涉及一种治疗心血管疾病药物组合物在制备对保护内皮细胞损 伤药物中的应用。
自Furchgottl980年[Furchgott , Zawadzki. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature , 1980 , 288 :373 —376.]报道兔主动脉内皮依赖性舒张作用以来，内皮细胞已被认为不仅是一层血管 壁内面的屏障，而是具有多种生理功能的组织或器官。它可分泌释放多种生物活性物质调节血 管张力和平滑肌生长,参与凝血及抗血栓形成，影响血管通透性和物质交换。血管内皮细胞直 接与循环血液接触，易于受到血液中活性物质的影响，导致内皮细胞的损伤，引起多种血管性 疾病。1993年,Rubanyi认为内皮是一种兼有感觉与效应功能的器官，在感受血流压力变化、炎 性反应及循环中激素水平等信号的同时,做出调节反应，从而维持正常血管功能和血液供应状 态[Rubanyi GM. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases[J]. J Cardio vase Pharmacol, 1993, 22 (S卿l 4) : S1-S4.]。
内皮细胞是维持正常血管生理功能动态平衡的重要结构，其在调节血管张力、抗血小板 聚集、抑制白细胞黏附和减轻血管壁炎症反应等方面具有重要作用。心血管疾病的危险因素 如高血脂、高血糖、高血压、吸烟、衰老[lerman. A， Zeiher A. Endothelial function: cardiacevents[J]. Circulation, 2005,111 (3) :363- 368.]等可以损伤内皮细胞的结构和 功能，最终导致心血管疾病的发生和发展。寻找能够保护和修复内皮细胞的药物对于心血管 疾病的防治有着重要的意义。建立可靠的内皮损伤的动物模型对于临床筛选药物和探讨心血 管疾病的发生机理十分必要。
正是由于这些发现，对于内皮细胞功能的研究越来越令人瞩目。用药物等手段对内皮细 胞的内环境及其分泌物进行调整,从而逆转内皮功能失调，己成为心血管疾病治疗领域的一个 新的研究方向。近年对血管内皮的研究使人们重新认识血管内皮的功能和多种心血管疾病的 发病机理，积极寻找血管内皮功能障碍的早期诊断与治疗的方法具有重要意义。
TNF-ci是单核巨噬细胞、淋巴细胞产生的与炎症和免疫有关的重要细胞因子，其通过与 细胞表面的受体结合而起作用。对人和动物多种肿瘤细胞有细胞毒和细胞生长抑制作用。在 正常情况下,TNF-a具有抗肿瘤、抗感染等作用，但如持续释放或产生过多或与其他细胞因子关系失调，TNF-ci可以诱发血管内皮细胞及微循环中一系列炎症反应，刺激合成急性期反应 蛋白，催化并放大炎症反应和毒性作用，因此,TNF- a可造成组织广泛损伤。TNF- a是通过影 响靶细胞膜的磷脂代谢，导致氧自由基的产生和溶酶体的破裂，还可以激活核酸内切酶将DNA 裂解成片断导致细胞死亡，激活炎症细胞产生多种炎症介质，损伤微循环和内皮细胞[Harris PR, Mobley HL, Perez—perez GI，et al.Helicobacterpylori urease is a potent stimulus of mononuclear phagocyteactivation and inflamemator cytokine production [ J ]. Gastroenterology, 1996， 111 :419-425.]。在许多以血管内皮细胞损伤为发病关键环节的疾 病(动脉粥样硬化、血栓形成、肺水肿、妊高征等)中均可观察到这种细胞因子的改变。肿瘤 坏死因子可通过多种途径损伤血管内皮细胞，血管内皮细胞的损伤又促使肿瘤坏死因子的释 放，再次损伤血管内皮细胞，两者互为因果，形成恶性循环。
NO是独立存于血管、巨噬细胞和神经系统中的生理性调节因子，是由L-精氨酸和氧在一氧 化氮合酶(NOS)催化下合成的。N0S不足，则直接影响NO的合成。近年研究表明NO能舒张血 管、抑制血小板黏附聚集、清除氧自由基、维持正常的心输出量、保护细胞作用。当NO减少 时，血小板活化并释放血栓素、5-羟色胺、腺嘌呤核苷酸及血小板源性生长因子等。引起血管 收縮,血管平滑肌细胞增殖，导致微循环障碍而引起心肌缺血变性坏死，出现心功能减退及心 律失常等变化。[李中言，赵连友.一氧化氮与心血管疾病.中华心血管病杂志，1996,24 (1) :73-76;郭志刚，沈令刚，翁昌鸿,等.冠心病、高血压病人血浆自由基、 一氧化氮及纤溶 活性的变化.第一军医大学学报，1999, 19(2) :124-126.]。
CRP是一种非特异性炎症标志物，在感染和组织损伤时血浆浓度快速升高,现在认为它不 仅是炎症标志物,还可能直接参与AS等多种心血管疾病的发生发展，是目前心血管疾病的的预 不因子禾卩危险因子[Koenig W. Predicting risk and treatment benefit in atherosclerosis: the role of C-reactive protein. Int J Cardiol, 2005, 98 (2) :199-206; Ridker PM, He皿ekens CH, Buring JE, et al. C-reactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women. N Engl J Med, 2000, 342(12): 836-843.]。 CRP由肝脏合成，可促进补体激活导致免疫损伤。炎症细胞含有CRP受体，CRP和 受体结合活化细胞,通过直接浸润、聚集或间接产生细胞因子导致血管损伤。CRP是急性炎症 状态下血液中最常见的一种非抗体性蛋白质，CRP的增加程度在--定范围内与机体炎症反应 程度成正相关。
内皮素(Endothelin, ET)是1988年由日本学者Yanagisawa[Tamirisa P， Frishman WH, Kumar A. Endothelin and endothelin antagonism: roles in cardiovascular health and disease. AmHeart J, 1995， 130:601-610.]等从猪主动脉内皮细胞培养液中分离纯化出来的-- 种由21个氨基酸组成的血管活性肽，是目前所知功能最强的縮血管物质。ET可促进平滑肌细 胞的增殖和成纤维细胞的有丝分裂反应[张海涛，吴清玉.内皮素的临床研究进展[J].心血管 病学进展，1999， 20(3): 131.]。 ET在体内与其他血管活性物质的相互作用，参与调节血压和 血流动力学的变化[Baumer TM, Wiece KA， Koko TF, et al. Para/endocrime function of the vascular endothelium of healthy pregnant women and pregnant~with preecla叩sis and their meonattes[J]. Pol Arch Med Wewn, 2001,105(4): 271-278.]。是调节心血管功能的 重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态有重要作用。其引起的血管收縮、代谢紊 乱和细胞增殖是与血管损伤有关疾病的共同致病因素。
上述TNF-ci、 N0、 CRP、 ET四个物质是反映内皮细胞损伤的重要指示性标志，研究其变 化情况对于了解内皮细胞早期损伤具有重要的意义。而内皮细胞损伤与微循环障碍有密切关 系，可引发多种心血管疾病。
发明人已经获得了一种治疗心血管疾病的药物组合物专利权，该组合物专利号为 ZL00111303.8,其是由人参、丹参、麝香、蟾酥等名贵中药材组成。具有芳香益气通脉、活 血化瘀止痛之功效，主治冠心病心绞痛(气虚血瘀证)，症见胸痛胸闷(胸憋)、心悸气短、神倦
乏力、面色紫暗、舌淡紫、脉弱而涩者。i、 n、 in期临床研究显示该药治疗冠心病、心绞 痛疗效确切，无毒副作用。按照本处方比例可以制成药剂学上任何一种剂型，包括滴丸、水 丸、片剂、胶囊等制剂。
目前中药复方药物在阐述药物作用机理等基础研究还比较薄弱，大部分药物没有进行药 物作用机理的研究，药物作用机理研究还存在作用靶点不明确，药物作用基础物质不明确， 观测指标确定难等问题。该药物组合物属中药复方药物，其作用机理十分复杂，因此对其机 理的深入研究，有利于进一步阐明该药的作用机制，利于发现新的用途。该药物组合物是新 开发的中药，至今为止未见关于其保护内皮细胞早期损伤作用的报道。 [发明内容]
本发明的目的是提供上述治疗心血管病的药物组合物在制备对保护内皮细胞早期损伤治 疗药物中的应用。
上述药物组合物的处方组成和重量百分比为
人参皂苷7-15份，丹参水溶性提取物20-45份，人工麝香4-10份，人工牛黄12-24份， 熊去氧胆酸l-8份，蟾毒配基l-8份，冰片12-22份。
人参皂苷10份，丹参水提取物40份，人工麝香6份，人工牛黄20份，熊去氧胆酸3.3 份，蟾毒配基3.3份，冰片17.4。按照上述配比，该药物组合物可以制成任意一种药剂学上可以接受的剂型。其中滴丸剂
的制备方法如下
将上述组分中的人参皂甙与丹参水溶性提取物分别以水为溶媒溶解，人工麝香、人工牛 黄、熊去氧胆酸、蟾毒配基和冰片分别以无水乙醇为溶媒溶解，然后将上述溶解后的药物分
别经高压均质超微乳化至粒径不超过lum;按药物与载体聚乙二醇6000的比例1: 9取聚乙 二醇6000加热至85'C全部融化；然后将所有成分加入到聚乙二醇中去，在85。C温度的储液 罐中保温待用。
在低温箱内将液体硅油灌入高度不低于40cm的玻璃管中分层降温，使上层降至15'C， 下层降至5'C;将储液罐中的药液注入装有不同直径的滴头和真空吸附装置的滴制管中。滴 头距硅油液面距离小于5cra。调整真空吸附开关，使液体按预定频率滴入玻璃管的液体硅油 中，药滴缓缓沉落，依靠自身的张力逐渐收縮成丸。成丸后，插净表明硅油，室温干燥而得 成品。
本发明利用大鼠埋植血管紧张素缓释泵的方法成功制作了血管内皮损伤的模型，建立假 手术组、内皮损伤组、药物组合物组三组进行对比研究。通过测定血液中CRP、 TNF-a、 ET、 NO四个观察指标以及用透射和扫描电镜手段观察三个对照组细胞形态变化的方法来研究该药 物对内皮细胞损伤的保护作用。
血管内皮细胞直接与循环血液接触，易于受到血液中活性物质的影响，导致内皮细胞的损 伤，引起多种血管性疾病。肿瘤坏死因子TNF-ci可通过多种途径损伤血管内皮细胞，血管内 皮细胞的损伤又促使肿瘤坏死因子的释放，再次损伤血管内皮细胞，两者互为因果，形成恶 性循环。NO引起血管收縮，血管平滑肌细胞增殖，导致微循环障碍而引起心肌缺血变性坏死， 出现心功能减退及心律失常等变化。CRP是目前心血管疾病的的预示因子和危险因子。ET引 起的血管收縮、代谢紊乱和细胞增殖是与血管损伤有关疾病的共同致病因素。这四种物质的 异常是微循环障碍的重要标志之一 。
发明的有益效果本发明中该药物组合物能够降低血浆CRP、 TNF-a、 ET的水平，升高 血液NO的水平，通过改变这四种物质的变化，可知其能够保护内皮细胞早期损伤，随着给药 时间延长，保护作用更明显。电镜结果显示药物组合物治疗组内皮细胞损伤已经修复，形态 未见明显异常。首次阐明了该药物组合物对内皮细胞损伤具有保护作用的用途。


图1药物组合物对大鼠内皮损伤后血浆ET含量的影响 图2药物组合物对大鼠内皮损伤后血浆NO含量的影响图3药物组合物对大鼠内皮损伤后血浆TNF- a含量的影响 图4药物组合物对大鼠内皮损伤后血浆CRP含量的影响 图5三组大鼠胸主动脉扫描电镜图 图6三组大鼠肾动脉透射电镜图 [具体实施方式
]
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下面实施例仅用于说明本发明而并非对本发明 的限制。
实施例药物组合物对大鼠血管内皮早期损伤保护作用
材料和方法
1动物及分组
8周龄雄性SD大鼠125只(中国科学院上海实验动物中心购买)，体重200g土15g，分为ld、 3d、 7d、 14d和28d五个组。每组25只再分为成假手术组(sham组)5只，内皮损伤组10只(Np 组)、药物组合物治疗组10只(sx组)。苦味酸溶液标记。大鼠在新饲养环境适应一周。室内 词养，自然光照，通风条件良好，环境清洁,室温18-25'C，湿度合适。动物均饲普通饮食，自由 饮水。
2. 内皮损伤模型的制作
假手术组仅埋植生理盐水缓释泵，内皮损伤组在背部皮下埋置AngII缓释泵，药物组合 物组在埋AngII缓释泵同时，在埋泵前3d和埋泵后用药物组合物灌胃。每天一次。灌胃是动 作轻柔，以防止灌胃针头对消化道造成的损伤。
3. 药物组合物剂量和配制方法。
药物组合物的配制方法药物组合物超微粉浓度0.04g/ml,均按lml/100g动物体重 配制。药物组合物超微粉用0. 5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na， sodium carboxymethycellulose) 溶解。每天灌胃一次。
4. 取材及检测内容
所有动物情况良好，未出现死亡。分别在埋泵后的第ld、 3d、 7d、 14d和28d，动物麻醉 后仰卧固定于解剖台上。在胸骨左缘旁开0.5cm处自下而上依次剪开左侧肋软骨，暴露胸腔， 剪开心包，右心室抽血(每只动物约可以采血6 8ml)，用作血清学检测。取下长约1.5cm的 胸主动脉，纵行剪开，先在肝素生理盐水内漂洗三次，置于冷2.5%的戊二醛溶液固定。制作 扫描电镜标本。取下左肾动脉，也置于冷2.5%的戊二醛溶液，制作透射电镜标本。此外还取 出肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、心脏和主动脉， 一分为二，分别固定与10%中性福尔马林溶液和液氮保存，以备将来检测之用。
从右心室抽血(每只动物约可以采血6 8ml)，置于含10。/。EDTA 2Na 30u L和抑肽酶800u 的试管中，3500卬m离心15 min,分离血浆于-20。C保存，测CRP和ET;另取不抗凝的血标本 1. 5mL,3500 rpm离心10 min，分离血清-20。C保存，测TNF-a 、 NO。 ET采用放射免疫分析法，试 剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供，仪器为FJ-2008G全自动Y计数器;NO水平通过其代谢产 物亚硝酸盐浓度测定，试剂盒由南京聚力生物医学工程研究所提供。CRP采用免疫浊度法，试 剂为Beckon,仪器为贝克曼公司的IMMAGE特定蛋白定量仪。TNF-a采用ELISA，仪器为雷勃公 司的Wellscan II型酶标仪器。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。 5透射电镜标本处理程序
取出肾动脉，肝素生理盐水洗涤。2. 5y。戊二醛前固定2h、 PBS洗涤三次，1%锇酸后固定1 2h。 PBS漂洗20min。分别用70%、 80%、 90%、 100%梯度丙酮脱水，每次10min。 Epon812包埋、 烤箱内45'C(12h)、 6(TC(36h)。半薄切片定位，超薄切片于铜网上。醋酸双氧铀和柠檬酸铅 染色。Philips TECNAI-12型电镜观察拍照。 6扫描电镜标本处理程序
取出胸主动脉，肝素生理盐水洗涤。2.5%戊二醛前固定21!、缓冲液漂洗20min。分别用 70%、 80%、 90%、 100°/。丙酮梯度脱水，临界点干燥，喷金。Philips XL30ESEM型电镜观察拍照。
结 果
由图l显示药物组合物能够降低血浆中内皮素的含量，在用药第—、天，与内皮损伤组无显 著差异，其余四个时间点，两者之间均有显著性差异(P<0.01)。
由图2显示在ld、 3d、 7d三个时间段，药物组合物治疗组和内皮损伤组相比，NO含量无 显著性差异。但在14d和28d两个时间点，两者有显著性差异(P<0.01)。说明随着用药时间的 延长，药物组合物能够升高NO的浓度。
由图3显示药物组合物治疗组和内皮损伤组相比，TNF-a水平在ld、 3d两个时间段无显著 性差异，在第7d，两者有显著性差异(P<0.05)，在14d和28d，两组间有显著性差异(P<0. 01)。 随着用药时间的延长，药物组合物能够降低TNF-a的浓度。
由图4显示在第3d、 7d、 14d和28d四个时间段，药物组合物治疗组能够显著降低血浆中CRP 含量，两者有显著性差异(P〈O.OD。随着用药时间的延长，药物组合物能降低CRP的浓度。
由图5显示扫描电镜可见假手术组，细胞形态呈梭形或不规则形结构，细胞结构轮廓较清 晰，中央部隐约可见隆起的细胞核。内皮细胞的长轴于血流的方向相一致。内皮损伤模型组， 见内皮细胞成片脱落，皮下组织和内弹力版裸露，表面粗糙不平，有时见血小板和白细胞粘 附。药物组合物组内皮仅有轻微的损伤，多出见内皮大部分已经修复。由图6显示假手术组见内皮细胞完整，内皮细胞间见有细胞连接，胞核清楚，连于呈波浪 形的内弹力版上。在内皮损伤组，可以见到内皮细胞不同程度的充血，肿胀，剥脱，在某些 部位还可见到内弹力板暴露。但在药物组合物组仅有轻微的内皮改变，新生内皮基本覆盖在 内弹力板上。部分区域内皮细胞较完整，病变轻，仅细胞质内线粒体略肿胀。平滑肌细胞未见 明显异常。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，下述该实施例仅用于说明本发明而对本发明 没有限制。 实施例一
1、 配方
按下述配比称取原料
人参皂苷0. 45克丹参水溶性提取物1. 35克人工麝香0. 3克人工牛黄0. 72 克 熊去氧胆酸0.24克蟾毒配基0.24克 冰片O. 66克 聚乙二醇6000 34克制成 1000粒滴丸。
2、 制备方法
将上述组分中的人参皂甙与丹参水溶性提取物分别以水为溶媒溶解，人工麝香、人工牛 黄、熊去氧胆酸、蟾毒配基和冰片分别以无水乙醇为溶媒溶解，然后将上述溶解后的药物分 别经高压均质超微乳化至粒径不超过lum;按药物与载体聚乙二醇6000的比例1: 9取聚乙 二醇6000加热至85'C全部融化；然后将已经溶解超微乳化的药物按先水溶性成分后脂溶性 成分的顺序， 一一加入到聚乙二醇中去，在85'C温度的储液罐中保温待用。
在低温箱内将液体硅油灌入高度不低于40cm的玻璃管中分层降温，使上层降至15'C, 下层降至5'C;将储液罐中的药液注入装有不同直径的滴头和真空吸附装置的滴制管中。滴 头距硅油液面距离小于5cm。调整真空吸附开关，使液体按预定频率滴入玻璃管的液体硅油 中，药滴缓缓沉落，依靠自身的张力逐渐收縮成丸。成丸后，插净表明硅油，室温干燥而得 成品。
实施例二 1.配方
人参皂苷0. 3克丹参水溶性提取物1. 2克人工麝香0. 18克人工牛黄0. 6克熊去氧胆酸O. l克蟾毒配基O. l克 冰片O. 52克 聚乙二醇6000 27克制成1000粒 滴丸。
2、制备方法
同实施例一。 实施例三
1. 配方
人参皂苷0. 21克 丹参水溶性提取物0. 6克 人工麝香0. 12克 人工牛黄0. 36 克 熊去氧胆酸0. 03克蟾毒配基0. 03克 冰片0. 36克 聚乙二醇6000 15克制成 1000粒滴丸。
2、 制备方法
同实施例一。
权利要求
1.一种药物组合物在制备对保护内皮细胞损伤药物中的应用
2. 根据权利要求1所说的用途，其特征在于该药物组合物在制备改善内皮细胞损伤所致心血 管疾病药物中的应用。
3. 根据权利要求l所说的内皮细胞损伤，其特征在于引起内皮细胞损伤的因素为CRP因子、 TNF-a因子、ET因子、NO因子中的一种或几种。
全文摘要
本发明属医药领域，具体涉及一种药物组合物在制备对保护内皮细胞早期损伤药物中的应用。本发明利用大鼠埋植血管紧张素缓释泵的方法成功制作了血管内皮损伤的模型，建立假手术组、内皮损伤组、药物组合物组三组进行对比研究。通过测定血液中CRP、TNF-α、ET、NO四个观察指标以及观察三个对照组细胞形态变化的方法来研究药物组合物对内皮细胞损伤的保护作用。药物组合物能够通过降低血浆CRP、TNF-α、ET的水平，升高血液中NO的水平，因此首次阐明该药物组合物对内皮细胞具有保护作用。
文档编号A61K38/19GK101406693SQ200710163509
公开日2009年4月15日 申请日期2007年10月12日 优先权日2007年10月12日
发明者斌 何, 剑 刘, 刘艳红, 王未沫, 王鹏义, 解小刚 申请人:内蒙古伊泰药业有限责任公司