疫苗及其制备方法

专利名称：疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及疫苗及其制备和施用方法，且特别涉及用于水生动物的纳米化 疫苗、其制备方法及施用方法。
背景技术：
病毒性神经坏死症(Viral nervous necrosis disease, VNN disease)是近年来普 遍发生在海水养殖鱼类的病毒性疾病，首次发生在日本，随后发生在世界各地， 除了非洲之外，其他各洲都有案例，是一种全球性的鱼类病毒性疾病，造成此 疾病的病毒称为神经坏死症病毒(N ervous necrosis virus, NNV),或称为鱼类结病 毒(Fish nodavims or Beta-nodavirus)。
神经坏死症病毒为单股RNA病毒，不具外套膜、外型为二十面体、直径约 25~34nm的病毒颗粒。罹病初期的鱼苗会有突发性的游动，体色变黑，失去平 衡能力，及回旋打转、螺旋游泳等不正常游泳行为，部分鱼只有身体侧弯、体 色变黑，有时会侧躺漂浮在水面，虚弱的鱼苗先是浮在水面，最后沈入池底死 亡；在出现病症后的一周内即会发生大量死亡的情形(Yoshikoshi, Inoue, 1990; Glazeb訓k et al" 1990; Bloch et al., 1991; Renault et al" 1991)。
随着养殖技术的进步，传统粗放式养殖逐渐转型发展到今日高密度集约式 养殖。目前世界上从事水产养殖业的国家大多采取高密度集约式养殖，此方式 虽能大幅度提高单位面积的生产能力，但也造成了许多问题，特別是养殖过程 中因管理不当而引起的疾病爆发。
现今的防治方法主要为药物处理，例如，以氯、碘、铵或臭氧对用具、鱼 卵、水及何料进行消毒，但在解决鱼类病毒性疾病中，除了环境的消毒及增加 鱼体免疫力外，疫苗的开发也非常重要，且台湾及许多鱼苗养殖国家每年都有 病毒性神经坏死症(VNN)爆发，造成经济严重损失，因此发展有效的神经坏死病 毒疫苗成为防疫工作的首要项目。

发明内容
本发明的目的是提供一种疫苗的制备方法及施用方法。本发明的疫苗制备 方法可制备出颗粒大小在20至500 nm之间的纳米化疫苗，保护效果在60%相 7十存活率(relative percentage survival, RPS)以上的疫苗。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括
一种制备疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)利用细胞林培养 病毒，以获得含有所述的病毒的上清液；(b)将所述的上清液以去活化药剂处 理，得到去活化疫苗；以及(c)将所述的去活化疫苗经纳米化包埋程序，形成 纳米化包埋的去活化疫苗。
优选的实施方案中，所述的纳米化去活化疫苗的大小在20至500nm之间。
优选的实施方案中，所述的细胞林为所有对NNV具感受性的鱼类细胞才朱。
优选的实施方案中，所述的细胞林是GF-1、 SSN-1、 E-ll、 GB3、 GF、 GL、 SISE、 GS、 SAF1或GL-av。
优选的实施方案中，所述的病毒是自所有罹患神经坏死症鱼体分离出来的 NNV分离抹的任意一种。
优选的实施方案中，所述的病毒是RGNNV、 SJNNV、 TPNNV、 BFNNV、 FEV、 DG丽V、 GGNNV、 G9410YA、 G9508KS或HGOOGD。
优选的实施方案中，所述的去活化药剂是0.1-0.2%体积比的曱醛水溶液或 2-澳乙胺(binary ethyleneimine)。
优选的实施方案中，所述的纳米去活化疫苗的病毒浓度在105TCID50/ml 以上。
优选的实施方案中，所述的纳米去活化疫苗的保护效果(relative percentage survival, RPS)为60%以上。
优选的实施方案中，所述的纳米去活化疫苗为浸泡式疫苗，以浸泡的方式 进行免疫。
优选的实施方案中，所述的浸泡的时间为30至60分钟之间。
优选的实施方案中，所述的纳米去活化疫苗用于免疫水生动物。
优选的实施方案中，所述的水生动物是鱼类、坏类或蟹类。
优选的实施方案中，所述的鱼类是金目逢卢(barramundi， Lates Calcarifer)、海
逢卢(seabass, Dicentrarchus labrax)、 鲜鱼(turbot, Scophthalmus maximus)、 红点石
斑(red-spotted grouper， Epinephelus akaara)条纟文錄(striped jack, Pseudocaranxdentex)、大西洋t匕目鱼(Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus)、虎;可鱼屯(tiger puffer, Takifugu mbripes)、 日本鲽鱼(Japanese flounder, Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel)、 条斑星鲽(barfin flounder, Versaper moseri)、 红甘錄 (purplish amberjack， Seriola dumerili)、 七带石斑(sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus)或曰本真多卢(Japanese sea bass, Lateolabrax japonicus)。
优选的实施方案中，所述的鱼类的鱼龄小于或等于1个月。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案还包括
一种疫苗，其是由权利要求1所述的方法制备得到，其特征在于所述的 疫苗的颗4立大小在20至500 nm之间，且其寸呆护凌丈果(relative percentage survival, RPS)在600/。以上。
优选的实施方案中，所述的制备疫苗用的病毒来自罹患神经坏死症鱼体分 离出来的NNV分离才朱。
优选的实施方案中，所述的NNV分离抹是RGNNV 、 SJNNV 、 TPNNV 、 BFNNV、 FEV、 DGNNV、 GGNNV、 G9410YA、 G9508KS或HG00GD。 优选的实施方案中，所述的疫苗的病毒浓度在105 TCID50/ml以上。 优选的实施方案中，所述的疫苗为浸泡式疫苗，以浸泡的方式进行免疫。 优选的实施方案中，所述的浸泡的时间在30 ~ 60分钟之间。 优选的实施方案中，所述的疫苗用于免疫水生动物。 优选的实施方案中，所述的水生动物是鱼类、蚱类或蟹类。 优选的实施方案中，所述的鱼类是金目多卢(barramundi， Lates Calcarifer)、海 多卢(sea bass, Dicentrarchus labrax)、 鲆鱼(turbot， Scophthalmus maximus)、 红点石 斑(red-spotted grouper, Epinephelus akaara)条纟丈錄(striped jack, Pseudocaranx dentex)、大西洋比目鱼(Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus)、虎河鱼屯(tiger puffer, Takifugu rubripes)、 日本蝶鱼(Japanese flounder, Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel)、 条斑星蝶(barfin flounder, Versaper moseri)、 红甘錄 (purplish amberjack, Seriola dumerili)、 七带石斑(sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus)或曰本真多卢(Japanese sea bass， Lateolabrax japonicus)等。 优选的实施方案中，所述的鱼类的鱼龄小于或等于1个月。 与现有技术相比较，本发明具有的有益效果是本发明的纳米包埋的去活 化疫苗的大小在20至500 nm之间，病毒浓度在105 TCID50/ml以上，且其相对
存活率(Relative percentage survival, RPS)在60%以上。


图1A显示当NNV病毒浓度为106 TCID50/ml时，无纳米包埋组及纳米包 埋组鱼苗的累积死亡率的比较；
图1B显示含高浓度NNV病毒(1(^TCID50/ml)的无纳米包埋疫苗组及低浓 度NNV病毒(105 TCID50/ml)的纳米包埋疫苗组鱼苗累积死亡率的比较。
具体实施例方式
本发明是提供一种制备疫苗的方法，包括以下步骤
(a) 利用细胞抹培养病毒，以获得含有病毒的上清液；
(b) 将上清液以去活化药剂处理，得到去活化疫苗；以及
(c) 将去活化疫苗经纳米化包埋程序后，形成纳米去活化疫苗。 在本发明的一实施例中，利用细胞抹增殖病毒，以获得含有病毒的细胞上
清液，其中细胞林包括所有对NNV具有良好感受性的鱼类细胞4朱，例如GF-1(美
国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)寄存编号
PTA-859;美国专利号US6，436，702)、 GF (Biochem. Biophys. Res. Comim. 2006
Oct 19)、 GL (Biochem. Biophys. Res. Comun. 2006 Oct 19)、 GB3 (Biochem.
Biophys. Res. Comun. 2006 Oct 19)、 SISE (J. Virol. Methods. 2006 Nov;
137(2):309陽16)、 GS(J. Virol. Methods. 2006 Jan;131(l):58-64)、 SAFl(Fish
Shellfish Immunol. 2004 Jan;16(1):11-24)、 SSN-l(Dis. Aquat. Organ. 1999 Dec
22; 39(l):37-47)、GL-av (Dis. Aquat. Organ. 2000 Nov 14; 43(2):81-9)或E-ll(Dis.
Aquat. Organ. 2000 Nov 14; 43(2):81-9)等，较佳为GF陽l。
病毒包括自所有罹患神经坏死症鱼体分离出来的NNV分离林，例如
RGNNV(J. Gen. Virol. 1995; 76 (7): 1563-1569)、 SJNNV (J. Gen. Virol. 1995; 76
(7): 1563-1569)、 TPNNV (J. Gen. Virol. 1995; 76 (7): 1563-1569)、 BFNNV(J. Gen.
Virol. 1995; 76 (7): 1563-1569)、 FEV、 DGNNV (Virology 2001; 290 (1): 50-58)、
GGNNV、 G9410YA(Dis. Aquat. Org. 2003;55 (3): 221-228)、 G9508KS(Dis.
Aquat. Org. 2003; 55 (3): 221-228)或HGOOGD(Dis. Aquat. Org. 2003; 55(3):
221-228)等，上述NNV分离抹包括许多品系(strain),例如SJNNV(D30814)、
TPNNV(D38637)、 BFNNV (D38635)、 RGNNV(D38636)、 MGNNV(AF245003)、
DGNNV(AF245004)、 B00GD(AY140794)、 G9508KS(AY140798)、
HG00GD(AY 140799)、 YP99PD(AY140800)、 G9410YA(AY140801)等，上述品系的核酸序列在美囯国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的基因库(Genbank)中都有记载。
取得含有病毒的上清液后，以0.1-0.2%的甲醛水溶液或4mM的2-溴乙胺 (binary ethyleneimine, BEI)去活化，形成去活化疫苗，再将去活化疫苗经纳米化 包埋程序，形成本发明的纳米化去活化疫苗。
本发明的去活化程序可为曱醛水溶液去活化或2-溴乙胺(binary ethyleneimine, BEI)去活化。在曱醛水溶液去活化程序中，可以0.1-0.2%的曱醛 水溶液溶液，在24。C至30。C下处理3至7天，再以磷酸緩沖液(PBS)透析24 小时，形成可使用的去活化疫苗。而在BEI去活化程序中，将2g的2-溴乙胺加 入100 ml的0.175 N的氢氧化钠中，在30。C至37°C下加热1-2小时，即形成 BEI去活化药剂。以3-4 mM的BEI药剂，在23-27。C下处理3至5天，并以磷 酸缓沖液(PBS)透析24小时，形成可使用的去活化疫苗。
本发明的纳米化包埋程序包括使用重量百分比为30-99.9%的基质与重量百 分比为0.1-70%的去活化疫苗，较佳为0.1%的去活化疫苗(有关纳米化包埋的程 序请参照台湾专利公开号TW200409656)。上述基质可为氢化植物油、氢化动物 油或C8-64饱和脂肪酸及其衍生物所组成的非水溶性基质。基质也可为二价离 子成胶类及其衍生物或随温度变化成胶类及其衍生物的水溶性基质。而被包埋 物为上述的去活化疫苗。
本发明的纳米包埋去活化疫苗的大小为约20至500 nm之间，较佳为约50 至100nm,最佳为约80nm。病毒浓度在105 TCID50/ml以上，较佳为约105至 107 TCID50/ml之间，最佳为约108 TCID50/ml。相对存活率在60%以上，较佳 在80%至90%之间。此外，与 一般的去活化疫苗相比，本发明的纳米包埋去活 化疫苗可以较少的量达到相同的保护效果，至少可节省病毒用量IOO倍，且纳 米包埋可增加疫苗保存时间，例如，可在4°C下存》t 1年以上。
本发明的去活化及纳米包埋去活化疫苗的施用方式可为注射法(如皮下注 射、肌肉注射)、口服法或浸泡法，较佳为浸泡法。本发明的浸泡方法适用于无 法以注射免疫的鱼苗，通常为鱼龄在1个月以内的鱼苗。浸泡方法为以105至 107 TCID50/ml的去活化疫苗或纳米去活化疫苗浸泡鱼苗，浸泡温度约20至25°C 之间，浸泡时间约30至60分钟之间。
本发明的去活化及纳米去活化疫苗适用于一般的水生(海水及淡水)动物，例 如鱼类、奸类或蟹类，特别是对NNV具感受性的鱼类，例如，金目妒(barramundi，Lates Calcarifer)、海多卢(sea bass, Dicentrarchus labrax)、鲆鱼(turbot， Scophthalmus maximus)、红点石斑(red陽spotted grouper, Epinephelus akaara)、条紋鰺(striped jack, Pseudocaranx dentex)、大西洋比目鱼(Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus)、 虎河鱼屯(tiger puffer, Takifugu rubripes)、 曰本鲽鱼(Japanese flounder, Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel)、条斑星鲽(barfin flounder, Versaper moseri)、红 甘鰺(purplish amberjack, Seriola dumerili)、 七带石斑(sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus)及日本真多卢(Japanese sea bass, Lateolabrax japonicus) 等。
实施例 病毒的增殖
将神经坏死病毒(NNV)接种在GF-1细胞，培养在含2%胎牛血清的L-15培 养液中，在28。C下4天，取含有病毒的细胞上清液。
以曱醛水溶液制备神经坏死病毒去活化疫苗
以0.2%的曱^水溶液(Formalin)进行神经坏死病毒(NNV)去活化处理，以去 活化的神经坏死病毒(NNV)作为疫苗的抗原。处理条件为取适当体积的37% 曱醛水溶液加入病毒液中，4吏曱醛水溶液的最终浓度为0.2%;例如耳又0.54ml的 37%甲醛水溶液加入99.46ml的病毒液中；将加入曱醛水溶液的病毒液置于 30°C, 3天后，以磷酸緩沖液(PBS)透析24小时，再以GF-1细胞测定各样品的 病毒力价。
以2-溴乙胺(binary ethyleneimine)制备神经坏死病毒去活化疫苗 以4 mM 2-溴乙胺(BEI)进行神经坏死病毒(NNV)去活化处理，以去活化的神 经坏死病毒(NNV)作为疫苗的抗原。处理条件为取2.1 g 2-溴乙胺(binary ethyleneimine)加入100 ml 0.175 N的NaOH中，再以37。C水浴槽加热2小时， 加热完毕后即为BEI;将配置好的BEI加入病毒液，使BEI的最终浓度为4mM， 置于25°C, 3天，取去活化病毒液以4°C磷酸緩冲液(PBS)透析24小时后备用。
纳米包埋程序 配方基质60%重量百分比的氢化-更棕油及30%重量百分比的椰子油
被包埋物10%重量百分比的被包埋物，被包埋物为本发明的去活化疫苗的 抗原以磷酸緩冲液(PBS)稀释100倍的稀释液
因此，纳米包埋疫苗中，去活化疫苗的抗原在纳米包埋后的浓度为包埋前 浓度的0.1%重量百分比。
条件
传输管管径20 mm 流速150升/小时 喷嘴口径0.8 mm
将氢化硬棕油、椰子油及本发明的去活化疫苗在55°C下充分搅拌均匀，利 用泵传输，注入38°C水溶液中造粒，再以冷冻干燥机干燥。 结果
颗粒粒径在80 nm左右，颗粒集结比重小于水，可悬浮在水中，溶点为43°C。 免疫方法
实验鱼苗为点带石斑(Epinephelus coioides ) 8分苗，体长平均为2.4cm, 重约0.22g,无NNV带原，蓄养在纯海水中，并以人工饲料驯斜。以浸泡方式 免疫，疫苗免疫条件分为4种(l)NNV浓度为106TCID50/ml的无纳米包埋疫 苗，(2)NNV浓度为106 TCID50/ml的纳米包埋疫苗，(3) NNV浓度为107 TCID50/ml的无纳米包埋疫苗，(4)NNV浓度为105 TCID50/ml纳米包埋疫苗。 浸泡免疫温度为25° C,浸泡时间30-60分钟，浸泡后将鱼只撈出置入新缸。 空白对照组则以磷酸緩冲液(PBS)代替疫苗。
活体攻毒试验
鱼苗免疫一个月后以浸泡方式攻毒，攻毒剂量为1.6xl06TCID50/ml的 NNV,浸泡温度为25° C,每组40尾苗。疫苗的保护效果以免疫鱼的相对存活 率(Relative Percent Survival, RPS)来计算，RPS= l-(免疫组鱼累积死亡率/对照组 鱼累积死亡率)x 100%。参照图1A，图1A显示当NNV病毒浓度为106 TCID50/ml 时，无纳米包埋组及纳米包埋组鱼苗的累积死亡率。^为PBS空白对照组，■ 为无纳米包埋的疫苗组，口为有纳米包埋的疫苗组。当病毒浓度都为106 TCID50/ml时，纳米包埋组鱼苗的累积死亡率最^f氐，经纳米包埋组疫苗免疫的鱼苗的RPS值为61%,经无纳米包埋组疫苗免疫的鱼苗的RPS值为32%。参照 图IB,图IB显示含高浓度NNV病毒(1(^TCID50/ml)的无纳米包埋疫苗组及 低浓度NNV病毒。经低病毒浓度的纳米包埋组(105 TCID50/ml)疫苗免疫的鱼苗 的累积死亡率最低，RPS值为85。/。，经高病毒浓度的无纳米包埋组(107 TCID50/ml)疫苗免疫的鱼苗的RPS值为43%。
保护期限试验
含107 TCID50/ml病毒浓度的BEI去活化神经坏死病(NNV)疫苗，浸泡免疫 石斑八分鱼苗，分批在免疫2周、1个月、3个月后，以1.6x106 TCID50/ml的 神经坏死病(NNV)浸泡攻毒。结果显示免疫2周后鱼苗的RPS值为30%,免疫 1个月后鱼苗的RPS值高达87.5。/。，而免疫3个月后鱼苗的RPS值仍高达82。/。。 由此可知，疫苗的保护效果在免疫后一个月达到高峰，且至少维持至免疫后三 个月。
以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人 员理解，在不脱离权利要求所限定的精神和范围的情况下，可作出许多修改、 变化或等效，但都将落入本发明的权利要求可限定的范围之内。
权利要求
1. 一种制备疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)利用细胞株培养病毒，以获得含有所述病毒的上清液；(b)将所述的上清液以去活化药剂处理，得到去活化疫苗；以及(c)将所述的去活化疫苗经纳米化包埋程序，形成纳米化包埋的去活化疫苗。
2. 根据权利要求1所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的纳米化去 活化疫苗的颗粒大小在20至500 nm之间。
3. 根据权利要求1所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的细胞林为 所有对NNV具感受性的鱼类细胞林。
4. 根据权利要求1所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的细胞林是 GF-1、 SSN-1、 E-ll、 GB3、 GF、 GL、 SISE、 GS、 SAF1或GL-av。
5. 根据权利要求1所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的病毒是自 所有罹患神经坏死症鱼体分离出来的NNV分离林的任意一种。
6. 根据权利要求1所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的病毒是 RGNNV、 SJNNV、 TPNNV、 BFNNV、 FEV、 DGNNV、 GGNNV、 G9410YA、 G9508KS或HG00GD。
7. 根据权利要求1所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的去活化药 剂是曱醛水溶液或2-溴乙胺(binary ethyleneimine)。
8. 根据权利要求1所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的纳米化去 活化疫苗的病毒浓度在105 TCID50/ml以上。
9. 根据权利要求1所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的纳米化去 活化疫苗为浸泡式疫苗，以浸泡的方式进行免疫。
10. 根据权利要求9所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的浸泡的时 间为30至60分钟之间。
11. 根据权利要求1所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的纳米去活 化疫苗用于免疫水生动物。
12. 根据权利要求11所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的水生动 物是鱼类或、虾类或蟹类。
13. 根据权利要求12所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的鱼类是金目多卢(barramundi, Lates Calcarifer)、 海多卢(sea bass, Dicentrarchus labrax)、 鲆鱼 (turbot, Scophthalmus maximus)、红点石斑(red-spotted grouper, Epinephelus akaara) 条纟丈鲮(striped jack, Pseudocaranx dentex)、 大西洋比目鱼(Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus)、 虎河鱼屯(tiger puffer, Takifugu rubripes)、 日本鲽鱼 (Japanese flounder, Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel)、条斑星鲽(barfin flounder, Versaper moseri)、 红甘鰺(purplish amberjack, Seriola dumerili)、 七带石 斑(sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus)或曰本真多卢(Japanese sea bass, Lateolabrax j aponicus)。
14. 根据权利要求12所述的制备疫苗的方法，其特征在于所述的鱼类的 鱼龄小于或等于1个月。
15. —种疫苗，其是由权利要求1所述的方法制备得到，其特征在于所述 的疫苗的颗粒大小在20至500 nm之间。
16. 根据权利要求15所述的疫苗，其特征在于所述的制备疫苗用的病毒 来自罹患神经坏死症鱼体分离出来的NNV分离^f朱。
17. 根据权利要求15所述的疫苗，其特征在于所述的NNV分离抹是 RGNNV、 SJNNV、 TPNNV、 BFNNV、 FEV、 DGNNV、 GGNNV、 G9410YA、 G950汰S或HG00GD。
18. 根据权利要求15所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗的病毒浓度在 105 TCID50/ml以上。
19. 根据权利要求15所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗为浸泡式疫苗， 以浸泡的方式进行免疫。
20. 根据权利要求19所述的疫苗，其特征在于所述的浸泡的时间在30-60分钟之间。
21. 根据权利要求15所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗用于免疫水生动物。
22. 根据权利要求21所述的疫苗，其特征在于所述的水生动物是鱼类、 虾类或蟹类。
23. 根据权利要求22所述的疫苗，其特征在于所述的鱼类是金目鲈 (barramundi, Lates Calcarifer)、 海逢卢(sea bass， Dicentrarchus labrax)、 鲆鱼(turbot， Scophthalmus maximus)、 红点石斑(red-spotted grouper, Epinephelus akaara)条纟丈 鲮(striped jack, Pseudocaranx dentex)、 大西洋比目鱼(Atlantic halibut,Hippoglossus hippoglossus)、 虎河鱼屯(tiger puffer, Takifugu rubripes)、 日本鲽鱼 (Japanese flounder, Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel)、条斑星鲽(barfin flounder, Versaper moseri)、 红甘錢(purplish amberjack, Seriola dumerili)、 七带石 斑(sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus)或曰本真纟卢(Japanese sea bass, Lateolabrax japonicus)等。
24.根据权利要求22所述的疫苗，其特征在于所述的鱼类的鱼龄小于或 等于1个月。
全文摘要
本发明是提供一种疫苗及其制造方法。此方法包括(a)利用细胞株培养病毒，以获得含有病毒的上清液，(b)将病毒去活化，以形成去活化疫苗，(c)将去活化疫苗进行纳米化处理。本发明的纳米包埋的去活化疫苗的颗粒大小在20至500nm之间，病毒浓度在10⁵TCID50/ml以上，且其用于水生动物的相对存活率(Relative percentage survival，RPS)在60％以上。
文档编号A61K39/12GK101461941SQ20071030222
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月20日 优先权日2007年12月20日
发明者齐肖琪 申请人:施怀哲股份有限公司