专利名称：抗肿瘤的树状多肽大分子药物载体系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤的树状多肽大分子药物载体系统，及其在制药中 的应用。树状多肽大分子可以由单一或不同的天然氨基酸经过固相、液 相或固-液结合方法合成得到，可用于制备装载抗恶性肿瘤治疗药物的载
体释放系统。树状多肽大分子载体药物系统可以是两种结构形式抗肿 瘤活性小分子药物包封于树状多肽大分子聚合物中，抗肿瘤药物与树状 多肽大分子表面的阴离子官能基团相互作用，使得树枝状聚合物能够摄 取抗肿瘤活性小分子，且有可能与树状多肽大分子内部的官能基团结合； 抗肿瘤活性药物小分子与抗肿瘤的树状多肽大分子表面的官能基团结 合，形成共价键载体药物系统，可以通过选择性的功能连接桥，此功能 连接桥可以在肿瘤组织有效的断裂释放药物。树状多肽大分子药物载体 系统可以相应的抑制恶性胂瘤生长，通过静脉、口服、皮下、动脉内给药 或局部给药的方式给予患恶性肿瘤的患者。抗肿瘤的树状多肽大分子药 物栽体系统具有较高的靶向性、较高的载药能力、良好的水溶性、稳定 性和较低的毒性。
背景技术：
癌症已经成为威胁人类生命健康的最严重的疾病。由于老龄化人群始 终在增加，预计癌症的发病率会持续增长。目前治疗癌症使用的方法有手 术、放疗和化疗。治疗方式的选择取决于癌症的类型、位置和散布情况。 化疗是手术和放疗的重要的辅助有段，对于不能手术和放疗的癌症只能借 助于化疗。目前使用的抗癌药物存在严重的副作用，这些副作用通常限制 了化疗药物的应用并且导致很多癌症没有了治疗选择。例如许多的抗肿瘤 药物分子以及含铂物质的非特异性毒性和较差的水溶性，卡铂和顺铂的使 用相应受到了限制。
聚合物作为抗胂瘤小分子药物载体，特别是对于那些在生理pH值下有低溶解度的药物，对正常组织是有毒性的，或不能够以足够的剂量给药
的药物，近年来成为令人感兴趣的研究对象[比如，H. Ringsdorf, J . Polymer sci. Symp. 1975， 51: 135-153 ]。抗肿瘤药物的聚合物栽体能够 提供有效的给药系统，是因为其在释放性能方面的溶解度、毒性和高剂量 等特征。文献有报道阿霉素负栽在大分子载体释放的一些研究成果〔如 R. Duncan etal.， Hum. Exp. Toxiocol. 1998， 17: 93-104; P. A. Vessey et al.， Clin. Cancer Res. 1999， 5: 83-94; L W. Se，ur et al.， J. Cancer 1990, 63: 859- 866〕。
将抗肺瘤药物与大分子载体偶合，利用肿瘤血管组织对大分子偶合物 的高渗透性，可以将药物选择性乾故于肿瘤组织。而且，非常需要提供一 种精确的药物释放系统，以提供抗肿瘤药物分子的良好的药效、较高的载 药能力、良好的水溶性、良好的贮藏稳定性、较小的毒性和在体内提高的 抗肺瘤活性。
树枝状聚合物独特的结构和性质而应用树枝状聚合物作药物释放载 体或载剂已经有才艮道[R， Esfsndando， D. A. Tomalia ， DDT. 2001， 6:427-436; US5338532和5527524]，特别是提出了树枝状聚合物的外表 面的功能特征和内部的形态特征特别有助于发展药物控制释放和靶向药 物释放系统的新方法。
多肽树枝状大分子是指在分子结构中包含有多肽的树枝状大分子。在 多肽树枝状大分子中，氨基酸或多肽作为引发核或者枝化单元，以共价键 形式连接在整个分子中。树枝状多肽大分子具有一般树枝状大分子的普遍 特性，同时又具有多肽的生物特性。树枝状多肽大分子的特性主要包括以 下几个方面(1)具有类蛋白的球状结构，能作为天然配体的受体；(2)多 价结构使其能同时与两个或多个配体发生相互作用或者连接众多的有用 基团；(3)生物相容性好，细胞毒性低；(4)水溶性好；(5)高支化度使 其不易被蛋白酶降解；(6)容易被细胞内吞，可用作药物的传输载体。由 于这些特性，使多肽树枝状大分子在生物、医药领域有着广泛的潜在应用
发明内容
本分明涉及可用于制备装载抗肿瘤治疗药物的树状多肽大分子载体 释放系统，以树状多肽大分子为载体，通过包封或者共价键连接形式结合 抗肿瘤活性小分子药物。树状多肽大分子可以由单一或不同的天然氨基 酸经过固相、液相或固-液结合方法合成得到，可用于制备装栽抗恶性肿 瘤治疗药物的栽体释放系统。
树状多肽大分子以天然氨基酸为结构单元，优选的为甘氨酸、赖氨 酸、谷氨酸、脯氨酸等氨基酸，树状多肽大分子可以有同种氨基酸单元 构建，也可以由不同种的氨基酸来构建。其合成方法和传统树枝状大分 子的相同，可分为发散法和收敛法两大类。发散法是一种直接合成的方 法，从引发核开始逐步生长，不断向外发散，形成树枝状大分子。收敛 法是一种间接合成的方法，先合成需要的功能基团，纯化后以特定的化 学方法连接到树状核心上。优选的釆用发散法和收敛法相结合的合成方 法，首先用发散法合成扇形的树枝状多肽大分子片断，然后通过收敛法 与特定的核心键合，得到不同结构的球型、哑铃型树枝状多肽大分子。 无论发散法还是收敛法，都可以运用固相、液相或固-液结合方法合成 方法来实现。
抗肿瘤治疗药物的载体系统中树状多肽大分子，可以是药学可接受的
盐类化合物对于碱性树状多肽大分子栽体优选的为氟化物、氯化物、溴 化物、碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸 盐、富马酸盐、枸橼酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁 桃酸盐、曱磺酸盐或对甲苯磺酸盐；对于酸性树状多肽大分子载体基于碱 金属和碱土金属的阳离子，如钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐、铝盐等， 以及铵、季铵和胺阳离子，其中包括但不限于铵、四曱基铵、四乙基铵、 甲胺、二曱胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等以及用于形成碱加成盐的其它代 表性有机胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、派溱等。
抗肺瘤治疗药物的载体系统中树状多肽大分子，可以是药学可接受的 酯类化合物，指可在体内7jc解的酯，包括在人体内降解释放出母体化合物 或其盐的酯，合适的酯基团包括例如衍生自药学上可接受的脂族羧酸或 脂族族醇，尤其是链烷酸(醇)、链烯酸(醇)、环烷酸(醇)和链烷二羧酸(二醇)的酯，其中优选的各烷基或烯基部分少于6个碳原子。
树状多肽大分子载体药物系统可以是两种结构形式抗肿瘤活性小 分子药物应用负电荷分流技术包封于树状多肽大分子聚合物中，抗肿瘤 药物与树状多肽大分子表面的阴离子官能基团相互作用，使得树枝状聚 合物能够摄取抗肿瘤活性小分子，且有可能与树状多肽大分子内部的官 能基团结合；抗肿瘤活性药物小分子与抗肿瘤的树状多肽大分子表面的 官能基团结合，形成共价键载体药物系统，可以通过有效的具有功能性 的连接桥，此功能性连接桥可以在肿瘤组织有效的断裂释放药物
抗肿瘤的树状多肽聚合物配合体含有结合了抗肿瘤剂的树枝状聚合 物，形成了树状聚合物的抗肿瘤剂配合体，例如，特别是铂类树枝状聚合 物配合体。这些抗肺瘤树枝状多肽聚合物配合体的制备是通过得到具有能 够结合抗肿瘤剂并能与之相互巧作用的功能基团或鳌合基团的树枝状多 肽聚合物，将该树状多肽聚合物与抗胂瘤剂接触，以共价或非共价方式， 例如包封于树状多肽聚合物内部，局部或全部分散在聚合物中，或以鳌合 方式链接在聚合物上，或这些方式的组合，使树状多肽聚合物摄取抗肿瘤 剂而完成的，其中链接是共价键、氢键、吸附、吸收、金属键、偶极-偶
极相互作用、范德华力、离子键、7T-7T芳香平面的堆积作用、酯键或酰
胺健，或其组合。
作为树状多肽大分子载体药物系统共价键合结构，具有选择性的功能 连接桥可以使在肺瘤组织选择性的裂解的寡肽小分子，可以有效地控制药 物分子的释放，其中优选的为组织蛋白酶敏感性的二肽为Phe-Lys连接， 前列腺特异性抗原可以特异性的裂解Gin-Ser之间的肽键。肿瘤组织中蛋 白水解酶的含量高于正常組织。如组织蛋白酶B(cathepsin B， CB)和前 列腺特异性抗原(prostate-specific antigen, PSA) 。 CB在胃癌、肺 癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌等胂瘤组织具有特异性表达；前列腺癌细胞 可分泌大量具有糜蛋白酶样活性的PSA。CB敏感性的二肽为Phe-Lys连接， PSA可以特异性的裂解Gln-Ser之间的肽键将抗肿瘤药物与CB、 PSA特异性的寡肽偶联形成的前药，到达胂瘤组织后，能够^皮CB、 PSA等肿瘤组 织特异性的酶水解，释放活性形式的抗肿瘤药物，从而提高化疗指数。如 紫杉醇与CB敏感性的二肽Phe-Lys形成的偶合物在血浆中保持稳定；在 组织蛋白酶中能够选择性水解；将阿霉素(Dox)、长春花碱(Vin)等抗肿瘤 药物与PSA特异性寡肽连接形成的前药偶合物[27-32]在血浆中能够保持 稳定，但是在前列腺癌组织中肽键能够被PSA选择性酶解，释放游离药 物。
在本发明的某些实施方案中，树状多肽大分子药物载体系统所包埋 或者键合的有机小分子治疗药物包括但不限于化疗药物、抗-致肿瘤剂、 抗血管化剂、肿瘤抑制剂、或抗微生物剂。在某些实施方案中，预期可 用于本发明的各种抗癌或化疗药物包括但不限于化疗药物优选的为阿西 维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿多来新、多柔比星、阿地 白介素、阿利维A酸、别嘌醇钠、六曱蜜胺、安波霉素、醋酸阿美蒽醌、 氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、氨茴霉素、门冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎 胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他、苯佐替派、贝沙罗汀、比卡鲁胺、 盐酸比生群、二曱磺酸双奈法德、疏酸博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、 白消安、卡麦角林、卡普睾酮、卡醋胺、盐酸卡柔比星、塞来考昔、苯 丁酸氮芥、西罗霉素、曱磺酸克立那托、环磷酸胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、 盐酸柔红霉素、地西他滨、地扎胍宁、地吖醌、多西他赛、屈洛昔芬、丙 酸曱雄烷酮、达佐霉素、依达曲沙、盐酸依氟乌氨酸、依沙声星、巴普氨 酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌 二醇氮芥磷酸钠、依他硝唑、乙碘油I131、依托泊苷、氯苯乙嘧胺、盐酸 法罗唑淋、法扎拉滨、芬维A胺、氟尿嘧啶脱氧核苷、磷酸氟达拉滨、 氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、醋酸戈舍瑞林、 盐酸伊达比星、异环磷酸胺、伊莫福新、盐酸依立替康、醋酸兰瑞肽、来 曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽 醌、马索罗酚、美登素、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯嘌呤、甲氨蝶呤、曱氧沙林、氯苯氨啶、美妥替派、米 丁度胺、米托洁林、米托马星、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托 蒽醒、麦考酚酸、诺考达唑、诺拉霉素、奥昔舒仑、紫衫醇、帕米麟酸二 钠、培门冬酶、培利霉素、溴新斯的明、疏酸培来霉素、培磷酰胺、派泊 溴烷、派泊舒凡等。
在本发明的某些实施方案中，树状多肽大分子药物载体系统所包埋 或者键合的由铂、钛、钒、铌、铝、铼或锡的含有金属的抗肿瘤药物的 组合物，优选的含有金属的抗肿瘤药物为顺铂、卡铂、奥沙利铂、
teraplatin 、 Platiniuln-DACH 、奥马柏、二氯环戊二烯钬、二氯环戊 二烯钒、二氯环戊二烯铌、二氯环戊二烯铝、二氯环戊二烯铼、二囟代二 有机锡或其它含有金属的抗肺瘤药物。
其中所述的肿瘤性疾病选自白血病(包括急性白血病、急性淋巴白血 病、急性髓细胞性白血病、成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、粒-单 核细胞型白血病、单核细胞性白血病、红白血病、慢性白血病、慢性髓细 胞性白血病、慢性淋巴白血病)、真性红细胞增多、淋巴瘤、何杰金病、 非何杰金病、多发性骨髓瘤、特发性巨球蛋白血症、实体瘤、肉瘤和癌、 纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉 瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、 平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、 鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺 癌、嚢腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、 精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺 癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管 细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少 突神经胶质瘤、硬脑膜肉瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜神经细胞瘤 等。
这些抗肿瘤的树状多肽大分子栽体药物系统可以抑制恶性肿瘤生 长，优选是通过静脉、口服、皮下、动脉内给药或局部给药的方式给予患 恶性肺瘤的患者。抗肺瘤树状多肽大分子载体药物系统使得抗肿瘤剂具有了令人惊奇的意想不到的高效能、高载药能力和高剂量。抗肿瘤树状聚合物配合体还显示出令人惊奇的意想不到的毒性的降低、良好的水溶性、良好的贮藏稳定性和在体内提高的抗肺瘤活性。
具体实施例方式
下面用实施例具体说明本发明，这些实施例不应理解为任何意义上的对本发明的限制。
树状多肽大分子载体直接或者通过寡肽与紫杉醇，米托蒽醌和喜树碱连接形成的耙向偶合物多种，
实施例1 二代谷氨酸树状大分子-喜树碱(la)的合成二代谷氨酸树状大分子(300mg ， 2. 9 mmol)与(S ) -10-叔丁氧基羰基喜树碱(200 mg， 0. 46inmo1)在二甲基甲酰胺(40mL)中的悬浮液，在温和加热下进行溶解。当获得的溶液冷却至室温时，顺序巧加入碘化氯曱基吡啶嗡(150mg， 0. 7mmo1)在二甲基甲酰胺U.5mL)中的溶液和4-二曱氨基吡咬(100mg， 0. 9 mmol )在二甲基曱酰胺(2. 5mL)中的溶液。搅拌100h后，混合物在冰浴中冷却，然后在剧烈搅拌下、在30min内加入10 Q/Q氯化钠水溶液(100mL).通过緩慢加入0. 5M盐酸酸化至pH-2之后，至室温再搅拌30min。通过离心收集固体，去除上清液。固体悬浮在水(200mL)中，离心后再次离析出来。该洗涤过程重复两遍，然后固体在真空下干燥。该固体在2%曱醇-氯仿(30mL)中的悬浮液用超声波处理100 min ，然后过滤。重复该洗涤过程，固体在真空下干燥，从而获得黄色粉末状三代谷氨酸树状大分子-10-叔丁氧基羰基喜树碱)(400mg，收率71%)。加载百分数经测定结果是15 %。取上述产物在50min时间内加入到三氟乙酸(300mL )中。搅拌36h后，混合物在真空浓缩，获得谷氨酸树状大分子-喜树碱(la) (210mg，收率49%) 。 H-NMR镨的积分指出13%的重量加栽百分数。H-腿R ( 300MHz,TFA-d) 5 9. 13(brs， Ar-H) ， 7. 0-8. 1 ( m宽信号，Ar-H ) ， 5.2-6.4(m，C-17， C-5CH2) ， 1.07 (三重宽峰，C-18CH3)。
三代谷氨酸树状大分子-喜树碱(lb)同la的合成。
10实施例2 二代谷氨酸树状大分子-丙氨酸-喜树碱(2a)的合成20-0-丙氨酰喜树碱三氟乙酸盐(228 mg ， 0. 4mmo1) 、 二代谷氨酸树状大分子(400 mg )和N，N-二甲氨基吡啶(150mg，1.2mmo1)在无水二曱基甲酰胺(15mL)中的悬浮液中，在20min内加入1,3-二异丙基碳化二亚胺(70mg， 0. 5mmo1)在二甲基甲酰胺(lmL)中的溶液。混合物在氮气下搅拌2日。在水浴中冷却后，在30 min内加入10 %氯化钠水溶液(40mL)。搅拌lh后，混合物通过加入1N盐酸调节到pH=2. 5。滤出固体物，用水(5 x 25 mL)洗涤，然后在真空下干燥。固体用2%甲醇-二氯曱烷(4 x 50mL)洗涤，在真空下干燥，结果产出黄色粉末状二代谷氨酸树状大分子-丙氨酸-喜树碱(2a) (630 mg ,收率75%)， H-NMR(300MHz, TFA-d): 5 9. 45 (s) ， 7. 85-8. 6 (m，芳烃质子)，5. 92 (d， /=18. 3Hz，内酯质子)，5.70(s)， 5. 62(d，/=18. 3Hz,内酯质子)，4.8 0-6. 05 (m)，3. 80-4. 50 (m) ， 1. 20-2. 80 (m) ， 1. 70 (brs) ， 1. 00 (s)。
三代谷氨酸树状大分子-丙氨酸-喜树碱(2b)同2a的合成。实施例3 二代谷氨酸树状大分子-Gln-Ser-喜树碱(3a)的合成二代谷氨酸树状大分子-Gin-Ser-喜树碱(3a)由三代谷氨酸树状大分子和0-(N-叔丁氧基羰酰基)Gin-Ser-喜树碱合成的到，制备过程同2a的合成。
三代谷氨酸树状大分子-Gln-Ser-喜树碱(3b)同3a的合成。实施例4 二代赖氨酸树状大分子-米托蒽醌(4a)的合成二代赖氨酸树状大分子(500mg ， 0. 21mmo1 )与(N， N-二芴氧羰酰基)米托蒽醌(450mg ， 0. 45mmo1)进入到原底烧并瓦中，加入干燥的二氯甲烷100mL和DMF50mL，水盐浴-10。C，加入DCC和DMAP个10 mg,低温反应一个小时，除去溶剂，柱色i瞽提纯，加干燥的4M盐酸的二氧六环溶液15mL，室温搅拌l小时，得到420mg白色固二代赖氨酸树状大分子-米托蒽醌(4a)，收率72%。 H-NMR镨的积分指出24%的重量加载百分数。三代赖氨酸树状大分子-米托蒽醌(4b)同4a的合成。实施例5 二代赖氨酸树状大分子-Gin-Ser-米托蒽醌(5a)的合成二代赖氨酸树状大分子-Gin-Ser-米托蒽醌(5a)由二代赖氨酸树状大分子和0-N-叔丁氧基羰酰基)Gln-Ser-米托蒽醌合成的到，制备过
程同(4a)的合成。
三代赖氨酸树状大分子-Gln-Ser-米托蒽醌(5b)同5a的合成。实施例6 二代赖氨酸树状大分子-紫杉醇(4a)的合成二代赖氨酸树状大分子-紫杉醇(4a)由二代赖氨酸树状大分子和
(N，N-二芴氧羰酰基)紫杉醇合成的到，制备过程同(4a)的合成。三代赖氨酸树状大分子-紫杉醇(4a)
实施例7 二代赖氨酸树状大分子-Gln-Ser-紫杉醇(7a)的合成二代赖氨酸树状大分子-Gln-Ser-紫杉醇(7a)由二代赖氨酸树状大
分子和0-N-叔丁氧基羰酰基)Gln-Ser-紫杉醇合成的到，制备过程同
(4a)的合成。
三代赖氨酸树状大分子-Gin-Ser-紫杉醇(7b)同7a的合成。
实施例8 体外释放试验
(a) HPLC测定条件
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶，流动相，乙腈0. 035mol/L醋酸铵(45: 55 ), pH = 5. 5，紫外检测波长为229謂，流速为1. Oml/min。测定结果以解离百分率表示解离百分率- (1-Ai/A。)100%Ai:不同时间取才羊所测峰面积AO: 0小时所测峰面积
(b) 树状多肽大分子药物载体系统在緩冲液和血浆中的稳定性
以pH 7. 20的緩冲液模拟血浆近中性pH，考察树状多肽大分子药物载体系统的稳定性；pH 4. 60的緩沖液模拟肝细胞溶酶体内偏酸性pH，测定药物的解离速率，考察pH对药物释放影响。
测定步骤用不同pH的0. 1M的Na2HP04-柠檬酸緩冲液配制一定浓度的偶合物样品溶液，放于371C恒温水浴保温，分别于0， 2， 4， 8,12，和24小时取样，吸取20pl， HPLC测定。
树状多肽大分子药物载体系统在血浆中的稳定性实验取适量偶合物样品加入到血浆中，放于371C恒温水浴保温，分别于O， 1， 2， 4, 8，
1212, 24小时取样，按"生物样品前处理"方法处理样品，HPLC测定。每个样品平行操作两次，结果取平均值，测定结果的表示及计算方法同緩冲液。
緩冲液实验结果表明，树状多肽大分子药物栽体系统在pH 7. 20的緩冲液中较稳定，37C下保温24小时后只解离了 2-5%;在pH 4.60的緩冲液中保温24小时后解离了 19-25% ，解离物以游离抗肿瘤药物为主，可见，pH对药物解离速率有一定影响。
血浆实验结果表明，树状多肽大分子药物载体系统在血浆中均较稳定，37匸下保温24小时后只解离了 3-5%
(c)树状多肽大分子栽体药物系统在PSA緩冲液中的稳定性测定
在50 mM Tris-HCl和140 mM NaCl pH7. 4的緩冲液中，按100: 1的摩尔比加入乾向偶合物和PSA，于37X:保温，在不同时间点取样，加ZnCl2 (100 mM终浓度)终止反应，用HPLC法测定药物的释放。
树状多肽大分子栽体药物系统在PSA緩冲液中能充分解离，解离速率随连接子结构的不同而变化，在37'C下保温2小时后可达完全解离，解离物以抗肿瘤药物为主。
实施例9细胞毒性药理实验
用SRB法测定目标化合物对3种人癌细胞的增殖抑制作用。取对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人早幼粒性白血病HL-60细胞、人肝癌细胞Bet-7402和人口腔上皮癌细胞KB等5种人癌细胞以4xl04个/mL细胞接种于96孔板内。在37 "C、体积分数5 %的002饱和湿度培养箱中培养12 h ，加入待测化合物处理48 h后，浮游细胞HL-60需每孔加入50jiL 4 r预冷的体积分数80 %的三氯醋酸，使其最终达到体积分数为16 。/。；贴壁细胞则需每孔加入50nL 4'C预冷的体积分数为50 %三氯醋酸，使其最终达到体积分数为IO %。 4"C冰箱固定细胞1 h后，每孔加入50iaL体积分数为O. 4 。/。的磺酰罗丹明B ，室温染色30 min。最后每孔加入150)iL lOmmol . 1/的Tris碱，在微量振荡器上振荡15 min ，直至染料全部溶解。利用酶标仪在540 nm处测每孔溶液的吸光度值(A值)、空白孔吸光度值。按以下公式计算目标化合物对肿瘤细胞体外增殖的抑制率(inhibition rate ， IR):
IR % = (1 - 4一M一) x簡％
用ICPl. 0. 0软件计算药物的半数抑制浓度(IC5。)。并与阳性对照药罗菲昔布和5-氟尿嘧啶比较。结果显示化合物2b， 3a， 3b， 5b对人胃癌SGC-"01细胞和人宫颈癌HeLa细胞的IC5。值高于阳性对照药紫杉醇，米托蒽醌和喜树碱；化合物la， lb， 6a,对人早幼粒性白血病HL-60细胞的I"。值高于阳性对照药。所测试化合物对人早幼粒性白血病HL-60细胞、人肝癌细胞Bet-7402和人口腔上皮癌细胞KB均有一定的抑制作用，但作用均低于阳性对照药。
实施例IO样品体外培养抗肿瘤作用实验
采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定所发明化合物对肺瘤细胞生长的抑制效应。方法将含体积分数为10 %新生小牛血清的RPMI-1640培养液配制的小鼠肉瘤腹7jC林(S彻)、小鼠艾氏腹水瘤林(EAC)和小鼠肝癌腹水林(HeAP) 3种肿瘤细胞悬液分别接种于96孔培养板，每孔180 pL(接种浓度为5 xl05/mL)，同时加入受试化合物使每孔浓度分别为250、 50 、 10 、 2、 0.4|ag/ mL共5个浓度，每个浓度均做3个复孔。
将培养板置于体积分数为5 °/。co2 、恒温37 x:、 100 °/。相对湿度的培养箱
内培养，72 h后每孔分别加入50nL MTT (1 mg/mL),继续培养4 h弃去上清液，每孔加入150 mL 二甲基亚砜(DMSO),震荡溶解后釆用3550型酶标仪在波长595 nm处测吸光度(幼值，计算细胞存活率p细胞存活/ %="实验组/"对照组x 100 °/。，将细胞存活率与化合物浓度的对数进行回归统计处理，计算半数抑制浓度(Pn:5。)，并与阳性对照药紫杉醇，米托蒽醌和喜树碱比较。结果显示化合物2~4对3种胂瘤细胞林均显示出一定的抑制作用，但作用均低于阳性对照药(P < 0. 01)。实施例13样品体内抗肿瘤作用实验
采用携带皮下B16黑瘤的C57BL/6小鼠，测定注射树状多肽大分子载体药物系统的最大耐受剂量(MTD)和相对疗效。肿瘤是通过皮下注射在补充了 2 %FBS的0.2mL体积PBS (磷酸緩冲盐水)中的1. 0 x 105，鼠科黑瘤细胞(B16-F0;ATTC CRL-6322 )而生长在右肩钾间隙区域的肌肉中的。试验化合物和载体对照样在肿瘤细胞移植后7或8日，当肿瘤已长到5土lmm3时给药的(每209体重0. 5mL)。所有注射都通过腹腔内进行。每一个治疗组由10只随机分派到每个组的小鼠组成。肿瘤体积按照会式(长x宽x高)/2计算。肿瘤等于或大于2000 mm3，的小鼠则通过颈稚脱位使之安乐死。试验化合物的胂瘤疗效，通过计算肿瘤生长延緩(TGD)来确定治疗组中肺瘤达到某一固定体积以天数表示的平均10时间减去对照组中肿瘤达到同样体积的平均时间。为确定统计学差异，^:了未配对的t-试验。以各种不同浓度对化合物进行了试验，以确定它们的最大耐受当量。
结果显示树状多肽大分子药物载体系统的最大耐受当量是游离药物的两倍。在所有情况下，树状多肽大分子药物载体系统都显示出比游离药物好的杭肿瘤效果，无论是直接偶联还是利用寡肽连接基，都具有在其最大耐受当量剂量水平比药物小分子提高的疗效。
权利要求
1. 一种可用于制备装载抗恶性肿瘤治疗药物的树状多肽大分子载体释放系统(抗肿瘤分子-X-)m-树状多肽大分子X可以为酰胺键、酯键或者寡肽连接小分子，树状多肽大分子的结构单元为天然的氨基酸，树状多肽大分子可以由单一或不同的氨基酸经过固相、液相或固-液结合方法合成得到。
2. 抗肿瘤治疗药物的载体系统中树状多肽大分子，可以是药学可接受的盐类化合物对于碱性树状多肽大分子栽体优选的为氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、枸橼酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐或对甲笨璜酸盐；对于酸性树状多肽大分子栽体基于碱金属和碱土金属的阳离子，如钠盐、锂盐、钟盐、钧盐、镁盐、铝盐等，以及铵、季铵和胺阳离子，其中包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、曱胺、二曱胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等以及用于形成碱加成盐的其它代表性有机胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、p底溱等。
3. 抗肿瘤治疗药物的载体系统中树状多肽大分子，可以是药学可接受的酯类化合物，指可在体内水解的酯，包括在人体内降解释放出母体化合物或其盐的酯，合适的酯基团包括例如衍生自药学上可接受的脂族羧酸或脂族族醇，尤其是链烷酸(醇)、链烯酸(醇)、环烷酸(醇)和链烷二羧酸(二醇)的酯，其中优选的各烷基或烯基部分少于6个碳原子。
4. 树状多肽大分子载体药物系统可以是两种结构形式抗肺瘤活性小分子药物应用负电荷分流技术包封于树状多肽大分子聚合物中，抗肿瘤药物与树状多肽大分子表面的阴离子官能基团相互作用，使得树枝状聚合物能够摄取抗肿瘤活性小分子，且有可能与树状多肽大分子内部的官能基团结合；抗肿瘤活性药物小分子与抗肿瘤的树状多肽大分子表面的官能基团结合，形成共价键载体药物系统，可以通过有效的具有功能性的连接桥，此功能性连接桥可以在肿瘤组织有效的断裂释放药物。
5. 作为树状多肽大分子栽体药物系统共价键合结构，具有选择性的功能连接桥可以使在肿瘤组织选择性的裂解的寡肽小分子，可以有效地控制药物分子的释放，其中优选的为组织蛋白酶敏感性的二肽为Phe-Lys连接，前列腺特异性抗原可以特异性的裂解Gin-Ser之间的肽键。
6. 树状多肽大分子载体药物系统，其中所述抗肿瘤药物选自小分子有机抗肿瘤分子、含有金属的抗肺瘤药物，或其组合药物，包括凋亡诱导剂、多核苷酸(如核酶)、多肽(如酶)、药物、生物模拟物、生物碱、烷化剂、抗癌抗生素、抗代谢剂、新生血管发生抑制剂等药物，由铂、钛、钒、铌、铝、铼或锡的抗肺瘤药物优选的为顺铂、卡铂、奥沙利铂、teraplatin 、 Platiniuln-DACH 、奥马柏、二氯环戊二烯钬、二氯环戊二烯钒、二氯环戊二烯铌、二氯环戊二烯铝、二氯环戊二烯铼、二闺代二有机锡或其它含有金属的抗肿瘤药物。。
7. 树状多肽大分子载体药物系统所作用的肺瘤性疾病为广镨哺乳动物(包括人)身体引发的恶性肺瘤和癌症，其中优选的作用于人类肺癌、人类非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌和黑瘤，尤其是固体肿瘤(例如，肺、卵巢癌、乳腺、胃肠、结肠、胰腺、膀胱、肾、前列腺、脑)以及各种造血系统癌(例如，Hodgkin氏疾病、非Hodgkin氏淋巴癌、白血症)。
8. 对于树状多肽大分子栽体药物系统，其中所述活性药物小分子与树状多肽大分子的摩尔比为大约100 : 1到l : 1 。
9. 树状多肽大分子药物载体系统可以通过静脉、口服、皮下、动脉内给药或局部给药的方式给予患恶性肿瘤的患者。
全文摘要
本发明涉及抗肿瘤的树状多肽大分子药物载体系统，及其在制药中的应用。树状多肽大分子可以由单一或不同的天然氨基酸经过固相、液相或固-液结合方法合成得到，可用于制备装载抗恶性肿瘤治疗药物的载体释放系统。树状多肽大分子载体药物系统可以是抗肿瘤活性小分子药物包封于树状多肽大分子聚合物中，也可以是抗肿瘤活性药物小分子与抗肿瘤的树状多肽大分子表面的官能基团结合形成共价键载体药物系统。树状多肽大分子药物载体系统可以相应的抑制恶性肿瘤生长，通过静脉、口服、皮下、动脉内给药或局部给药的方式给予患恶性肿瘤的患者。抗肿瘤的树状多肽大分子药物载体系统具有较高的靶向性、较高的载药能力、良好的水溶性、稳定性和较低的毒性。
文档编号A61K47/48GK101461946SQ20081014712
公开日2009年6月24日 申请日期2008年8月20日 优先权日2008年8月20日
发明者湖 刘 申请人:湖 刘