专利名称：1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗流感药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于药品领域，特别涉及l， 2, 3， 4， 6-五-0没食子酰基如0-葡萄糖作为制备抗流感病毒的药物、食品或化妆品的用途。
背景技术：
流感病毒是人类感染的最大的呼吸道传染病的病原体，由于流感病毒的 抗原变异能力极强且相当频繁，每年世界各国都有小范围流行，导致免疫力 弱的被感染的幼儿及老人死亡，目前仍然是人类面临的最大的公共卫生威胁 之一。近年来，高致病性禽流感H5N1的流行，不但对养鸡业带来毁灭性打 击，并能感染接触的人导致50%以上的高致死率，给我们敲响了警钟， 一旦 变异可以在人与人之间传播，将对人类的生存构成巨大威胁。正当人们对 H5N1禽流感警戒之时，今年4月从墨西哥开始流行的甲型H1N1流感现正在 世界范围传播，阻止此流感病毒在世界范围的大流行的药物研究已经迫在眉 睫。
对流感病毒的预防及治疗方法主要包括疫苗和抗流感药物治疗。疫苗只 对已知的流感病毒亚型有预防作用，而对于由抗原性漂移或抗原性转换所产 生的新型流感病毒保护率不高或无效。目前，临床上使用抗流感药物有离子 通道阻断剂和NA抑制剂两大类共四种药物，但是，由于现有药物在临床上 的广泛应用，使得流感病毒发生变异，对这些药物产生了不同程度的耐药性。 因此，寻找具有预防和治疗作用的新型抗流感药物就显得尤为重要和紧迫。 本研究从中国南方药用植物余甘子中提取的天然化合物中筛选出具有 高活性的抗流感病毒的化合物l， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖 (PGG)，此化合物对乙肝病毒(HBV)，呼吸合胞病毒(RSV)等病毒有抑制 活性。抗流感病毒活性属首次报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供了l, 2， 3， 4，6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖(1， 2， 3， 4， 6-penta-Ogalloyl-卩-D-glucose， 简称PGG)作为制备抗流感病毒的药物的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基 -b-D-葡萄糖作为制备抗流感病毒的药物、食品或化妆品的用途。
所述抗流感病毒的药物含有治疗有效量的1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子 酰基-b-D-葡萄糖和药学上可接受的载体。
所述流感病毒为甲型流感病毒。
所述食品为饮料、保健食品或食品添加剂。
所述抗流感病毒的药物制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、乳膏剂、口 服液、喷雾剂、针剂或粉针剂。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果本发明首次证明 1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖(PGG)不但有很强抗病毒活性， 感染12小时后还有明显治疗效果，更重要的是首次发现此化合物还具有灭 活病毒(virucidal)活性，且活性浓度在细胞毒性范围之外，其对病毒有直 接灭活作用，可以将接触到的病毒灭活使病毒失去感染能力或对已被病毒感 染的细胞起到治疗作用，因此，PGG不仅可以作为药物开发，还可以应用于 饮料等食品领域或者化妆品领域；另外，此化合物也可以在防治病毒的卫生 保健品中广泛应用。
图1是1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖的细胞毒性检测结果图。
图2是1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖抗流感病毒活性结果图。
图3是不同浓度1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖对流感病 毒复制的抑制作用图。
图4是MDCK细胞感染流感病毒48小时后细胞病变图(X200)，其 中A为非感染组，B为二甲基亚砜处理组，C为1.56Pg/mlPGG处理组，D 为3.13Pg/ml PGG处理组，E为6.25Mg/ml PGG处理组，F为12.50|Jg/ml PGG 处理组。
图5是1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖对流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用图。
图6是流感病毒感染细胞的细胞内病毒mRNA和蛋白表达图。 图7是不同时间点加药实验步骤图。 图8是不同时间点加药实验结果图。
图9是1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖灭活流感病毒活性
的实验图。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施 方式不限于此。
实验材料的说明如下
1、 MDCK细胞(狗肾细胞)，购于CELL BANK (细胞银行，理研生 物资源中心3-1-1 Koyadai ，筑波，茨城县305-0074 ，日本传真 +81-29-836-9130 /电子邮箱cellbank@brc.riken.jp);
2、 流感病毒Influenza A/WSN/33 (H1N1): A型流感病毒(Influenza A/WSN/33 (HINI))接种于10日龄的鸡胚尿囊腔内，35°<3培养2天后回收 尿囊液，于一80T保存备用；
3、 培养基
含体积百分比浓度为10% (v/v)的胎牛血清MEM培养基(含青霉素 100U/ml，链霉素100Mg/ml);
含体积百分比浓度为1% (v/v)的维他命的MEM培养基(含青霉素 100U/ml，链霉素100Mg/ml);
含质量体积百分比浓度为1% (即lg/100m)的牛血清白蛋白(BSA) 的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素10(mg/ml);
无血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素lOOl^g/ml);
2XMEM培养基(含体积百分比浓度为2%的维生素，质量体积百分比 浓度为2X的BSA (2g/100ml)，体积百分比浓度为6%的谷氨酰胺)； 2mM的l-甲氧基-5-甲基硫酸甲酯盐(1-MethoxyPMS):将0.01g l-MethoxyPMS溶解于lml双氧水(ddH20)中，然后进行梯度稀释，经酶 标仪检测波长从420mn到600nm范围内的吸收光值，找到最大吸收峰值所在 的波长，将该最大吸收值波长代入公式C-A/s(e-2.7XlCP，C为浓度，A为吸 收光值)，计算该吸收值对应的浓度，用ddH20稀释到浓度为2mM， 4。C保存
5备用;
WST-1溶液16.3mgWST-l粉末，即2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯)-5-(2， 4-二磺苯基)-2H-四唑钠盐，(2國(4 - Iodophenyl) - 3 - (4漏nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl-2H-tetrazolium， monosodium salt.) (DOJINDO)溶解于 5ml0.2mMl-MethoxyPMS溶液中，经0.2pm孔径滤膜过滤，-80°(3保存备用；
固定液(EtOH:AcOH (v/v=l:l)):醋酸和乙酸等体积混合而成；
质量体积百分比为0.5%的氨基黑(Amino black 10B):将2g Amino black 10B溶解于400ml ddH20中；
1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖(PGG):将PGG粉末经二甲 基亚砜(DMSO)充分溶解后于-80。C保存备用，PGG(C^H32026)的分子量为 940，化学式如下式所示
实施例l: PGG的细胞毒性和抗流感病毒活性检测
(1) PGG的细胞毒性检测方法如下将3X104个MDCK细胞/孔接种 于96孔板，在含体积百分比浓度为10% (v/v)的胎牛血清MEM培养基(含 青霉素100U/ml，链霉素100^g/ml)中培养24小时后，吸取除去培养基， 加入200(J含系列梯度稀释浓度(0.39ng/ml-25昭/ml， 2倍稀释)PGG的含 体积百分比浓度为1% (v/v)的维他命的MEM培养基(青霉素100U/ml，链 霉素100Mg /ml)，在37°C， 5%0)2培养箱中培养72小时后用WST-1法进 行检测。每个实验组设三个复孔，重复四次实验。
WST-1法向培养72小时后的96孔板里每孔加入10iilWST-l溶液，在 37°C， 5%0)2培养箱中培养4小时后，混匀，酶表仪检测450nm吸收光值。 实验结果如图l所示。
(2) PGG的抗流感病毒活性检测方法如下将3X10"个MDCK细胞/孔接种于96孔板，在含体积百分比浓度为10% (v/v)的牛胎血清MEM培 养基(含青霉素100U/ml，链霉素lOOpg/ml)中培养24小时后，吸取除去 培养基，加入100pl含不同浓度(0.39|ug/ml-25ng/ml， 2倍稀释)PGG的无 血清MEM培养基和lOOfil流感病毒(influenza A/WSN/53, 100TCID5。(半数组 织培养感染剂量)，在37。C， 5%0)2培养箱中培养72小时后用WST-l法进行 检测。以浓度为0.2nMZanamivir (扎那米韦)作为阳性对照药物，每个实验 组设三个复孔，重复四次实验。
WST-1法向培养72小时后的96孔板里每孔加入10nl WST-1溶液，37°C， 5% C02培养箱中培养4小时后，混匀，酶表仪检测450nm吸收光值。
实验结果如图2所示。将四次重复实验的结果进行平均，根据 Reed-Muench法计算半数致死浓度CC50 (50% cell cytotoxic concentration) 和半数抑制率IC50 (50% vims-inhibitory concentration)以及选择系数SI (selective index),结果表明PGG对MDCK细胞的IC50为2.36ng/ml, CC50 为28.85pig/ml, SI为12.22。
实施例2:不同PGG浓度对流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用 实验方法将8X10SMDCK个细胞/孔接种于12孔板，在含体积百分比 浓度为10% (v/v)的胎牛血清MEM培养基(青霉素100U/ml，链霉素lOOpg /ml)中培养24小时。用磷酸缓冲液(PBS(-))洗细胞两次后，每孔加入用 无血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素lOOpg/ml)稀释的流感病 毒A/WSN/33 (H1N1) 200|_il (病毒感染剂量为MOI=0,001)。在370C， 5%C02 培养箱中感染l小时后，吸取弃去病毒感染液，用磷酸缓冲液洗细胞两次， 加入含不同浓度(l.56^/r^ 12.5ng/ml， 2倍稀释)PGG的含体积百分比 浓度为l%(v/v)的维生素的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素lOOpg /ml)，继续培养48小时后回收培养上清液。通过空斑实验对培养上清液中 放出的病毒进行滴定。重复三次实验，每次实验每个组设2复孔。
空斑实验将1.6Xl()SMDCK个细胞/孔接种于6孔板，在含体积百分比 浓度为10。/。(v/v)的牛胎血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素lOOpg /ml)中培养48小时以后汇合度达100%;用PBS(-)洗细胞两次后，每孔加 入500 nl用含质量体积百分比浓度为1%的牛血清白蛋白(BSA)的MEM培 养基梯度稀释(10倍稀释)的病毒培养上清液，在37。C， 5% C02培养箱中 感染1小时后，吸取弃去病毒感染液，用PBS(-)洗细胞两次；等体积混合质量百分比浓度为1.6% (1.6g/100ml)的琼脂糖和2XMEM培养基(琼脂糖终 浓度为质量百分比浓度为0.8%)，每孔加入3ml含终浓度0.8%琼脂糖的培 养基，待琼脂糖培养基凝结后倒置于37°C， 5% C02培养箱中培养三天。各 孔加入lml固定液(乙醇醋酸=1 : 1 (v/v))室温固定l小时后，弃除琼 脂糖，加入质量体积百分比为2.5%的氨基黑(amino black)染色3小时，对 空斑进行计数，并计算病毒滴度(PFU/ml)。
实验结果如图3所示图中星号表示具有显著性差异(*P<0.05,**P< 0.01)，其中浓度为12.50|ig/ml的PGG处理组的病毒滴度和对照组相比相差 105PFU/ml,表明PGG对流感病毒抑制作用具有浓度依赖性。
图4显示MDCK细胞感染流感病毒A/WSN户3 (MOI=0.001) 48小时后 不同浓度PGG条件下的细胞病变情况6.255叱/ml和12.50|ig/ml的PGG处理 后,细胞病变程度明显降低.
实施例3: PGG对流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用 实验方法将8X105个MDCK细胞/孔接种于12孔板，在含体积百分 比浓度为10% (v/v)的牛胎血清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素 lOO^g/ml)中培养24小时；用PBS(-)洗细胞两次后，每孔加入用无血清MEM 培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100蹄/ml)稀释的流感病毒A/WSN/33 (H1N1) 20(^1 (病毒感染剂量为MOI=0.001)。在37°C， 5%0)2培养箱中感 染1小时后，吸取弃去病毒感染液，PBS(-)洗细胞两次，加入2ml含不同浓 度(1.56ng/ml 12.5昭/ml， 2倍稀释)PGG的含体积百分比浓度为1%的维 生素的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素lOO^tg /ml);实验分对照 组(加含DMSO (V/V=0.1%)培养基)，实验组l (加含6.25ng/mlPGG的培 养基)和实验组2 (加含6.25ng/mlPGG的培养基)。在感染后8， 24， 36， 48小时分别回收培养上清液。通过空斑实验对培养上清液进行滴定。重复三 次实验，每次实验每个组设2复孔。空斑实验方法如实施例2所述。
实验结果如图5所示病毒感染后经过6.25叱/ml和12.50吗/ml PGG处 理组明显抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制，并且呈浓度依赖性。
实施例4:感染细胞细胞内病毒mRNA和蛋白的表达 实验方法将8X 1()S个MDCK细胞/孔接种于12孔板，在含体积百分比 浓度为10。/。的胎牛血清MEM培养基(青霉素100U/ml，链霉素100pg/ml)中培养24小时。用PBS(-)(磷酸缓冲液)洗细胞两次后，每孔加入用无血 清MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100ng/ml)稀释的流感病毒 A/WSN/33 (H1N1) 200jul (病毒感染剂量为MOI=0.001)。在37°C， 5°/。C02 培养箱中感染l小时后，吸取弃去病毒感染液，用PBS(-)洗细胞两次，加入 含不同浓度(1.56pg/ml、 12.5pg/ml， 2倍稀释)PGG的含体积百分比浓度 为1。/。(v/v)的维生素的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100|iig/ml)， 继续培养48小时后回收培养细胞。
从细胞中提取总RNA，用流感病毒(A/WSN/33) NP基因mRNA特异 性引物进行反转录PCR，检测流感病毒NP基因mRNA的表达；流感病毒 的NP mRNA特异性引物序列为
正义链5'-CGGTCTGCACTCATATTGAG A GG-3 ，，
反义链5，-GAAAGCTTCCCTCTTGGG-3，；
同时以18SrRNA基因作为内参基因18SrRNA基因引物
正义链5，-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3，，
反义链5，-GCTGGAATTACCGCGGCT-3，；
逆转录PCR条件为94°。预变性2分钟，94。C30秒，60'C延伸30秒， 24个循环，72'C退火1分钟。
此外，回收的细胞经由细胞裂解液处理(95'C加热5分钟)，经质量百 分数为10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至二氟化树脂(PVDF) 膜，最后用特异性抗体进行免疫反应检测actin蛋白和流感病毒NP蛋白的表 达。0.5% (质量百分比数)脱脂牛奶封闭过夜后，加入一次抗体(抗actin 兔血清和抗NP兔血清)，室温孵育2小时，加入二抗(抗兔血清IgG)室温 孵育1小时，加入DAB显色剂至能够观察到条带。
实验结果如图6所示经过6.25|ig/ml和12.50pg/ml PGG处理48小时 的细胞内病毒NPmRNA和蛋白的表达受到明显的抑制。
实施例5:不同时间点加药实验(加药的步骤如图7所示) 实验方法将8X105 MDCK细胞/孔接种于12孔板，在含10%牛胎血清 MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100昭/ml)中培养24小时。实验 分三组，实验组一为预防组(pre-culture)，实验组二为灭活组(pre-mix)， 实验组三为治疗组(感染后3， 6， 9， 12小时后加药)。预防组细胞中加入浓度为12.50|ig/ml PGG的含体积百分比浓度为1% (v/v)的维他命的MEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素lOOpg/ml)， 在37°C培养2小时后，用PBS(-)洗细胞三次；每孔加入用无血清MEM培养 基(含青霉素100U/ml，链霉素100(xg/m)稀释的流感病毒A/WSN户3(H1N1) 200nl (病毒感染剂量为MOI=0.001)。在37。C培养1小时后，吸取弃去病毒 感染液，PBS(-)洗细胞两次后，加入2ml无血清MEM培养基(含体积百分比 浓度为1% (v/v)的维他命，青霉素100U/ml，链霉素100pg/ml)继续培养 24小时，回收培养上清液，用空斑试验测定其病毒滴度(PFU/ml)。
灭活组流感病毒(5X103 PFU/ml)分别于含25ng/ml PGG的无血清培养 基(含体积百分比浓度为l%(v/v)的维他命，青霉素100U/ml，链霉素100|ng /ml)和含0.2。/。DMSO(V/V)的无血清培养基(含1%维生素，青霉素100U/ml， 链霉素100^lg/ml)等体积混合，冰上放置l小时；MDCK细胞经PBS(-)洗细 胞两次后，每孔加入用上述流感病毒混合液200|il (病毒感染剂量为 MOI=0.001);在37°C培养1小时后，吸取弃去病毒感染液，加入无血清培 养基继续培养24小时后吸取弃去病毒感染液，PBS(-)洗细胞两次后，加入2ml 无血清MEM培养基(含1%维生素，青霉素100U/ml，链霉素lOO^ig/ml)继 续培养24小时，回收培养上清液，用空斑试验测定其病毒滴度(PFU/ml)。
治疗组MDCK细胞经PBS(-)洗细胞两次后，每孔加入用无血清MEM 培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100(ig/ml)稀释的流感病毒A/WSN/53 (HlNl) 200^1 (病毒感染剂量为MOI=0.001)。在37°C培养1小时后，吸取 弃去病毒感染液，PBS(-)洗细胞两次，于感染后不同的时间点(0， 3， 6， 9， 12小时)加入含浓度为12.5叱/ml PGG的培养基接续培养，直至感染24小 时后，回收培养上清液，用空斑试验测定其病毒滴度(PFU/ml)。
实验结果如图8所示预防组结果表明PGG没有预防作用；灭活组的 结果显示PGG具有灭活或降低病毒感染能力的作用；治疗组的结果显示PGG 具有显著的治疗效果，在感染病毒12小时后加PGG仍然有效。
实施例6: PGG灭活流感病毒活性的实验
实验方法为了进一步确认PGG对病毒的灭活活性(virucidal activity), 将流感病毒A/WSN/33 (HlNl)液稀释为103PFU/ml、 104PFU/ml、 105PFU/ 100|il，分别与不同浓度(6.25， 12.5(ig/ml)的PGG液lOOpl混合，冰上放
置1小时，然后通过空斑实验测定混合后的病毒的滴度。空斑实验方法如前
10述。实验结果如图9所示其中(A)和(B)分别为6.25pg/ml和12.5pg/ml PGG对105PFU/ml的流感病毒滴度的抑制率达到96.4%和98.4%，对 104PFU/ml的流感病毒灭活率达到98%和100%，而对103PFU/ml的流感病 毒灭活率均达到100%。图(C)禾Q (D)为105PFU/ml的流感病毒液lOOpl分别与不同浓度 G.13吗/ml， 6,25吗/ml， 12.5pg/ml)的PGG稀释液100|il混合，冰上放置 1小时后，感染MDCK细胞，通过空斑实验测定混合后的病毒液中病毒的滴 度。结果表明，各个浓度的PGG对流感病毒灭活率均达到98n/。以上。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述 实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护 范围之内。
权利要求
1、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗流感病毒的药物、食品或化妆品的用途。
2、 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗流感病毒的药物 含有治疗有效量的1, 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖和药学上可接受的载体。
3、 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述流感病毒为甲型流 感病毒。
4、 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述食品为饮料、保健食品或食品添加剂。
5、 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗流感病毒的药物 制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、乳膏剂、口服液、喷雾剂、针剂或粉针 剂。
全文摘要
本发明提供了1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗流感病毒的药物、食品或化妆品的用途。1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖不仅有很强的抗病毒活性，还具有灭活病毒活性，且活性浓度在细胞毒性范围之外，其对病毒有直接灭活作用，可以将接触到的病毒灭活使病毒失去感染能力或对已被病毒感染的细胞起到治疗作用，不仅可以作为药物开发，还可以应用于饮料等食品领域或者化妆品领域，可以在防治病毒的卫生保健品中广泛应用。
文档编号A61K31/7024GK101618043SQ20091004015
公开日2010年1月6日 申请日期2009年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者格 刘, 北里海雄, 张颖君, 盛 熊, 王一飞, 钱垂文 申请人:暨南大学