包覆有可促进内皮细胞的黏附和分化的包衣的医疗装置的制作方法

专利名称：包覆有可促进内皮细胞的黏附和分化的包衣的医疗装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及供植入躯体的血管或空腔器官的各种医疗装置(medical device)。具 体来说，本发明涉及置于腔内的，其表面与血液直接接触的各种人造的医疗装置， 例如，各种包有包衣的移植片固定模(stent)、移植片固定模移植物(stent graft)、 合成的人造血管、心脏瓣膜、导管以及血管修补筛(vascular prosthetic filter) 等类医疗装置。植入的医疗装置上的的包衣材料，具有促进祖代内皮细胞在该植入 的医疗装置的表面黏附、生长和分化的作用，并可形成功能性内皮细胞层，从而抑 制在植入部位的血管和器官的内膜增殖过程。
背景技术：
动脉粥样硬化症是当今世界上人类死亡和丧失能力的主要原因之一。动脉粥样硬 化症的起因，与动脉的内腔表面有脂肪性蚀斑沉积相关。这类脂肪性蚀斑的沉积作 用可引起动脉管的横径狭。这类沉积作用最终会造成在病变部位远端的血行受阻， 而导致受该动脉供血的组织发生缺血性损害。
心冠动脉是为心脏供血的。在美国，心冠动脉的动脉粥样硬化症(CAD)是最为常 见的严重威胁生命的一种慢性疾病，受其侵害的人群可达1100万人。心冠动脉粥样 硬化症造成的社会和经济损失，要远远超过其他大多数疾病。心冠动脉内腔狭窄对 于心脏肌肉的损害作用，首先是发生心绞痛，并继以心肌梗死，最后导致死亡。在 美国，每年发生心肌梗死形成的患者人数，要高达150万例。这类患者中有60万人 (或40%)是罹患急性心肌梗死形成，这类患者中有30万人以上都是在抵达医院之前就己经死亡。(Harrison氏内科医学原理，第14版，1998)。
对于心冠动脉粥样硬化症，能够采用经由皮下的血管腔内心冠气囊血管成形术 (PTCA)进行治疗。在美国，每年要施行这种经由皮下的血管腔内心冠气囊血管成形 术的矫治程序，可达40万例。这种经由皮下的血管腔内心冠气囊血管成形术的矫治 程序的操作，是将气囊导管插入一条外周动脉管内，顺着动脉系统探索进入受阻的 心冠动脉部位。然后使气囊膨胀，将该段动脉管撑开，趟平阻塞该处的脂肪性蚀斑 块，从而增加该受损动脉管截面积的血液流量。然而，这种治疗方法往往并不能使 受损的心冠动脉管持久地维持开张状态。在接受经由皮下的血管腔内心冠气囊血管 成形术治疗的患者中，在6个月之内，为了矫治心冠动脉再狭窄问题而需要重复施 治的病例，竟可高达50%。这种在施行经由皮下的血管腔内心冠气囊血管成形术之后 再度发生狭窄的问题，在医学上就称之为再狭窄症。在急性的再狭窄症方面，血管 会重新缠巻收縮。随后，发生缠巻收縮的血管的中层平滑肌细胞，对于施行气囊矫 治程序的动脉管部位所引起损伤发生反应而增殖。平滑肌细胞的增殖部分地是由损 伤部位释放的各种炎性因子所介导的。这类炎性因子包括，凝血嗯烷A2、血小板衍 生生长因子(PDGF)以及成纤维细胞生长因子(FGF)现已开发了多种不同的技术来克 服这种再狭窄症问题。包括对于患者采用各种药物或器械(利用移植片固定模)施行 治疗。(Harrison氏内科医学原理，第14版，1998)。
在用于制服再狭窄症的各种治疗程序方面，已经证明移植片固定模是最为有效的 一种。这类移植片固定模，是可安置在受侵害的血管段内，使该处的血管内腔保持 正常状态的一种金属支架。在受侵害的血管段内放置这种移植片固定模，就可防止 该动脉段发生缠巻而形成封闭状态。移植片固定模还可防止该动脉管段沿着中层组 织发生局部开裂。移植片固定模可使动脉管腔保持大于单独采用经由皮下的血管腔 内心冠气囊血管成形术所形成的管腔，从而可减少再狭窄症多达30%。但是，尽管获 得这样的成功，这种移植片固定模仍然未能完全消除再狭窄症。(Suryapranata等， 1998。对于选择的若干急性心肌梗死形成患者的冠心动脉部位使用移植片固定模与 血管腔内心冠气囊血管成形术的随机性比较。循环系统97:2502-2502)。
动脉管狭窄问题，也可在心冠动脉之外的其他血管部位发生。其中包括腹主动脉 与骼动脉、下腹股沟动脉、远侧深股动脉、远侧胭动脉、胫动脉、锁骨下动脉以及 肠系膜动脉等。外周动脉的动脉粥样硬化症(PAD)的流行情况，与受侵害的具体解剖 部位，以及对于阻塞部位采用的诊断判定标准相关。在传统上，医师都是采用间歇 性跛行测试方法，来判定是否存在外周动脉的动脉粥样硬化症。不过，这种方法有可能过于低估人群中的实际发病情况。这类外周动脉的动脉粥样硬化症的发病率是 随年龄而变动的，在老龄人群中，外周动脉的动脉粥样硬化症的发病率是逐渐增长 的。据来自美国国家医院流量调查的数据估计，每年首次记录的诊断为慢性外周动
脉的动脉粥样硬化症病例，男性有55，000例，女性有44,000例；而首次记录的诊 断为急性外周动脉的动脉粥样硬化症病例，则有男性60， 000例和女性50， 000例。 其中有91%的急性外周动脉的动脉粥样硬化症病例都是侵害下肢部位。在外周动脉 的动脉粥样硬化症(PAD)患者中，伴发冠心动脉的动脉粥样硬化症(CAD)的比率可能 超过50%。此外，在外周动脉的动脉粥样硬化症的患者中，脑血管的发病情况也有增 长。
外周动脉的动脉粥样硬化症都可采用经由皮下的血管腔内气囊血管成形术(PTA) 施行治疗。施行经由皮下的血管腔内气囊血管成形术并结合安置移植片固定模，可 减少再狭窄症的发病率。不过，在采用诸如移植片固定模之类的医疗装置所获得的 术后效果，却与采用标准的血管再造术(即，釆用静脉或修补用旁路材料)所获得的 效果并不相称。(外科学原理，Schwartz等编，第20章，动脉管疾病，第7版，McGraw-Hill 保健专业分部，纽约1999)。
较好的是，对于外周动脉的动脉粥样硬化症采用建立旁路的程序进行治疗，艮P， 对于被封锁的动脉段，采用一种移植物建立一段旁路。(外科学原理，Schwartz等编， 第20章，动脉管疾病，第7版，McGraw-Hill保健专业分部，纽约1999)。这类移 植物可包括，自体同源性静脉段，例如，隐静脉；或者，合成的移植物，例如，采 用聚酯、聚四氟乙烯(PTFE)或膨胀性聚四氟乙烯(ePTFE)或其他各种聚合物材料。其 术后的开放率，与多种不同的因素有关。其中包括，旁路移植物的内腔大小、用作 移植物的合成材料的类型，以及流出物的部位等。不过，尽管是采用了旁路移植物， 却还是会遗留下内膜过度增殖以及血栓形成等重大问题。例如，在腹股沟下采用膨 胀的聚四氟乙烯旁路移植物施行旁路矫治程序经3年后的开放率，对于股-胭动脉旁 路是54%，而对于股-胫动脉旁路则仅有12%。
因而，有必要大大改进各种移植片固定模、合成的旁路移植物以及其他持久性接 触血液的表面和/或装置，以便可进一步减少心冠动脉的动脉粥样硬化症(CAD)和外 周动脉的动脉粥样硬化症(PAD)的发病率和死亡率。
对于移植片固定模，所用的方法是，采用各种抗凝血剂或抗再狭窄剂来涂敷移植 片固定模，以便减少血栓形成和再狭窄症。例如，用放射活性物质浸渍移植片固定 模，显示出能够抑制心肌成纤维细胞的游动和增殖，从而抑制再狭窄症。(美国专利号5, 059, 166、 5, 199， 939和5, 302, 168)。对于经受治疗的血管施行辐照处理，能够 在患者体内引起严重的边缘再狭窄症问题。此外，辐照处理方法并不许可对受损害 的血管进行均匀处理。
或者，对于移植片固定模还可采用化学药剂来包敷，例如，肝素、磷酸胆碱、雷 帕霉素和紫杉酚，所有这类药剂都有可能缓减血栓形成和/或再狭窄症。所述肝素和 磷酸胆碱，虽然对于动物模型在短时内有可能明显减少血栓形成，但是用这类药剂 施行治疗，对于预防再狭窄症则并没有长期效果。而且，肝素有可能诱发血小板减 少症，从而导致严重的血栓栓子性并发症，例如中风。由此看来，在这种治疗再狭 窄症的操作实施方面，对于移植片固定模还无法涂敷足够治疗有效量的肝素或磷酸 胆碱。
己经在若干不同的治疗方式中，采用了各种合成材料的移植物，来减少施术后的 再狭窄症和血栓症。(Boe等，1998。小口径人造血管修补术现状。生理学和生物化 学档案。106:100-115)。例如，据报道，聚氨酯的复合物，例如，多孔性聚碳酸酯 氨基甲酸乙酯具有相当于膨胀性聚四氟乙烯(ePTFE)移植物的减少再狭窄症的作用。
其移植物的表面是采用射频发热放电作用对聚对二苯甲酸酯移植物进行氟素化处理 作了修饰。这类合成的移植物还已经采用胶原之类的生物分子进行了浸渍处理。不 过，这类方法都并没有明显的减少血栓形成或再狭窄症发生率的长期效果。
内皮细胞(EC)层是在正常血管壁上的一种重要的成分可在血流与周围的血管壁 组织之间形成一个界面。这类内皮细胞还可参与各种生理活动，包括，血管形成、 发生炎症过程以及防止血栓形成(Rodgers GM. FASSEB J 1988; 2:116-123)。据近
期的一系列研究表明，除了组成血管系统的内皮细胞之外，在出生后的外周血行中， 还用内皮细胞和祖代内皮细胞(EPC)进入血液循环之中。(AsaharaT等。科学19W; 275:964-967; Yin AH，等。血液1997; 90:5002-5012; Shi Q，等。血液围;92:362-367; Gehling UM，等，血液2000; 95:3106-3112; Lin Y等，临床研究杂志2000; 105:71-77)。
据认为，祖代内皮细胞可在受损伤的内皮细胞内衬层的循环系统区域，包括创伤和 缺血性损伤部位游动(Takahashi T等，国家医学1999; 5:434-438)。在正常的成年 人中，在外周血行内的祖代内皮细胞数量可达每立方毫米3-10个(Tkahashi T等' 国家医学1999; 5:434-438;胸外科年鉴。2000; 70:629-834)。如今已经证明，血 管对于损害作用的反应，每一阶段都会受到内皮层的影响(甚至是控制)。据信，在 发生损伤而安置移植片固定模的血管段迅速建立功能性内皮细胞层，可有助于设置 一套循环细胞因子的屏障，防止血栓的不良作用，而制止潜在的严重并发症，以及
8依赖内皮细胞的作用能力，而产生使其下方平滑肌细胞层钝化的各种物质。(Van Belle等，1997;移植片固定模的内皮细胞成形术。循环系统95:438-448; Bos等， 1998。小口径人造血管修补术现状。生理学和生物化学档案。106:100-115)。
在植入移植片固定模之后，对局部施用一种内皮细胞丝裂原——血管内皮细胞生 长因子(VEGF)，就可促进内皮细胞在移植片固定模表面生长(Van Belle等，1997; 移植片固定模的内皮细胞成形术。循环系统95:438-448)。在损伤部位应用一种重 组蛋白质生长因子一血管内皮细胞生长因子的盐水溶液，就可诱发所需的作用效果。 这种血管内皮细胞生长因子可在植入移植片固定模之后，利用一种通道气囊导管输 入损伤部位。此项技术并不理想，因为，据证实，其一次输入剂量的效果太低，而 且所获的效果不一致。因而，这种施治程序并不能每次都精确地重现。
对于合成材料的移植物，也已经播种了内皮细胞。但是这种播种内皮细胞的临床 效果一般都太差。即施术之后的管腔开张率都太低(Lio等，1998，微血管移植术的 新概念和新材料修补性移植的内皮细胞播种和基因治疗方法。显微外科学 18:263-256)，其原因极是由于细胞未能妥善地黏附在移植物上和/或由于通过离体 操作处理，以至细胞丧失了其内皮细胞功能。
因而，在该具体部位的各种内皮细胞生长因子以及各种环境条件，对于内皮细胞 在血管损伤部位的黏附、生长以及分化等功能的调节作用，都是十分重要的因素。 据此，就有必要开发一些新的方法和材料，对于这类医疗装置，包括各种移植片固 定模和合成材料的移植片固定模进行包敷处理。这样就可在植入的装置上促进和加 速功能性内皮细胞层的形成，使得在目标血管段或移植的内腔部位形成一片融合的 内皮细胞单层组织，并且抑制新的内膜组织的增殖过程。这种类型的包敷技术，不 仅可抑制再狭窄症的发生，而且还可抑制因移植装置所引起的各种血栓栓子性并发 症。这种改良方案所提供的各种方法和材料，都可消除原来的技术中的各种缺陷， 而对于冠心动脉性动脉粥样硬化症(CAD)和外周动脉性动脉粥样硬化症(PAD)的发病 率和死亡率带来显著重大的良性效果。

发明内容
本发明的目标是，提供有包衣层的医疗装置，例如，移植片固定模、移植片固定 模移植物、心脏瓣膜、导管、血管修补用筛片、人工心脏、左心室内、外辅助装置 (LVAD)以及合成的人造血管，用于治疗各种血管疾病，其中包括，再狭窄症、动脉 粥样硬化症、血栓症、血管阻塞等。在一个方面，提供了一种医疗装置，所述装置包括，(a)—层包衣层，(b)至少 一种具有治疗有效量的抗体、抗体片段或其组合，以及(C)至少一种化合物；其特征 在于，所述包衣包括至少一层生物相容的基质；所述至少一种抗体或抗体片段可直 接对抗祖代内皮细胞表面的一种抗原；且所述至少一种化合物可刺激祖代内皮细胞 在该医疗装置表面形成内皮组织。
在该方面的一个优选例中，医疗装置选自移植片固定模、移植片固定模移植物、 合成的人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、 开放性卵圆孔隔膜封闭装置、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液 透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物装置、静脉瓣、缝线、血管接合夹、 留置式静脉导管、留置式动脉导管、血管鞘和药物输送口。更优选医疗装置是一种
移植片固定模。还更优选移植片固定模包括选自不锈钢、NiTi、 MP35N以及铬合金的 材料。在一个更优选实施方式中，移植片固定模还包括一个外套层、遮蔽层或包封 层，其材料选自交联PVA水凝胶、ePTFE、 PTFE、多孔型HDPE、聚氨酯和对苯二甲酸 酯。优选合成的人造血管中含有选自交联的聚乙烯醇、ePTFE、 PTFE、多孔型HDPE、 聚氨酯和对苯二甲酸酯的一种物质。
在另一个优选实施方式中，生物相容的基质中含有选自聚氨酯、嵌段的聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纤维素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖和白明胶的 一种合成材料。
在另一个优选实施方式中，生物相容的基质中含有选自胶原、弹性蛋白、层粘 连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、肝素、血纤蛋白、纤维素以及无定形碳的一种天然 存在的材料。
在另一个优选实施方式中，生物相容的基质中含有碳原子数为C2。-C彻的球烯。
更优选球烯是Ce。或C7。球烯。
在一个优选实施方式中，至少一种抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗 体和人源化抗体。在另一个优选实施方式中，至少一种抗体或抗体片段是以共价或 非共价结合的方式，或以一种连接分子共价拴系的方式，与所述医疗装置生物相容 性基质包衣的最外层相结合。在另一个优选实施方式中，至少一种抗体或抗体片段 对于人的始祖代内皮细胞具有特异性。在另一个优选实施方式中，至少一种抗体或 抗体片段可直接对抗选自CD133、 CD34、 C歸O、 CD117、 HLA-DR、 VEGFR-1、 VEGFR-2、 Muc-18(CD146)、 CD130、干细胞抗原(Sea-1)、干细胞因子1 (SCF/c-Kti配体)、Tie-2 和HAD-DR的祖代内皮细胞表面抗原。优选至少一种抗体是含有Fab或F(ab')2片段的单克隆抗体。更优选至少一种抗体是以连接分子共价拴系的方式与该医疗装置的
生物相容的基质包衣的最外层相结合。
在另一个优选实施方式中，抗体片段含有合成的或天然来源的小分子物质。 在另一个优选实施方式中，至少一种化合物是选自血管内皮生长因子(VEGF)、
成纤维细胞生长因子-3(FGF-3)、 FGF-4、 FGF-5、 FGF-6、 FGF-7、 FGF-8、 FGF-9、碱
性成纤维细胞生长因子、血小板诱导性因子、转化生长因子ei、酸性成纤维细胞生
长因子、骨粘连蛋白、促血管生成素l、促血管生成素2、胰岛素样生长因子、粒细 胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、血小 板衍生生长因子AB、内皮细胞PAS蛋白1、血小板反应蛋白(trhombospondin)、增 殖蛋白、肝配蛋白-A1、 E-选择蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲状腺素以及神 经鞘氨醇1-磷酸酯的一种生长因子。更优选生长因子是VEGF家族或促血管生成素家 族中的一种成分。
在另一个优选实施方式中，生物相容的基质中含有葡聚糖，至少一种抗体是结 合CD34细胞表面抗原的单克隆抗体，且至少一种化合物是VEGF或Ang-2。
在另一个优选实施方式中，生物相容的基质中含有葡聚糖，至少一种抗体是结 合CD133细胞表面抗原的单克隆抗体，且至少一种化合物是VEGF或Ang-2。
在另一个优选实施方式中，生物相容的基质中含有白明胶，至少一种抗体是结 合CD34或CD133细胞表面抗原的单克隆抗体，且至少一种化合物是VEGF或Ang-2。
在另一个优选实施方式中，，生物相容的基质中含有白明胶或葡聚糖，至少一种 抗体是结合Tie-2细胞表面抗原的单克隆抗体，且至少一种生长因子是VEGF或 Ang-2。
在另一个优选实施方式中，生物相容的基质中含有球烯，至少一种抗体是结合 Tie-2细胞表面抗原的单克隆抗体，且至少一种生长因子是VEGF或Ang-2。 在另一个优选实施方式中，祖代内皮细胞是一种人体细胞。 在本发明的另一个方面，提供了一种用来包衣医疗装置的组合物，组合物含 有(a)生物相容的基质，(b)治疗有效量的至少一种抗体、抗体片段或其组合，以及 (c)治疗有效量的至少一种用来刺激祖代内皮细胞在医疗装置表面形成内皮细胞层 的化合物。优选医疗装置选自移植片固定模、移植片固定模移植物、合成的人造血 管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、PF0隔膜封闭 装置、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分 流、大动脉血管瘤移植物装置、静脉瓣、缝线、血管接合夹、留置式静脉导管、留
11置式动脉导管、血管护鞘和药物输送口。优选生物相容的基质含有选自聚氨酯、嵌 段性聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纤维素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖 和白明胶的一种合成材料。还优选生物相容的基质含有选自胶原、弹性蛋白、层粘 连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、肝素、血纤蛋白、纤维素以及无定形碳的一种天然 存在的材料。还优选生物相容的基质包括碳原子数为C2。-C，的球烯。
在一个优选实施方式中，至少一种抗体或抗体片段包括选自CD133、CD34、CDw90、 CDH7、 HLA-DR、血管内皮生长因子R-1、血管内皮生长因子R-2、 Muc-18(CD146)、 CD130、干细胞抗原(Sca-1)、干细胞因子l(SCF/c-Kti配体)、Tie-2和HAD-DR的一 种祖代内皮细胞表面抗原。
在另一个优选实施方式中，至少一种抗体选自多克隆的、嵌合的、人源化的和 单克隆的抗体，且所述单克隆抗体含有Fab或F(ab，)2片段。
在另一个优选实施方式中，至少一种化合物是选自血管内皮生长因子、成纤维 细胞生长因子-3、成纤维细胞生长因子-4、成纤维细胞生长因子-5成纤维细胞生长 因子-6、成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-8、成纤维细胞生长因子-9、 碱性成纤维细胞生长因子、血小板诱导性生长因子、转化生长因子ei、酸性成纤维 细胞生长因子、骨粘连蛋白、促血管生成素l、促血管生成素2、胰岛素样生长因子、 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、 血小板衍生生长因子AB、内皮细胞PAS蛋白1、血小板反应蛋白(trhombospondin)、 增殖蛋白、肝配蛋白-Al、 E-选择蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲状腺素以及 神经鞘氨醇卜磷酸酯的一种生长因子。
在本发明的第三个方面，提供了一种包衣医疗装置的方法，包括以下步骤
a. 在医疗装置表面至少敷上一层生物相容的基质，其中生物相容的基质含有选 自聚氨酯、嵌段的聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纤维素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙 烯酯、葡聚糖、白明胶、胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、肝 素、血纤蛋白、纤维素以及碳和球烯的至少一种成分，以及
b. 在生物相容的基质中同时或相继加入治疗有效量的至少一种抗体、抗体片段 或其组合，和小分子物质，小分子物质与祖代内皮细胞表面的抗原相互作用，并将 所述祖代内皮细胞固定在该装置表面，以及至少一种刺激祖代内皮细胞在医疗装置 表面形成内皮细胞层的化合物。
在一个优选实施方式中，医疗装置选自移植片固定模、移植片固定模移植物、 合成的人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、开放性卵圆孔(PFO)隔膜封闭装置、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、 血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物装置、静脉瓣、缝线、血管接 合夹、留置式静脉导管、留置式动脉导管、血管鞘和药物输送口。
在另一个优选实施方式中，至少一种抗体是以共价或非共价方式附着在包裹该 医疗装置的生物相容的基质上。
在另一个优选实施方式中，球烯是"。或C7。球烯。
在另一个优选实施方式中，至少一种抗体或抗体片段可直接对抗选自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-服、血管内皮生长因子R-1、血管内皮生长因子R-2、 Muc-18(CD146) 、 CD130、干细胞抗原(Sea-1)、干细胞因子1 (SCF/c- Kti配体)、Tie-2 和HAD-DR的祖代内皮细胞表面抗原。优选至少一种抗体是一种单克隆抗体并包括抗 体的大分子或小分子。
在另一个优选实施方式中，至少一种化合物是选自血管内皮生长因子、成纤维 细胞生长因子-3、成纤维细胞生长因子-4、成纤维细胞生长因子-5成纤维细胞生长 因子-6、成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-8、成纤维细胞生长因子-9、
碱性成纤维细胞生长因子、血小板诱导性生长因子、转化生长因子ei、酸性成纤维
细胞生长因子、骨粘连蛋白、促血管生成素l、促血管生成素2、胰岛素样生长因子、 粒细胞巨噬细胞集落剌激因子、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、 血小板衍生生长因子AB、内皮细胞PAS蛋白1、血小板反应蛋白(trhombospondin)、 增殖蛋白、肝配蛋白-Al、 E-选择蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲状腺素以及 神经鞘氨醇1-磷酸酯的一种生长因子。
在本发明的第四个方面，提供了一种治疗哺乳动物血管疾病的方法，包括将该 医疗装置移植入哺乳动物的血管或管状器官，医疗装置被(a)生物相容的基质，(b) 治疗有效量的至少一种抗体、抗体片段或其组合，以及(c)至少一种化合物包衣；其 中，抗体或抗体片段可识别和结合袓代内皮细胞表面的抗原，从而消除该祖代内皮 细胞在基质表面的活动能力，且化合物用来刺激固定的祖细胞以在该医疗装置表面 形成内皮细胞层。优选医疗装置选自移植片固定模、移植片固定模移植物、合成的 人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、开放 性卵圆孔隔膜封闭装置、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析 导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物装置、静脉瓣、缝线、血管接合夹、留 置式静脉导管、留置式动脉导管、血管鞘和药物输送口。
在一个优选实施方式中，生物相容的基质含有至少一种选自聚氨酯、嵌段的聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纤维素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖、白明 胶、胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、肝素、血纤蛋白、纤维 素、无定形碳和球烯的组分。更优选球烯是C6。或C7。球烯。更优选至少一种抗体或抗
体片段可直接对抗选自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管内皮生长因子 R-l、血管内皮生长因子R-2、 Muc-18(CD146)、 CD130、干细胞抗原(Sea-1)、干细胞 因子l(SCF/c- Kti配体)、Tie-2和HAD-DR的祖代内皮细胞表面抗原。还更优选至 少一种抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体，且所述单克隆 抗体含有抗体的大分子或小分子。
在另一个优选实施方式中，至少一种化合物是选自血管内皮生长因子(VEGF)、 成纤维细胞生长因子(FGF)-3、成纤维细胞生长因子-4、成纤维细胞生长因子-5、成 纤维细胞生长因子-6、成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-8、成纤维细 胞生长因子-9、碱性成纤维细胞生长因子、血小板诱导性生长因子、转化生长因子 fH、酸性成纤维细胞生长因子、骨粘连蛋白、促血管生成素1、促血管生成素2、 胰岛素样生长因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子AA、血小 板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB、内皮细胞PAS蛋白1、血小板反应蛋 白、增殖蛋白、肝配蛋白-A1、 E-选择蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲状腺素 以及神经鞘氨醇1-磷酸酯的一种生长因子。
在另一个优选实施方式中，血管性疾病选自动脉粥样硬化症、血管瓣膜再狭窄 症、血栓症、血管和管状器官闭塞症。
本发明的医疗装置中，优选生物相容的基质包括Ce。或C7。球烯，至少一种抗体 或其片段可识别和结合祖细胞表面抗原CD34或CD133，且化合物是VEGF或Ang-2。
优选球烯排列成纳米管。
在本发明的第五个方面，提供了一种抑制哺乳动物内膜增殖的方法，该方法包 括将一种医疗装置植入哺乳动物的血管或管状器官，医疗装置被(a)至少一层生物相 容的基质，(b)治疗有效量的至少一种抗体、抗体片段或其其组合，以及(c)至少一 种化合物包衣；其中，抗体或抗体片段可识别和结合祖代内皮细胞表面的一种抗原，
使该祖代内皮细胞在基质的表面失去活，且至少一种化合物用来刺激固定的祖代内 皮细胞以在该医疗装置表面形成内皮细胞层。优选医疗装置选自移植片固定模、移 植片固定模移植物、合成的人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起 搏器导子、除纤颤器、开放性卵圆孔隔膜封闭装置、血管夹、动脉血管瘤闭合器、 血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物装置、静脉瓣、缝线、血管接合夹、留置式静脉导管、留置式动脉导管、血管鞘和药物输送口。 在一个优选实施方式中，生物相容的基质含有至少一种选自聚氨酯、嵌段的聚 氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纤维素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖、白明 胶、胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、肝素、血纤蛋白、纤维 素、无定形碳和球烯的组分。优选球烯是C6。或C7。球烯。
在另一个优选实施方式中，至少一种抗体或抗体片段含有选自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管内皮生长因子R-1 、血管内皮生长因子R-2 、 Muc-18(CD146)、 CD130、干细胞抗原(Sea-1)、干细胞因子1 (SCF/c-Kti配体)、Tie-2 和HAD-DR的袓代内皮细胞表面抗原。
在另一个优选实施方式中，至少一种抗体片段选自单克隆的、多克隆的、嵌合 的和人源化的抗体，并包括抗体的大分子或小分子。
在另一个优选实施方式中，至少一种化合物是选自血管内皮生长因子(VEGF)、 成纤维细胞生长因子(FGF)-3、成纤维细胞生长因子-4、成纤维细胞生长因子-5、成 纤维细胞生长因子-6、成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-8、成纤维细 胞生长因子-9、碱性成纤维细胞生长因子、血小板诱导性生长因子、转化生长因子 fU、酸性成纤维细胞生长因子、骨粘连蛋白、促血管生成素1、促血管生成素2、 胰岛素样生长因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子AA、血小 板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB、内皮细胞PAS蛋白1、血小板反应蛋 白、增殖蛋白、肝配蛋白-A1、 E-选择蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲状腺素 以及神经鞘氨醇1-磷酸酯的生长因子。
在本发明的第六个方面，提供了一种医疗装置，包含一层包衣层和治疗有效量 的至少一种小分子物质，其中，包衣层含有至少一层生物相容的基质，且所述小分 子与祖代内皮细胞表面的抗原相互作用，并将所述祖代内皮细胞固定在该装置表面。 优选医疗装置选自移植片固定模、移植片固定模移植物、合成的人造血管、心脏瓣 膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、开放性卵圆孔隔膜封闭 装置、血管夹、动脉血管瘤闭合器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分 流、大动脉血管瘤移植物装置、静脉瓣、缝线、血管接合夹、留置式静脉导管、留 置式动脉导管、血管鞘和药物输送口。
在一个优选实施方式中，生物相容的基质含有选自聚氨酯、嵌段的聚氨酯-尿素 /肝素、聚-L-乳酸、纤维素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖、和白明胶的人 工合成材料。
15在另一个优选实施方式中，生物相容的基质含有选自胶原、弹性蛋白、层粘连 蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、肝素、血纤蛋白、纤维素、无定形碳的天然存在的材料。
在另一个优选实施方式中，生物相容的基质含有碳原子数约为c2。-c，的球烯。 更优选球烯是a。或C7。球烯。
在另一个优选实施方式中，小分子选自天然存在的肽类、合成肽类、糖肽类、 脂肽类、脂质类、糖类、有机分子类、无机分子类以及核酸类。更优选小分子对于 人源的祖代内皮细胞具有特异性。
在另一个优选实施方式中，小分子以共价或非共价方式附着在基质的表面，或 者通过连接分子以共价方式栓系在包覆该医疗装置的基质包衣的最外层。
在另一个优选实施方式中，小分子是选自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、 血管内皮生长因子R-1、血管内皮生长因子R-2、 Muc-18(CD146)、 CD130、干细胞抗 原(Sea-1)、干细胞因子1 (SCF/c-Kti配体)、Tie-2和HAD-DR的祖代内皮细胞表面 抗原的配体。
在另一个优选实施方式中，医疗装置还包括一种选自血管内皮生长因子(VEGF)、 成纤维细胞生长因子(FGF)-3、成纤维细胞生长因子-4、成纤维细胞生长因子-5、成 纤维细胞生长因子-6、成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-8、成纤维细 胞生长因子-9、碱性成纤维细胞生长因子、血小板诱导性生长因子、转化生长因子 Pl、酸性成纤维细胞生长因子、骨粘连蛋白、促血管生成素1、促血管生成素2、 胰岛素样生长因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子AA、血小 板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB、内皮细胞PAS蛋白1、血小板反应蛋 白、增殖蛋白、肝配蛋白-Al、 E-选择蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲状腺素 以及神经鞘氨醇1-磷酸酯的生长因子。
本发明的第七个方面提供了一种治疗哺乳动物治疗血管性疾病的方法，将上述 医疗装置植入有此治疗需要的哺乳动物的血管或管状器官。
本发明的第八个方面提供了一种抑制哺乳动物抑制内膜增殖的方法，将上述医疗 装置植入有此治疗需要的哺乳动物的血管或管状器官。
在一项实施例中，这类医疗装置的包衣层包含有一种生物相容的基质、至少一种 抗体或抗体片段或抗体与片段的组合物以及至少一种诸如生长因子之类的物质，可 用于调节被俘获的祖代内皮细胞在该医疗装置表面黏附、生长和分化，以诱导功能 性内皮层的形成，赖以抑制内膜层的增殖，从而防止再狭窄症的发生，最后改善接受血管疾病治疗的患者的预后过程。
在一项实施例中，所述生物相容的基质包含有一层外表面，以供治疗有效量的至 少一种抗体、抗体片段或抗体与抗体片段的组合物附着其上。这类抗体或抗体片段 能够识别一种抗原，使之与袓代内皮细胞的细胞膜或表面相结合，令这类细胞固定 在该基质层的表面。此外，包衣层包含有至少一种治疗有效量的物质，可，可赖以 刺激固定的祖代内皮细胞，在该医疗装置上加速形成成熟的功能性内皮细胞层。
本发明的这类医疗装置，可能是一种供植入器官或有空腔的体躯部分，也可能是， 但不限于移植片固定模、移植片固定模移植物、合成的人造血管、心脏瓣膜、导管、 血管修补用筛片、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、开放性卵圆孔(PFO)隔膜封闭装 置、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分流 器、大动脉血管瘤移植物装置或组件、静脉瓣、缝线、血管接合夹、留置式静脉或 动脉导管、血管鞘和药物输送口。例如，本发明的该类移植片固定模可能是用不锈
钢、镍钛合金(NiTi)或铬合金构成。合成的人造血管可能是采用交联PVA水凝胶、 聚四氟乙烯、膨胀性聚四氟乙烯(ePTFE)、多孔型高密度聚乙烯(HDPE)、聚氨酯以及 对苯二甲酸酯制成。
形成本医疗装置的包衣层的生物相容的基质，包含一种合成物质，例如，聚氨酯、 嵌段性聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纤维素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚 糖或白明胶。或一种天然存在的物质，例如胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋 白、玻连蛋白之类的基底膜成分、肝素、血纤蛋白、纤维素以及无定形碳或球烯 (fullerene)。
在本发明的一项实施例中，其医疗装置中包含的生物相容的基质，是由各种球烯 材料中的一种所组成。在该实施例中的球烯含有碳原子数约为C2。-C，，更具体的是 所述球烯含有碳原子数约为U或C7。。本发明中的球烯还可能在医疗装置表面排列成 纳米管(nanotube)。
在医疗装置的包衣层中包含至少一种抗体或抗体的片段。该种抗体可能是单克隆 抗体或多克隆抗体、嵌合型抗体或人源化抗体。这类抗体或抗体的片段能够识别和 结合祖代内皮(能够转变为成熟的功能性内皮细胞的各种内皮细胞、祖细胞或干细胞) 细胞表面的抗原，并调节这类细胞在医疗装置表面的黏附能力。本发明的这类抗体 或抗体片段能够以共价或非共价的方式附着在基质的表面，或者通过一种连接分子 以共价的方式栓系在医疗装置的基质包衣的最外层。在本发明的这一方面，例如， 单克隆抗体还可包含有Fab或F(ab')2片段。本发明的抗体片段可包含任何大小的片
17段，例如，能够保留与抗体一样的识别和结合目标抗原的特性。
本发明的抗体或抗体片段所识别和结合的各种抗原，具有受治疗哺乳动物的特异 性。其特异性与细胞系列物关。在一项实施例中，其抗体或抗体片段是对人类祖代
内皮细胞表面抗原具有特异性，例如，CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管 内皮生长因子(VEGF)R-1、血管内皮生长因子R-2、 Muc-18(CD146)、 CD130、干细胞 抗原(Sea-1)、干细胞因子1 (SCF/c-Kti配体)、Tie-2和HAD-DR。
在另一项实施例中，医疗装置的包衣材料中包含至少一层上述的生物相容的基 质。该基质有一层外表面，可供具有治疗有效量的至少一种天然或合成来源的小分 子物质附着在其上。该小分子物质可识别袓代内皮细胞表面的一种抗原，并与之相 互作用，使该祖代内皮细胞固定在装置表面，而形成一层内皮细胞层。该类小分子 物质具有不同的来源，例如，各种细胞成分，例如，各种脂肪酸、蛋白质、核酸、 糖类等，都能够产生与抗体同样的效果或作用。在本发明这一方面，在医疗装置上 的包衣材料中，除了抗体或抗体片段之外，还可包含一种化合物，例如生长因子。
本发明的包衣材料中的一种化合物，可以是能够刺激或加速祖代内皮细胞生长和 分化成为成熟的功能性内皮细胞层的任何物质。例如，本发明所采用的一种化合物 是一种生长因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子血小 板诱导的生长因子、乙1型转化性生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、骨粘连蛋 白、促血管生成素l(Ang-1)、促血管生成素2(Ang-2)、胰岛素样生长因子、粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、血小板 衍生生长因子AB以及内皮细胞PAS蛋白1。
本发明还提供了采用本发明的敷有包衣的医疗装置，用于治疗血管疾病的各种方 法，例如，动脉粥样硬化症、再狭窄症、血栓形成、动脉瘤以及血管阻塞。在本发 明的该项实施例中，提供了优于本领域其他各种方法的一种改良方法，可将医疗装 置牢固连接在其插入的血管壁部位，例如，移植片固定模或合成的人造血管、心脏 瓣膜、腹主动脉动脉瘤装置以及各种组件、以求建立血管系统的自身平衡，从而预 防过度的内膜组织增殖。在治疗动脉粥样硬化症的本方法中，其动脉可能是心冠动 脉，也可能是外周动脉例如股动脉。对于静脉，也可采用本发明的各种技术和方法 进行治疗。
本发明还提供了一种工程性方法，可将康复反应过程都包括在内。在一项实施例 中提供的一种方法，可在移植的血管中的目标病变处植入装置的管腔表面，迅速诱 导融合的内皮细胞层的形成。所述内皮细胞有氧化一氮合成酶以及其他抗炎症性因子和炎症调节性因子的表达。本发明还提供了在提高生物相容的方面优于本领域其 他各种装置的一种医疗装置，并且还可通过减少或抑制平滑肌细胞游动、平滑肌细 胞分化，以及在医疗装置植入部位的管腔内表面一带有胶原沉积，从而减少或抑制 以组织为基础的内膜组织过度增殖过程以及再狭窄症。
在本发明的一项实施例中，其对于易用装置包敷包衣的一种方法，包括如下一些 步骤:对于该医疗装置表面至少包敷一层生物相容的基质，其特征在于，该生物相容
的基质至少包含一种组合物，选自聚氨酯、嵌段性聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、
纤维素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖、白明胶、胶原、弹性蛋白、层粘连 蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、肝素、血纤蛋白、纤维素以及碳和球烯。
同时或随后，对于生物相容的基质加入至少一种治疗有效量的抗体抗体片段或其 其组合，以及可刺激内皮细胞生长和分化的至少一种化合物。
本发明另外还提供了对哺乳动物治疗血管疾病的一种方法，包括如下步骤:对于 哺乳动物的血管或管形器官植入一种医疗装置，其特征在于，该医疗装置上包敷有 (a)—层生物相容的基质，(b)至少一种治疗有效量的抗体、抗体片段或其其组合， 以及(c)至少一种化合物；其特征在于，该种抗体或抗体片段能够识别和结合祖代内 皮细胞表面的一种抗原，并使之固定在该基质的表面；而该种物质则可刺激被固定 的祖代内皮细胞，在医疗装置的表面形成一层内皮细胞层。
本发明另外还提供了对哺乳动物抑制内膜组织增殖的一种方法，包括如下步骤 对于哺乳动物的血管或管形器官植入一种医疗装置，其特征在于，该医疗装置上包 敷有(a)至少一层生物相容的基质，(b)至少一种治疗有效量的抗体、抗体片段或其 其组合，以及(c)至少一种化合物；其特征在于，该种抗体或抗体片段能够识别和结 合祖代内皮细胞表面的一种抗原，并使该种祖代内皮细胞固定在该基质的表面，以 及所述至少一种化合物则可剌激被固定的祖代内皮细胞，在医疗装置的表面形成一 层内皮细胞层。
附图简述


图1A是通过一种横向连接分子以共价方式系留在基质上的示意图象。图1B显 示锚定在基质上的Ce。0分子的图解。图1C一种包敷有本发明的基质包衣的移植片固
定模的示意图象描述。
图2A是黏附在含有从富集培养基分离的细胞的纤连蛋白包敷的载玻片上的祖代 内皮细胞的一种相差显微照相图象。图2B是黏附在含有利用包敷有抗CD34抗体的磁珠分离的细胞的纤连蛋白包敷的载玻片上的祖代内皮细胞的一种相差显微照相图
象。图2D和2F是经7天培育后并用PI核染剂染色的袓代内皮细胞的显微照相图象。 从这些图象中可以见到，表达成熟的内皮细胞标记的细胞，都是由对于Tie-2(图2E 和图2G)的抗体荧光，以及血管内皮细胞生长因子R-2(VEGFR-2)(图2C)的抗体反应 性来显示。
图3A和3B都是对于内皮细胞的氧化一氮合成酶，eNOS和甘油醛磷酸酯脱氢酶 (GAPDH)的半定量RT-PCR溴乙非啶染色的2%琼脂糖凝胶的照相图象。在纤连蛋白包 敷的载玻片上经3天(图3B)和7天(图3A)培育之后，祖大内皮细胞就可开始表达eNOS m飄。
图4A-4E都是在CMDx和CD34抗体(4A);白明胶和抗-CD34抗体(4B);空白的不 锈钢碟(4C)附着D的各种HUVEC的显微照相图象；CMDx包敷的和白明胶包敷的不锈 钢碟都曾经用于培育过HUVEC细胞并用碘化丙锭染色。
图5A-5C都是包敷CMDx而没有抗体的对照组的显微照相图象；图5D-5F都是包
敷白明胶而在其表面没有抗体结合的对照组不锈钢碟的显微照相图象。
图6A-6C都是包敷CMDx并在其表面结合抗-CD34抗体的不锈钢碟的显微照相图象。
图6I^6F都是包敷白明胶基质而在其表面结合抗体的不锈钢碟的显微照相图象。 图7是包敷CMDx，在其表面结合抗体，并培育祖细胞经24小时的不锈钢碟的显
微照相图象。
图8A-8B都是包敷CMDx，在其表面结合抗-CD34抗体，并培育祖细胞经7天而有
抗-KDR抗体形成的不锈钢碟的显微照相图象。
图9A-9B都是包敷CMDx，在其表面结合抗-CD34抗体，并培育祖细胞经7天而有
抗-Tie-2抗体形成的不锈钢碟的显微照相图象。
图10A-10C都是包敷CMDx，并在内皮细胞培养基中培育祖细胞经3周的不锈钢 碟的相差显微照相图象。其中显示为成熟的内皮细胞。
图11是包敷功能性球烯并在其表面结合祖细胞的本发明的移植片固定模的不锈 钢碟的示意图解。
图12A-12D都是经溴化丙锭和抗血管内皮细胞生长因子R-1(VEGFR-2)抗体染色 的有或无抗-CD34抗体的球烯-包敷的若干样本的显微照相图象。
图13A-13D都是心冠动脉的外植体移植在赤裸的不锈钢质移植片固定模(图 13A-13C)和球烯包敷的样本(图13B"13D)上经4周后的显微照相图象，分别是底倍扩图14A-14G都是1和48小时的扫描电子显微照相图象。在葡聚糖包敷的(图14A) 和葡聚糖/抗-CD34抗体包敷的(图14B)移植片固定模上移植l小时的外植体。图14C 和图14D显示对照样本的外植体，以及图14E-G是在移植之后48小时的葡聚糖/CD34 抗体包敷的移植片固定模。图14H-14M是取自移植之后4周的雄性约克夏猪的心冠 动脉外植体横截面的组织学显微照相图象分别是，无包敷(赤裸的不锈钢质)(图 14H-141)、葡聚糖包敷的对照组(图14J和14K)以及葡聚糖/抗-CD34抗体包敷的(图 14L和14M)。
图15A、 15B和15C分别是其表面没有抗体的葡聚糖-血浆-包敷的移植片固定模， 以及葡聚糖-血浆包敷的/抗-CD34抗体包敷的18毫米长的移植片固定模上的48小 时外植体切片的共焦显微照相图象。
图16A和16B都是碘化丙锭和抗-凝集素/FITC-结合的样本的显微照相图象。
发明详述
本发明提供了可植入体内的一种有包衣的医疗装置，例如，移植片固定模、包敷 医疗装置的方法和材料组合物以及利用该医疗装置治疗各种血管疾病的方法。图1A -1C显示本发明的一种医疗装置表面包衣的示意图。该医疗装置的包衣中包含一种生 物相容的基质，可促进在该装置表面的内皮细胞形成一片融合层，并抑制过度的内 膜组织增殖过程，从而防止发生再狭窄症和血栓相成。在一项实施例中，所述基质 材料包含一种合成的或天然存在的物质，其中含有至少一种治疗有效量的抗体，可 促进内皮细胞、祖细胞或干细胞黏附在医疗装置上，以及至少一种生长因子之类的 物质，可刺激内皮细胞的生长和分化。在该装置移植之时，黏附在该装置表面上的 细胞，就会在该医疗装置的内腔表面，转化为融合一片的成熟的功能性内皮细胞层。 在医疗装置上的内皮细胞融合层的形成，可减少受移植部位的再狭窄症和血栓症的 发生。
在此采用的"医疗装置"是指临时或持久性引入哺乳动物体内，以供预防或治疗 一种医学问题的材料。这类装置材料包括，可经皮下、经皮层或通过外科手术，置 于某个器官、组织或器官的内腔，例如，动脉、静脉、心室或心房等部位的任何物 件。这类医疗装置材料可包括，移植片固定模、移植片固定模移植物、有包衣层移 植片固定模，其包衣层材料有，例如，聚四氟乙烯(PTFE)、膨胀性聚四氟乙烯(ePTFE)， 或是，合成的人造血管、人工心脏瓣膜、人工心脏以及可将修补的器官血管循环系
21统相连接的固定夹、静脉瓣膜、腹主动脉动脉瘤(AAA)移植物、下腔静脉筛片、永久性输药导管、螺巻栓子、在血管栓塞形成时使用的栓子材料(例如，交联PVA水凝胶)、血管缝线、血管接合固定夹、通过心肌血管重新形成的移植片固定模、和/或其他各 种导管类材料。采用本发明的各种材料组合物和方法对医疗装置包敷的包衣，可刺激内皮细胞在 医疗装置表面形成融合内皮细胞层。从而防止发生再狭窄症，以及调节由于植入乙 用装置所造成的局部慢性炎症反应和其他血栓栓塞形成性并发症。包敷医疗装置的基质材料可包含一种合成物质，例如，聚合性凝胶泡沫，其中有由聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚-L-乳酸、纤维素酯或聚乙二醇制成的各种水凝胶。 在另一项实施例中，所述基质是各种天然存在的物质，例如，胶原、血纤蛋白、弹 性蛋白或无定形碳等。基质可以有多层，第一层可以是合成材料或天然存在的材料， 第二层可以含有抗体。各层可相继顺次排列，第一层是直接与移植片固定模或合成 材料移植物表面相接触，第二层则有一面直接与第一层相接触，，另一面则与血管内 腔相接触。基质层还可包含至少一种生长因子、细胞因子等类物质，能够刺激内皮细胞的增 殖和分化过程。例如，本发明可采用的有血管内皮生长因子(VEGF)及其异构体、碱 性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板诱导性因子(PIGF)、转化生长因子P 1(TGF，(31)、酸性成纤维细胞生长因子(FGF)、骨粘连蛋白、促血管生成素1、促血管 生成素2、胰岛素样生长因子(ILGF)、血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)、血小板衍 生生长因子BB(PDGF-BB)、血小板衍生生长因子AB(PDGF-AB)、粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子(GM-CSF)等，或其各种功能性片段。在另一项实施例中，该种基质材料可包含各种球烯，其所含的碳原子数约为 C2。-C15。。这类球烯也可排列成纳米管样，其中含有各种分子或蛋白质。这种基质也可 应用于不锈钢质、聚四氟乙烯(PTFE)质或膨胀性聚四氟乙烯质(ePTFE)的医疗装置材 料表面，其表面再包敷一层抗体和生长因子，而具备功能性。或者，例如，可在不 锈钢质医疗装置上先敷上一层聚四氟乙烯或膨胀性聚四氟乙烯，在敷上第二层球烯， 然后加上抗生素和生长因子。该基质层可以非共价或共价的方式附着在医疗装置上。各种抗生素类和生长因子 类都可利用异性或同性双功能交联试剂，以共价方式附着在该基质上。生长因子可采用标准技术与抗体一起或在抗体结合之后加入该基质内。在此采用的术语"抗体"是指一种单克隆的、多克隆的、人源化的或嵌合型的抗体，或其各类组合物，其特征在于，该类单克隆的、多克隆的、人源化的或嵌合型 的抗体，可与一种抗原或该种抗原的功能性等价物相结合。术语抗体片段包括一种 抗体的诸如Fab， F(ab')2等任何片段部分，且具有任何大小，即，大或小分子；具有与抗体同样的作用和功效。(包含有多数单个抗体分子的一种抗体，相当于每克分子抗体有6.022xl()23个分子)。在本发明的一个方面，本发明的移植片固定模或合成材料移植物，包敷有一层含 有不同抗体的生物相容的基质材料，该类抗体可调节血行中的祖代内皮细胞黏附在 医疗装置上。本发明的这类抗体，可识别和结合血行中的祖代内皮细胞表面抗原， 并使该类细胞固定在装置表面。在一项实施例中，其抗体是可与祖代内皮细胞表面 抗原，或者一种祖细胞或干细胞表面抗原发生反应(识别和结合)的单克隆类抗体。 这类抗原有，例如，血管内皮生长因子受体-1、-2和-3(VEGFR-1、VEGFR-2、和VEGFR-31 以及VEGFR受体族的各种异构体)、Tie-1、Tie-2、CD34、Thy-l、Thy-2、Muc-18(CD146)、 CD30、干细胞抗原-l(Sca-l)、干细胞因子(SCF或c-配套配体)、CD133抗原、VE-钙粘着蛋白、P1H12、 TEK、促血管生成素-l(Ang-l)、促血管生成素-2 (Ang-2)或一 种在祖代内皮细胞表面表达的抗原。在一项实施例中，可采用能够与一种抗原相反 应的单一型的抗体。也可选用能够直接对抗祖代内皮细胞的不同抗原的多数不同抗 体，混合一起加入基质材料中。在另一项实施例中，是混合选用各种单克隆抗体， 分别以不同的特异性细胞表面抗原为靶标，而提高其上皮细胞层的形成率。在本发 明的这一方面，例如，是选用抗-CD34和抗-133组合，并将其附着在移植片固定模上的基质材料表面。在此采用的"治疗有效量的抗体"的含意是能够促进内皮细胞、祖细胞或干细胞 附着在移植片固定模上的基质材料表面所用的抗体用量。实施本发明时所需的抗体 用量，以所选用的抗体性质而有所不同。例如，所采用的抗体用量取决于该种抗体 与其所反应的抗原之间的结合常数。关于一种抗体对具体抗原所需的治疗有效量的 确定方法，在本领域的一般技术人员中，都是普遍熟知的。在此采用的术语"化合物"是指诸如生长因子之类的物质，例如，属于促血管生 成素家族和血管内皮细胞生长因子(VEGF)族的一种成分；以及维生素类，例如，A和 C，可刺激祖代内皮细胞的生长和分化过程，成为成熟的，可表达例如氧化一氮合成 酶分子的功能性内皮细胞。在此采用的术语"生长因子"是指肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白或其一种片段或 修改变体，或一种合成材料，都能够刺激内皮细胞、祖细胞或干细胞的生长和分化过程'形成成熟的功能性内皮细胞。成熟的内皮细胞可表达氧化一氮合成酶，从而 可向组织内释放氧化 -氮。如下表1所示为可用于对医疗装置包敷的若干生长因子。表1^因子 内皮细胞特异性酸性成纤维细胞生长因子(aFGF) 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 成纤转化性生长因子-(TGF-) 维细胞生长因子3(FGF-3) 成纤维细胞生长因子4(FGF-4) 成纤维细胞生长因子5 (FGF-5) 成纤维细胞生长因子6 (FGF-6) 成纤维细胞生长因子7 (FGF-7) 成纤维细胞生长因子8 (FGF-8) 成纤维细胞生长因子9(FGF-9) 血管原素1 血管原素2肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)血小板衍生生长因子(PDE-CGF)转化性生长因子-a(TGF-a)转化性生长因子-(J(TGF-p)肿瘤坏死因子-a(TNF-a)血管内皮细胞生长因子121 (VEGF121)血管内皮细胞生长因子145(VEGF145)血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)血管内皮细胞生长因子189(VEGF189)血管内皮细胞生长因子206(VEGF206)血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)血管内皮细胞生长因子D(VEGF-D〉血管内皮细胞生长因子E(VEGF-E)血管内皮细胞生长因子F(VEGF-F)胎盘生长因子促血管生成素-l促血管生成素-2血小板反应蛋白(TSP)增殖蛋白肝配蛋白-A1(B61)E-选择蛋白鸡趋化学性和血管原性因子(cCAF) 肥胖蛋白肝素亲和调整肽(HARP) 肝素颗粒细胞群落剌激因子胰岛素样生长因子白介素8甲状腺素神经鞘氨醇1-磷酸酯否否否否否否否否否否是是否是否否否是是是是是是是是是是是否否否是是是否是否否否否否否否在此采用的术语"血管内皮细胞生长因子(VEGF)"的含义是，如上表1所列述的血管内皮细胞生长因子(除了用数字或组母縮略词特别标明的异构体)的所有各种异 构体。在此采用的术语"治疗有效量的生长因子"的含义是，可刺激或诱导内皮细胞、 祖细胞或干细胞的生长和分化过程，从而在医疗装置材料的内腔表面形成成熟的功 能性的内皮细胞的融合层。在本发明的操作实施中所需的生长因子用量，随所用的 生长因子的性质和该生长因子与其受体之间的结合动力学关系而有变化。例如，据证实，IOO微克的血管内皮细胞生长因子可刺激内皮细胞黏附在医疗装置上，并形成 内皮细胞融合层。至于有关用于刺激内皮细胞的生长和分化过程所用的生长因子的 治疗有效量的确定方法，对于本领域的一般技术人员都是耳熟能详的。在此采用的"内膜组织增殖"是，在血管壁上平滑肌的增殖和基质的沉积异常增 多现象。在此采用的"再狭窄症"是指血管内腔再度狭窄现象。血管可因再狭窄症 而发生阻塞。经心冠动脉腔内气囊血管成形术(PTCA)或血管腔内气囊血管成形术 (PTA)之后，正常情况下并不存在于内膜组织的，来自中层和动脉外膜层的平滑肌细 胞会增殖和向内膜层游动，并分泌各种蛋白质，而在内膜层中形成平滑肌细胞和基 质蛋白质的积聚。这一积聚过程可导致动脉内腔的狭窄，致使狭窄部远端的血流量 减少。在此采用的"抑制再狭窄症"是指抑制平滑肌细胞的游动和增殖过程，并伴 以制止其蛋白质的分泌能力，从而抵制了再狭窄症，以及相应发生的各种并发症。能够采用本发明的医疗装置、方法和组合物材料进行治疗的对象是哺乳动物，具 体来说，就是人类、犬、猫、猪、啮齿动物或猴类等。本发明的各种方法可在体内或活体外实施。术语"祖代内皮细胞"是指在任何发育阶段的各种内皮细胞，从源自骨髓、血液 或局部组织的祖细胞或千细胞，到成熟的功能性内皮细胞，但是都不可是恶变细胞。对于有包敷层的医疗装置进行在活体外的研究或使用方面，可从动脉管或静脉 管，例如，人的脐带静脉，分离出完全分化的内皮细胞；从外周血液或骨髓内分离 出祖代内皮细胞。将内皮细胞与包敷有基质材料(含有可黏附内皮细胞的抗体、生长 因子或其他物质)的医疗装置一起培育，使内皮细胞与医疗装置相结合。在另一项实 施例中，可用内皮细胞来转化内皮细胞。转染的内皮细胞含有各种媒体物质，可表 达各种生长因子或蛋白质，因而能够抑制血栓发生或再狭窄症或其他治疗结局。本发明的治疗各种血管疾病的方法，能够施用于任何动脉或静脉。在本发明范围 内可包括任何动脉部位的动脉皱样硬化症，例如，心冠动脉、腹股沟下动脉、腹主25动脉/骼动脉、锁骨下动脉、肠系膜动脉和肾动脉。其他例如，切开动脉瘤所造成的 各型血管阻塞症，也都属于本发明的范畴。对于哺乳动物治疗血管疾病的方法包括，将带有包敷层的医疗装置植入患者的 器官或血管内，例如，在血管造型外科手术方面，可采用有包敷层的移植片固定模。 一旦植入就位之后，该移植片固定模就可由其包敷层所含的抗体，识别和结合祖代 内皮细胞表面的抗原，而将该祖代内皮细胞俘获。 一旦该祖代内皮细胞粘敷在该基 质上后，其包敷层内的生长因子就可促进这批新结合的祖代内皮细胞生长和分化， 而在移植片固定模的内腔表面形成一片融合而成熟的功能性内皮细胞层。或者，其 医疗装置先在活体外包敷从患者体的血液、骨髓或血管分离的袓细胞、干细胞或成 熟的内皮细胞，再植入其体内。该两种方法中，在医疗装置内腔中存在的内皮细胞 都能够抑制过度的内膜组织增殖和血栓症。舰雄按照Jaffe等，临床研究杂志，52:2745-2757， 1973的方法(在此已经收录作为 参考材料，并在实验中应用)，从人的脐带静脉内取得人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)。 其方法的基本步骤是，用胶原酶处理血管壁剥离所述细胞，并放入包敷白明胶的组 织培养瓶中，在含有10%低内毒素的胎牛犊血清、90微克/毫升无防腐剂的猪肝素、 20微克/毫升内皮细胞生长补充剂(ECGS)和谷氨酰胺的M199培养基中培育。按照Asahara等，(供血管生成的假定的祖代内皮细胞的分离。1&275:964-967， 1997。已经收录在此作为参考材料)。用对CD34的抗体包敷的磁珠与分组的人外周 血液一起培育。经过培育之后，洗提出结合的细胞，可在EBM-2培养基中培育。 (Clonetics， San Diego， CA)或者可采用富集培养基分离方法来分离这类细胞。其 基本方法是，从健康男性志愿者取得外周静脉血液，采用密度梯度离心分提法提取 单核细胞，将细胞涂抹在经纤维接合素包敷的培育玻片上(Becton Dickinson)，在 补充5%胎牛血清、人VEGF-A、人成纤维细胞生长因子-2、人表皮细胞生长因子、胰 岛素样生长因子-1和抗坏血酸的EC基础培养基-2(EBM-2) (Clonetics)中培育。每 48小时更换培养基，令祖代内皮细胞生长7天之后，利用对于CD45、 CD34、 CD31、 VEGFR-2、 Tie-2和E-选择蛋白等的荧光抗体进行细胞鉴定。采用各种常规方法，用任何表达媒体对哺乳动物细胞施行转染处理，该类表达媒 体含有可编码各种蛋白质的任何克隆基因，这类蛋白质有，例如，血小板衍生生长 因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)或氧化一氮合成酶(NOS)等。(参见，例如，哺乳动物表达酶体和转染试剂盒，由Stratagene，San Diego，CA商品供应)。例如， 按照Rosengart等(采用表达血管内皮细胞生长因子121cDNA的一种腺病毒媒体直接 用于心肌内施行血管生成基因治疗第一期试验的6个月评估报告。外科手术年鉴。 230(4) :466-470(1999)。已经收录在此供参考)的各种方法，采用表达血管内皮细胞 生长因子(VEGF)cDNA的腺病毒表达媒体，对纯化的猪的祖代内皮细胞，进行血管内 皮细胞生长因子(VEGF)转染处理。
拔谬
在本发明的方法中采用的单克隆抗体，可按照Kohler和Milstein(关于能够分泌 预先确定其特性的抗体的融合细胞的连续培育方法。自然265:495-497， 1975，在此 已经收录以供参考)的标准技术进行制备，或者可直接从商品来源取得。内皮细胞可 用作一种可产生直接对抗内皮细胞表面抗原的单克隆抗体的一种免疫原。
可直接对抗内皮细胞的单克隆抗体，可将人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)或提纯的 祖代内皮细胞注入小鼠或大鼠体内来制备。经过足够的时间之后，将小鼠扑杀，提 取其脾脏细胞。将该脾脏细胞与骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞，通常在含有非离子型洗 涤剂例如聚乙二醇中进行融合处理，制备成永存性细胞。将这类制成的包括融合性 杂交瘤的细胞，培育在一种选择性培养基，例如，HAT-培养基中，这种生存的细胞 可在使用限定稀释条件的这种培养基中生长。这种细胞是在适宜的容器，例如，微 量滴定孔穴中生长，从其上清液中筛取具有所需特异性，即，可与内皮细胞抗原发 生反应的单克隆抗体。
现成有可增量产生单克隆抗体的各种技术，例如，可将杂交瘤细胞注入能够容受 该类细胞的哺乳动物宿主的腹腔内，然后收集其腹水。如果从腹水中收集的单克隆 抗体的数量不足，还可从该宿主的血液中收集抗体。现成还有可分离和提纯单克隆 抗体的各种常规方式，可从其他各种蛋白质和夹杂物中分离出这种单克隆抗体。
在本发明范围内，还包括抗内皮细胞单克隆抗体的各种有用的结合性片段，例如， 这类单克隆抗体的Fab,F(ab，)2。可采用各种常规技术来取得这类抗体片段。例如， 可采用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，对抗体进行肽酶消化处理，而制备有用的结合性片 段。
本发明的各种抗体属于鼠源性IgG级的抗体类；然而，实际并不限于此。上述的 抗体以及在功能方面与上述抗体相当的各种抗体，无论是鼠源性的、哺乳动物包括 人源性的、还是其他来源的，或者其各种组合物，都包括在本发明范畴内，以及另
27外还有其他各级例如，IgM、 IgA、 IgE、等，包括这几级内的各种同型体。在各种抗
体方面，术语"功能等价"其含义是，两个不同抗体分别与同一抗原的同一抗原部
位相结合的现象；换言之，就是不同的抗体竞争与同一抗原相结合的现象。其抗原 可以是在同一分了上，或者在不同的分子上。
在一项实施例中，采用的是可与内皮细胞表面抗原发生反应的单克隆抗体。据证 实，附着在固体支持物上的抗-CD34单克隆抗体，能够从人的外周血行中俘获祖代内 皮细胞。这类租代内皮细胞被俘获之后，就能够分化为内皮细胞。(Asahara等，1997， 供血管生成的推定的祖代内皮细胞的分离处理。科学275:964-967。)由杂交瘤产生 的可直接对抗CD34的单克隆抗体，可取自美国标准组织收集中心(Rockville， MD)。
在另一项实施例中，是采用可与各种内皮细胞表面抗原，例如，血管内皮细胞生长 因子受体-UVEGFR-1)、血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)、 CD133或Tie-2相
反应的各种单克隆抗体。
也可采用可与接受医疗装置移植的同一物种中分离的内皮细胞发生对抗反应的 多克隆抗体。
术语"移植片固定模"的含义是，可插入或植如血管内腔而扩张其血管内腔横径 的任何医疗装置材料。该术语"移植片固定模"包括，有商品供应的已经按照本发 明的方法进行包敷的不锈钢质支持模架；这类支持模架上包敷的材料有，例如，聚 四氟乙烯(PTFE)或膨胀性聚四氟乙烯(ePTFE)。在一项实施例中'包括'经皮下输入 以治疗心冠动脉的各种闭塞症，或对于脾脏、颈动脉、骼部和腿帼部血管，封闭各 种切口或动脉瘤的各种移植片固定模。这类支持模架可用聚合物或金属构件组成， 其上敷以含有抗体和一种生长因子之类物质的基质层，该支持模架上也可采用基质 材料与聚合物混合的复合构件制成。例如，可采用一种可变形的金属丝制成的支持 模架，例如，在美国专利号4,886,062中，Wiktor已经作了展示'在此已经收录作 为参考。在公开发表的国际专利申请号W091/12779 "内腔药物冲洗修补术"(在此已 经收录以供参考)中展示的，用一种有弹性的材料制成的可自行张开的支持模架也已 经可供使用。也可选用不锈钢、各种聚合物、镍钛合金、钽、金、铂铱合金或埃尔 吉洛伊非磁性合金、MP35N，以及其他含铁材料制造。支持模架可通过一根导管输送 入体腔达到治疗部位，将该支持模架放出，使之在血管内张开直接支撑其内腔壁。 在另一项实施例中，采用一种生物可降解性支持模架(H. Tamai，心冠动脉支持模架手册，297页，第3版，PW Serruys和MJB Kutryk编，Martin Dunitz (2000))。对 于本领域老资格的技术人员都很清楚，其他各种规格的可自行张开的支持模架(例 如，弹性金属制的支持模架)，也都可使用本发明的各种抗体、生长因子、和基质材料。
会成辦微微
术语"合成性移植物"的含义是，具有生物相合特性的任何人造的修补性材料。 在一项实施例中，其合成性移植物材料可以是聚乙烯对苯二酸酯(Dacron⑧，PET)或 聚四氟乙烯(Teflon⑧，ePTFE)。在另一项实施例中，其合成性移植物可包括，聚氨 酯、交联PVA水凝胶和/或各种生物相容的水凝胶泡沫。在还有第3项实施例中，其 一种合成性的移植物是，其内层是多孔性聚碳酸酯氨基甲酸乙酯，外层是多孔性聚 乙烯对苯二酸酯。对于本领域的老资格技术人员显然都很清楚，任何生物相容的合 成材料的移植物，都可使用本发明的各种抗体、生长因子、和基质材料。(Bos等， 1998，小口径的血管修补材料现状。生理学和生物化学档案。106:100-115，在此 己经收录作为参考文献)。各种合成性移植物都可用作有病的血管段对血管的端-端、 端-侧、侦i」-端、侧-侧或血管内腔的接合材料，或旁路材料，例如，作为腹主动脉动 脉瘤的装置材料。
基jr
(A) 合成性物质-用于包敷支持模架或合成性移植物的基质材料，可以选自各种合 成性材料，例如，聚氨酯、嵌段性聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纤维素酯、聚乙 二醇、交联PVA水凝胶、各种生物相容的水凝胶泡沫或各种亲水性葡聚糖、例如， 羧甲基葡聚糖。
(B) 天然存在的物质-选自天然存在物质中的基质材料有，例如，胶原、纤连蛋白、 玻璃体结合素、弹性纤维、层粘连蛋白、肝素、血纤蛋白、纤维素或碳。对于基质 材料的初基本要求是，具有足够的弹性和柔韧性，能够在支持模架或合成性移植物 的暴露表面，保持不致破裂。
(C) 各种球烯类-基质材料也可以采用球烯(术语"球烯"包含多种球烯分子)。各种 球烯是含有大量碳原子的材料。在不同的球烯中，其碳原子(C)的数量大约可在 C2fC15。。各种球烯可采用本领域的老资格技术人员都熟知的，采用元素碳或含碳材料 进行高温富裕的处理方法来生产。例如，利用激光使碳汽化蒸发、在电弧中将碳加热或将烃类物质在碳黑生成火焰中燃烧。(美国专利号5，292,813的Patel等；在此 引入作为参考材料；美国专利号5， 558， 903的Bhushan等；在此引入作为参考材料)。 其每一种处理方法都可产生含碳的沉积物或碳黑物质。采用适用的溶剂，例如，二 甲苯，就可从这种碳黑中获得各种球烯。可用各种已知的方法，特别是高性能的液 相层析法(HPLC)，将各种球烯分离开来。也可利用合成的方法生产各种球烯，或者 通过商品供应渠道，取自Dynamic Enterprises, Ud. ， Berkshire, England;或者 Southern Chemical Group, LLC, Tucker, Georgia, 或Bucky USA, Houston, Texas。 这类球烯可采用多种不同的方式，使之沉积在支架表面，包括，升华处理、激光 汽化处理、反应溅射处理、离子束处理、喷涂包敷处理、浸渍涂层处理、滚搽或刷 涂包敷处理等，如美国专利号5,558,903所展示，或由移植片固定模的表面衍生而 成。
这类球烯的一种重要的特性是，能够生成"有活性的碳"。这类球烯的电子结构， 是以多数结合的电子协调地存在于该分子表面周围的一种交迭的兀-轨道系统。(化学 和工程新闻，1991-04-08， 59页，己经在此引入以供参考)。各种球烯以活性炭的形 式，表现出明显的对于弱相互作用的范德华力。在球烯表面的吸附性质，可使其本 身发生另外一些变化，来引导各种特异性的细胞膜相互作用。例如，可选择性地与 特定细胞类型的细胞膜或细胞膜上的特定成分，例如，各种植物血宁素或抗体相结 合的具有各种化学特性的特定分子，都能够吸附在球烯的表面。因而，就可利用不
同的分子能够吸附在球烯表面的特性，而创造出能够有选择性地吸附不同细胞类型， 例如，祖代内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、原始外植体、T-细胞的各种亚群等 的各种表面。美国专利号5,310， 669的Richmond等，在此已经列为参考材料；St印hen R. Wilson,球烯类的生物学特性。球烯:化学、物理学和工艺学，Kadish等编，John Willey & Sons, NY2000,已经再次列为参考材料。
球烯还可与其他原子或分子相混合而形成一种纳米管。(Liu等，, 280:1253-1256(1998)。已经在此列为参考文献)。关于碳纳米管的合成和制备方法， 在本领域中都是普遍熟知的。(美国专利号5,753,088的01k等，以及美国专利号 5， 641， 466的Ebbson等，两份材料都已经在此列为参考文献)。各种蛋白质之类的分 子都能够结合在碳纳米管之内。例如，纳米管可以充满各种酶类，例如，Zn2Cd2-金 属硫因、细胞色素C和C3以及切开纳米管的端部后有乙型-内酰胺酶。(David等， 无机化学档案272:261(1998); Cook等，科学技术详解5 (4:695 (1997);两者都已经 在此列为参考文献)。球烯的三维空间结构也都可使用。美国专利号5,338.571的Mirkin等，在此已 经引为参考文献，揭示了以如下几种方式在基础表面形成球烯的各种三维空间多层 的结构(i)化学改型的球烯，提供一种形成键合的种类；(ii)对基础表面进行化学 处理，以形成可有效地与在溶液中的球烯的键合形成种类形成共价键合的一种键合 种类；以及(iii)使改型的各种球烯与经过处理的基础表面相接触，使之形成与该处 理过的基础表面发生共价键合的球烯层。
(A) 基质材料在医疗装置方面的应用 基质材料必须与支持模架或合成材料移植物的表面紧密黏附。较好的是，可采用 连续的若干薄层基质材料来实现这一要求。或者，可将抗体和生长因子材料只用于 直接接触血管内腔的外层表面。可相继连续若干层采用不同类型的各种基质材料。 可在基质层包敷在支持模架上之后，再将各种抗体以共价或非共价方式，包敷在基 质材料上。
在对支持模架之类的医疗装置施行包敷处理方面，可用中等粘度的基质液态溶 液，将支持模架浸渍或喷涂。每一层涂敷后，都要将支持模架晾干，再可涂敷下一 层。在一项实施例中，其菲薄涂料样的包敷层的厚度，总共不超过ioo微米。
在一项实施例中，对于支持模架表面，先进行功能性处理，再加上基质层。然后，
再将抗体和生长因子结合在基质层的表面。在本发明的这一方面，对于支持模架表
面的技术是创造一类具有功能性的化学基团。再用这类化学基团，例如，胺类，将
赖以支持抗体和生长因子的基质的中层固定。
在另一项实施例中，先制备一种适用的基质包敷溶液，g卩，将一种药物载体，例
如，聚右旋左旋(混旋)丙交酯(以R203形式供应，Boehringer Inc., Ingelheim, Germany) 480毫克，以无菌条件溶于3毫升氯仿中。不过，在原则上，具有生物可降 解性(或非生物可降解性)以及血液和组织相合性(生物相容的)，并能够溶解、分散 或乳化的任何基质材料，都可作为基质使用，只要在使用于医疗装置包敷处理之后， 能够迅速自行干燥成为油漆样或涂料样的包敷层。
例如，在本领域的普通技术员工中，对于采用血纤蛋白包敷支持模架的技术都是 熟知的。在Muller等申请的美国专利号4,548，736(在此已经列为参考材料)中，是 采用含有凝血酶的血纤蛋白原处理，使血纤蛋白凝固。较好的是，如Gerendas在其 美国专利号3， 523, 807中论述，或在已发表的欧洲专利申请材料0366564中论述，(该 两份材料都己经在此列为参考文献)，为了改善植入装置的机械特性和生物稳定性，在本发明的含有血纤蛋白的支持模架中的血纤蛋白，在凝固过程须加入因子VIII和 钙成分。较好的是，在本发明中用于处理血纤蛋白的血纤蛋白原和凝血酶，都必须 取自须施行支持模架植入的同一种动物或人体，以避免任何动物种间的免疫反应， 例如，人抗牛反应。血纤蛋白的生产，可以是将血纤蛋白原和凝血酶混合，铸成菲 薄的血纤蛋白膜，然后利用半透膜的渗透作用除去所述水分。在欧洲专利申请
0366564材料中，是利用一种基础材料(较好的是，具有多孔性或对于凝血酶或血纤 蛋白原具有高度亲和力)处理血纤蛋白原溶液和凝血酶溶液。结果，其血纤蛋白原就 可在医疗装置表面发生聚合作用，而形成血纤蛋白层。利用这种方法重复多次敷以 血纤蛋白层，就可得到任何所需厚度的血纤蛋白层。或者，可先使血纤蛋白凝固， 然后调入一种粉剂加水碾磨，并装入加热的模具中，压铸成所需的形状(美国专利号 3,523,807)。将已经成形的血纤蛋白膜用一种固定剂，例如，戊二醛或甲醛处理， 更可提高其稳定性。在本领域的老资格技术人员所知的这类或其他各种方法，都可 供本发明用于制造和形成血纤蛋白薄膜。
在对合成材料的移植物包敷胶原方面，对于胶原的制备和将其包敷在合成材料的 移植物装置的方法，都是一般都熟知的，并在Weadock等的美国专利号5, 851， 230(在 此已经列为参考文献)中已经论述。该专利报告中论述了对于合成材料移植物包敷胶 原的各种方法，在多孔性移植物基材上黏附胶原的方法，通常是将胶原分散在移植 物基材上，待其干燥，重复数次。胶原的分散材料的制备， 一般是将不溶性的胶原(以 重量计，大约1-2%)以酸性pH(pH范围为2-4)制成分散混合物。通常是用注射器将 该分散物注入移植物内腔，并用手揉搓，使该胶原糊剂料包敷在其整个内表面。按 要求其包敷和干燥处理步骤可重复操作多次。
在还有一项实施例中、是采用无定形碳来包敷支持模架或合成材料的移植物。在 此列为参考材料的美国专利号5,198,263中，论述了在氟化处理或其他卤化物气体 的条件下，以高速低温的沉积方式，生产无定形碳薄膜的一种方法。按照本发明的 方法，其沉积过程可在低于IOO 。C包括室内大气的温度下实施，其方法包括，射频 处理、血浆辅助处理、化学蒸发沉积处理等。采用本发明的各种方法制备的无定形 碳薄膜层，对于各种类型的基材，能够牢固黏附。包括例如，各种玻璃、金属、半 导体以及塑料。
球烯分子部分与含胺的聚合物中的反应性氨基团相结合时，可形成-球烯-移植 物。含胺聚合物类可按照美国专利号5,292,813所述进行制备。该方法中的化学修 改技术，可使直接使球烯直接与支持模架相结合。在另一项实施例中，可按照上述的方法，使球烯沉积在支持模架或合成材料移植物表面。(参见，Leone等的 W099/32184，在此已引为参考材料)。各种球烯(例如，C6。)也可通过一种环氧化物的 键合作用，黏附在不锈钢材料的表面(Yaniago等，各种有机性的球烯通过氧化作用、 还原作用以及C-0与C-C键合作用等形成反应过程的化学衍生状况。有机化学杂志， 584796-4798(1998)，已经在此引为参考材料)。其附着作用是与氧素形成键合。这 种物质及其结合处理方案，在美国Bucky公司都有商品供应(BuckyUSA， Houston, Texas)。
(B) 对于基质材料加入抗体和生长因子-各种抗体可促进祖代内皮细胞的黏
附
能力，各种生长因子则是以共价或非共价的方式与基质相结合，而促进细胞的生 长和分化。可将抗体和生长因子与基质包敷溶液混合，再涂敷于装置表面，抗体和 生长因子就可与基质层相结合。通常，抗体和生长因子是附着在包敷在装置的内腔 面所涂敷的基质的最外层。因而所述抗体和生长因子，就可突出在其与循环血行相 接触的表面。抗体和生长因子都可采用标准的技术施敷于表面的基质层。
在一项实施例中，是将抗体加入含有基质材料的溶液中。例如，对于抗-CD34单 克隆抗体的Fab片段，用含有浓度为500-800毫克/分升的人血纤蛋白原的溶液一起 培育。就能够判定抗-CD34单克隆抗体的Fab片段的浓度所发生的变化，本领域的一 般技术人员也都能够确定其最适宜的浓度，而不必过分依赖实验验证。将支持模架 放入Fab/血纤蛋白混合物中，再添加浓縮的凝血酶(浓度至少达到1000单位/毫升)。 将所形成的含有直接与基质相结合的Fab片段的聚合化的血纤蛋白混合物，在支持 模架或合成材料的移植物表面压制成薄膜层(小于ioo微米)。实际上，任何类型的 抗体或抗体片段都能够依此方法结合在基质溶液中，再包敷到支持模架或合成材料 的移植物表面。
例如，在另一项实施例中，带有或不带有抗体片段的完整抗体以及生长因子，都 可以共价方式与基质相结合。在一项实施例中，各种抗体和(各种)生长因子都可利 用异种-或同种-双功能连接分子以共价的方式与基质栓系在一起。在此采用的术语 "栓系起来"是指，利用连接分子将抗体栓系在基质上。有关本发明所用的连接分 子，是在基质黏附在支持模架上之后，再以共价方式将连接分子与该基质相连接。 在与基质形成共价结合之后，该连接的分子可对基质提供一批活性功能性基团。依 赖这类功能性基团，就可进一步与一种或多种抗体形成共价结合。图1A显示的是通过胶联分子的结合状态。所述内皮细胞1. 01通过细胞表面的抗原1. 02与抗体1. 03 相结合，该抗体通过胶联分子1. 04与基质1. 05-1. 06栓系在一起。基质1. 05-1. 06 黏附于支持模加1.07上。各种连接分子能够与基质直接(g卩，通过羧基)相连接，也 可通过著名的连接化学作用相连接，例如，酯化作用、酰胺化作用以及酰化作用
连接分子可以是一种双胺或三胺的功能性物质，可通过酰胺键合而与基质相结 合，并可提供胺功能基团而与抗体发生反应。例如，连接分子可以是聚胺功能性聚 合物。例如，聚乙烯亚胺(PEI)、聚烯丙基酰胺(PALLA)或聚乙二醇(PEG)。已经有多 种聚乙二醇衍生物，例如，m聚乙二醇-琥珀酰二酰亚胺基丙酸酯或m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺，包括若千共价结合方案，都已经由Shearwater Corporation, Birmingham, Alabama提供商品供应。(还可参见Weiner等，聚乙二 醇衬垫对于固定的抗体对抗原俘获的影响。生物化学和生物物理学方法杂志 45:211-219(2000)，已经在此列为参考文献)。须注意，对于具体的结合剂的选择， 须根据所用的抗体类型而定，这种选择不必过分依赖实验验证。也可采用这类聚合 物的混合材料。这类分子中，含有多数未定的胺功能性基团，可用于对一种或多种 抗体施行表面固定处理。
抗体可附着在已经直接沉积在支持模架表面上的C6。球烯层。各种交联剂则可以 共价方式附着在球烯层上。先使抗体附着在交联剂层，然后，就可附着在支持模架 上。图lB显示了Ce。的结合情况。其中，内皮细胞2.01通过细胞表面抗原2.02与抗 体2.03相结合，而抗体再以共价或非共价的方式与基质2.04结合，基质2.04则以 共价方式，通过C6。2.05与支持模架2.06相结合。
本发明的各种小型分子物质，含有可用于替代抗体、生长因子或其片段合成性或 天然存在的各种分子或肽类物质。例如，凝集素是一类天然存在的非免疫原性的与 糖类结合的肽类。 一种内皮细胞特异性凝集素抗原(Ulex Europaeus Uea 1) (Schatz
等2000人子宫内膜内皮细胞组织因子和1型血血纤蛋白溶酶原催化物抑制因子的 分离、鉴定以及炎症介导的表达。生物繁殖62:691-697)具有能够对祖代内皮细胞 表面的选择性结合能力。
已经创造出能够以各种细胞表面受体作为靶标的一种合成性"小型分子物质"。 这类分子物质能够有选择地与(各种)特异性受体相结合，并且能够针对特异性细胞 类型，例如，祖代内皮细胞选定耙标。已经能够合成可以识别内皮细胞表面标记物， 例如，血管内皮细胞生长因子(VEGF)的小型分子物质SU11248(Sugen Inc.) (Mendel 等2003，以血管内皮细胞生长因子受体和血小板衍生生长因子受体为靶标的一种新型的酪氨酸激酶抑制物SU11248在体内的抗肿瘤活性药物动力学/药物活力相互关 系的确定。临床癌症研究 一月；9(1) :327-37); PTK787/ZK222584(Drevs J等，2003， 受体的各种酪氨酸激酶:抗癌症治疗的一些新的主要靶标。现到药物的各种靶标。二 月;4(2) :113-121);以及SU6668(Laird， AD等，2000，在体内SU6668对Flk-1/KDR 和乙型PDGFR的抑制作用，在小鼠体内可导致肿瘤血管系统迅速凋亡和肿瘤衰退。 FASEB杂志，五月；16(7) :681-690);都是可与血管内皮细胞生长因子受体-2相结 合的小型分子物质。
以内皮细胞表面为靶标的合成性小型分子物质的另一个亚组是，甲型(v)乙型 (3)integrin(alpha(v)beta(3)integrin)抑制物。SM256和SD983(Kerr JS等，1999 新型小分子物质alpha v integrin拮抗物:与已知的各种促血管生成素类抑制物的 抗癌症功效相比较。抗癌症研究，三月，四月；19(2A):959-968)是两种合成分子， 能够以存在于内皮细胞表面的alpha(v)beta(3)作为靶标，并与之相结合。
试验性实施例
本发明分节详细列述各项试验实施例如下。下述各节都是在本发明的理解范围， 但是，如后附的权利要求所述，并无意图也切勿解释为对于本发明的限制。
实施例1
内皮祖细胞的表型鉴定
据新近介绍(Asahara T, Murohara T， Sullivan A等，供血管生成用的推定的内 皮诅代细胞的分离方法。,，1997; 275:964-967)，内皮祖细胞(EPC)可采用CD34+ 磁珠分离法(Dynal Biotech)或富集培养基分离法进行分离。其方法大体是，从健康 男性志愿者取得外周静脉血液，以密度梯度离心法分离所述单核细胞组合物。将该 细胞材料涂布在用人的纤连蛋白包敷的培育玻片(Bcton Dickinson)上的培养基内。 培养基是EC基础培养基-2(EBM-2) (Clonetics)，其中补充了 5%的胎牛血清、人血 管内皮细胞生长因子-A、人成纤维细胞生长因子-2、人表皮生长因子、胰岛素样生 长因子-1以及抗坏血酸、每48小时更换培养基，令内皮祖细胞培育7天。这批试验 结果如图2A和2B所示，其中由抗-CD34分离的细胞，形如纺锤状，表明是在分化为 内皮细胞。
采用免疫组织化学方法测定内皮细胞(EC)的表型。其方法大体是，将内皮祖细胞 放入2%多聚甲醛(PFA) (Sigma)的磷酸盐缓冲盐水(PBS) (Sigma)溶液经10分钟，用
磷酸盐缓冲盐水清洗3次，再用各种内皮细胞特异性标记物染色:例如，兔抗人血管 内皮细胞生长因子受体-2 (Alpha Diagnostics, Intl. Inc.)、小鼠抗人Tie-2 (CloneAb33， Upstate Biotechnology)、小鼠抗人CD34 (Becton Dickinson)、内皮细胞凝 集素(Ulex Eur叩aeus Uea) (Sigma)以及小鼠抗人因子8(Sigma)。将细胞暴露在荧光 素异硫氰酸盐(FITC)结合的次级抗体，就可验证抗体的存在。碘化丙锭(PI)则作为 细胞核染色标记物。这组实验的结果如图2C-2G所示。图2C所示为，培育24小时 之后表达的血管内皮细胞生长因子受体-2的情况，验证了该细胞正是内皮细胞；图 2D和2F在培育7天之后，结合的细胞的细胞核染色情况；以及图2E和2G表明是细 胞着染和对抗Tie-2抗体的同一个视野的情况。
内皮祖细胞能够表达内皮细胞氧化一氮合成酶(eNOS)，这是内皮细胞功能的一种 特性。可采用反向转录酶聚合酶链式反应(rt-PCR)对于内皮细胞氧化一氮合成酶 mRNA进行测定。可使内皮祖细胞在EBM-2培养基中生长7天后，采用基因洗脱哺乳 动物总RNA试剂盒(Sigma)来分离总RNA，再在260纳米波长测定其吸光值进行定量。 对于总RNA采用Omniscript反向转录试剂盒(Qiagen)用1微克随意的引物反向转录 成20微升容量。每种反向转录(RT)产物取最终反应容量的等份量(2-IO微升)，在两 组平行的聚合酶链式反应中进行扩增处理，其中采用内皮细胞氧化一氮合成酶(eNOS) (299bp产物，正义5，-TTCCGGGGATTCTGGCAGGAG-3，，反义5，-GCCATGGTCGCCGCAG-3，) 或GAPDH (343bp产物，正义5，-CTCTAAGGCTGTGGGCAAGGTCAT-3，，反义5，-GAGATCCACCACCCTGTTGCTGTA-3')作为特异性引物，和T叫聚合酶(Pharmacia Biotech Amersham)。聚合酶链式反应周期程序如下94。C5分钟，65 。C 45分钟，72°C30分 钟(用内皮细胞氧化一氮合成酶时须经35个周期，用GAPDH时须经25个周期)。反 向转录酶聚合酶链式反应的产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳法进行分析采用溴非乙啶 染色进行眼观判定，并采用密度测计法进行定量测定。此项实验的结果如图3A和3B 所示。图中显示，在含有或不含氧的培育条件下，细胞在培养基中培育3天后，都 有氧化一氮合成酶(eNOS)的表达，在培育7天之后，可持续表达内皮细胞氧化一氮 合成酶mRNA。内皮细胞氧化一氮合成酶mRNA的存在，表明细胞在培育第3天就分化 为成熟的内皮性，开始在功能方面如同完全分化的内皮细胞。
实施例2
包敷抗-CD34抗体的不锈钢碟对内皮细胞的俘获
在整个实验过程中，人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)(美国标准培养物收藏中心)一 直生长在内皮细胞生长培养基中。细胞是培育在用CMDX和白明胶包敷的样本上，其 表面有或没有结合的抗体，或者是裸露的不锈钢(SST)样本。经培育之后，除去培养基，对样本用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗两次。将细胞固定在2%多聚甲醛(PFA)中 IO分钟，再用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，每次10分钟以保证固定剂已全部除去。每 份样本须在室温下用封闭溶液培育30分钟，以封闭所有的非特异性封闭现象。样本 经用磷酸盐缓冲盐水一次清洗之后，暴露在以1:100稀释的血管内皮细胞生长因子 受体-2抗体中培育过夜。然后再将样本用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，以保证全部初 级抗体完全除去。将在封闭溶液制备的荧光素异硫氰酸盐结合的次级抗体，以1:100 的稀释度分别加入每份样本，在Belly Dancer装置中于室温下培育45分钟。经培 育之后，样本再用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，再用含有O. l%Tween 20的磷酸盐缓冲 盐水溶液清洗1次，然后再用磷酸盐缓冲盐水清洗。将样本用碘化丙锭(PI)封装， 并在共焦显微镜下观察。
图4A-4E是如下各类不锈钢(SST)样本的显微照相图象包敷CMDX和抗-CD34抗体 (图4A)、包敷白明胶和抗-CD34抗体(图4B)、裸露的不锈钢材料(图4C)、包敷CMDX 而无抗体(图4D)以及包敷白明胶而无抗体(图4E)。图中数据显示，惟有包敷抗体的 样本，由碘化丙锭染色呈现的含有多数附着在样本表面细胞。对照的裸露的不锈钢 碟的表面却也有少数细胞附着。
图5A-5C是在其表面有CMDX包敷而无抗体结合的对照样本的显微照相图象。图 5A显示，由碘化丙锭染色显示在样本表面有很少量细胞黏附。图5B显示，黏附的细 胞是血管内皮细胞生长因子受体-2阳性，表明这类细胞是内皮细胞。显示了细胞核 染色与血管内皮细胞生长因子受体-2阳性的绿色荧光组合的情况。图5D-F是在其表 面包敷白明胶而无抗体结合的对照样本的显微照相图象。图5D显示，样本中因无碘 化丙锭的染色而未显出细胞存在，各份样本也未显现绿色荧光发射(参见图5E和5F)。
图6A-6C是在其表面包敷CMDX并且有抗-CD34抗体结合其上的不锈钢样本的显微 照相图象。其数据表明，各样本上含有多数黏附的细胞，已经接近融合一片单层(图 6A)。并且据所述绿色荧光显示，是血管内皮细胞生长因子受体-2阳性的表现(图6B 和6C)。同样，图6D-6F是在其表面包敷白明胶并且有抗-CD34抗体结合其上的样本 的显微照相图象。其各项数据也表明，由多数红染的细胞核与血管内皮细胞生长因 子受体-2/荧光素异硫氰酸盐结合的抗体所呈现的绿色荧光显示，有人脐带静脉内皮 细胞附着在样本表面(图6E和6F)。
实施例3
血管内皮细胞生长因子受体-2和Tie-2对于祖代内皮细胞的染色作用按照实施例l所述，从人的血液中分离祖细胞，并在活体外的生长培养基中，培
育24小时、7天、和3周。培育之后，除去培养基，将样本用磷酸盐缓冲盐水清洗 两次。细胞再用2%多聚甲醛(PFA)固定处理10分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水清洗3 次，每次10分钟。以保证除去所有的固定剂成分。每份样本用440微升山羊性(对 于血管内皮细胞生长因子受体-2)或马性(对于Tie-2)封闭溶液在室温下培育30分 钟。以封闭全部非特异性结合作用。将样本用磷酸缓冲盐水清洗1次，再加入用封 闭溶液稀释成1:100的血管内皮细胞生长因子受体-2或Tie-2抗体，将样本培育过 夜。再将样本用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，以保证清除全部初级抗体。对每份样本 按照1:100稀释加入马性或山羊性封闭溶液制备的荧光素异硫氰酸盐结合的次级抗 体(200微升)，在Belly Dancer装置中于室温下培育45分钟。经培育之后，样本再 用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，再用含有0. l%Tween 20的磷酸盐缓冲盐水溶液清洗1 次，然后再用磷酸盐缓冲盐水清洗。将样本用碘化丙锭(PI)封装，并在共焦显微镜 下观察。
图7是经CMDX包敷，在其表面含有CD34抗体的样本，加入细胞经24小时培育 后的显微照相图象。由样本表面呈现的红染的细胞核，显示其样本的表面有祖细胞 被俘获。其数据还表明，大约有75%的细胞的形态呈圆形，以及血管内皮细胞生长 因子受体-2呈阳性。
图8A和8B是从培育7天的细胞取得的样本。图8A显示，在样本中呈现红染的 细胞核，以及血管内皮细胞生长因子受体-2呈阳性，表明其中含有细胞(图8B， 100%)， 由细胞的纺锤形显示其具有较多的内皮细胞结构。
图9A和9B是在其表面包敷CMDX并含有CD34抗体的样本，加入细胞培育7天， 经培育之后再将样本暴露Tie-2抗体的显微照相图象。在图9A可见到有红染的细胞 核，表明样本表面有多数细胞附着。并且，据细胞发射的绿色荧光表明，附着在样本 表面的细胞也是Tie-2阳性(100。/。))(图29B)。总之，在样本中加入细胞培育7天后， 在CD34抗体包敷的样本，据其表面有多数细胞附着，以及在附着的细胞表面存在着 血管内皮细胞生长因子受体-2和Tie-2受体的情况表明，这种样本能够俘获内皮细 胞。此外，在培育7天的样本表面存在着100%内皮细胞的情况表明，非内皮细胞都 已经被分离，或者，在培育的第7天，所有附着的细胞都已经表达了内皮细胞的标 记物。
图10A-10C是在内皮细胞生长培养基中培育生长周的祖代内皮细胞的相差显微照 相图象。图10A显示，据其中形成的类似血管内腔(箭头所示)二维管状结构(箭头)表明，所述细胞已经分化为成熟的内皮细胞。图10B显示，细胞已经形成多层的三 维结构，即， 一个细胞在另一个细胞的上部。这种情况验证了有关内皮细胞的生长 期延长时就开始形成一个落在一个上面的多层结构的报道。图10C显示，在涂布培
育生长3周之后的祖细胞己经具备内皮细胞的外观，该图示确认，由样本表面存在 CD34/荧光素异硫氰酸盐结合的抗体的绿色荧光证实，所述细胞已经是内皮细胞。
上述数据表明，从人的血液分离的白血细胞中含有CD34阳性的祖细胞，并且容 易表达内皮细胞的各种表面抗原(血管内皮细胞生长因子受体-2和Tie-2)。此项数 据也表明，抗祖细胞或干细胞表面抗原的各种抗体，也可包敷在本发明的医疗装置 表面，用于俘获这类细胞。
实施例4
对于不锈钢的球烯包敷以及球烯配以抗-CD34抗体和/或 内皮细胞生长因子(Ang-2， VEGF)的包敷
不锈钢支持模架和平碟都可采取如下程序，敷以功能性球烯层，而可附着各种抗 体和/或生长因子(血管内皮生长因子或促血管生成素)
第一步是，对于不锈钢的支持模架或碟子，用0.5M HC1进行活化处理，同时还 清除其表面的任何钝化性污染物。从活化处理池中取出该金属样本，用蒸馏水冲洗， 经甲醇脱水，放在75。C烘炉上烘干。再将该支持模架浸入加有氧化球烯(C6。-0)甲苯 衍生溶液经24小时。该氧化球烯可通过在该支持模架上可发现的Fe-0、 Cr-0、 Ni-O 而与该支持模架相结合。将支持模架从该衍化池中取出，用甲苯冲洗，再放入 Soxhlet抽提器经16小时，用新鲜的甲苯清除其中自然吸附的C6。。将支持模架取出， 再放入105°C烘炉中干燥过夜。这一反应过程可制成具有单层球烯的完全衍化的支 持模架或碟子。
第二步是，由癸二酸与亚硫酰二氯或氯氧化硫(S0Cl2)而形成氯化癸二酰。该氯化 癸二酰再与锂铝[t-叔丁基LH和二甘醇二甲醚发生反应，可产生1,10-癸二醇 (decanediol)，其反应式如下
<formula>formula see original document page 39</formula>第三步是，在支持模架或碟子的表面(由第一步)形成N-甲基吡咯烷.衍生物。将 等摩尔量的球烯和N-甲基甘氨酸与第二步的反应产物1，10-癸二醇，在充氮回流的 甲苯溶液中再进行48小时反应，球烯分子可进一步衍化，而产生N-甲基吡咯烷衍生 的球烯-不锈钢支持模架或碟子，列述如下
经衍生处理的不锈钢支持模架或碟子须进行清洗册底除去任何化学品残迹，再用 于结合抗体(血管内皮细胞生长因子(VEGF)和促血管生成素-2 (Ang-2))和/或用于其 他标准操作程序。如实施例1所述，从人血液中提取分离祖细胞，暴露处理用抗-CD34 抗体包敷的球烯碟子，经培育之后，将样本用磷酸盐缓冲盐水清洗两次。细胞用2%多 聚甲醛(PFA)固定处理10分钟，再用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，每次10分钟，以保 证除去全部的固定剂。每一份样本都用封闭溶液在室温下培育30分钟，，以封闭全 部非特异性结合。将样本用磷酸盐缓冲盐水清洗一次，再暴露在1:100稀释的血管 内皮细胞生长因子受体-2抗体，培育过夜。然后将样本用磷酸盐缓冲盐水清洗3次， 以保证除去全部初级抗体。分别对每份样本加入以1:100稀释度用封闭溶液制备的 荧光素异硫氰酸盐结合的次级抗体。，放入Belly Dancer装置在室温下培育45分钟。 经培育之后，经培育之后，样本再用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，再用含有O. l%Tween 20的磷酸盐缓冲盐水溶液清洗1次，然后再用磷酸盐缓冲盐水清洗。将样本用碘化 丙锭(PI)封装，并在共焦显微镜下观察。图11显示是用功能性的球烯包敷的本发明 的支持模架表面并结合祖细胞的示意图象。图12A-12B分别是球烯包敷的没有碘化 丙锭(PI)染色(12A)，也没有抗血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)的抗体/荧 光素异硫氰酸盐结合的(FITC)抗体染色的对照样本的显微照相图象。图12C和12D 是包敷有球烯/抗-CD34抗体包衣的样本的显微照相图象。如各插图所示，在抗-CD34 抗体包敷的样本中，含有较多附着在其表面的细胞，对于血管内皮细胞生长因子受 体-2呈现阳性。
如实施例5所述，将含有或不含抗体的球烯包敷的样本，植入一组约克夏猪体内。 对移植的支持模架进行组织学研究，对支持模架分割的片段用10%缓冲的福尔马林 冲洗30秒钟，并固定在10%缓冲的福尔马林中备用。每个支持模架切割成5份l 毫米支架的近侧段、l毫米近侧端段、中段、l毫米远侧边段以及l毫米远侧端段。 各段样本材料都采用苏木紫伊红(服)和弹性蛋白三色剂(Elastin Trichrome)染色。图13A-13D都是通过已经植入4周的支持模架的心冠动脉外植体横截面的显微照相 图象。其数据显示，经球烯包敷(图13B和13D)的支持模架，与对照材料相比较(裸 露的支持模架，图13A和13C)，可抑制在支持模架部位的过度的内膜组织增殖。
实施例5
猪体气囊损伤研究
对一组体重在25-30千克的一组幼龄约克夏猪，植入抗体包敷的支持模架。猪群 按照"实验动物管理使用手册"(NIH出版号80-23，修订版，1985)进行照料。先令 猪群饥饿过夜，再施用增静剂氯胺酮(20毫克/千克)。再经施用戊硫代巴比妥(12毫 克/千克)诱导麻醉后，分别插管并连接通气机，输以氧和一氧化二氮的混合气体 (l:2[容量/容量])。麻醉过程以0.5-2.5容量％异氟烷来维持。同时施以抗生素预 防措施，用普鲁卡因青霉素-G和苄星青霉素-G(链霉素)混合物1000毫克施行肌肉内 注射。
在无菌条件下，对左侧颈动脉施行动脉切开术，对左侧颈动脉插入一个 8F (French, 1F=0. 33毫米)口径的插管套管，各例试验猪分别给予100单位/千克体重 的肝素。在整个实验过程，还要定时给予2， 500国际单位的肝素浓縮药团，以维持 大约300秒钟的活化凝固时间。再在该颈动脉套管中插入一条6F 口径规格的导管， 通入心门抵达心冠动脉。对心冠动脉内输入200微克三硝酸甘油酯后，进行血管造 影术，并采用定量心冠动脉血管照相装置对其影象进行分析。对于心冠动脉的近端 部位插入一条3F 口径的栓子切除术导管，探向其远端段选定的植入移植片固定模的 部位，并剥除其上的内皮细胞层。将经包敷R并结合抗-CD34抗体的移植片固定模， 通过定向导管送至心冠动脉剥除内皮细胞层的部位。利用裸露的不锈钢支持模架或 包敷基质而没有抗体的支持模架作为对照。植入左前降支心冠动脉(LAD)或右心冠动 脉(RCA)或旋绕心冠动脉(Cx)的各支持模架，在模架与动脉之家的比率市是1:1。通 过血管造影术来确定对支持模架的校准和位置，然后取出插管套管，将皮肤分两层 闭合。在整个实验过程，将实验猪放在300毫克的ASA上。
实验猪在植入移植片固定模之后，分别在l、 3、 7、 14和28天将各例猪只先按 照上述方式施行镇静和麻醉，然后扑杀。采取植入支持模架的心冠动脉部位，连带 其近侧和远侧的无支持模架的血管段各1厘米，作为外植体样本。用3种方法处理 该植入支持模架的心冠动脉，即，组织学方法、免疫组织化学方法以及扫描电子显 微镜方法。在免疫组织化学方法方面，将摘出的支持模架用10%福尔马林轻轻冲洗30秒钟，
并保存在10%福尔马林/磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，备用。预定供免疫组织化学 方法处理的支持模架，都用2%多聚甲醛(PFA)的磷酸盐缓冲盐水溶液冲洗30秒钟， 然后放入2%多聚甲醛溶液中浸泡15分钟，再用磷酸盐缓冲盐水清洗和保存，以备 用家兔抗人血管内皮细胞生长因子受体-2 (VEGFR-2)或小鼠抗人Tie-2进行免疫组织 化学方法检测。
供扫描电子显微镜方法(SEM)的移植片固定模的制备程序是，将支持模架用10% 缓冲的福尔马林冲洗30秒钟，放入2。/。多聚甲醛(PFA)2. 5%戊二醛的0. 1M 二甲次砷 酸钠缓冲液中固定过夜。然后将样本用二甲次砷酸钠缓冲液清洗3次，并留置清洗 过夜。再用1。/。四氧化锇(Sigma)的0. 1M 二甲此砷酸钠缓冲液中完成后固定处理。随 后再用乙醇递增级次进行脱水处理(乙醇级次为30%、 50%、 70%、 85%、 95%、 100%、 100%)，最后用C02进行临界点干燥处理。经干燥处理之后，对样本进行溅金处理后 在扫描电子显微镜下观察。(对猪的心冠动脉采用经肝素包敷的Palmatz-Schatz移 植片固定模以减免血栓形成的支持模架。循环系统93:423-430，已经在此引为参考 资料)。
在组织学方法方面，将装入移植片固定模的血管段，用10%缓冲的福尔马林冲洗 30秒钟，放入2。/。多聚甲醛(PFA)2. 5%戊二酸的0. 1M 二甲次砷酸钠缓冲液中固定过夜。 将每份支持模架分割成5段，g卩，支持模架近侧l毫米、支持模架近侧端l毫米、 支持模架中段、支持模架远侧缘1毫米以及支持模架远侧1毫米。各分段用苏木紫 伊红(HE)和弹性蛋白三色剂染。
图14A-14G显示的是，在植入1小时(图14A和14B)和48小时((图14C-14G)摘
取的，在扫描电子显微镜下观察的各例外植体。这些显微照相图象清晰地显示了， 经葡聚糖/抗-CD34抗体包敷的支持模架(14B， 14E-G)，在48小时后与采用葡聚糖包 敷的对照材料(图14A、 14C、禾卩14D)相比较，已经俘获了祖代内皮细胞，在高倍放 大(400x)时，可见到外观呈纺锤形的细胞形态。
从猪体心冠动脉的外植体横截面，也显示出与对照组材料(裸露的不锈钢，14H 和141;右旋糖膏包敷的材料，14J和14K)相比较，在经葡聚糖/抗-CD34抗体包敷 的支持模架(1L， 14M)上，其内膜组织增殖现象明显受到抑制。如图13B-13D所示， 由球烯类包敷的支持模架植入物，与裸露的不锈钢模架对照材料相比较，对内膜组 织增殖的抑制作用也相当良好。
图15A和15B分别显示的是，葡聚糖-血浆包敷的没有抗体在其表面结合的移植片固定模，以及葡聚糖-血浆包敷的有抗CD34抗体结合的18毫米长度的移植片固定
模的共焦显微照相图象。各例移植片固定模都是植入幼龄约克夏猪体的心冠动脉内， 其各例外植体都采用免疫组织化学方法处理，并用血管内皮细胞生长因子受体
-2(VEGFR-2)染色，然后用荧光素异硫氰酸盐结合的次级抗体处理，再用共焦显微镜 观察。图15B和15C显示，在含有抗体的移植片固定模段，由其中显现的绿色荧光 表明有内皮细胞覆盖；与之相比较，在没有抗体的支持模架上，就完全缺乏内皮细 胞层(图15A)。
实施例6
内皮细胞生长因子与在固定的应用于移植片固定模上的抗体基质的结合
现介绍将直接对抗内皮祖细胞细胞表面抗原的一种抗体，固定在应用于血管内移 植片固定模的生物相容的基质上的一种方法如下。于是就可吸收一种内皮细胞生长 因子，在与血液相接触时，可提高血行中的内皮祖细胞的附着能力，并且生长成熟 为功能性内皮细胞层。
基质层 的沉积过程:采用本领域的老资格技术人员所熟知的各种方法，对于不锈 钢支持模架材料用血浆沉积方法处理，将胺的功能导入移植片固定模表面。对于沉 积在移植片固定模上的胺的功能层，通过采用一种标准的程序(已知是一种水溶性含 碳二亚胺化学处理)激活羧基功能性葡聚糖(CMDX)上的羧基基团，在胺功能层上结合 一层羧基功能性葡聚糖层。其操作是在水体条件中进行，其中在血浆沉积层上的胺 基团，可在血浆层与功能性葡聚糖之间形成酰胺键结合。
抗体的固定过程对抗内皮祖细胞表面抗原的各种抗体，例如，小鼠单克隆抗人 CD34，可通过在水溶性含碳亚胺化学处理方法，在缓冲的酸性溶液中培育，与功能 性葡聚糖(CMDX)包敷的移植片固定模以共价的方式结合。
生长因子的吸收过程:在将单克隆抗人CD34固定在应用于移植片固定模的功能性 葡聚糖，再将该装置培育在相当于吸收入功能性葡聚糖的生长因子的浓度的一种内 皮细胞生长因子，例如，促血管生成素-2的水溶液中。经此处理的装置用生理缓冲 盐水溶液淋洗之后，于叠氮化钠防腐溶液中保存。
采用标准的血管造影技术检査，上述植入猪心冠动脉并暴露接触人血液的装置， 在受处理的斯坦特支持膜架表面上可产生加强对血行中内皮祖细胞的承受和附着， 以及转化为成熟的功能性内皮细胞层的能力。预期快速形成的功能性内皮细胞层， 可减少装置引起的血栓形成，并可调整内膜组织增殖的程度。实施例7
内皮细胞生长因子和抗体在移植片固定模上的固定过程
以下介绍有关将对抗内皮祖细胞的细胞表面抗原以及内皮细胞生长因子固定在 应用于血管内的移植片固定模上的生物相容的基质的步骤。这种生物相容的基质层 在与血液接触时，可加强血行中的内皮祖细胞的附着过程，以及促使其转化为成熟 的功能性内皮细胞层。
基质层的沉积过程:采用本领域老资格的技术人员已知的各种方法，利用血浆沉 积方法处理不锈钢材料的移植片固定模，对该支持模架表面导入胺的功能。对于沉 积在移植片固定模上的胺的功能层，通过采用一种标准的程序(已知是一种水溶性含 碳二亚胺化学处理方法)激活羧基功能性葡聚糖(CMDX)上的羧基基团，在胺功能层上 结合一层羧基功能性葡聚糖层。其操作在水体条件中进行，其中在血浆沉积层上的 胺基团，可在血浆层与功能性葡聚糖之间形成酰胺键结合。
抗体和生长因子的固定过程
对抗内皮祖细胞的细胞表面抗原的各种抗体，例如，小鼠单克隆抗人CD34，以及 一种内皮细胞生长因子，例如，促血管生成素-2，都可在酸性条件下，在水溶性含 碳的二亚胺溶液中，以等摩尔浓度进行培育，以共价的方式与有羧基功能性葡聚糖 (CMDX)包敷的支持模架相结合。该经过处理的装置用生理缓冲盐水溶液淋洗之后， 于叠氮化钠防腐溶液中保存。
采用标准的血管造影技术检查，上述植入猪心冠动脉并暴露接触人血液的各例装 置，在受处理的斯坦特支持膜架表面，可加强对血行中内皮祖细胞的承受和附着， 以及转化为成熟的功能性内皮细胞层。预期快速形成的功能性内皮细胞层，可以减 少装置引起的血栓形成，并可调整内膜组织增殖的程度。
实施例8
移植片固定模的小分子物质发挥的功能
按实施例1所述的方法分离祖代内皮细胞。将细胞涂布在纤连蛋白包敷的玻片上， 在EBM-2培养基中培育生长7天。用碘化丙锭(PI)和一种荧光素异硫氰酸盐结合的 内皮细胞特异性凝集素(UlexEur叩aeusUea l)固定和染色。该组实验的结果如图16A 和16B所示。图示表明，所述祖代内皮细胞已经与纤连蛋白包敷的玻片相结合，并 且细胞在其表面表达为凝集素的一种配体。
权利要求
1. 一种医疗装置，所述装置包括，一层包衣层，其在体内促进祖代内皮细胞在该医疗装置表面黏附、生长和分化，所述包衣层包含(a)治疗有效量的至少一种选自抗体、抗体片段，或其组合和小分子物质的物质；(b)一种生物相容的基质；以及(c)至少一种化合物；其中所述至少一种物质直接对抗祖代内皮细胞表面的一种抗原，或与祖代内皮细胞表面的抗原相互作用，并将所述祖代内皮细胞固定在该装置表面；且所述至少一种化合物可刺激祖代内皮细胞分化成内皮细胞，在该医疗装置表面形成内皮组织。
2. 如权利要求1所述的医疗装置，其特征在于，所述至少一种抗体或抗体片段 可直接对抗选自CD133、 CD34、 CDw90 、 CD117、 HLA-DR、 VEGFR-1 、 VEGFR-2 、 Muc-18 (CD146) 、 CD130、干细胞抗原(Sea-1)、干细胞因子1 (SCF/c-Kti配体)、Tie-2 和HAD-DR的祖代内皮细胞表面抗原。
3. 如权利要求1所述的医疗装置，其特征在于，所述至少一种化合物是选自血 管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子-3(FGF-3) 、 FGF-4、 FGF-5、 FGF-6、 FGF-7、 FGF-8、 FGF-9、碱性成纤维细胞生长因子、血小板诱导性因子、转化生长因 子P1、酸性成纤维细胞生长因子、骨粘连蛋白、促血管生成素l、促血管生成素2、 胰岛素样生长因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子AA、血小 板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB、内皮细胞PAS蛋白1、血小板反应蛋 白(trhombospondin)、增殖蛋白、肝配蛋白-Al、 E-选择蛋白、肥胖蛋白、肝素、白 介素8、甲状腺素以及神经鞘氨醇1-磷酸酯的一种生长因子。
4. 如权利要求1所述的医疗装置，其特征在于，所述小分子选自天然存在的肽 类、合成肽类、糖肽类、脂肽类、脂质类、糖类、有机分子类、无机分子类以及核 酸类。
5. 如权利要求1所述的医疗装置，其特征在于，所述小分子是选自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管内皮生长因子R-l、血管内皮生长因子R-2、 Muc-18 (CD146) 、 CD130、干细胞抗原(Sea-1)、干细胞因子1 (SCF/c-Kti配体)、Tie-2 和HAD-DR的祖代内皮细胞表面抗原的配体。
6. —种包衣组合物，其在体内促进祖代内皮细胞在医疗装置表面黏附、生长和分化，所述组合物含有(a)—种生物相容的基质；(b)治疗有效量的至少一种选自抗 体、抗体片段，或其组合和小分子物质的物质；以及(c)至少一种化合物；其中所述 至少一种物质直接对抗祖代内皮细胞表面的一种抗原，或与祖代内皮细胞表面的抗 原相互作用，并将所述祖代内皮细胞固定在该装置表面；且所述至少一种化合物可 刺激祖代内皮细胞分化成内皮细胞，在该医疗装置表面形成内皮组织。
7. 如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述至少一种抗体或抗体片段可 直接对抗选自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管内皮生长因子R-1、血管 内皮生长因子R-2、Muc-18 (CD146) 、CD130、干细胞抗原(Sca-1)、干细胞因子1 (SCF/c-Kti配体)、Tie-2和HAD-DR的祖代内皮细胞表面抗原。
8. —种包衣医疗装置的方法，所述方法包括以下步骤a. 在医疗装置表面至少敷上一层生物相容的基质，其中，所述生物相容的基质 含有选自聚氨酯、嵌段的聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纤维素酯、聚乙二醇、聚 乙酸乙烯酯、葡聚糖、白明胶、胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋 白、肝素、血纤蛋白、纤维素以及碳和球烯的至少一种成分，以及b. 在所述生物相容的基质中同时或相继加入(i) 治疗有效量的至少一种物质，选自抗体、抗体片段或其组合，和小分子物质， 其中至少一种物质直接对抗祖代内皮细胞表面的一种抗原，或与祖代内皮细胞表面 的抗原相互作用，并将祖代内皮细胞固定在该装置表面；禾口(ii) 至少一种化合物，刺激祖代内皮细胞分化成内皮细胞，在该医疗装置表面形成内皮组织。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗体或抗体片段可直 接对抗选自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管内皮生长因子R-l、血管内 皮生长因子R-2、 Muc-18 (CD146) 、 CD130、干细胞抗原(Sea-1)、干细胞因子1 (SCF/c-Kti配体)、Tie-2和HAD-DR的祖代内皮细胞表面抗原。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述至少一种化合物是选自血管内 皮生长因子、成纤维细胞生长因子-3、成纤维细胞生长因子-4、成纤维细胞生长因 子-5成纤维细胞生长因子-6、成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-8、成 纤维细胞生长因子-9、碱性成纤维细胞生长因子、血小板诱导性生长因子、转化生 长因子ei、酸性成纤维细胞生长因子、骨粘连蛋白、促血管生成素1、促血管生成 素2、胰岛素样生长因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子AA、 血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB、内皮细胞PAS蛋白1、血小板反应蛋白(trhombospondin)、增殖蛋白、肝配蛋白-Al、 E-选择蛋白、肥胖蛋白、肝素、 白介素8、甲状腺素以及神经鞘氨醇1-磷酸酯的一种生长因子。
全文摘要
在此提供包覆有可促进内皮细胞的黏附和分化的包衣的医疗装置，生产一种医疗装置的各种成分和方法。这类医疗装置包括，例如，移植片固定模、移植片固定模移植物、合成的人造血管、心脏瓣膜等，都用含有各种抗体、抗体片段或小分子物质的生物相容的基质进行包衣。这种生物相容的基质对于始祖细胞表面抗原具有识别、结合和/或相互作用的能力，从而可将所述细胞固定在该装置表面。该种装置所用的包衣材料，还可含有一种化合物或生长因子，能够促进在该装置表面的始祖代内皮细胞，从受束缚的细胞状态，加速黏附、生长和分化过程，而成为成熟的和功能性的内皮细胞的能力，以防止内膜增殖。在此公开发表了有关这类医疗装置的方法，及其各种组成成分，以及对于患有各种血管性疾病，例如，血管瓣膜再狭窄症、动脉粥样硬化症或者其他类型的血管性障碍问题的哺乳动物进行治疗的各种方法。
文档编号A61BGK101502674SQ20081018431
公开日2009年8月12日 申请日期2003年2月6日 优先权日2002年2月6日
发明者M·A·库里泽斯基, M·J·B·库特里克, R·J·小科托尼, S·M·罗兰德 申请人:祥丰医疗有限公司