具有免疫调节和抗肿瘤能力的肽的制作方法

专利名称：：具有免疫调节和抗肿瘤能力的肽的制作方法
技术领域：
：本发明包括在癌症免疫疗法领域中。更确切地说，衍生自鲎(Z/zzw7m)抗-LPS因子这种蛋白质的32-51区域的肽或其组合，所述肽不能与脂多糖结合并呈现出免疫调节和抗肿瘤性质以用于治疗癌症和转移。现有技术近期已报道了生物应答的改性剂主要与目前疗法相组合地用于治疗癌症以增强治疗益处的用途(US2004/0101511)。另一方面，CpG序列(Toll-样受体9(TLR9)的激动剂)的用途已被开发为新药物以用于治疗、控制和预防癌症的多种适应症，即非小细胞肺癌、黑素瘤和肾癌(KlinmanD.M.等人(2004)ImmunotherapeuticusesofCpGoligodeoxynucleotides.Aev4:249-258)。Toll-样受体7(TLR7)的激动剂目前在I期临床试验中就激活免疫系统进行测试，具有作为新药物以用于治疗黑素瘤和其他肿瘤的有希望的结果(DudekA.Z.等人(2005)ASCOAnnualMeeting)。先前提及的TLR7和9的激动剂还基于其在宿主中促进有效免疫应答的能力在病毒感染中进行评估。此外，已开发了与TLR4结合的所谓的热休克蛋白(Hsp)，并被制备为与人乳头瘤病毒(HPV)E7癌蛋白质的融合蛋白。这种新免疫治疗方法也称为治疗性疫苗，具有用于治疗人乳头瘤病毒相关疾病的广泛前景(ChuN.R等人(2000)Immunotherapyofahumanpapillomavirus(HPV)type16E7-expressingtumourbyadministrationoffusionproteincomprisingMycobacteriumbovisbacilleCalmette-Guerin(BCG)hsp65andHPV16E7.^rp//腿mo/121:216-225)。Toll-样受体是存在于免疫系统的细胞中的受体分子，其识别病原体相关的分子模式，如LPS、脂磷壁酸质、未曱基化的CpG序列以及病毒双链和单链RNA。TLR对于侵入性病原体的识别帮助免疫系统指导平衡的Thl/Th2免疫应答，以有效地将感染清除出生物体。TLR激动剂作为药物来治疗癌症的用途基于激活先天性和适应性的免疫系统。其主要机制在于激活由I型干扰素(例如，IFNa和P)和白介素12(IL-12)介导的Thl免疫应答。因此，达到高度特异的和持久的免疫应答(SwitajT.,JaliliA.等人(2004)CpGImmunostimulatoryoligodeoxynucleotide1826enhancesantitumoreffectofinterleukin12gene-modifiedtumorvaccineinamelanomamodelinmice.C///7/ca/(7a/7cer)esearc力，Vol.10:4165-4175)。免疫系统的这种双重激活与几种其他免疫治疗方法相反，所述其他免疫治疗方法不能在适应性免疫应答中产生持久效应，并且还非特异性地激活先天性免疫系统并具有后续的不希望的效应(SpeiserD.E等人(2005)RapidandstronghumanCD8+Tcellresponsestovaccinationwithpeptide，IFA，andCpGoligodeoxynucleotide7909.r力e/ow/7a7o尸6V2'/z/ca///「e5^.Vol.115(3))。树突细胞(DC)是通过细胞-细胞相互作用和细胞因子的产生来连接先天性和适应性免疫应答的专业的抗原呈递细胞。基于一系列表面分子标记物的表达以及不同TLR的表达，DC可以具有骨髓或淋巴起源。淋巴起源的DC(也称为浆细胞DC)是I型干扰素的主要来源。考虑到这些性质，DC已作为有希望的细胞佐剂进行了处理，以开发针对癌症和慢性病毒感染的治疗性疫苗(SantiniS.M.等人(2003)AnewtypeIIFN-mediatedpathwayforrapiddifferentiationofmonocytesintohighlyactivedendriticcells,57e迈CeZ/s,21:357-362)。然而，这是非常昂贵和困难的技术，目前正通过其来开发其他更实际和费用更低的备选治疗策略(VanEppsH.L.(2005)Newhopefortumor4vaccines,r力e/owi72a/o尸iUT^er/zzze/ifaiyl/e(//c//7e，Vol.202:1615)。最初通过其抗病毒活性进行描述，I型干扰素UFNct，P)近期已显示对免疫系统发挥重要影响，通过其对DC的辅佐效应来促进细胞和体液免疫应答(Bogdan，C.(2000)ThefunctionoftypeIinterferonsinantimicrobialimmunity.Cwrr,/顺""o厶12:419-424)。近期工作已显示出内源性I型干扰素在高度免疫原性同系基因鼠类肉瘤消退的过程中，以及在保护宿主免于原发性致癌肿瘤形成中的关键作用(GavinP.Durm等人(2005)AcriticalfunctionfortypeIinterferonsincancerimmunoediting.y"we/顺w7o/野，June12)。此夕卜，在病毒感染例如流感中,IFN-oc通过直接激活004+或008+T淋巴细胞而在起始抗病毒T淋巴细胞应答中起重要作用(FonteneauJ.F等人(2003)Activationofinfluenzavirus-specificCD+4andCD+8Tcells:anewroleforplasmacytoiddendriticcellsinadaptiveimmunity,/迈膨/7062'c^og7，101:3520-3526)。Hoess(WO95/05393)在他的发明中描述了以高亲和力结合LPS的物质，其用于预防或治疗感染，例如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌介导的败血症、一般而言的细菌感染和真菌感染。此类物质是具有内毒素结合结构域的LPS结合肽(HoessA.等人(1993)Crystalstructureofanendotoxin-neutralizingproteinfromthehorseshoecrab,Limulusanti-LPSfactor,at1.5A°resolution,r力e/.12:3351-3356)。原始鲎抗-LPS因子(LALF)这种蛋白质的晶体结构揭示出类似于多粘菌素B的环，其带正电荷、为两亲性的并包含暴露的疏水和芳香族残基。基于这个原则，他证明了相应于LALF蛋白上的氨基酸31-52的序列结合并中和与肝素相关的效应的能力，所述效应例如为抗凝、血管发生以及抑制内皮和肿瘤细胞的增殖。然而，在上文提及的专利中不存在支持这种阐述的实验数据。事实上，所授权的权利要求涉及用于去除溶液中的LPS的装置，其中所述装置包含固定在固体支持体中的肽(US6,384,188)。另一方面，Vallespi(US6,191,114)在她的发明中描述了包含LALF蛋白的氨基酸31-52的肽，其通过诱导IFN-ot和y而对于Hep-2和MDBK类型的细胞施加抗病毒效应；在她的发明中还描述了所述肽用于治疗病毒感染和免疫抑制相关病症的用途。此外，同一作者已证明了这种肽在败血症的动物模型中的抗感染效应(VallespiM.G.等人(2003)ALimulusanti-LPSfactor-derivedpeptidemodulatescytokinegeneexpressionandpromotesresolutionofbacterialacuteinfectioninmice,/"fer/za〃ona〃/Z7節/70/7力ar/zaco70^7，3:247-256)。存在许多针对癌症的疗法，包括化疗、放射和基因疗法。毒性是所有这些疗法的一个主要缺点，其中在延长的时间段内施用高剂量以最终达到某些有益的疗效。因此，仍需要开发新药物用于获得更有效的治疗。基于免疫系统检测和指导针对肿瘤的有效应答的基本作用，被设计为激活宿主先天性和适应性防御机制的药物可以变成用于癌症治疗的有力工具。迄今没有描述过在LALF蛋白质的序列HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW中的特定氨基酸置换，其消除了结合LPS的能力并增强免疫调节效应，还在体内赋予针对几种肿瘤的抗肿瘤效应。发明详述本发明解决了先前提及的问题，提供了衍生自LALF蛋白质序列HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW(SEQ.ID.NO:13)的32-51区域的肽，其中氨基酸已进行置换以消除结合LPS的能力并增强免疫调节和抗肿瘤效应。通过置换而衍生自所述序列的类似肽(其不结合LPS或肝素，并与亲本肽相比较还提供增加的免疫调节和抗肿瘤效应)呈现出下述序列HARIKPTFRRLKWKYKGKFWHYRIKPTARRLKWKYKGKFWHYRIKPTFRRLAWKYKGKFWHYRIKPTFRRLKWKYKGKFA(SEQ.ID.NO:1)(SEQ.ID.NO:2)(SEQ.ID.NO:3)(SEQ.ID.NO:4)由Hoess和Vallespi描述的LPS结合肽是不利的，因为它们使混合的Thl/Th2特性镨朝向对癌症患者有害的占优势的Th2特性谱方向偏离。由于免疫抑制这些患者通常呈现伴随感染，其中不排除血液中LPS颗粒的存在。在LPS存在下诱导占优势的Th2特性谱的肽的施用将导致不希望的效应，这使患者的免疫状态进一步恶化并使针对肿瘤的宿主应答变坏。此外，由Vallespi描述的肽与LPS的结合将使这种肽的免疫调节效应降到最低。另一方面，在本发明中描述的肽缺乏与肝素的结合使得它们优于先前由Hoess和Vallespi描述的那些。在临床患者例如患有缺血性心脏病、脑血管病、静脉血栓栓塞性疾病(深静脉血栓形成和肺栓塞)和下肢缺血的那些患者中，肝素的使用被指明为治疗(D.CabestreroAlonso等人(2001)Heparinasdebajopesomolecularenpacientescri'ticos:usos，indicacionesytipos.#ed/c//7a/""/7"><3，Vol.95:18-26)。随后施用肝素结合肽在这种情况下可以是禁忌的，因为千扰了这种药物的效应。癌症和血栓栓塞性疾病的关联是可以显著促成癌症患者中的发病率和死亡率的经充分描述的现象，例如深静脉血栓形成和肺栓塞。基于先前提及的这些原因，能够获得不能结合肝素并显示出免疫调节和抗肺瘤效应的肽在治疗癌症患者中是有利的，大部分这些患者通常经历外科手术并呈现出其他病症例如高凝性(CastelliR.等人(2004)Theheparinsandcancer:Reviewofclinicaltrialsandbiologicalproperties.Kascu/ar#ed/c//2e,Vol.9:l-9)。本发明还包括具有2个或更多个由丙氨酸置换的氨基酸的肽，其包含下述氨基酸序列HYRIKPTARRLAWKYKGKFWHARIKPTARRLKWKYKGKFWHARIKPTFRRLAWKYKGKFWHARIKPTARRLAWKYKGKFWHARIKPTARRLAWKYKGKFA(SEQ.ID.NO:8)(SEQ.ID.NO:9)(SEQ.ID.NO:10)(SEQ.ID.NO:11)(SEQ.ID.NO:12)，和通过合成或重组过程获得的这些前述肽的任何同源或模拟变体，以及任何包含它们的融合肽。同源变体涉及缺乏LPS或肝素结合能力并具有免疫调节和抗肿瘤效应的任何肽。类似地，所述模拟变体涉及其结构缺乏LPS或肝素结合能力并维持免疫调节和抗肿瘤效应的任何化学起源的分子(非蛋白质)。在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物包含一种或多种肽和化合物或其各自的药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂或载体。在本发明的其他优选实施方案中，药物组合物另外还包含选自细菌、病毒或癌抗原的抗原。类似地，本发明的肽可以与针对癌症的常规治疗如化疗、外科手术、放射等联合使用。本发明还包括这些肽和化合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于治疗和/或预防需要有效的Thl免疫应答的免疫学病症；治疗或预防癌症；以及发展出针对细菌或病毒起源的感染的有效的免疫应答。所描述的肽通过缺乏结合LPS的能力来进行定义，而不是先前描述为用于LPS结合的共有最佳结构域的原始HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW序歹'J(Hoess等人(1993)Crystalstructureofanendotoxin-neutralizingproteinfromthehorseshoecrab,Limulusant卜LPSfactor,at1.5AQresolution,r力e/.12:3351-3356)。同样地，与Vallespi在她的专利(US6,191,114)中将其描述为抗病毒和免疫调节肽的衍生自LALF蛋白质并且包含氨基酸32-51的肽相比较，在本发明中描述的肽增强由IFN-oc的分泌所介导的免疫调节效应。类似地，可以将本发明中描述的肽施用于免疫抑制的患者和需要激活其免疫状态的那些患者，例如患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的患者和经历复杂手术的患者。体内实验数据证实了类似肽在移植入小鼠中的肺瘤中的功效，这些肿瘤衍生自鼠类黑素瘤B16细胞；来自C57BL/6小鼠的恶性肺上皮细胞；和得自小鼠肺癌的3LL-D122细胞。在另一个实施方案中，可以施用肽以使转移事件降到最低。本发明的其他结果表明，所描述的肽显示出对各种组织学起源的胂瘤细胞系的抗增殖效应，这证实了对癌细胞的直接的细胞毒性效应。原则上，所描述的肽可以单独地或者与用于治疗癌症的目前疗法(例如外科手术、放射或化疗)联合使用。类似地，当在预防方面进行施用时，在本发明中描述的肽产生针对肿瘤的快速的先天性免疫应答，随后发展出适应性的抗原特异性免疫应答，这强调了其在针对癌症的预防或治疗性疫苗中的用途。附图简述图1:肽对于结合细菌脂多糖(LPS)的能力的影响。图1A，这些实验一式三份地进行；显示了一次实验的抑制曲线。图1B中显示的抑制百分比表示3次独立实验的平均值。图2:肽对于结合阴离子化合物肝素的能力的影响。显示了3次独立实验的平均值。图3:肽对于人单核细胞中干扰素a和P以及IL-12的产生的影响。3次实验用不同供体来进行，显示了其中之一的结果。图4:肽在TC-1胂瘤模型中的抗肿瘤效应。图5:L-2肽在黑素瘤模型中的抗肿瘤效应。图6:L-2类似肽在TC-1肿瘤模型的预防性施用方案中的抗肿瘤效应。图7:L-2类似肽在使用TC-1肿瘤细胞的双重攻击方案中的抗肿瘤效应。图8:L-2类似肽的抗转移能力。图9:L-2类似肽对于TC-1、H125和L929细胞增殖的影响。实施例实施例1.肽合成本发明的肽根据固相操作程序来合成。粗制的肽用30%乙酸溶液进行萃取，冻干，并通过RP-HPLC进一步纯化。纯化的肽的分子量通过使用质谱仪JEOLJMS-HX110HF与FAB枪进行检查。所得到的制剂是非抗原性的、非热原性的并且对于在动物和人中施用是药学上可接受的。置换通过将丙氨酸引入肽HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW的原始序列的每个位置中来进行。实施例2.选择缺乏结合脂多糖(LPS)的能力的类似肽这个测定法由ELISA类型的竟争系统(HardyE.等人(1990EnhancedEUSAsensitivityusingTCAforefficientcoatingofbiologicallyactiveLPSorLipidAtothesolidphase././迈/ou"o/.#eM.Vol.176:111-116)组成。使用0.2%三氯乙酸(TCA),将聚苯乙烯平板(Costar，USA)用来自大肠杆菌0111:B4的LPS(1pg/ml)进行包被。平板于37。C温育过夜，并用1X磷酸盐緩冲盐水(IXPBS)+Q.1%Tween-20(洗涤溶液)进一步洗涤10次。类似肽与固定至固体表面的LPS的结合通过使用0.2^iM的生物素化的LALF32—51肽的竟争ELISA进行评估，获得90。/。的最大LPS结合。为了估计抑制曲线，使用IOjuM-0.01jaM的不同浓度的类似肽，并且制作LALF32_51肽的曲线作为实验对照。生物素化的LALF32-"在类似肽存在下于37'C温育2小时，并且平板在那之后用洗涤溶液洗涤5次。与LPS结合的生物素化的LALF3^通过于37C与链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物(1:2，000稀释度)温育45分钟来进行检测。平板用洗涤溶液洗涤5次，并且添加底物溶液(0.05M柠檬酸盐-磷酸盐緩沖液，pH5.5，1片3，3'，5，5'-四曱基联苯胺和0.025%过氧化氢)。在15分钟温育后，反应通过添加2M疏酸来终止。吸光度在450nm处在平板阅读器(SensidentScan)中进行定量。在类似肽的光密度值和LPS结合能力之间存在关联。与LALF32-5,肽的抑制曲线相比较，具有更高LPS结合能力的类似肽显示出更低O.D.的抑制曲线。与LALF3^肽的抑制曲线相比较，具有更低LPS结合能力的类似肽呈现出具有更高O.D.值的抑制曲线。结果显示于图1A中，其证实命名为L-2、L-8、L-12和L-20的肽丧失了结合LPS的能力，而肽L-9和L-19显示出类似于LALF^肽的结合LPS的能力。另一方面，L-3肽显示出更高的LPS结合能力。图1B给出了根据其替代生物素化的LALF32—51(0.2nM)与吸附至固体表面的LPS进行结合的能力，在固定的0.5M浓度时，类似肽的抑制百分比。抑制％=(l-(([O.D.]样品-[O.D.]最小)/([O.D.]最大一最小)"x100样。。。在固定浓度的类似肽存在下的光密度值；最小:ELISA背景;a^无类似肽时的光密度值。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>L-1932HYRIKPTFRRLKWKYKGKAW51(SEQ.ID.NO:7)L-2032HYRIKPTFRRLKWKYKGKFA51(SEQ.ID.NO:4)作为来自这些分析的结果，从缺乏LPS结合能力的肽开始进行双重、三重和四重突变HYRIKPTARRLAWKYKGKFW(SEQ.ID.NO:8)HARIKPTARRLKWKYKGKFW(SEQ.ID.NO:9)HARIKPTFRRLAWKYKGKFW(SEQ.ID.NO:10)HARIKPTARRLAWKYKGKFW(SEQ.ID.NO:11)HARIKPTARRLAWKYKGKFA(SEQ.ID.NO:12)实施例3.类似肽L-2、L-8、L-12和L-20的肝素结合能力的评估。这个测定法由类似于先前描述的那种的ELISA类型的竟争系统组成。使生物素化的LALF3w,肽在IXPBS中吸附至聚苯乙烯平板(Costar，USA),并于4。C温育过夜。将类似肽L-2、L-8、L-12和L-20以2/aM与在1XPBS+0.1%牛血清白蛋白(BSA)中的250个单位的肝素(肝素钠，5，000U/ml，Liorad)相混合。之后，将混合物加入至包含与固体表面吸附的0.02nM生物素化的LALF32—51肽的ELISA平板中。在室温下进行l小时温育后，平板用洗涤溶液洗涤5次，并且通过于37。C与链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物(1:2，000稀释度)温育"分钟来检测与固体表面固定的生物素化的LALF3^肽。之后，平板用洗涤溶液洗涤5次，并且添加底物溶液。在另外温育15分钟后，反应用2M硫酸溶液来终止。缺乏类似肽与肝素的结合与光密度的减少相关，因为它们不能替代吸附至固体表面的生物素化的LALF32—51肽与肝素的结合。以100X摩尔过量的未标记的LALF3H,肽用作该测定法的对照。未标记的LALF^肽与肝素的结合由增加的光密度值得到证实，因为过量的冷的肽竟争与肝素的结合。如图2中所示，结果表明，在本发明中描述的肽L-2、L-8、L-12和L-M不能结合肝素。12实施例4.类似肽L-2、L-8、L-12和L-20对于人单核细胞中IFN-ct、IFN-y和IL-12的表达的影响。对于这个测定法，通过Ficol1-Hypaque梯度从供体的白细胞浓缩物或"血沉棕黄层(BuffyCoat)，，中分离出人单核细胞。在24孔平板中，将高达5xl()6个细胞种植在补充有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中。进一步地以在0.1ml体积的RPMI培养基中40|ig/ml添加每种肽，并且将细胞在37。C和5%c02下培养18小时。总RNA通过使用TriReagent方法进行提取。之后，IFN-cx、IFN-y和IL-12基因的表达通过逆转录反应和PCR扩增(RT-PCR试剂盒，PerkinElmer)来测定。结果显示为针对P-肌动蛋白持家基因的表达水平进行标准化的信使RM的相对量。在这个测定法中获得的结果证实，在本发明中描述的肽L-2、L-8、L-12和L-20能够诱导IFN-a、IFN-y和IL-12基因的表达，如图3A中所示。类似肽L-2、L-8和L-12在诱导IFN-a基因表达方面比LALF32-w肽特别更加有效，如图3B中所示。这个实施例证实，原始LALF3^序列中的氨基酸置换消除了结合LPS的能力，随后增强所得到的肽的免疫调节效应。实施例5.类似肽L-2、L-8、L-12和L-20在TC-1肿瘤模型中的抗肿瘤效应。8-10周大的C57BL/6雌性小鼠用于这个测定法(n=10只动物/实验组)。对于肿瘤移植，使用来源于恶性C57BL/6肺上皮细胞的TC-1肿瘤细胞，其重悬浮于磷酸盐緩沖盐水(PBS)中。将在200yl体积中50，000个细胞的量通过皮下途径在右后肢中接种至小鼠。一旦肿瘤达到100mm3的体积，就通过皮下途径在右胁腹中进行第一次肽施用，和第二次在10天后进行。在这个测定法中，评估4mg/kg体重的剂量(80jug/小鼠)。动物存活和肿瘤质量是为了测量目的肽的抗肿瘤效应而进行评估的参数，如图4A和4B中所示。类似肽L-2、L-8、L-12和L-20分别对于抑制肿瘤进展和延长小鼠存活是有效的。这些结果证明了类似肽在小鼠中的实体瘤模型中的抗肿瘤效力。LogRank方法用作用于检测组间的显著差异的统计分析。结果证明，与LALF3^肽相比较，类似肽L-2、L-8、L-12和L-20显著增加动物的存活('p〈0.05)。这些结果证实，在LALF蛋白质中的原始31-51序列中的氨基酸置换可以显著增加肽的抗肿瘤能力。实施例6.类似肽L-2在黑素瘤模型中的抗肿瘤效应。8-10周大的C57BL/6雌性小鼠用于这个测定法(n=10只动物/实验组)。对于肿瘤移植，使用MB16-F10肿瘤细胞，其重悬浮于磷酸盐緩冲盐水(PBS)中。将在200jLi1体积中15,000个细胞的量通过皮下途径接种在右后肢中。4天后，施用L-2肽，第二次注射在第一次注射后7天进行，和在14天后进行第三次注射。在这个测定法中，评估4mg肽/kg动物体量的剂量。为了在这个测定法期间测量给定肽的抗肿瘤效应而进行评估的参数是肿瘤成活的时间和动物的存活。如图5A中所示，L-2类似肽显著延迟肿瘤移植('p〈0.05，LogRank方法)。经由LogRank方法进行的存活分析证实，L-2肽显著增加动物的存活('p<0.05),比LALF^肽更有效，如图5B中所示。这些结果证明了L-2肽的抗肿瘤效力，其不仅针对肺上皮癌细胞，还针对来自机体的其他组织学和解剖学部分的癌细胞，如黑素瘤。实施例7.在TC-1肿瘤模型中，在预防性治疗方案中L-2类似肽的抗肿瘤效应。8-10周大的C57BL/6雌性小鼠用于这个测定法(n=10只动物/实验组)。对于肿瘤移植，使用TC-1肿瘤细胞，其重悬浮于磷酸盐緩沖盐水(PBS)中。小鼠接受L-2肽的第一次注射(4mg肽/kg体重)。7天后，它们接受相同剂量的第二次注射；第一次肽注射14天后，用在200m1体积中的50，000个细胞通过皮下途径在右后肢中对动物进行接种。为了测量肽的抗肿瘤效应而进行评估的参数包括肿瘤成活的时间(图6A)和动物的存活(图6B)。在这个测定法中获得的结果证实，本发明的L-2肽对于防止肿瘤的发展是有效的并且还增加动物的存活。这些结果证明，本发明的肽显示出防止肿瘤建立的预防效应。实施例8.L-2类似肽在双重攻击方案中的抗肿瘤效应。通过皮下途径在左后肢中用在200|i1体积的PBS中的50，000个TC-1细胞第二次进一步攻击在先前实施例的方案中没有建立的肿瘤的动物(n=6)(第一次攻击后第49天)。将相同量的肿瘤细胞接种至来自同一窝的"首次用于实验的"小鼠(作为实验的对照组)以保证年龄方面的同质性，并且维持在相同条件下但不接受肽(n-10只动物)。为了测量L-2肽的抗肿瘤效应而进行评估的参数包括肿瘤成活的时间和动物存活。在这个测定法中获得的结果证实，L-2肽能够保护小鼠免于受到用肿瘤细胞进行的第二次攻击，其中延緩肿瘤的建立(图7A)并增加动物存活(图7B)。这个结果证明，本发明的肽能够诱导持久的抗胂瘤应答，其针对用肿瘤细胞进行的第二次攻击仍起作用，这证明了抗原特异性的适应性免疫应答的形成。实施例9.L-2类似肽在Lewis'癌的转移^=莫型中的抗肿瘤效应。8-10周大的C57BL/6雌性小鼠用于这个测定法(n=8只动物/实验组)。在后右足垫中用250，000个小鼠肺癌3LLD122细胞对这些动物进行接种。7天后，皮下注射剂量为4mg/kg体重的L-2类似肽。当肿瘤达到8mm的直径时，通过外科手术从携带腿中除去原发性肿瘤。在这个手术操作后21天处死小鼠。对肺进行称重以表明转移至其上的量。图8中所示的结果表明，本发明的L-2类似肽能够减少转移性肿实施例10.L-2类似肽对于肺瘤细胞生长的影响。对于这个测定法，在96孔培养平板(Costar)中，将TC-1细胞、H-125细胞(人非小细胞肺癌细胞)和L929细胞(鼠类成纤维细胞)以2xl(T细胞/mL种植在补充有胎牛血清(Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Gibco)中。24小时后，将肽以9mM-300|iM的范围加入至培养物中。在5%C02存在下将平板温育72小时，并且在那之后，使用结晶紫进行揭示。平板用自来水进行充分洗涤，并且平板在562nm处进行读取。结果显示于图9中。在体外具有显著的抗增殖效应的促凋亡肽用作阳性对照(Perea，S.等人(2004)AntitumorEffectofaNovelProapoptoticPeptidethatImpairsthePhosphorylationbytheProteinKinase2Ca/jceriesearc力64:7127—7129)。获^f的结果证实，L-2肽对于TC-l和H-125细胞产生剂量依赖性的抗增殖效应。然而，用本发明的肽在鼠类成纤维细胞L929细胞系中没有检测到效应。这个结果证实，本发明的肽在体外显示出对肿瘤细胞的选择性细月包毒'l"生效应。权利要求1.衍生自LALF蛋白质的32-51区域的具有免疫调节和抗肿瘤能力的肽，其缺乏LPS结合和肝素结合能力，并且包含下列氨基酸序列SEQ.ID.NO.1-4和8-12，以及这些肽的同源变体。2.模拟根据权利要求1的肽的化合物，其中所述化合物具有抗肿瘤作用并且缺乏LPS结合或肝素结合能力。3.药物组合物，其包含一种或多种根据权利要求1和2的肽和化合物，以及药学上可接受的赋形剂或栽体。4.根据权利要求3的药物组合物，其中所述组合物另外还包含免疫原。5.根据权利要求4的药物组合物，其中所述免疫原选自肽、神经节苷脂或蛋白质性质的免疫原，病毒样颗粒，或细菌起源的蛋白质嚢泡。6.根据权利要求1和2的肽和化合物在制备用于治疗和/或预防免疫学病症和癌症的药物组合物中的用途。7.根据权利要求6的用途，其中使用有效量以刺激人类中的先天性免疫应答。8，根据权利要求6的用途，其特征在于应用其以抑制转移。全文摘要本发明涉及开发衍生自其中引入了氨基酸置换的序列HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW的肽，所述肽不能与脂多糖结合并具有免疫调节和抗肿瘤作用。所述肽或其组合用于治疗癌症，以及与常规疗法协同地用于治疗癌症。文档编号A61K38/17GK101426813SQ200780013884公开日2009年5月6日申请日期2007年2月23日优先权日2006年2月24日发明者B·E·阿塞韦多卡斯特罗,G·E·吉伦涅托,H·E·加雷佩雷兹,I·D·C·托伦斯马德拉索,M·格拉巴列斯皮,O·雷伊斯阿考斯塔,R·乌比塔戈麦斯申请人:遗传工程与生物技术中心