专利名称：基于n1l和b8r基因缺失的痘苗病毒载体的艾滋病疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗病毒免疫学领域。更具体地，本发明涉及一种复制型痘 苗病毒载体、基于所述载体的重组艾滋病疫苗、及所述疫苗的制备方法和 用途。
背景技术：
获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) 简称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)
感染引起的一种传染性疾病。自1981年发现第一例病例以来，艾滋病一直 以惊人的速度在全球蔓延，成为世界上危害人类生命和健康最严重的病毒 性疾病之一。
HIV的全球流行导致了极高的致病率和病死率，为防治HIV的感染， 传统的化学药物治疗、免疫治疗以及新的方法得以不断研究、发展。对多 数HIV感染者进行高活性抗病毒治疗(HAART)，虽可有效抑制病毒血症， 延缓病程，但不能清除潜伏的病毒。保护性的疫苗接种是解决防治HIV感 染全球性问题的最佳途径。为此，科学家们幵展了减毒活疫苗、灭活疫苗、 重组亚单位疫苗、DNA疫苗以及各种活载体疫苗(例如以腺病毒、金丝雀 痘病毒、流感病毒、痘苗病毒、狂犬病毒、疱疹性口腔炎病毒、伤寒杆菌、 链球菌等为载体的疫苗)的研究。虽然减毒活疫苗在猴免疫缺陷病毒(SIV) 感染模型中被证实有效，但在初次免疫成年猕猴中存在一定致死率。被HIV 感染的猩猩仍可被第二种不相关的HIV感染。由于减毒活疫苗的风险性以 及有证据表明其无广泛保护性，减毒活疫苗的应用尚待进一步研究。研究 表明，在猩猩模型中，灭活疫苗不能保护HIV攻击，不能诱导细胞毒性T 淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte, CTL)反应。病毒活载体疫苗和DNA疫 苗都既可以诱导细胞免疫反应，又可以诱导体液免疫反应，表达HIV抗原 的活载体疫苗和HIV DNA疫苗的联合免疫成为防治HIV感染的新的疫苗 研究策略。
3在活载体疫苗的研究中，以痘苗病毒(例如，痘苗病毒天坛株(vaccinia virus TianTan strain，VTT))为载体的活载体疫苗研究进行得最为深入和广 泛。重组痘苗病毒疫苗具有效果好、对热稳定性好、接种方便、不需佐剂 等优点，然而重组痘苗病毒疫苗接种人体后产生较重的局部反应，特别是 在一定比例的免疫缺陷患者中可引起严重的并发症。表达某些免疫原的重 组痘苗病毒疫苗未能达到理想的免疫效果，如何能在增强重组痘苗病毒疫 苗的免疫原性同时进一步提高痘苗病毒载体的安全性，学者们作出了很多 深入的研究。随着新的病毒性疾病不断出现，以及对宿主抗病毒免疫机理 的深入了解，构建表达同一病原多种抗原、不同病原多种抗原的多价重组 痘苗病毒载体，以及在重组痘苗病毒载体中寻找更多稳定有效的外源基因 插入区意义重大。
发明内容
本发明提供了针对HIV感染的新的疫苗，其中该疫苗采用复制型痘苗 病毒为载体构建。本发明还提供了应用本发明的疫苗的免疫接种方案。
本发明提供了一种表达HIV抗原的减毒艾滋病疫苗，其包含复制型痘 苗病毒作为载体，其中所述痘苗病毒基因组的TK区插入了至少一种编码 HIV抗原的多核苷酸，且所述痘苗病毒基因组的NIL基因和B8R基因同时 缺失。
本发明的艾滋病疫苗中，所述复制型痘苗病毒例如是痘苗病毒天坛株。 优选地，在本发明的艾滋病疫苗中，所述至少一种编码HIV抗原的多 核苷酸来源于中国HIV主要流行毒株B7C型CN54株。可用于构建本发 明的艾滋病疫苗的HIV抗原选自gag、 pol和env中的一或多种。在一个优 选的实施方式中，可以将gag、 pol和env同时插入本发明的艾滋病疫苗。 本发明的艾滋病疫苗还可包含药用可接受的佐剂、载体和/或赋形剂。 本发明还提供了一种艾滋病免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个成份和 指示免疫程序的说明书，其中 一个成份为本发明的上述艾滋病疫苗。
本发明还提供了艾滋病疫苗病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ，其于2008 年4月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北 京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏号CGMCC2431。
本发明还提供了转移质粒pSKNlLLacZ，包含其的大肠杆菌(&c^^/w'a co//)于2008年4月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏号CGMCC2432。
此外，本发明还提供了转移质粒pSKNlL，其构建图谱如图17中所示。
图1A-图1D:显示VTTDNA、 N1LL片段、N1LR片段、N1LLR片段、 pE/L+p7.5+下游LacZ片段PCR扩增结果。泳道1、 8、 ll为DNA分子量 标记DL15000 (Takara公司)；泳道2、 5为DNA分子量标记DL2000 (Takara 公司)；泳道3、 4为VTTDNA;泳道6为N1LL片段；泳道7为N1LR片 段；泳道9为N1LLR片段；泳道10为pE/L+p7.5+LacZ片段。
图2A和图2B:显示质粒pSKNlL、 pSKNlLLacZ酶切分析结果。泳 道1 、4为DNA分子量标记DL15000 (Takara公司)；泳道2为pSKNlL/Bg/II; 泳道3为pSKNlL/尺; "I ; 泳道5为pSKNlLLacZ ; 泳道6为 pSKNlLLacZ/K;wI;泳道7为pSKNlLLacZASa/1。
图3A-图3C:显示PCR扩增检测N1L、 B8R基因同时缺失的重组病 毒VTKgpeAB8RANlLLacZ的结果。泳道1、 6为DNA分子量标记DL2000 (Takara公司)；泳道4为DNA分子量标记DL15000 (Takara公司)；泳道2 为VTKgpe扩增产物(引物SEQ ID NO.: 7和8);泳道3为 VTKgpeAB8RANlLLacZ扩增产物(引物SEQ ID NO.: 7禾卩8);泳道5为 VTKgpe八B8RANlLLacZ扩增产物(引物SEQ ID NO.: 1禾n 4);泳道7为 VTKgpe扩增产物(引物SEQ ID NO.: 1和4)。
图4:显示PCR扩增检测重组病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ中的fflV-1 外源基因的结果。泳道1为DNA分子量标记DL15000 (Takara公司)；泳道 5为DNA分子量标记DL2000 (Takara公司)；泳道2为 VTKgpeAB8RANlLLacZ扩增产物(引物SEQ ID NO.: 9和10);泳道4 为VTT扩增产物(引物SEQ ID NO.: 9和10)。
图5:显示Western blot检测重组病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ中的外 源基因稳定表达结果。泳道1为CEF细胞；泳道2为预染蛋白质分子量标 记(BENCHMARK Prestained protein Ladder);泳道3为VTT感染的CEF 细胞；泳道4为VTKgpe感染的CEF细胞；泳道5为VTKgpeAB8RANlLLacZ 感染的CEF细胞。图6A-图6D:显示重组病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ分别在CEF、 TIC143、 Vero、 BHK细胞中生长曲线测定结果。
图7:显示重组病毒在小鼠足垫局部增殖检测结果。 图8:显示重组病毒的家兔皮内毒力实验结果。 图9:显示重组病毒的乳鼠脑内毒力实验结果。
图10:显示免疫小鼠脾细胞胞内IFN-Y染色流式细胞仪分析结果。 图11:显示免疫小鼠脾细胞胞内IL-2染色流式细胞仪分析结果。
图12:显示Elispot检测小鼠抗-mVenvT细胞产生IFN-Y的结果。 图13:显示Elispot检测小鼠抗-HIV gag T细胞产生IFN々的结果。
图14:显示Elispot检测小鼠抗-HIVpolT细胞产生IFN-Y的结果。 图15:显示各免疫组gag特异性IgG抗体滴度结果。 图16:显示各免疫组gpl20特异性IgG抗体滴度结果。 图17:显示转移质粒pSKNlL、 pSKNlLLacZ构建示意图。
具体实施例方式
本发明提供了一种表达HIV抗原的减毒艾滋病疫苗，其包含复制型痘 苗病毒作为载体，其中所述痘苗病毒基因组的TK区插入了至少一种编码 HIV抗原的多核苷酸，且所述痘苗病毒基因组的NIL基因和B8R基因同时 缺失。
在一个优选的实施方式中，在本发明的艾滋病疫苗中作为载体的是痘 苗病毒天坛株。
在一个优选的实施方式中，用于构建本发明的艾滋病疫苗的编码HIV 抗原的多核苷酸来源于中国HIV主要流行毒株B7C型CN54株。
在另一个优选的实施方式中，可用于构建本发明的艾滋病疫苗的HIV 抗原选自gag、 pol和env中的一或多种。在一个更优选的实施方式中，可 以将gag、 pol和eiw同时插入本发明的艾滋病疫苗。
在一个优选的实施方式中，本发明的艾滋病疫苗还可包含药用可接受 的佐剂、载体和/或赋形剂。合适的佐剂、载体和赋形剂是本领域中所己知 的。
本发明还提供了一种艾滋病免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个成份和 指示免疫程序的说明书，其中一个成份为本发明的艾滋病疫苗。在一个优选的实施方式中，在母本毒株VTKgpeAB8R (中国专利申请
发明者颖 刘, 刘明杰, 邵一鸣, 薇 黄 申请人:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心