专利名称：：妊娠促进剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在通过人胚泡移植进行的不孕症治疗中的促进妊娠的组合物及其制造方法。
背景技术：
：据称，人的不孕症的发生率在所有夫妇中有10%左右。因此，不孕症治疗的需求大，如今正在广泛地进行。在作为不孕症治疗所采用的方法中，直接操作精子和卵子的方法有人工授精和体外受精。人工授精是如下技术-利用导管等器具将精子注入子宫颈附近的阴道内，或者直接注入子宫或输卵管内，从而促进受精；其目的是回避到精子与卵子相遇为止的过程中存在的各种障碍，从而提高受精的成功率。与此相对，体外受精是如下技术从体内收集通过对患者给予排卵诱发剂而产生的卵子，在试管内与精子混合，从而使卵子受精(授精)，对受精卵进行培养，一般在培养的第2天或第3天用导管将4细胞期或8细胞期的胚胎移植至子宫腔内。为使所移植的胚胎易于着床，通常会补充用于调节子宫内膜的促黄体生成激素。为了向母体发送信号来告知自身的存在，着床前胚胎在发育时会产生多种因子。例如，白细胞介素一l(IL一l)是调节母体的子宫内膜和胚胎之间的信息交换的主要因子，在人胚胎发育的所有阶段均可检出完整的IL一1系统(参照非专利文献1)。作为另一种来源于胚胎的因子的人绒毛膜促性腺激素(HCG)在2细胞期的胚胎中其基因就已被转录(参照非专利文献2)。此外，观察到包括这些因子在内的与信息交换相关的多种来源于胚胎的因子在体外(试管内)对胚胎进行培养时被释放至细胞外。g卩，调节子宫内膜的感受性的多种来源于胚胎的因子在胚胎的培养上清中被检出(参照非专利文献39)。在体内(人体内)，也已知在输卵管中发育的胚胎诱导子宫内膜的分化(参照非专利文献10)。所有这些事实表明，在胚胎发育的早期阶段，胚胎和子宫内膜之间介以由胚胎产生的因子进行信息交换。事实上，已知不仅是子宫腔内的着床前胚胎，输卵管内的早期胚胎也可调节子宫内膜的分子，使胚胎自身能控制着床(参照非专利文献10)。近年来，作为改善人的不孕症治疗中的着床成功率的方法，提倡作为体外受精的一种形态的胚泡移植，并在临床上得到实施(参照非专利文献1113)。该移植技术是将上述体外受精后的胚胎培养至第5天第6天，从而使其发育至胚泡，然后将其注入子宫腔内。通过胚泡移植，可使子宫内膜与胚胎的发育阶段在生理上同步化，且经由长时间的体外培养，更容易选择着床能力高的胚胎，因而与早期胚胎的移植相比着床的成功率提高(参照非专利文献14及15)。关于到着床为止的天数，培养23天的胚胎为45天，而胚泡移植与之相比要短1天，胚胎向子宫外流失的风险降低，这也有利于着床。然而，即便如此，目前人胚泡移植的妊娠率仍停留在36.4%左右。胚泡移植中的着床失败被认为是由于胚泡无法从透明带开始孵化，或是由于所移植的胚泡的发育在子宫腔内停止等。如上所述，即使通过现行的胚泡移植也无法实现妊娠的案例较多，因此需要进一步提高妊娠成功率的方法。非专利文献1:DelosSantosMJ，AndersonDJ，RacowskyC，SiraonC，和HillJA(1998)BiolR印rod.59，1419-1424非专利文献2:JurisicovaA，AntenosM，KapasiK,MerianoJ，禾口CasperRF(1999)HuraR印rod.14，1852-1858非专利文献3:TazukeSI，禾BGiudiceLC，(1996)SeminReprodEndocrinol.14，231-245非专禾U文献4:SimonC，GimenoMJ，MercaderA，0'ConnorJE，RemohiJ，PolanML，和PellicerA(1997)JClinEndocrinolMetab.82，2607-2616非专利文献5:GiudiceLC(1995)SeminReprodEndocrinol.13，93-101非专利文献6:ShethKV，RocaGL，al-SedairyST，ParharRS，HamiltonCJ,禾卩al-AbdulJabbarF(1991)FertilSteril.55，952-957非专利文献7:BaranaoRI，PiazzaA，RumiLS，禾BPolakdeFriedE(1997)AmJReprodImmunol.37，191-194非专利文献8:LichtP，RussuV，和WildtL(2001)SeminR印rodMed.19，37-47非专利文献9:Perrierd'HauteriveS，Charlet-RenardC，BerndtS，DuboisM，MunautC,GoffinF，等(2004)HumR印rod.19,2633-2643非专利文献10:WakudaK，TakakuraK，NakanishiK，KitaN，ShiH，HiroseM，和NodaY(1999)JReprodFertil.115，315-324非专利文献ll:GardnerDK，SchoolcraftWB,WagleyL，SchlenkerT，StevensJ，和HeslaJA(1998)HumReprod.13,3434-3440非专利文献12:ScholtesMC，和ZeilraakerGH(1998)FertilSteril.69，78-83非专利文献13:MilkiAA，FischJD，和BehrB(1999)FertilSteril.72，225-228非专利文献14:GardnerDK，VellaP，LaneM，WagleyL，SchlenkerT和SchoolcraftWB(1998)FertilSteril.69，84-88非专利文献15:EdwardsRG,禾卩BeardHK(1999)HumReprod.14,1-4发明的揭示本发明的目的是以现在妊娠成功率停留在36.4%左右的人胚泡移植为基础，提供用于提高利用该技术的妊娠的成功率的方法。本发明人估计，胚泡移植最终失败的一个主要原因在于，从早期胚胎到胚泡为止的发育阶段中存在子宫内膜和胚胎之间的信息交换的欠缺。该信息交换的欠缺可能是无法充分地调节子宫内膜的胚胎感受性的原因。因此，为提高人胚泡移植中的着床及妊娠的成功率，本发明人着眼于胚胎本身对子宫内膜的感受性的调节进行了研究。即，预先将人胚胎的培养上清注入接受者的子宫腔，再尝试进行胚泡移植后，本发明人发现能够以明显比以往的胚泡移植高的成功率实现着床及妊娠。对于通过预先将胚胎的培养上清注入子宫可提高胚泡移植中的着床及妊娠的成功率的发现至今尚无报道，本发明是基于该发现进一步研究而完成的。艮P，本发明提供以下技术内容。1.一种在胚泡移植中使用的妊娠促进剂，该妊娠促进剂含有将人胚胎在培养基中培养至胚泡而得的培养物的培养上清。2.上述l所述的妊娠促进剂，其中，所述培养上清是从人胚胎在其中培养了至少2天的培养基得到的培养上清。3.上述1或2所述的妊娠促进剂，其中，培养在每1个人胚胎10100u1的培养基中进行。4.上述13中任一项所述的妊娠促进剂，该妊娠促进剂至少含有相当于0.3个人胚胎的量的培养上清。5.上述14中任一项所述的妊娠促进剂，其中，所述培养基为无血清培养基。6.—种在胚泡移植中使用的妊娠促进剂的制造方法，该方法包括在培养基中培养人胚胎，从而形成胚泡的步骤；以及收集形成有胚泡的培养液的上清的步骤。7.上述6所述的妊娠促进剂的制造方法，其中，所述培养进行至少2天。8.上述6或7所述的妊娠促进剂的制造方法，其中，培养在每l个人胚胎10100y1的培养基中进行。9.上述68中任一项所述的妊娠促进剂的制造方法，该方法中，至少收集相当于0.3个人胚胎的量的培养上清。10.上述69中任一项所述的妊娠促进剂的制造方法，其中，所述培养基为无血清培养基。11.一种用于促进人的妊娠的方法，该方法包括将人胚胎在培养基中培养，直至该人胚胎发育成胚泡的步骤；将含有该培养物的上清的组合物注射至接受胚泡移植的人类患者的子宫腔内的步骤；以及将l个或2个以上的胚泡移植至该患者的子宫腔内的步骤。12.上述ll所述的方法，其中，所述培养进行至少2天。13.上述11或12所述的方法，其中，培养在每l个人胚胎10100W1的培养基中进行。14.上述1113中任一项所述的方法，其中，所述组合物至少含有相当于0.3个人胚胎的量的培养上清。15.上述1114中任一项所述的方法，其中，所述培养基为无血清培养基。16.上述1115中任一项所述的方法，其中，所述组合物的注射在胚泡移植的15天前进行。上述基于本发明的妊娠促进剂通过在将胚泡移植至胚胎的接受者的子宫内之前预先注入子宫腔，与现行的胚泡移植的情况相比，可显著提高所移植的胚泡的着床及妊娠的成功率。实施发明的最佳方式本发明者认为，基于本发明的胚泡移植中的着床及妊娠的成功率的显著提高的原因在于，胚胎的培养上清中存在由胚胎所分泌的调节子宫内膜的感受性的来源于胚胎的因子，通过投与该培养上清，子宫内膜受到刺激而形成适宜胚泡移植的环境。因此，本发明通过在胚泡移植前利用培养液中的来源于胚胎的因子来弥补以往的胚泡移植中欠缺的从早期胚胎到胚泡的发育阶段中的子宫内膜和胚胎之间的信息传递，从而使着床及妊娠的成功率提高。本发明的妊娠促进剂是含有将人胚胎在培养基中培养至胚泡而得的培养上清的组合物(例如培养上清本身)。收集的培养上清优选在收集前用其进行了至少2天、更好的是至少3天的培养的培养上清。所用的培养基可以是胚泡移植中惯用的培养基中的任一种，如果考虑到阻断朊病毒及其它感染性因子的混入的可能性，则优选无血清培养基。作为上述优选的无血清培养基，现在可例举例如BlastAssist系统(BlastAssistSystem)培养基1和2，特别是适用于到胚泡为止的约3天的培养的BlastAssist系统培养基2(麦迪克特(MediCult)公司，丹麦基林阁(Jyllinge))。考虑到为胚泡提供足够量的培养基的必要性和从培养液中收集胚泡的方便性，上述人胚胎的培养以在每1个人胚胎10100y1的培养基中进行为宜，优选在每l个人胚胎1060yl的培养基中进行。已发育至胚泡的人胚胎的培养上清中，较好的是至少含有相当于0.3个人胚胎的量的培养上清。即，例如将l个胚胎在50ul的培养基中培养至发育成胚泡的情况下，较好的是本发明的组合物中含有从培养基中收集的至少15pl(即50y1X0.3)的液量的上清。但是，由于也可将本发明的组合物分成少量的单位保存，在使用(注入患者体内时)时将多个单位合并使用，因此在该情况下，单位给药量的组合物中并不一定要含有相当于0.3个胚胎的量的培养上清。所收集的培养上清可直接使用，也可先冷冻保存，在使用时解冻使用。此外，也可添加药学上呈惰性的稀释剂(例如无菌纯水，或含有实施例部分中记载的BlastAssist系统培养基2所含的人血浆白蛋白、葡萄糖、氯化钠等成分的水溶液)，从而稀释增量至易于操作的液量，例如0.2ral或0.5ml等。在胚泡移植中，为提高妊娠及着床的成功率，本发明的妊娠促进剂在将胚泡移植至接受者的子宫内之前注入接受者的子宫腔。胚泡的接受者主要是发育成该胚胎的卵子的提供者本人，但也可以是第三者，因此接受本发明的妊娠促进剂的注入的人同样既可以是发育成胚胎的卵子的提供者，也可以是第三者。此外，可预先将通过多个胚胎的培养而得的上清例如分别冷冻保存，在对其他接受者进行的其它胚泡的移植中，在移植前将其解冻，注入接受者的子宫腔内。本发明的妊娠促进剂较好的是在对患者进行胚泡移植的15天前、更好的是24天前注入患者的子宫腔内。注入可以进行1次(例如在3天前进行l次)，也可以隔天或每天进行多次注入。本发明还提供一种妊娠促进方法，该方法包括如下步骤将人胚胎在培养基中培养至胚泡，将含有该培养上清的上述组合物(例如培养上清本身)注入接受胚泡移植的人的子宫腔，然后移植胚泡。这里，该组合物的注入以在胚泡的移植的15天前进行为宜，优选在移植的24天前进行，特优选在移植的3天前进行。本发明还提供一种用于促进人的妊娠的方法，该方法包括如下步骤将人胚胎在培养基中培养至该人胚胎发育成胚泡为止，将含有该培养物的上清的组合物(例如该培养上清本身)注射至接受胚泡移植的人患者的子宫腔内，然后将胚泡移植至该患者的子宫腔内。这里，本组合物的注射以在胚泡的移植的15天前进行为宜，优选在移植的24天前进行，特优选在移植的3天前进行。本发明的妊娠促进剂通过在胚泡移植前预先注入接受者的子宫腔，可显著提高胚泡移植中的着床及妊娠的成功率。实施例下面，参照实施例对本发明进行更具体的说明，但并不表示本发明限定于实施例。(试验方案)登记了22名患者。这些患者在2005年1月到2006年4月期间，在雌激素和黄体酮的激素补充疗法(HRT)下接受了经冻结融解的胚泡的移植。该试验针对的患者的标准为年龄在32岁以上，过去曾有过l次以上的胚泡移植或两阶段(连续2次的)胚胎移植失败的治疗经历，且在采卵周期的第2天至少具有4个以上的发育成早期胚胎的胚胎。作为前治疗周期，对患者进行基于长方案(longprotocol)的治疗。艮P，自治疗前周期的高温期的第7天起开始使用60ug的促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂，自月经第3天起至第二优势卵泡(secondleadingfollicle)的直径达到18mm为止连续用促卵泡激素(FSH制剂或HMG制剂)来刺激卵巢。在第二优势卵泡的直径超过18mm时促使排卵。肌肉注射5000单位的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，36小时后利用超声波检査法经阴道采卵。卵泡的测量采用超声波扫描仪(三菱(Mitsubishi)RDF173H)进行。回收的卵子通过授精法或卵细胞质内精子注入法使其受精。将受精卵在50u1的BlastAssist系统培养基1(含有合成血浆替代物(SSR)、人血浆白蛋白、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸盐、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢钠、非必需氨基酸、L一谷氨酰胺、牛磺酸、碳酸氢钠、HEPES、链霉素50mg/L、青霉素50000IU/L及酚红；麦迪克特公司，丹麦基林阁)的小滴中培养，在第2天得到早期胚胎。接着，将14个所得的早期胚胎在矿物油(油状胚胎培养基(0ilEmbryoCulture)，埃尔文科技(IrvineScientific)公司，美国加利福尼亚圣塔安那(SantaAna))被膜下，在50u1的BlastAssist系统培养基2(含有合成血浆替代物(SSR)、人血浆白蛋白、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢钠、必需氨基酸、非必需氨基酸、L一谷氨酰胺、碳酸氢钠、链霉素50mg/L、青霉素50000IU/L及酚红；麦迪克特公司，丹麦基林阁)的小滴中，即每l个胚胎的培养基量为12.550yl的条件下进一步培养3天，直至总计的第5天，得到胚泡。作为培养板，使用FALC0N353002组织培养皿(TissueCultureDish)(BD(BectonDickinson)公司，美国富兰克林湖(FranklinLakes))。胚胎的培养在设定为5%C02、5%02、90%N2、37°C、100%湿度的培养箱(TE-HERPRODUCT02002培养箱CP02-1800系列，平泽(hirasawa)株式会社，日本东京)内进行。该培养过程中得到的早期胚胎及胚泡的一部分在新鲜的状态用于前治疗周期的移植。未用于前治疗周期的移植的剩余的胚泡冷冻保存。此外，将BlastAssist系统培养基2中的胚胎培养上清在一20'C下保存。对于患者，在前治疗周期中，分别于采卵后第2天移植通过上述培养而得的早期胚胎，于采卵后第5天移植通过上述培养而得的胚泡。通过该前期治疗而妊娠的患者从本试验中排除。对于未通过前治疗周期的移植而妊娠的患者(22名)，在该移植后的下一个月经周期或再下一个月经周期进行如下治疗。自月经周期第2天起开始贴附作为雌二醇制剂的EstradermM。自第2天起隔天贴附2片EstradermM，随后逐渐增加，第10天增至3片，第12天增至4片，第14天增至6片，然后自第16天起到作为妊娠判定日的第30天为止维持在3片。并且，作为孕激素制剂，自月经周期第15天起并用黄体酮阴道栓剂(400mg/天)和乙酸氯地孕酮12mg/天(内服)。在激素补充疗法(HRT)疗程的第20天，将l个或2个胚泡移植至患者体内。移植通过子宫颈管采用FaiconIVF导管(富士系统(FujiSystems)株式会社)进行。对于子宫内膜刺激胚胎移植组(SEET(StimulationofEndometriumEmbryoTransfer)组)，在胚泡移植前，先在激素补充疗法(HRT)疗程的第17天将冷冻保存的BlastAssist系统培养基2中的患者自身的胚胎培养上清解冻，将约20u1的该培养上清给药至11名患者的子宫腔。给药通过下述方法进行将装填有20ul胚胎培养上清的FaiconIVF导管(富士系统株式会社)插入子宫颈管，在导管的前端到达距离子宫腔的基底部约lcm的位置时放出培养基。对属于作为对照的通常的胚泡移植组(BT组)的ll名患者，在不将胚胎培养上清给药至子宫腔的情况下进行胚泡移植。在胚胎移植后第17天，利用超声波扫描仪(三菱RDF173H)来确认子宫内是否有胎囊。(受试者组)SEET组和BT组的患者的基本特征示于表1。SEET组和BT组的平均年龄(士SD)分别为37.1±4.1岁以及36.0±3.4岁(p=0.47)。不孕的持续时间(士SD)为SEET组7.6±3.8年，BT组6.0±2.3年(p=0.27)。在本次试验前接受过的体外受精等生殖辅助技术(ART)的疗程数为SEET组1.6±0.9次，BT组2.5±2.9次(p=0.39)。促卵泡激素(FSH)的基础值(土SD)为:SEET组6.5±2.OmlU/ml，BT组5.7±2.7mlU/ml(p=0.46)。受精了的卵细胞的数量(士SD)为SEET组8.5±2.0个，BT组8.5±1.7个(p=1.0)。所移植的胚泡的数量(士SD)为SEET组1.5±0.5个，BT组1.5±0.5个(p=0.69)。如上所述，SEET组和BT组的患者之间在基本特征方面没有显著差异。此外，所移植的胚泡的品质在两组间是同等的。(结果)SEET的有效性及安全性试验结果示于表1。SEET组中，11名患者中有IO名妊娠，而BT组中，11名患者中仅有4名妊娠。妊娠率(确认有胎囊的发育的患者的比例(％))为SEET组91.9X，BT组36.4%;与BT组相比，SEET组的妊娠率的提高在统计学上显著(p=0.027)。此外，着床率(所移植的胚泡中发育至胎囊的胚泡的比例(％))为SEET组70.6%，BT组25.0%;与BT组相比，SEET组的着床率的提高在统计学上显著。=0.023)。两组的患者均未观察到副作用。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>产业上利用的可能性本发明作为显著改善胚泡移植中的妊娠率、着床率的新型妊娠促进剂有用。权利要求1.一种在胚泡移植中使用的妊娠促进剂，其特征在于，含有将人胚胎在培养基中培养至胚泡而得的培养物的培养上清。2.如权利要求l所述的妊娠促进剂，其特征在于，所述培养上清是从人胚胎在其中培养了至少2天的培养基得到的培养上清。3.如权利要求1或2所述的妊娠促进剂，其特征在于，培养在每l个人胚胎10100u1的培养基中进行。4.如权利要求13中任一项所述的妊娠促进剂，其特征在于，至少含有相当于0.3个人胚胎的量的培养上清。'5.如权利要求14中任一项所述的妊娠促进剂，其特征在于，所述培养基为无血清培养基。6.—种在胚泡移植中使用的妊娠促进剂的制造方法，其特征在于，包括在培养基中培养人胚胎，从而形成胚泡的步骤；以及收集形成有胚泡的培养液的上清的步骤。7.如权利要求6所述的妊娠促进剂的制造方法，其特征在于，所述培养进行至少2天。8.如权利要求6或7所述的妊娠促进剂的制造方法，其特征在于，所述培养在每1个人胚胎10100"1的培养基中进行。9.如权利要求68中任一项所述的妊娠促进剂的制造方法，其特征在于，至少收集相当于0.3个人胚胎的量的培养上清。10.如权利要求69中任一项所述的妊娠促进剂的制造方法，其特征在于，所述培养基为无血清培养基。11.一种用于促进人的妊娠的方法，其特征在于，包括将人胚胎在培养基中培养，直至该人胚胎发育成胚泡的步骤；将含有该培养物的上清的组合物注射至接受胚泡移植的人类患者的子宫腔内的步骤；以及将l个或2个以上的胚泡移植至该患者的子宫腔内的步骤。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述培养进行至少2天。13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述培养在每l个人胚胎10100u1的培养基中进行。14.如权利要求1113中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物至少含有相当于0.3个人胚胎的量的培养上清。15.如权利要求1114中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基为无血清培养基。16.如权利要求1115中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物的注射在胚泡移植的15天前进行。全文摘要本发明以人胚泡移植为基础，揭示了一种用于提高利用该技术的妊娠的成功率的方法。该方法包括一种在胚泡移植中使用的妊娠促进剂，该妊娠促进剂含有将人胚胎在培养基中培养至胚泡而得的培养物的培养上清。本发明还揭示了该药剂的制造方法，以及一种用于促进人的妊娠的方法，该方法包括如下步骤将人胚胎在培养基中培养至胚泡，将含有该培养物的上清的组合物注射至接受胚泡移植的人类患者的子宫腔内，然后将胚泡移植至该患者体内。文档编号A61K35/48GK101500585SQ20078002893公开日2009年8月5日申请日期2007年7月31日优先权日2006年8月4日发明者后藤荣,盐谷雅英申请人:日本化学研究株式会社