包含硫酸多糖的抗病毒组合物的制作方法

专利名称：包含硫酸多糖的抗病毒组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及选自由卡拉胶和褐藻糖胶组成的组的硫酸多糖和由其制成的药物组
合物，其中，所述硫酸多糖作为抗病毒活性成分存在，所述抗病毒活性成分用于经由呼吸道进入个体体内的病毒所引起或与其相关的疾病的预防或治疗方面的医学或兽医学应用，所
述病毒选自由正粘病毒、副粘病毒、腺病毒和冠状病毒组成的组。
背景技术：
正粘病毒是RNA病毒，并且是作为流感病毒物种的最突出的成员。甲型流感病毒和乙型流感病毒是弓I起流行性人类疾病的两类流感病毒。它们通常在人与人之间散播，主要通过呼吸飞沫传播。 副粘病毒科包括呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒和偏肺病毒。RSV和副流感病毒感染可能导致婴幼儿中的严重呼吸道感染，但也可能导致具有受损的免疫系统的老年人和成人中的严重疾病。 在人类副流感病毒物种中，已知有四个成员会导致儿童中目前尚不能有效预防或治疗的严重呼吸道疾病，这四个成员是1型 4型副流感病毒。据信，副流感病毒和RSV的爆发显著地促使住院率和死亡率的增加。免疫、心血管或肺部系统受损的患者在副粘病毒感染后发生严重并发症的风险增加，因而将特别受益于抗病毒治疗。 作为通过折磨婴幼儿期的个体的世界上散布最广泛的呼吸道病原体，呼吸道合胞
病毒(RSV)每年在冬季和早春期间导致肺炎和支气管炎的爆发。RSV支气管炎和肺炎每年
令数十万婴儿需要住院。通过每月进行人源化单克隆抗RSV抗体帕利珠单抗(Synagis )
的肌内注射，可以以报道的55%成功率至少部分地实现抵抗RSV的被动保护。 冠状病毒科包括冠状病毒和环状病毒。已知冠状病毒会感染哺乳动物和鸟类的上
呼吸道和胃肠道。据信，冠状病毒引起成年人中所有普通感冒中较大的百分比。 腺病毒是通常感染上呼吸道的DNA病毒。目前，已知人类腺病毒有超过50种不同
的血清型，这些血清型被分为A F六种亚型并且是造成5X 10%的儿童上呼吸道感染
的原因。 有鉴于上述内容，可以认为，亟需易于应用并且可有效预防或治疗由副粘病毒科、正粘病毒科、冠状病毒科和/或腺病毒科的成员引起的呼吸道病毒感染的有力抗病毒药物组合物。 数十年来，已知包括卡拉胶和褐藻糖胶在内的硫酸多糖具有抗病毒功效。于是，现有技术领域充斥着有关卡拉胶的抗病毒效果的科学文章。在一篇最令人感兴趣的综述中，Gonzalez M. E.等(1987， Antimicrob. Agents Chemother. 31， 1388-1393)报道了包括i-卡拉胶的不同硫酸多糖抵抗数种动物病毒的抗病毒功效。i-卡拉胶显示出抵抗HSV-l、HSV-2、赛姆利基森林病毒(SFV)、痘苗病毒和非洲猪瘟病毒(ASF)等包膜病毒和抵抗裸露的脑心肌炎(EMC)病毒的抗病毒活性。i -卡拉胶对水泡性口炎病毒(VSV)和麻疹病毒等包膜病毒和1型脊髓灰质炎病毒和5型腺病毒等裸露的病毒没有效果。
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美国专利第4， 783， 446号公开了 t _卡拉胶、k -卡拉胶和A -卡拉胶抵抗逆转
录病毒感染、特别是抵抗人类T细胞白血病病毒(HTLV) III感染的抗病毒活性。WO 88/06396公开了一种通过施用卡拉胶或卡拉胶混合物来治疗包括HIV感染的
逆转录病毒感染的方法。Girond等(1991， Research Virol. 142,261-270)公开，如i -卡拉胶、k -卡拉胶
和入-卡拉胶等硫酸多糖具有抵抗甲肝病毒(HAV)复制的有效抑制活性。Baba M.等(1988， Antimicrob. Agents Chemother. 32， 1742-1745)公开了包括硫
酸葡聚糖、多硫酸戊聚糖、褐藻糖胶和卡拉胶的数种硫酸多糖作为HSV-1、 HSV-2、人类巨细
胞病毒(CMV)、水泡性口炎病毒(VSV)、辛德毕斯病毒和HIV-1的有力抑制剂。另一方面，经
测试这些硫酸多糖没有抵抗柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒和副流感病毒的活性。 EP 0293826公开了如褐藻糖胶和卡拉胶等硫酸多糖在体外抑制HIV-1上的治疗
性和预防性应用。 美国专利第5， 658， 893号公开了一种通过使轮状病毒与入-卡拉胶接触而抑制人类细胞的轮状病毒感染的方法。该专利还公开，i -卡拉胶和K-卡拉胶没有展示出抗轮状病毒活性。 US 2003/181415A公开，已知包括硫酸纤维素的硫酸多糖可有效抵抗各种包膜病毒，特别是抵抗单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒和HIV。 褐藻糖胶是主要提取自各种褐藻物种的硫酸多糖。可以在市场上获得两类药理学等级的褐藻糖胶， 一种平均分子量为约1， 000， OOODa 2， 000， OOODa的高分子量褐藻糖胶(HMWF)组分(例如，Kraeber，德国)和一种平均分子量为8， 200Da的低分子量褐藻糖胶(L丽F)组分。F-褐藻糖胶主要由岩藻糖的硫酸酯组成，而U-褐藻糖胶由约20X的葡萄糖醛酸组成。 卡拉胶是提取自海藻(红藻)的线性硫酸酯化的基于半乳糖的多糖的通称。卡拉胶主要被用作药品和食品中的增稠剂、胶凝剂、稳定剂或乳化剂。存在有超过10种结构不同的卡拉胶，其性质取决于所提取自的海藻的属。三种主要卡拉胶类型为i-卡拉胶、K-卡拉胶和A-卡拉胶，它们在其结构和硫酸酯化程度上略有不同。t-卡拉胶是
形成软凝胶的硫酸酯化半乳聚糖，主要提取自红藻星芒杉藻(Gigartina stellate)和皱
波角叉藻(Chondrus crispus) 。
k -卡拉胶产生坚固的刚性凝胶且主要产自耳突卡帕藻
(K即p即hycus cottonii)。入-卡拉胶是最常见形式且常用于增稠乳制品。尽管卡拉胶具有抵抗如HIV、HSV、HAV、HTLV或HPV等病毒的抗病毒活性是长期已
知的，但卡拉胶如何展示出抗病毒活性的机理仍需进一步的澄清。 例如，Baba M.等(1988，Antimicrob. Agents Chemother. 32， 1742—1745)推领lj，包括K-卡拉胶和A-卡拉胶的硫酸多糖抑制或至少有助于抑制数种包膜病毒对宿主细胞表面的病毒吸附。类似地，US 2005/0261240假设，卡拉胶可能与病毒非特异性结合从而阻断病毒受体位点。Damonte E. B.等(2004， Curr. Med. Chem. 11， 2399-2419)公开，硫酸多糖可能模拟细胞硫酸肝素并因此阻断引起病毒和宿主细胞之间的初始相互作用的病毒受体位点，然而，Gonzalez M. E.等(1987，Antimicrob. Agents Chemother. 31， 1388-1393)利用标记的病毒粒子颗粒发现，即使在高浓度的i -卡拉胶存在下，HSV-1病毒粒子也会被内化。他们提出，至少对于HSV-1而言，卡拉胶抑制了在病毒附着并进入细胞之后但仍在合成晚期病毒蛋白之前的病毒复制中的步骤。Turner E. V.禾P Sonnenfeld G. (1979，Infection and Immunity 25,467-469)公
开了入-卡拉胶而非K-卡拉胶抵抗牛水泡性口炎病毒的抗病毒活性，该抗病毒活性是因免疫调节(即诱导干扰素)而造成的。 综上所述，可以采用US 5，658，893的话来总结，"鉴于不同病毒对硫酸多糖的不同响应，显而易见的是无法不经实验而确切地预测特定病毒对卡拉胶的响应。硫酸多糖、特别是卡拉胶抑制病毒复制和感染性的机理可能不是单一的，因为不同的研究者在采用不同病毒和细胞类型时报道出矛盾的发现。对于本领域技术人员而言，如硫酸多糖等作为一种病毒的有效抑制剂的物质将表现出类似的抵抗另一种病毒的效力是非显而易见的。"
鉴于上述内容，本发明现提供了适于预防或治疗由副粘病毒科、正粘病毒科、腺病毒科和/或冠状病毒科的成员造成的呼吸道病毒感染的基于卡拉胶和/或褐藻糖胶的抗病毒组合物。Fujisawa H.等(1987， J. gen. Virol. 68，425-423)报道，鼻内施用卡拉胶不会降低小鼠中的甲型流感病毒滴度而相反甚至会取决于用于感染的病毒量而增强动物对病毒的易感性，与该公开相反的是，现在令人惊讶地发现卡拉胶、特别是i-卡拉胶和K-卡拉胶事实上具有抵抗正粘病毒科、副粘病毒科、腺病毒科和冠状病毒科的各种成员的抗病毒效力。 另外，令人惊讶地发现，褐藻糖胶、特别是高分子量褐藻糖胶(HWMF)组分具有抵抗正粘病毒科和副粘病毒科的各种成员的抗病毒效力。 于是，本发明的目的是提供适于预防或治疗由选自由正粘病毒、副粘病毒、腺病毒和冠状病毒组成的组的病毒引起的呼吸道感染以及与这类原发性病毒感染相关的疾病或病理状态的抗病毒药物组合物，所述疾病或状态包括继发性病毒或细菌感染以及通常与这类原发性或继发性感染相关的身体症状(包括如发烧、疼痛、眩晕、战栗、出汗和/或脱水等症状)。

发明内容
在第一实施方式中，本发明涉及卡拉胶作为抗病毒活性成分在用于预防或治疗由呼吸道病毒感染所引起或与该感染相关的病理状态或疾病的药物组合物的制造中的应用，其中所述呼吸道病毒包含连接或整合于其病毒膜中的至少一种蛋白，所述蛋白能通过具有至少一个糖部分的受体而与宿主细胞结合，所述呼吸道病毒选自由正粘病毒和副粘病毒组成的组，而所述卡拉胶选自由i _卡拉胶和k-卡拉胶组成的组。 本文提及的"宿主细胞"是天然(即在天然或类天然条件下)受任何后文提及的病毒靶向并侵入的真核细胞。对于实验和实验室目的，本领域的技术状况是使用这样的宿主细胞系，所述宿主细胞系通常被认为是适用于测试生理活性剂的效力的体外模型并且就类似人类应用而言有至少一定的结果可预测性。 本发明还涉及包含t _卡拉胶和/或k _卡拉胶作为抗病毒活性成分的药物组合物及其在因病毒通过呼吸道进入个体体内而引起或与之相关的疾病的预防或治疗中的应用，其中所述病毒包含连接或整合于其病毒膜中的至少一种蛋白，所述蛋白能通过具有至少一个糖部分的受体而与宿主细胞结合，而所述病毒选自由正粘病毒和副粘病毒组成的组。
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本文所用的术语"抗病毒活性成分"是指可直接或间接有效地特异性干扰选自由真核细胞的病毒侵入、真核细胞中的病毒复制、病毒组装和病毒从受感染的真核细胞的释放组成的组的至少一种病毒活动的化合物，或指可有效地非特异性抑制病毒滴度的增加或有效地非特异性降低真核宿主体系或哺乳动物宿主体系中的病毒滴度水平的化合物。该术语也指避免或减少遭受病毒感染的可能性的化合物。 可以根据情况而将本药物组合物在病毒感染发生之前或之后施用，即用于预防性或治疗性目的，或者进行预防性和治疗性兼有的施用。 本文所用术语"预防"或"预防性治疗"涉及对健康个体施用本药物组合物以便降低所述个体对病毒感染的易感性。 本文所用术语"治疗"或"治疗性治疗"涉及施用本药物组合物以便实现症状严重性和/或频率的降低、消除症状和/或基本病因、防止症状和/或其基本病因的出现、和/或改善或弥补由病毒感染直接造成或与其间接相关(例如，通过继发性感染)的损害。
已知正粘病毒、副粘病毒和数种其它病毒通过与宿主细胞表面存在的受体结合而附着于宿主细胞，所述受体通常为含有包括唾液酸(N-乙酰神经氨酸)和硫酸类肝素残基的糖残基的糖蛋白或糖脂。 在正粘病毒(例如，流感病毒)的情形中，病毒粒子与唾液酸残基结合。人流感病毒优选与具有a2-6键的唾液酸残基结合，而禽流感病毒优选与具有a2-3键的唾液酸残
其妙a举￡口 口 。 副粘病毒的细胞摄入涉及至少两种其膜整合糖蛋白。其中之一通常选自糖蛋白HN、H和G的组，并且参与细胞附着，而另一种糖蛋白(即糖蛋白F)参与介导病毒包膜与宿主细胞膜的非pH依赖性融合。例如，呼吸道病毒和德国麻疹病毒(rubulavirus)与糖蛋白或糖脂宿主细胞受体的唾液酸残基结合。 RSV的附着尚未被完全认识，但对宿主细胞的附着很可能涉及与硫酸类肝素的相互作用，硫酸类肝素是作为细胞外基质的一部分的葡糖胺聚糖。 随着对本发明的揭示，据体外观察，将宿主细胞暴露于卡拉胶、特别是t -卡拉胶
和/或k -卡拉胶可能改变所述宿主细胞的细胞表面结构，所述改变据推测通过导致某些
细胞表面受体的三维结构的构象变化或通过掩蔽和/或修饰所述受体而发生。 令人惊讶的是，即使在将卡拉胶从宿主细胞除去之后，即在通过体外接种而人工
触发感染时不存在卡拉胶的情况下，宿主细胞表面的这种变化仍阻止正粘病毒和副粘病毒
对宿主细胞的附着。 只要在不晚于从寄主细胞移除所述聚合物(卡拉胶)之后约2小时开始人工触发的感染，都能观察到卡拉胶的这种特定的抗病毒效果，从而表明通过与卡拉胶的相互作用造成的细胞表面结构变化的效果持续时间相对较长。 与副粘病毒和正粘病毒相反，对于包括鼻病毒和冠状病毒的其它病毒，在触发感染时不存在卡拉胶的情况下没有观察到保护效果，而仅在卡拉胶存在时可获得保护。
因此，鉴于经实验证实的卡拉胶抵抗鼻病毒感染的抗病毒效力，据推断对于鼻病毒和可能的其它病毒而言，抗病毒效果可能也是由于卡拉胶聚合物对病毒粒子的附着而不是所述聚合物与宿主细胞受体的化学或物理相互作用而造成的。 如前文所述，本发明的卡拉胶组合物可以成功地用于抵抗包括由甲型或乙型流感病毒引起的感染在内的正粘病毒感染，尤其是其中所述甲型或乙型流感病毒是通过2-6唾 液酸键与宿主细胞结合的人类病毒时。主要使用或仅使用i -卡拉胶或褐藻糖胶作为抗病 毒活性成分可最佳地治疗人流感病毒感染。 然而，卡拉胶还可成功地用于抵抗其中所述甲型流感病毒是通过2-3唾液酸键与 宿主细胞结合的禽类病毒。在后一种情况下，K-卡拉胶成为最有效的卡拉胶，因此在有关 禽类病毒预防或治疗时优选使用K-卡拉胶。然而，据发现t -卡拉胶和褐藻糖胶对于甲 型禽流感病毒的活性低得多甚至没有活性。 据发现对卡拉胶治疗敏感的副粘病毒物种选自由1型人副流感病毒(HPV) 、2型 HPV、3型HPV、4型HPV和RSV组成的组。当所选副粘病毒为RSV时，优选将i -卡拉胶或褐 藻糖胶用作主要的或唯一的硫酸多糖成分以进行预防性或治疗性施用，这是因为i -卡拉 胶和褐藻糖胶在实验设置中产生了最佳结果。 本文提及的与预防性或治疗性施用卡拉胶相关的病理状态或疾病包括急性支气 管炎、慢性支气管炎、鼻炎、鼻窦炎、哮吼、急性细支气管炎、咽炎、扁桃体炎、喉炎、气管炎、 哮喘和肺炎。 卡拉胶尤其适于局部施用以治疗皮肤或粘膜炎症。根据本发明的可用于对皮肤 或粘膜局部施用的卡拉胶的分子量为约15， OOODa 5， 000， OOODa，优选平均分子量超过 50， OOODa的组分，尤其是特别优选平均分子量为50， OOODa 3， 000， OOODa的组分。
也可以进行全身施用(例如，胃肠外施用或口服施用)，尤其是使用平均分子量为 15， OOODa 100， OOODa的较低分子量聚合物进行。 调节用于胃肠外应用的本发明的药物组合物可作为选自由皮肤洗剂、乳膏剂、软 膏剂、凝胶剂、包括吸入用粉末的粉末剂、喷雾剂、泡沫剂、液体滴剂或含漱液组成的组的制 剂而提供。然而，卡拉胶制剂也可以经调节例如作为液体溶液或如干粉剂、片剂、胶囊剂、糖 锭剂或任何其它可口服摄入的盖伦形式(galenic form)等半固体或固体制剂而用于口服 施用。用于粘膜施用的药物组合物包括鼻部喷雾剂或滴剂和本领域中已知的任何其它鼻部 药物输送体系(例如，US 6， 391， 452所公开的)。 当所述组合物用于局部应用并且为液体或半固体时，相对于所述组合物的总体 积，它通常在其即用形式(ready-for-use form)中包含的卡拉胶的量为0. 01重量％ 10 重量％、优选为0. 01重量％ 5重量％、最优选为0. 1重量％ 2重量％。当所述组合物 为固体时，相对于所述组合物的总重，它通常在其即用形式中包含的卡拉胶的量为0. 01重 量％ 10重量％、优选为0. 01重量％ 5重量％、最优选为0. 1重量％ 2重量％。
可用于本发明中的卡拉胶可以商购，但也可通过根据本领域已知的提取步骤从海 藻植物中提取而制备。 如果没有另外指明，本文所用术语"卡拉胶"是指t _卡拉胶或k _卡拉胶或两者 的混合物。 本发明的卡拉胶还可以为均聚物或杂聚物。卡拉胶均聚物由t -卡拉胶或k _卡
拉胶中仅一种的亚单元构成，而卡拉胶杂聚物包含两种所述卡拉胶的亚单元。 因而，卡拉胶的"混合物"也可指包含混合的不同卡拉胶亚单元的的物质的组合
物，所述物质作为所述组合物中存在的至少一种杂聚物卡拉胶的一部分。 通常，本发明的抗病毒药物组合物基本不含除t -卡拉胶和K-卡拉胶以外的其
8它卡拉胶，即，相对于所述组合物中存在的所有卡拉胶的干重，所述组合物包含的i _卡拉 胶或k -卡拉胶或两者的混合物的量为80重量％以上、优选为90重量％以上且尤其可高 达99重量％以上。 对于某些应用而言，所述组合物基本仅由i -卡拉胶组成，而对于其它应用而言，
相对于所述组合物中存在的所有卡拉胶的总干重，所述组合物可以包含干重超过50重
量％、优选超过70重量％且尤其是可高达超过95重量％的t -卡拉胶。 对另一些应用而言，可能有用的是，相对于所述组合物中存在的所有卡拉胶的总
干重，所述组合物包含干重超过50重量％、优选超过70重量％且尤其是可高达超过95重
量％的k-卡拉胶。 当所述组合物包含至少一种杂聚卡拉胶时，上文给出的数值涉及各卡拉胶亚单元 的百分比。 本发明的抗病毒卡拉胶组合物还可以包含至少一种适合且允许用于医学应用的 药学可接受载体和/或添加剂。 所述载体可以为稀释剂(例如，水、盐水、可选的磷酸盐缓冲的盐水(PBS))、赋形 剂或另一种有助于施用所述组合物的载剂。当所述组合物为固体、半固体或流体时，载体组 和添加剂组可以分别包含但不限于Si02、 1102、如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶、 明胶、淀粉、乳糖、单水合乳糖、海藻酸或玉米淀粉等粘合剂；如硬脂酸镁或十二烷基硫酸钠 等润滑剂或表面活性剂；例如胶体二氧化硅等助流剂；如蔗糖或糖精等甜味剂。
其它添加剂可以选自由生理可接受防腐剂、如氯化钠、氯化钾、氯化锂或氯化铵等
药学可接受碱金属盐、如柠檬酸、乙酸、富马酸、盐酸、马来酸、硝酸、磷酸、丙酸、硫酸和酒石 酸以及所述酸的组合等缓冲剂或pH调节剂组成的组。 对于许多应用而言，有用的是所述组合物包含氯化钠作为添加剂。 通常，药学可接受盐以不超过1%、优选不超过0.6% (w/v)的量存在于组合物中。 在本发明的组合物中，卡拉胶自身也可作为盐、优选作为钠盐存在。 优选将用于预防性或治疗性医学应用的本组合物作为消毒的、无菌、无病原、无热
原和/或无过敏原的制剂而提供。 据发现，即使以极高剂量使用时，卡拉胶在口服施用或皮肤施用后或在吸入后也
无毒性。因此，食品和药物管理局(FDA)将其划分为"一般视为安全"(GRAS)。 卡拉胶、特别是t -卡拉胶还能作为可有效抵抗正粘病毒和副粘病毒感染的抗病
毒剂在各种医药产品中与作为主要活性成分的其它生理活性化合物或药物共同使用，其
中，卡拉胶的作用包括其作为载体或作为如乳化剂或粘度调节剂等添加剂的应用。卡拉胶
与大多数药物制剂相容而不会造成不利的副作用。 因此，在本发明的范围之内可提供这样的药物组合物其包含卡拉胶作为药剂的 添加剂、更具体地作为抗病毒的、特别是抗副粘病毒或抗正粘病毒的佐剂；所述药剂通常被 用于预防或治疗感染性和/或炎性疾病、过敏和/或免疫系统受损或受抑制的状况。特别 地，将卡拉胶、优选i -卡拉胶作为抗流感病毒有效佐剂与药剂组合使用是在本发明的范 围之内，所述药剂可用于预防或治疗感染性和/或炎性疾病、过敏和/或免疫系统受损或受 抑制的状况。 据观察，卡拉胶也可以具有免疫调节活性，特别是免疫系统增强活性。然而，尚未明确该活性是与所述物质的生理干扰直接相关还是通过其抗病毒效力而间接相关。
本发明的组合物通常会被配制为用于局部或粘膜应用的制剂，所述制剂优选选自 喷雾剂、特别是鼻部喷雾剂、粉末剂、滴剂、含漱液、泡沫剂、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、洗剂和 锭剂等。然而，也可将本发明的药物组合物涂布在卫生或清洁物品的固体表面，例如，包括 但不限于鼻部纸巾或纸和手帕的常用于口部和/或鼻部区域的面部卫生或清洁物品。
更具体而言，可以将所述药物组合物应用于(例如，类似消毒剂地喷雾于)手套、 包括鼻部纸巾或纸的卫生纸巾或纸上，以便至少在某种程度上发挥杀病毒剂的效果，由此 有助于减少个体通过受污染的指尖而引起的反复自我感染并且还减少彼此密切接触(例 如，手与手的接触)的不同个体之间的病毒散播。 以基于卡拉胶的药物组合物涂布、浸渍或浸泡的其它物品还包括棉签、防尘罩或 者清洁或医用面罩。甚至还能将唇膏配制来包含抗病毒有效量的卡拉胶。这些卫生或清洁 物品可以被预防性使用或用于抗病毒感染的治疗并且可以辅助避免或降低感染风险。
本发明的一个目的是提供基于卡拉胶的抗病毒组合物以用于预防或治疗特别易 受正粘病毒或副粘病毒感染或者受所述病毒感染风险较高的个体，所述个体包括选自由 COPD患者、哮喘患者、患有过敏症的个体或者患有免疫系统、心血管系统或肺系统受损的个 体和移植患者组成的组的高风险患者。 根据本发明，还可以将卡拉胶作为抗病毒活性成分用于制造用于预防或治疗由呼 吸道病毒感染引起或与之相关的病理状态或疾病的药物组合物，所述呼吸道病毒选自由腺 病毒和冠状病毒组成的组，所述腺病毒优选为B型腺病毒(Ad50)。 使用t -卡拉胶是唯一或主要的活性抗病毒成分的组合物可最佳地治疗腺病毒 和冠状病毒感染。 实验性试验进一步证实，褐藻糖胶也可有用地在制造用于有效预防或治疗由呼吸 道病毒感染引起或与之相关的病理状态或疾病的药物组合物中用作抗病毒活性成分，所述 呼吸道病毒选自由正粘病毒和副粘病毒组成的组。在该情形中，所述正粘病毒通常为甲型 或乙型流感病毒，而所述副粘病毒通常为RSV。 基于褐藻糖胶的组合物在其用于局部或口服施用的即用形式中可以包含的褐藻 糖胶的量为0.01% 10%、优选为0.01% 5%、最优选为0.01% 2%，所述百分比根据
所述组合物是液体或半固体(重量/体积百分比)还是固体(重量/重量百分比)而为重 量/体积比(w/v)或重量/重量比(w/w)。所述组合物还可以包含至少一种药学可接受载 体和/或添加剂以及其它生理活性物质或药物。例如，常常将氯化钠用作添加剂。 一般而 言，药学可接受盐可以以不超过1 % 、优选不超过0. 6%的量存在于褐藻糖胶组合物中。


图1显示了 t -卡拉胶在最终浓度为0. 1 ii g/ml 100 y g/ml的不同剂量下减少 MDCK细胞中的甲型流感/智利/1/93 H1N1病毒的噬斑形成的效力。 纵坐标=相对于用没有t _卡拉胶的甲型流感/智利/1/93 H1N1病毒悬浮液感 染的MDCK细胞的噬斑形成(设为100%)，用含有不同浓度的t-卡拉胶的甲型流感/智 利/1/93 H1N1病毒悬浮液感染MDCK细胞后的噬斑形成的百分比；横坐标=病毒悬浮液中 以Pg/ml计的i-卡拉胶的不同终浓度。
图2显示了 i -卡拉胶在终浓度为75 ii g/ml 300 ii g/ml的不同剂量下对减少 MDCK细胞中的甲型流感/Aichi2/68 H3N2病毒的噬斑形成的效力。 纵坐标=相对于用没有i _卡拉胶的甲型流感/^1(*12/68 H3N2病毒悬浮液感 染的MDCK细胞的噬斑形成(设为100% )，用含有不同浓度的t _卡拉胶的甲型流感/ Aichi2/68 H3N2病毒悬浮液感染MDCK细胞后的噬斑形成的百分比；横坐标=病毒悬浮液 中以Pg/ml计的i-卡拉胶的不同终浓度。 图3显示了 t -卡拉胶在终浓度为0. 1 ii g/ml 100ii g/ml的不同剂量下减少 H印-2细胞中副流感病毒3的噬斑形成的效力。 纵坐标=相对于用没有t _卡拉胶的副流感病毒3悬浮液感染的H印-2细胞的噬 斑形成(设为100% )，用含有不同浓度的i _卡拉胶的副流感病毒3悬浮液感染H印-2细 胞后的噬斑形成百分比；横坐标=病毒悬浮液中以Pg/ml计的t-卡拉胶的不同终浓度。
图4显示了 i -卡拉胶预处理在终浓度为13 ii g/ml 400 ii g/ml的不同剂量下 减少HeLa细胞中副流感病毒3的噬斑形成的效力。 纵坐标=相对于未经处理的HeLa细胞(没有进行t _卡拉胶预温育)的噬斑形 成(设为100% )，用副流感病毒3悬浮液感染经预处理的HeLa细胞(用t _卡拉胶预温 育3h ;随后除去该聚合物)后的噬斑形成百分比；横坐标=预温育培养基中以P g/ml计的 i _卡拉胶的不同终浓度。C =用聚合物羧甲基纤维素预温育的细胞(负对照)。
图5显示了猫肾(CK)细胞中冠状病毒引起细胞死亡的抑制实验结果。
纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染后未被感染细胞的百分比；横 坐标=病毒悬浮液中(图5A)或预温育培养基中(图5B)以ii g/ml计的卡拉胶的不同终 浓度；图5A =在t -卡拉胶、k -卡拉胶或A -卡拉胶存在下以猫冠状病毒FIP感染的细 胞；图5B =用t -卡拉胶、k -卡拉胶或A -卡拉胶预温育3h后随即用PBS洗涤3次并在 不存在所述聚合物时用猫冠状病毒FIP感染的细胞。
图6显示了 HeLa细胞中HRV8引起细胞死亡的抑制实验结果。
纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染后未被感染细胞的百分比；横 坐标=病毒悬浮液中(图6A)或预温育培养基中(图6B)以ii g/ml计的t -卡拉胶的不 同终浓度；图6A二在t -卡拉胶的存在下以S型人鼻病毒(HRV8)感染的细胞；图6B =用 i _卡拉胶预温育3h后随即用PBS洗涤3次并在不存在t -卡拉胶时用HRV8感染的细胞。
图7显示了在用PBS连续洗涤后FITC标记的t -卡拉胶与HeLa细胞的结合。
纵坐标=计算出的t -卡拉胶的Pg/ml(使用标准曲线从荧光单位转化为yg/ ml);横坐标二用PBS洗涤细胞的步骤；O二将含有FITC标记的t-卡拉胶的上清液从细胞 除去；1 =使用PBS的细胞的第1洗涤步骤；2 =使用PBS的细胞的第2洗涤步骤；3 =使用 PBS的细胞的第3洗涤步骤。 图8显示了 Vero细胞中RSV引起细胞死亡的抑制实验结果。 纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染后未被感染细胞的百分比；横 坐标=病毒悬浮液中(深色柱形)或预温育培养基中(浅色柱形)以Pg/ml计的t _卡 拉胶的不同终浓度；深色柱形=在i _卡拉胶的存在下以RSV感染的细胞；浅色柱形=用 i _卡拉胶预温育3h后随即用PBS洗涤3次并在不存在t _卡拉胶时用RSV感染的细胞。
图9显示了 HN印细胞中RSV引起细胞死亡的抑制实验结果。
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纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染和5天的温育后未被感染细胞 的百分比；横坐标=以lOOyg/ml的终浓度向温育培养基中添加t -卡拉胶的时间点(感 染后的小时数)。 图10显示了 HN印细胞中RSV引起细胞死亡的抑制实验结果。 纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染和5天的温育后未被感染细胞
的百分比；横坐标=病毒悬浮液中以P g/ml计的t _卡拉胶的不同终浓度。 图11显示了 HEp-2细胞中RSV引起细胞死亡的抑制实验结果。 纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染和6天在37°C的温育后未被感
染细胞的百分比；横坐标=病毒悬浮液中以Pg/ml计的t-卡拉胶、K-卡拉胶或A-卡
拉胶的不同终浓度。 图12显示了 HN印细胞中RSV引起细胞死亡的抑制实验结果。 纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染后的未被感染细胞的百分比；
横坐标=病毒悬浮液中以P g/ml计的t -卡拉胶(深色柱形)和褐藻糖胶(浅色柱形)
的不同终浓度。 图13显示了 HN印细胞中副流感病毒3引起细胞死亡的抑制实验结果。 纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染后的未被感染细胞的百分比；
横坐标=病毒悬浮液中以P g/ml计的t -卡拉胶、k -卡拉胶或A -卡拉胶或者褐藻糖胶
的不同终浓度。 图14显示了 HN印细胞中流感病毒H3N2(FLU)引起细胞死亡的抑制实验结果。
纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染后的未被感染细胞的百分比； 横坐标=病毒悬浮液中以P g/ml计的t -卡拉胶、k -卡拉胶或A -卡拉胶或者褐藻糖胶 的不同终浓度。 图15显示了 t-卡拉胶、K-卡拉胶、A-卡拉胶和褐藻糖胶在400iig/ml和 44 ii g/ml的剂量下减少MDCK细胞中甲型流感H5N1病毒的噬斑形成的效力。
纵坐标二相对于用没有聚合物的流感H5N1病毒悬浮液感染的MDCK细胞的噬斑形 成(设为100% )，用含有不同浓度的t _卡拉胶、k _卡拉胶、A -卡拉胶或褐藻糖胶的禽 流感H5N1病毒悬浮液感染MDCK细胞后噬斑形成的百分比；横坐标=病毒悬浮液中以y g/ ml计的t -卡拉胶、k -卡拉胶、A -卡拉胶或褐藻糖胶的不同终浓度。
图16显示了 HN印细胞中50型腺病毒(Ad50)引起细胞死亡的抑制实验结果。
纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染后未被感染细胞的百分比；横 坐标=病毒悬浮液中以Pg/ml计的i-卡拉胶的不同终浓度。
图17显示了 HN印细胞中Ad50引起细胞死亡的抑制实验结果。
纵坐标=相对于未接受感染的对照细胞，进行感染后未被感染细胞的百分比；横 坐标=病毒悬浮液中(深色柱形)或预温育培养基中(浅色柱形)以Pg/ml计的t _卡 拉胶的不同终浓度；深色柱形=在i _卡拉胶的存在下以Ad50感染的细胞；浅色柱形=用 i _卡拉胶预温育3h后随即用PBS洗涤3次并在不存在t _卡拉胶时用Ad50感染的细胞。
具体实施例方式
为了使本文所述的发明可以被更全面地理解，对以下实施例进行了阐述。所述实施例仅出于说明性目的而不应被视为在任何方面对本发明进行限制。此外，还可理解，本发 明也应包含所确切公开的实施方式在本领域普通技术人员可以想象的程度的变化。
实施例 实施例1 :不同浓度的t _卡拉胶对MDCK细胞中甲型流感病毒噬斑形成的效果
将含有60pfu 80pfu的甲型流感病毒/智利/1/93 H1N1的病毒悬浮液与i -卡 拉胶储备液混合而达到0. lii g/ml、lii g/ml、10 ii g/ml、25 ii g/ml、50 ii g/ml或100 y g/ml 的终浓度。在34t:用病毒悬浮液感染6孔板中的犬肾细胞系MDCK的汇合单层60分钟。除 去感染接种物并用PBS洗涤细胞，并且添加含有0. 6%琼脂糖的琼脂糖覆盖层。将板在36°C 的5% C02的空气的潮湿氛围中进行温育。感染后48h 60h除去琼脂糖覆盖层，用结晶紫 染色剂将细胞染色并对可见噬斑进行计数。对于每个i -卡拉胶浓度，相对于受感染的对 照(未经i -卡拉胶处理)，确定噬斑形成百分比。 如图l所示，发现i _卡拉胶以剂量依赖方式抑制100(细胞中甲型流感/智利 /1/93H1N1病毒的噬斑形成。在50 ii g/ml的t -卡拉胶浓度实现了噬斑数50%的减少 (IC50)。 实施例2 :不同浓度的t _卡拉胶对MDCK细胞中甲型流感病毒噬斑形成的效果
将含有60pfu 80pfu的甲型流感病毒/Aichi2/68H3N2的病毒悬浮液与i _卡 拉胶储备液混合而达到75 ii g/ml、 150 ii g/ml或300 y g/ml的终浓度。在34。C用病毒悬浮 液感染6孔板中的犬肾细胞系MDCK的汇合单层60分钟。除去感染接种物并用PBS洗涤细 胞，并且添加含有0. 6%琼脂糖的琼脂糖覆盖层。将板在37t:的5% C02的空气的潮湿氛围 中进行温育。感染后48h 60h除去琼脂糖覆盖层，用结晶紫染色剂将细胞染色并对可见 噬斑进行计数。对于每个i -卡拉胶浓度，相对于受感染的对照(不含i -卡拉胶)，确定 噬斑形成百分比。 如图2所示，发现t -卡拉胶以剂量依赖方式抑制MDCK细胞中甲型流感/ Aichi/2/68 H3N2病毒的噬斑形成。 实施例3 :不同浓度的t -卡拉胶对H印-2细胞中副流感病毒3噬斑形成的效果
将含有60pfu 80pfu的副流感病毒3的病毒悬浮液与i _卡拉胶储备液混合而 达到0. 1 ii g/ml、l ii g/ml 、10 ii g/ml 、25 y g/ml 、50 y g/ml和100 y g/ml的最终浓度。将混 合物在34t:温育lh。在34t:用病毒悬浮液感染6孔板中的H印-2细胞的汇合单层60分 钟。除去感染接种物并用PBS洗涤细胞，并且添加含有0.6X琼脂糖的琼脂糖覆盖层。将 托盘在潮湿的5% C02氛围中进行温育。感染后48h 60h除去琼脂糖覆盖层，用结晶紫染 色剂将细胞染色并对可见噬斑进行计数。对于每个i -卡拉胶浓度，相对于受感染的对照 (不含i -卡拉胶)板，确定噬斑形成百分比。 如图3所示，发现t _卡拉胶以剂量依赖方式抑制11印-2细胞中副流感病毒3的
噬斑形成。在10 ii g/ml的t -卡拉胶浓度实现了噬斑数50%的减少(IC50)。 实施例4 :以t -卡拉胶进行的预温育对HeLa细胞中副流感病毒3噬斑形成的效
果 将HeLa细胞的汇合单层与浓度为13 y g/ml、40 y g/ml、 133 y g/ml和400 y g/ml 的i-卡拉胶温育3小时。除去含有t _卡拉胶的上清液，用？85洗涤细胞3次，其后如 实施例3所述用副流感病毒3感染细胞，但不向病毒悬浮液中添加t-卡拉胶。对于每个
13i -卡拉胶浓度，相对于受感染的对照(未经i -卡拉胶预处理)，确定噬斑形成百分比。
如图4所示，发现在以浓度为400 ii g/ml和133 y g/ml的t -卡拉胶与细胞预温 育3小时的时候，尽管在感染时和随后在37t:的整个温育期过程中没有t -卡拉胶存在，
i _卡拉胶也使副流感病毒3的噬斑形成得到了抑制。该结果表明，t -卡拉胶对宿主细胞 的表面受体进行化学修饰或结构性修饰，从而使得即使在不存在修饰剂卡拉胶时，经受体 介导的副流感病毒3与宿主细胞的结合仍受到阻碍或阻止。这也证实了 t -卡拉胶的强预 防性功效。 实施例5 :不同卡拉胶对真核细胞的预处理对于抑制冠状病毒介导的细胞死亡的 效果 在浓度为4 ii g/ml 、40 ii g/ml和400 ii g/ml的i -卡拉胶、k -卡拉胶或A -卡拉 胶的存在下，用moi (感染复数)为0. 1的猫冠状病毒FIPV感染近汇合CK细胞(见图5A)。 相比之下，将浓度为4 ii g/ml、40 ii g/ml和400 y g/ml的i -卡拉胶、A -卡拉胶或k -卡 拉胶与近汇合CK细胞温育3小时。除去含有卡拉胶的上清液并用PBS洗涤细胞3次，然后 在不存在所述聚合物的情况下用猫冠状病毒FIP(moi = 0. 1)感染细胞(见图5B)。对于每 种卡拉胶和每个浓度，确定活细胞相对于未接受感染的对照的百分比。
如图5A所示，所有3类卡拉胶在400 y g/ml的最高浓度均抑制了 CK细胞的冠状 病毒介导的细胞死亡。在浓度为4yg/ml时t -卡拉胶仍显示出显著的抑制，而K-卡拉 胶和入-卡拉胶在该浓度没有效果。从图5B可以推断，与通过糖受体进入细胞的病毒(见 前述实施例)相反，冠状病毒感染似乎不会因宿主细胞表面的冠状病毒特异性受体受卡拉 胶的化学修饰或结构性修饰而被抑制，这是因为即使在400 g/ml的最高实验卡拉胶浓度 和3小时的预温育期时，也无法使对宿主细胞的保护增加超过35%抑制的水平。卡拉胶对 宿主细胞的预处理也没有显著改善抵抗冠状病毒感染的细胞保护。所述结果表明，为了获 得抵抗冠状病毒感染的显著保护，抗病毒活性剂(即卡拉胶)必须在感染时存在，即在病毒 与宿主细胞之间即将发生相互作用时存在。 实施例6 : t -卡拉胶对真核细胞的预处理对于抑制HRV8介导的细胞死亡的效果
在浓度为4ii g/ml、40ii g/ml和400ii g/ml的i _卡拉胶的存在下，用8型人鼻 病毒(HRV8 ;moi = 0. 1)感染近汇合HeLa细胞(见图6A)。相比之下，将浓度为4 y g/ml、 40 ii g/ml和400 ii g/ml的t -卡拉胶与近汇合HeLa细胞在感染之前温育3小时。除去含 有i _卡拉胶的上清液并用PBS洗涤细胞3次，然后在不存在所述聚合物的情况下用HRV8 感染细胞(见图6B)。对于每个t -卡拉胶浓度，确定活细胞相对于未接受感染的对照的百 分比。 如图6A所示，t -卡拉胶在所有浓度下均抑制HRV8介导的细胞死亡。从图6B可 以推断，与通过糖受体进入细胞的病毒相反，即使在400 g/ml且细胞与t -卡拉胶预温育 3小时，HRV8介导的细胞死亡也未受到超过5X的抑制。该结果与此前的发现(数据未显 示)相一致，并且表明对于HRV8而言，如果在感染时没有卡拉胶存在，则卡拉胶与靶标细胞 的预温育不会显著保护靶标细胞不受感染。该结果表明，HRV8的受体(LDL受体)没有经 i -卡拉胶处理而被修饰或掩蔽。 实施例7 :通过用PBS洗涤细胞将t _卡拉胶从HeLa细胞定量去除将HeLa细胞与浓度为400 y g/ml、 133 y g/ml、4 y g/ml和0. 4 y g/ml的FITC标记的i-卡拉胶温育10分钟，然后除去上清液并用PBS洗涤细胞3次。在除去含有FITC标 记的i -卡拉胶的上清液之后以及在每次洗涤步骤之后，用荧光检测读取器(BMG-Omega) 确定残留的FITC标记的卡拉胶的量。使用标准曲线将荧光单位转化为Pg/ml卡拉胶的浓 度值。 如图7所示，通过用PBS将细胞洗涤至少3次，FITC标记的t -卡拉胶被从HeLa 细胞中定量除去(>95%)。该结果证实，卡拉胶不与细胞表面共价结合。通过第二实验 组确证了该结果，在所述第二实验组中，使用相同检测方法并将温育期从10分钟延长至3 小时。其结果因而支持此处和相关实施例中所得出的结论，即卡拉胶引起了对参与结合病 毒粒子的靶标细胞表面上的糖受体的修饰，所述修饰在将所述聚合物从靶标细胞表面除去 之后仍然存在。 实施例8 : t -卡拉胶对真核细胞的预处理对于抑制RSV介导的细胞死亡的效果
在浓度为0. 4ii g/ml、4ii g/ml和40 y g/ml的i _卡拉胶的存在下，用RSV (moi = 0. 1)感染近汇合Vero细胞。相比之下，将浓度为0. 4iig/ml、4iig/ml和40iig/ml的i -卡 拉胶与近汇合Vero细胞温育3小时。除去含有t -卡拉胶的上清液并用PBS洗涤细胞3 次，并且在不存在卡拉胶的情况下用RSV (moi = 0. 1)感染细胞。对于每个卡拉胶浓度，确 定活细胞相对于未接受感染的对照的百分比。 如图8所示，即使在感染时和感染期间不存在t -卡拉胶，该聚合物也可在所有浓 度下抑制RSV介导的细胞死亡。已知RSV通过存在于上皮细胞表面的糖分子硫酸类肝素而 附着于细胞。该结果表明，该受体被i -卡拉胶修饰，从而阻断RSV对细胞表面的附着和随 后的病毒复制。 实施例9 :在感染后不同时间点用t _卡拉胶处理真核细胞对于抑制HN印细胞中 RSV介导的细胞死亡的效果 用RSV (moi = 0. 1)感染近汇合的HN印细胞。将i -卡拉胶以40 ii g/ml的终浓 度在如图9所示的感染后不同时间点(感染后0h、8h、24h、32h、48h、56h和72h)添加，并对 各时间点确定活HN印细胞相对于未接受感染的对照的百分比。 如图9所示，即使仅在感染后24小时添加t _卡拉胶，该聚合物也在浓度为
100 g/ml时显著抑制了 RSV介导的细胞死亡。该结果表明，不仅可将t -卡拉胶预防性使
用而且其还可以在病毒感染的早期施用时在治疗过程中发挥抗病毒功效。 实施例10 :采用t -卡拉胶的预防性处理对于抑制HN印细胞中RSV介导的细胞
死亡的效果 在浓度为400 li g/ml、133ii g/ml、44ii g/ml、15ii g/ml、5ii g/ml、2ii g/ml禾口 1 u g/ ml的t -卡拉胶的存在下，用RSV (moi = 0. 1)感染近汇合HN印细胞。对于每个t -卡拉 胶浓度，确定相对于未接受感染的对照的活HN印细胞的百分比。 如图IO所示，在感染期间存在t -卡拉胶时，该聚合物即使在浓度低至IP g/ml 时仍显著抑制了RSV介导的细胞死亡。该结果表明，可以将t -卡拉胶有效用于预防性干 预策略。 实施例11 :不同卡拉胶对真核细胞的处理对于抑制HEp-2细胞中RSV介导的细胞 死亡的效果在浓度为0. 01 ii g/ml、0. 1 ii g/ml、l ii g/ml、10ii g/ml禾P 100 ii g/ml的i-卡拉
15胶、k -卡拉胶或A -卡拉胶的存在下，用RSV A2病毒(moi = 0. 001)感染6孔板中的HEp-2 细胞。对于每种卡拉胶和每个浓度，确定相对于未接受感染的对照的活细胞的百分比。
如图ll所示，所有3类卡拉胶均抑制HEp-2细胞中RSV介导的细胞死亡，而t -卡 拉胶显示出最强的效果。 实施例12 : t -卡拉胶和褐藻糖胶对真核细胞的处理对于RSV介导的细胞死亡的 抑制的效果比较 在浓度为400u g/ml、133u g/ml、44u g/ml、15u g/ml、4u g/ml、l. 3u g/ml禾口 0. 4ii g/ml的t -卡拉胶和褐藻糖胶的存在下，用RSV (moi = 0. 1)感染近汇合HN印细胞。 对于各个i -卡拉胶和各个褐藻糖胶浓度，确定相对于未接受感染的对照的活HN印细胞的 百分比。 如图12所示，当感染期间存在褐藻糖胶时，该聚合物在浓度为0. 4i! g/ml时显著 抑制HN印细胞中RSV介导的细胞死亡。因此，褐藻糖胶是用于开发用于预防和治疗RSV感 染的产品的令人感兴趣的候选物。 实施例13 :采用不同的卡拉胶和褐藻糖胶处理真核细胞对于抑制副流感病毒3介 导的细胞死亡的效果 在浓度为400 u g/ml、133. 3u g/ml、44. 4u g/ml、14. 8u g/ml、4u g/ml、l. 3u g/ml 和0. 4 g/ml的t -卡拉胶、k -卡拉胶、A -卡拉胶或褐藻糖胶的存在下，用3型副流感病 毒感染近汇合HN印细胞。对于每种聚合物和每个聚合物浓度，确定相对于未接受感染的对 照的活的(因而未受感染的)HN印细胞的百分比。 如图13所示，所有3类卡拉胶均抑制HN印细胞中副流感病毒3介导的细胞死亡， 而i -卡拉胶显示出最强的效果。褐藻糖胶也以与k-卡拉胶和A-卡拉胶的抑制效果相 当的程度抑制HN印细胞中副流感病毒3介导的细胞死亡。 实施例14 :采用不同卡拉胶和褐藻糖胶处理真核细胞对于抑制流感病毒H3N2介 导的细胞死亡的效果 在浓度为400 u g/ml、133. 3u g/ml、44. 4 u g/ml、14. 8 u g/ml、4 u g/ml、l. 3u g/ml 和0. 4 ii g/ml的t -卡拉胶、k -卡拉胶、A -卡拉胶和褐藻糖胶的存在下，用流感病毒H3N2 感染近汇合的HN印细胞。对于每种聚合物和每个聚合物浓度，确定相对于未接受感染的对 照的活HN印细胞的百分比。 如图14所示，所有3类卡拉胶均抑制HN印细胞中流感病毒H3N2介导的细胞死亡。 另外，发现褐藻糖胶以与i _卡拉胶相当的程度抑制丽印细胞中流感病毒113^介导的细 胞死亡。 实施例15 :不同卡拉胶和褐藻糖胶对于MDCK细胞中禽流感病毒H5N1的噬斑形成 的效果 将含有60pfu 80pfu的禽流感病毒H5N1的病毒悬浮液与i _卡拉胶、k -卡拉 胶、A -卡拉胶或褐藻糖胶的聚合物储备液混合而达到400 g/ml或44. 4 g/ml的聚合物 终浓度。在34t:用病毒悬浮液感染6孔板中的犬肾细胞系MDCK的汇合单层60分钟。除去 感染接种物并用PBS洗涤细胞，并且添加含有0. 6%琼脂糖的琼脂糖覆盖层。在36t:将板 在5% C02的空气的潮湿氛围中进行温育。感染后48h 60h除去琼脂糖覆盖层，用结晶紫 染色剂将细胞染色并对可见噬斑进行计数。对于每种聚合物和每个聚合物浓度，相对于受感染的对照(未经聚合物处理)，确定噬斑形成的百分比。 如图15所示，发现禽流感病毒H5N1的噬斑形成不受i _卡拉胶和A -卡拉胶以 及褐藻糖胶的影响。然而，k-卡拉胶以剂量依赖的方式抑制了MDCK细胞中禽流感病毒 H5N1的噬斑形成。由于禽流感病毒优选与带a 2-3键的唾液酸残基结合，因而所述结果表 明，k -卡拉胶可能优选修饰这种具有2-3键的唾液酸残基。 实施例16 : t -卡拉胶对真核细胞的预防性处理对于抑制B型腺病毒(Ad50)介导 的细胞死亡的效果 在浓度为400 u g/ml、133. 3u g/ml、44. 4u g/ml、14. 8u g/ml、4u g/ml、l. 3u g/ml 和0. 4 ii g/ml的t -卡拉胶存在下，用Ad50感染近汇合HN印细胞。对于每个t -卡拉胶 浓度，确定相对于未接受感染的对照的活HN印细胞的百分比。 如图16所示，当感染时和感染期间存在t -卡拉胶时，该聚合物即使在浓度低至 g/ml时仍可抑制Ad50介导的细胞死亡。该结果表明，可以将i-卡拉胶用于抵抗B亚 型腺病毒(例如，Ad50)的有效预防干预策略。然而，当在如上所述的实验组中测试来自亚 型A、 C和D的其它腺病毒时，没有检测到t _卡拉胶的显著效果(数据未显示)。
实施例17 : t -卡拉胶对真核细胞的预防性处理对于抑制八(150介导的细胞死亡的 效果的比较 在浓度为400 ii g/ml、40 y g/ml和4 y g/ml的i -卡拉胶的存在下，用Ad50感染 近汇合HN印细胞。相比之下，将近汇合HN印细胞与浓度为400ii g/ml、40ii g/l和4ii g/ml 的i _卡拉胶在感染之前进行3小时温育。除去含有t -卡拉胶的上清液并用PBS洗涤细 胞3次，并且在不存在卡拉胶的情况下用Ad50感染细胞。对于每个t-卡拉胶浓度，确定 相对于未接受感染的对照的活HN印细胞的百分比。 如图17所示，在感染时和所观察的感染期过程中存在和不存在t-卡拉胶时， i _卡拉胶均在浓度为400 ii g/ml和40 ii g/ml时显著抑制Ad50介导的细胞死亡。这些数 据表明，i -卡拉胶修饰B亚型腺病毒的细胞表面受体(已知该受体为糖受体)，而其它亚 型的腺病毒可能通过不同的受体而进入细胞。
权利要求
一种硫酸多糖，所述硫酸多糖选自由ι-卡拉胶、κ-卡拉胶和褐藻糖胶组成的组并且被作为用于预防或治疗由呼吸道病毒感染引起或与所述感染相关的症状、病况或疾病的药物组合物或药剂中的抗病毒活性成分而应用，所述呼吸道病毒选自由正粘病毒、副粘病毒、冠状病毒和腺病毒组成的组。
2. 如权利要求1所述而应用的硫酸多糖，其中，所述呼吸道病毒是通过受体介导的对宿主细胞的附着而进入所述细胞的病毒，所述受体包含一个或多个糖残基，优选唾液酸或硫酸类肝素残基。
3. 如权利要求2所述而应用的硫酸多糖，其中，所述病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒。
4. 如权利要求2或3所述而应用的硫酸多糖，其中，所述病毒是通过细胞表面受体与所述宿主细胞结合的人甲型流感病毒或人乙型流感病毒，所述细胞表面受体包含具有a 2-6键的唾液酸残基。
5. 如权利要求3或4所述而应用的硫酸多糖，其中，所述硫酸多糖主要或仅仅包含i -卡拉胶或褐藻糖胶。
6. 如权利要求2或3所述的硫酸多糖，其中，所述甲型流感病毒是通过细胞表面受体与宿主细胞结合的甲型禽流感病毒，所述细胞表面受体包含具有a2-3键的唾液酸残基，并且其中所述硫酸多糖主要或仅仅包含K-卡拉胶。
7. 如权利要求1或2所述而应用的硫酸多糖，其中，所述副粘病毒选自由l型人副流感病毒(HPV) 、2型HPV、3型HPV、4型HPV和RSV组成的组，并且其中优选所述硫酸多糖主要或仅仅包含i-卡拉胶或褐藻糖胶。
8. 如权利要求7所述而应用的硫酸多糖，其中，所述副粘病毒是RSV，且所述硫酸多糖主要或仅仅包含i-卡拉胶或褐藻糖胶。
9. 如权利要求1或2所述而应用的硫酸多糖，其中，所述病理状态或疾病选自由急性支气管炎、慢性支气管炎、鼻炎、鼻窦炎、哮吼、急性细支气管炎、咽炎、扁桃体炎、喉炎、气管炎、哮喘和肺炎组成的组。
10. 如权利要求1或2所述而应用的硫酸多糖，其中，所述症状选自由发烧、疼痛、眩晕、战栗、出汗和脱水组成的组。
11. 如权利要求1 10中任一项所述的应用，其中，所述抗病毒药物组合物或药剂适用于局部皮肤或粘膜应用并且优选被制备为皮肤洗剂、乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、包括吸入用粉末的粉末剂、喷雾剂、泡沫剂、液体滴剂或含漱液。
12. 如权利要求1 10中任一项所述的应用，其中，所述抗病毒药物组合物或药剂适用于口服施用且被优选制备为液体溶液或如干粉剂、片剂、胶囊剂或糖锭剂等半固体或固体制剂。
13. 如权利要求11或12所述的应用，其中，所述组合物是液体或半固体，并且相对于所述制剂的总体积，所述组合物作为即用制剂所包含的卡拉胶的量为0. 01重量％ 10重量％、优选为0. 01重量％ 5重量％、最优选为0. 1重量％ 2重量％。
14. 如权利要求12所述的应用，其中，所述组合物是固体并且作为即用制剂所包含的卡拉胶的量为0. 01重量％ 10重量％、优选为0. 01重量％ 5重量％、最优选为0. 1重量％ 2重量％。
15. 如权利要求l所述的应用，其中，所述组合物包含t _卡拉胶、1^-卡拉胶或两者的混合物，且相对于所述组合物中存在的卡拉胶的总干重，i-卡拉胶、K-卡拉胶或两者的混合物的量为干重80%以上、优选90%以上且尤其是99%以上。
16. 如权利要求15所述的应用，其中，相对于所述组合物中存在的卡拉胶的总干重，所述组合物包含干重为50%以上、优选70%以上且尤其是95%以上的t -卡拉胶。
17. 如权利要求15所述的应用，其中，相对于所述组合物中存在的卡拉胶的总干重，所述组合物包含干重为50%以上、优选70%以上且尤其是95%以上的k -卡拉胶。
18. 如权利要求1 17中任一项所述的应用，其中，所述组合物还包含至少一种药学可接受载体和/或添加剂。
19. 如权利要求18所述的应用，其中，所述药学可接受添加剂包含药学可接受碱金属盐，优选氯盐、尤其是氯化钠或氯化钾。
20. 如权利要求19所述的应用，其中，所述药学可接受盐以1 %以下、优选为0. 6%以下的量存在于所述组合物中。
21. 如权利要求1 20中任一项所述的应用，其中，所述组合物通过所述卡拉胶的盐形式、优选通过钠盐形式包含一部分或全部所述卡拉胶。
22. 如权利要求1 21中任一项所述的应用，其中，所述组合物无菌且优选无热原和无过敏原。
23. 如权利要求1 22中任一项所述的应用，其中，通过涂布或浸渍而将所述组合物附着于卫生或清洁物品、特别是卫生或清洁手套、纸巾或纸、尤其是鼻部纸巾或纸、棉签、防尘罩或者清洁或医用面罩的固体表面。
24. 如权利要求1 22中任一项所述的应用，其中，所述组合物被加入唇膏中。
25. 如权利要求1 24中任一项所述的应用，其中，所述组合物还包含非卡拉胶非褐藻糖胶的生理活性化合物，所述化合物可选地作为主要活性成分。
26. 如权利要求25所述的应用，其中，卡拉胶或褐藻糖胶作为添加剂，特别是作为抗副粘病毒或抗正粘病毒的佐剂与一种或多种非卡拉胶的生理活性物质共同存在，所述非卡拉胶的生理活性物质通常被用于预防或治疗感染性和/或炎性疾病、过敏症和/或免疫系统受损或受抑制的状态。
27. 如权利要求1 26中任一项所述的应用，其中，所述病理状态或疾病存在于作为高风险患者的个体中，所述高风险患者选自由COPD患者、哮喘患者、患过敏症者、带有受损的免疫系统、心血管系统或肺系统的个体和移植术患者组成的组。
全文摘要
本发明提供了用于制造抗病毒药物组合物的ι-卡拉胶和/或κ-卡拉胶的应用，所述抗病毒药物组合物用于预防或治疗由呼吸道病毒感染引起或与该感染相关的病理状态或疾病，所述呼吸道病毒选自由正粘病毒、副粘病毒、腺病毒和冠状病毒组成的组。本发明还提供了用于制造抗病毒药物组合物的褐藻糖胶、特别是高分子量褐藻糖胶的应用，所述抗病毒药物组合物用于预防或治疗由呼吸道病毒感染引起或与该感染相关的病理状态或疾病，所述呼吸道病毒选自由正粘病毒和副粘病毒组成的组。
文档编号A61P31/16GK101784272SQ200880103946
公开日2010年7月21日 申请日期2008年8月22日 优先权日2007年8月24日
发明者伊娃·普里斯赫-格拉索尔, 安德里亚·格拉索尔 申请人:玛丽诺姆德生物技术公司