专利名称：含微粉化人血管内皮抑制素的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有微粉化固体形式的人血管内皮抑制素药物组合物，尤其涉及一种活 性保持良好的人血管内皮抑制素药物组合物的制备方法。
背景技术：
研究发现，实体瘤在生长和转移过程中，需要血管的生成来提供营养，此时肿瘤细 胞会发出一些信号来促进血管向肿瘤组织增生， 一些内源性血管生成抑制因子如 Angiostatin、 Endostatin能够阻碍血管在肿瘤组织中的生长，使肿瘤的生长和转移处于停 滞(O，Relly， M.S.， " Ce〃. 79:315-328,1994; O,Relly, M.S., " Ce〃. 88:277-285， 1997)，美国哈佛医学院的Folkman教授在上世纪七十年代提出了用血管内皮抑素
(Endostatin)来抑制肿瘤生长的"饿死肿瘤疗法"理论。但由于Endostatin在表达制备过 程中存在着易于沉淀和复性困难等问题，限制了其在肿瘤患者中的大规模应用。
罗永章教授等人通过修饰人血管内皮抑制素的核苷酸编码序列，生产出N末端带 有9个附加氨基酸序列的重组人血管内皮抑制素(取名为Endostar，中文名恩度)
(ZL00107569.1)，其氨基酸序列为
(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGL
GQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK,其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时 会被部分删除。
重组的人血管内皮抑制素恩度保持内源性Endostatin的所有生物活性，同时解决了 Endostatin在生产过程中的难题，纯化过程简单，纯度高，活性保存好，其注射液已经 上市销售，临床上联合NP化疗方案用于非小细胞肺癌患者。
重组的的人血管内皮抑制素作为外源性蛋白，在体内很容易被免疫系统识别，进而 被降解，因此体内半衰期很短，患者需要频繁注射，临床顺应性很差。以乳酸-羟基乙 酸聚合物为基质的生物可降解微球在上世纪八十年代已经被利用于多肽药物的注射用
3缓释制剂，例如如Takeda公司的Lupron Depot,瑞士 Debiopharm公司的Trelstar Depot 和Novartis公司的Sandostatin Depot等。多肽药物在肌肉或皮下随着聚合物材料不断的 生物降解缓慢释放到体内，在较长时间里维持体内有效的血药浓度，释放周期从一周到 6个月不等，对于需要长期或终身给药的疾病，病人的顺应性大大提高。随着分子生物 学的发展，越来越多的大分子蛋白质药物也需要借助这一缓释平台来克服药物本身的缺 陷。
缓释微球制剂一般采用水包油包水的方法制备，蛋白质药物先存在于内水相中，与 含有乳酸-羟基乙酸聚合物的有机溶剂在高速剪切或超声的作用下形成初乳，再分散到 外水相中。蛋白质在油水界面上受到张力的影响，结构很容易发生改变，导致其生物学 活性的丧失。而固态的蛋白质则不受油水界面的影响，其在制备中可很好的保持活性， 因此，将蛋白固态化现正成为制剂研发的热点，然而，现有的生产固态蛋白的技术无法 生产出粒径小于3mn的微粉化蛋白，故不能满足一些新剂型研发的需要，比如粒径较小 的微球。现有微粉化蛋白的方法已经有很多，总体归纳可分为以下几种喷雾干燥法、 冷冻干燥法、喷雾冷冻干燥法、超临界流体技术。喷雾干燥是利用雾化器将药物溶液分 散为细小的雾滴，并在热干燥介质中迅速蒸发溶剂形成干粉的过程，该技术制得的微粉 粒径均匀，但是该法需使用热空气，不适合用于干燥对温度不敏感的蛋白质和多肽药物。 喷雾冷冻干燥法将喷雾干燥中的雾化步骤与冷冻干燥相结合，步骤是将雾化的药物水溶 液喷入液氮中，以冷冻干燥的步骤将其干燥，得到粒径均匀的药物微粉。该方法批处理 量大，但成本较高，得到的微粉粒径较大。超临界流体技术是新近发展的技术，可用于 超临界流体的性质来提取溶剂，干燥蛋白，但是，该技术仍存在许多需要研究和解决的 问题如蛋白和多肽类药物在有机溶剂中的溶解度普遍较小，如何通过改变溶剂组成来 增加药物的溶解度，以及不同的操作条件与最终得到的不同性质微粉之间的关系。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的蛋白质微球制备方法中存在的问题，提供一种活性 保持良好的人血管内皮抑制素缓释微球制剂的制备方法。
本发明中的人血管内皮抑制素药物组合物微球制剂可以用于可皮下注射或肌肉注 射。该制剂适合用于持续释放人血管内皮抑制素的用途。
本发明公开了一种包含可药用载体和人血管内皮抑制素的药物组合物，其特征在于 该活性成分人血管内皮抑制素是微粉化固体形式的。
上述的微粉化固体形式的人血管内皮抑制素可通过以下步骤制备(1) 在含有人血管内皮抑制素的缓冲盐溶液中加入可溶性金属盐，然后调整该溶 液的pH至蛋白的等电点(pl)，得到蛋白的细小颗粒沉淀，蛋白溶液变为混悬液；
(2) 将混悬液与冻干保护剂混合均匀后，冻干；
(3) 将冻干后的固体粉块用溶剂洗涤，除去冻干保护剂，得到微粉化蛋白。 上述微粉化人血管内皮抑制素的制备方法的冻干保护剂为聚乙二醇，在冻干中起到
空间赋形和稳定的作用，沉淀下来的人血管内皮抑制素蛋白颗粒可吸附在聚乙二醇的骨 架上。
上述微粉化人血管内皮抑制素的制备方法聚乙二醇分子量范围在1000至8000道尔 顿。聚乙二醇有着良好的悬浮稳定性，分子量范围在1000至8000道尔顿均可很好的稳 定蛋白颗粒，保持其在冻干中不聚集，不下沉。
上述微粉化人血管内皮抑制素的制备方法，步骤(2)中混悬液和冻干保护剂的体 积比为1:99 99:1，优选15:85 90:10;混悬液中的人血管内皮抑制素蛋白浓度为 0.01mg/ml~500mg/ml，冻干保护剂的浓度为1%~50% (w/v)。冻干保护剂的浓度不可小 于1%，否则悬浮稳定性很差，蛋白沉淀会很快下沉聚集；冻干保护剂的浓度过高也不 适合，因为冻干后为了得到蛋白微粉，需使用有机溶剂洗涤除去该保护剂，若保护剂占 的比例过高，需消耗大量有机溶剂，反复清洗，给操作带来不便。保持1% 50% (w/v) 的浓度较适宜。
上述微粉化蛋白的制备方法，步骤(3)中的洗涤溶剂是可溶解聚乙二醇的溶剂， 例如丙酮、乙酸乙酯、二氯申垸、乙腈。优选乙酸乙酯、二氯甲垸、乙腈。
本发明的药物组合物的可药用载体是乳酸-羟基乙酸聚合物。可药用载体乳酸-羟基 乙酸聚合物由羟基乙酸和乳酸通过聚合作用形成；聚合物可以是乳酸和羟基乙酸酸的共 聚或均聚物，也可以指单一的聚乳酸；聚合作用可以是无规、嵌段或接枝型，它们可以 具有D-， L-或者DL的光学构型。
当所用聚合物是乳酸-羟基乙酸的共聚物或均聚物时，乳酸/羟基乙酸的摩尔比为 40:60至99:1，优选50:50至85:15;聚合物重均分子量大小为5000~150000道尔顿，优 选为10000至80000道尔顿。分子量的大小决定了聚合物在体内的降解速度，进而决定 了药物的释放周期，释放周期可选择一周至二月。聚合物重均分子量应该根据凝胶透析 色谱法测得(GPC)。
本发明的药物组合物的人血管内皮抑制素优选重组人血管内皮抑制素Endostar。
所述药物组合物是固体药物组合物，有意义的固体药物组合物是微球和植入剂。本发明范围内优选的固体药物组合物是微球。因为微球通常的给药方式为注射给 药，方便，注射后无需取出。而植入剂需进行小手术植入及取出，给病人造成痛苦。
本发明所述的药物组合物，人血管内皮抑制素占组合物的l%wt至30%wt、优选 10%wt至20%wt。微球的体积平均粒径在O.lum至300um之间。
在组合物中还可以加入一些起骨架支撑作用的糖、多元醇或聚合物等保护剂，起到 空间赋形和稳定作用，其中多元醇类物质还可以有效防止蛋白的聚集，减少无活性的多 聚体的产生。保护剂占组合物的0.5%wt至30%wt。
本发明所述的药物组合物的保护剂包括多元醇(山梨醇、木糖醇、甘露醇)、糖类 (海藻糖、壳聚糖、葡聚糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖)、高分子聚合物(泊洛沙姆188、聚 乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮)中的一种或几种。
本发明所述的药物组合物的聚乙二醇重均分子量范围在1000至8000道尔顿；聚乙 烯吡咯垸酮重均分子量范围在2000至20000道尔顿。
本发明制备的药用组合物外观为球形，表面多孔或无孔，内部呈蜂窝状结构。
本发明制备的药用组合物可抑制哺乳动物恶性肿瘤的新生血管的生成，用于治疗各 类癌症。
本发明的优点有
一采用本发明的方法制备的人血管内皮抑制素缓释微球制剂在保持其活性的同 时，可以在体内长期缓慢释放重组人血管内皮抑制素，大大减少病人给药次数，提高病 人的顺应性。通过选择不同载体聚合物材料的分子量可以方便调节药物的释放速率。
二将人血管内皮抑制素溶液与保护剂共同冷冻干燥，形成微粉化的人血管内皮抑 制素固体，人血管内皮抑制素这种蛋白质药物被骨架支撑材料(保护剂)保护，保持蛋 白质多级结构的完整性。将此固体形式的蛋白制备成微球，消除了可能发生的油水界面 张力使蛋白活性丧失的问题。
三将蛋白制备成固态，提高了蛋白被制备成微球的稳定性。
图1 实施例一中微球的粒径分布图
图2、图3 实施例一中微球的SEM扫描电镜照片 图4 实施例二中微球的粒径分布图
图5 实施例二中用PLGA (Mw=30000，乳酸:羟基乙酸=75:25)制备的Endostar 微球体外释放行为曲线。
6图6 实施例三中将Endostar制成微球前后对HUVEC细胞增殖活性。
具体实施例方式
本发明通过以下实施例作更详细的描述，但不能将其解释为限制本发明的保护范围。
实施例一
精密量取50ml重组人血管内皮抑制素Endostar蛋白溶液(9.1462mg/ml， PH=5.5)， 加入0.004%的醋酸锌，至锌盐完全溶解后，用氢氧化钠溶液(lmol/L)调蛋白溶液的 PH至8.8-9.3这个区间内。此时，大量蛋白沉淀，溶液呈现乳白色，加入50ml浓度为 50% (w/v)的PEG-8000溶液，磁力搅拌5min使之混合均匀。将上述制备好的溶液分 装在规格30ml的西林瓶中，装量规格为5ml/瓶，冻干。用二氯甲烷溶解冻干物，PEG-8000 在二氯甲烷中溶解，离心后，在离心管底部得到含有二氯甲烷的微粉化蛋白，常温减压 干燥之，得到干燥的微粉化蛋白，将PLGA (Mw=50000，乳酸:羟基乙酸=50:50) 2g溶 于3ml乙酸乙酯与7ml丙酮的混合溶剂中形成有机相。将上述组合物粉末混悬在有机相 中，10000rpm高速分散20s，形成S/0二相分散系统，然后将此初乳倾倒至1L含有0.2 %大豆卵磷脂的大豆油中，20摄氏度下，机械搅拌常压挥发溶剂6小时，使用0.8pm 的微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤，过滤微球，干燥得到微球成品。
精密称取微球成品20mg，用lml二氯甲垸溶解，再加入10ml PH=7.4的磷酸盐缓 冲液(PBS)萃取药物，将萃取后的PBS溶液用BCA的方法(试剂盒来自于Thermo Scientific ，名为BCA Protein Assay Kit)测定其中的蛋白浓度，其中Endostar占微球 总量的1.27%wt，包封产率为99.21%,使用Mastersizer 2000激光粒度仪测得微球体积 平均粒径为70.461um。(图l)。
将所得微球在扫描电镜(scanning electronic microscopy)中观察形态，可见微球粒
径均一，微球外观圆整，表面多孔。将微球在固体石蜡中包裹后切片在扫描电镜下观察，
可见其内部结构疏松。(图2、图3) 实施例二
精密量取50ml重组人血管内皮抑制素蛋白Endostar溶液(9.1462mg/ml， PH=5.5)， 加入0.004%的醋酸锌，至锌盐完全溶解后，用氢氧化钠溶液(lmol/L)调蛋白溶液的 PH至8.8-9.3这个区间内。此时，大量蛋白沉淀，溶液呈现乳白色，加入50ml浓度为 50% (w/v)的PEG-8000溶液，磁力搅拌5min使之混合均匀。将上述制备好的溶液分 装在规格30ml的西林瓶中，装量规格为5ml/瓶，冻干。用二氯甲烷溶解冻干物，PEG-8000 在二氯甲垸中溶解，离心后，在离心管底部得到含有二氯甲烷的微粉化蛋白，常温减压
7干燥之，得到干燥的微粉化蛋白。用2ml二氯甲垸溶解该组合物粉末，离心，弃去上清 (含PEG6000)，将蛋白沉淀真空干燥成蛋白质粉末备用。将PLGA (Mw=30000，乳酸: 羟基乙酸=75:25) 2g溶于5ml 二氯甲垸与7ml乙腈的混合溶剂中形成有机相。将蛋白质 粉末混悬在有机相中，10000rpm高速分散40s，，形成S/0 二相分散系统，然后将此初 乳倾倒至2L含有0.5X司盘60的液体石蜡中，20摄氏度下，机械搅拌常压挥发溶剂6 小时，使用0.8nm的微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤，过滤微球，干燥得到微 球成品。
精密称取微球成品20mg，用lml 二氯甲烷溶解，再加入10ml PH=7.4的磷酸盐缓 冲液(PBS)萃取药物，将萃取后的PBS溶液用BCA的方法(试剂盒来自于Thermo Scientific,名为BC A Protein Assay Kit)测定其中的蛋白浓度，其中Endostar占微球 总量的2.13%wt，包封产率为99.39%,使用Mastersizer2000激光粒度仪测得微球体积 平均粒径为81.488um。(图4)。
精密称取微球成品50mg，平行3份，置于含有10ml磷酸缓冲液(0.1M pH 7.0)的离 心管中(旋紧管盖，防止液体挥发后体积改变)，放入37度恒温水浴中振摇。分别在每 个时间点取试管中上清液lml，同时补充相同体积新鲜的磷酸缓冲液。样品中Endostar 的含量用BCA法测定。用药物的累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放11.25%， 第15天释放49.88%，第30天释放89.96%。(图5) 实施例三
取实施例二制备的微球进行Endostar的生物活性测定
1、 HUVEC细胞用添加FBS、 ECGS、 P/O Solution的ECM培养基于37°C, 5%C02 的培养箱中培养，待细胞状态良好并进入对数生长期后进行接种。
2、 细胞用0.25%胰酶消化，lOOOrpm离心5min，弃上清，用培养基重新混悬，显 微镜下用血细胞计数板计数活细胞。调细胞密度为5000个/ml，每孔加入160^1细胞悬 液，置37'C 5%0)2培养箱中培养。
3、 将Endostar原液和Endostar微球含量测定时得到的萃取液用pH7.4的磷酸盐缓 冲液预稀释至2.5mg/ml，按孔中终浓度为500、 250、 125、 62.5、 31.25、 15.625、 O^ig/ml, 每孔加入40^U药物体积，每个梯度设3个平行，37°C 5。/。C02培养箱中培养96h。
4、 加入5mg/ml MTT工作液，每孔20ixl，置37°C 5%C02培养箱中培养4 h，弃 去细胞上清，每孔加入DMSO200nl。放置10min，使用酶标仪4卯nm波长下测定OD 值。5、根据OD值求出细胞抑制率，计算公式为抑制率(IR)=(对照组OD值均数-实验 组OD值均数)/ (对照组OD值均数-空白OD值均数)。(图6)
从图中可以看出，微球的第15天释放液中的药物和第30天释放液中的药物都保 持了 90%以上Endostar原液的生物学活性。 实施例四
精密量取50ml重组人血管内皮抑制素Endostar蛋白溶液(9.1462mg/ml， PH-5.5), 加入0.004%的醋酸锌，至锌盐完全溶解后，用氢氧化钠溶液(lmol/L)调蛋白溶液的 PH至8.8-9.3这个区间内。此时，大量蛋白沉淀，溶液呈现乳白色，加入50ml浓度为 50% (w/v)的PEG-8000溶液，磁力搅拌5min使之混合均匀。将上述制备好的溶液分 装在规格30ml的西林瓶中，装量规格为5ml/瓶，冻干。用二氯甲垸溶解冻干物，PEG-8000 在二氯甲垸中溶解，离心后，在离心管底部得到含有二氯甲烷的微粉化蛋白，常温减压 干燥之，得到干燥的微粉化蛋白。将PLGA (Mw=80000，乳酸:羟基乙酸=65:35) 2g溶 于5ml 二氯甲烷与6ml丙酮的混合溶剂中形成有机相。将蛋白质粉末混悬在有机相中， 10000rpm高速分散3min，，形成S/0 二相分散系统，然后将此初乳倾倒至2L含有0.1 %司盘80的液体石蜡中，20摄氏度下，机械搅拌常压挥发溶剂6小时，使用0.8pm的 微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤，过滤微球，干燥得到微球成品。 实施例五
精密量取50ml重组人血管内皮抑制素Endostar蛋白溶液(102.8mg/ml， PH=6.5)， 加入0.001%的硫酸镁，至镁盐完全溶解后，用氢氧化钠溶液(lmol/L)调蛋白溶液的 PH至8.8-9.3这个区间内。此时，大量蛋白沉淀，溶液呈现乳白色，加入50ml浓度为 20% (w/v〉的PEG-6000溶液，磁力搅拌5min使之混合均匀。将上述制备好的溶液分 装在规格30ml的西林瓶中，装量规格为5ml/瓶，冻干。冻干时间为一天。用二氯甲烷 溶解冻干物，PEG-6000在二氯甲垸中溶解，离心后，在离心管底部得到含有二氯甲烷 的微粉化蛋白，常温减压干燥之，得到干燥的微粉化重组人血管内皮抑制素蛋白。。将 PLGA (Mw=30000，乳酸:羟基乙酸=50:50) 2g溶于5ml乙酸乙酯与6ml乙腈的混合溶 剂中形成有机相。将蛋白质粉末混悬在有机相中，10000rpm高速分散10min，形成S/0 二相分散系统，然后将此初乳倾倒至2L含有0.2M司盘85的液体石蜡中，程序控温，1 小时内由20摄氏度升至40摄氏度，后五小时由40摄氏度缓慢降温至10摄氏度。机械 搅拌常压挥发溶剂6小时，使用0.8pm的微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤，过 滤微球，干燥得到微球成品。
权利要求
1、一种包含可药用载体和活性成分为人血管内皮抑制素的药物组合物，其特征在于该活性成分是微粉化固体形式的。
2、 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于微粉化固体形式的人血管内皮 抑制素占组合物的l%wt-30%wt。
3、 根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于微粉化固体形式的人血管内皮 抑制素占组合物的10%wt-20%wt。
4、 根据权利要求1至3中任一项的药物组合物，其中人血管内皮抑制素为重组人 血管内皮抑制素Endostar。
5、 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于可药用载体是乳酸-羟基乙酸聚 合物。
6、 根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于乳酸-羟基乙酸聚合物的乳酸/ 羟基乙酸的摩尔比为40:60至99:1，聚合物重均分子量大小为5000至150000道尔顿。
7、 根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于乳酸-羟基乙酸聚合物的乳酸/ 羟基乙酸的摩尔比为50:50至85:15。聚合物重均分子量大小为10000至80000道尔顿。
8、 根据权利要求1或4所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物还包含 0.5%wt至30%wt保护剂。
9、 根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于保护剂选自山梨醇、木糖醇、 甘露醇、海藻糖、壳聚糖、葡聚糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、泊洛沙姆188、聚乙二醇或 聚乙烯吡咯垸酮中的 一种或几种。
10、 根据权利要求9所述的药物组合物，其中聚乙二醇重均分子量范围在1000至 卯00道尔顿；聚乙烯吡咯烷酮重均分子量范围在2000至20000道尔顿。
全文摘要
本发明涉及含有微粉化固体形式的人血管内皮抑制素为活性成分的药物组合物及所述组合物的制备方法。该组合物包含可药用载体和微粉化固体形式的人血管内皮抑制素，可药用载体可以是乳酸-羟基乙酸聚合物。该组合物还可以包含0.5％wt至30％wt保护剂。
文档编号A61K38/17GK101642559SQ20081012276
公开日2010年2月10日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者李海瑞, 王青松, 许向阳, 陈英杰 申请人:江苏先声药物研究有限公司