专利名称：：Pcl-pla-tpgs共聚物及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物材料
技术领域：
，特别是涉及PCL-PLA-TPGS共聚物及制备方法和应用。
背景技术：
：聚e-己内酯(PCL，Polyc即rolactone)是美国FDA批准的药用辅料，具有优良的药物透过性、优异的生物可降解性和生物相容性。但线性PCL具有较高的结晶度，亲水性较差，降解速率慢，影响了其应用范围。因此有必要通过结构的改变和引入亲水性链段来降低PCL的结晶性，提高其亲水性能，以使其成为更为有效的药物传递材料。聚乳酸(Polylactide，PLA)亦称为聚丙交酯，是一种具有优良的生物相容性和可生物降解性的合成高分子材料，也已经被美国FDA批准用于人体内使用，与PCL共聚可以用于调节降解、机械和物理性能。VitaminETPGS(TPGS)是聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(D_a-tocopherolpolyethyleneglycol1000succinate)的简称，是维生素E的水溶性衍生物，由维生素E琥珀酸酯(T0S)的羧基与聚乙二醇1000(PEG1000)酯化而成，相对分子量约为1513，分子结构如图1所示，已载入《美国药典》。TPGS最早由美国Eastman公司生产并上市，在国外现已广泛应用于制剂研究中，TPGS是淡黄色的蜡状固体，近乎无味，它是一种两亲分子，有一个亲水的极性头部和一个疏水的脂肪族碳链尾部分子，能溶于水，也能溶于大多数极性有机溶剂。
发明内容本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种可以降低PCL的结晶性，提高其亲水性能的PCL-PLA-TPGS共聚物。本发明的第二个目的是提供一种PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种PCL-PLA-TPGS共聚物的用途。本发明的技术方案概述如下PCL-PLA-TPGS共聚物，具有下式结构ODOf>h和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(II)其中n=30-60a=2-490b=2-380c=2-380d=2-490。PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(II)的制备方法，包括如下步骤按质量百分比取2%_95%的e己内酯单体、2%-95%的丙交酯单体和3%-40%的聚乙二醇IOOO维生素E琥珀酸酯为原料放入聚合设备中，加入所述原料质量的0.1X-1^的催化齐U，抽真空，充氮气，在密闭的聚合设备中，在140-16(TC反应12-20小时，即获得分子量为3000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)。还可以将PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)溶于二氯甲烷或乙酸乙酯中，加入甲醇或石油醚使PCL-PLA-TPGS共聚物沉淀，过滤，将沉淀于30-50°C真空干燥，即获得分子量为3000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(II)。丙交酯单体为外消旋丙交酯、左旋丙交酯或右旋丙交酯。催化剂可以是辛酸亚锡、有机胍、金属锌、三丁基氯化锡、乙酰丙酮铁、乳酸锌、纳米氧化锌、牛磺酸、乙醇铁、正丙醇铁、异丙醇铁或正丁醇铁。抽真空，充氮气的次数为1-3次。反应温度以145。C为最佳。分子量为3000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(II)在制备药用辅料中的应用。本发明的PCL-PLA-TPGS共聚物具有良好的生物相容性，生物可降解性。本发明的方法制备简单，无污染。本发明的PCL-PLA-TPGS共聚物应用于药物制剂(例如载药纳米粒，凝胶和载药微球等等)和组织工程领域(例如人工器官，手术缝线和血管支架等)。图1为VitaminETPGS的化学结构式。图2为PCL-PLA-TPGS共聚物合成示意图。图3为PCL-PLA-TPGS与VitaminETPGS的傅里叶变换红外光谱图。图4为PCL-PLA-TPGS共聚物与VitaminETPGS的核磁共振光谱图。图5为PCL-PLA-TPGS共聚物与VitaminETPGS的凝胶色谱图。图6为PCL-PLA-TPGS共聚物与VitaminETPGS的热重分析仪表征结果。图7为载多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS纳米粒的FESEM图。图8为激光粒度仪检测载药PCL-PLA-TPGS纳米粒的粒径和粒径分布结果。图9为Zeta电位仪测量载药PCL_PLA_TPGS纳米粒的结果。图10为差示扫描量热仪表征多烯紫杉醇晶体及载多烯紫杉醇PCL与PCL-PLA-TPGS纳米粒的结果。图11为以0.03%TPGS为乳化剂制备载药量为10%的载多烯紫杉醇PCL和PCL-PLA-TPGS纳米粒的体外药物释放曲线。图12.24小时后，载多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS纳米粒、Taxotere⑧(与载药纳米粒相同多烯紫杉醇剂量)以及空白PCL-PLA-TPGS纳米粒(与载药纳米粒相同纳米粒悬液浓度)对Hela细胞的细胞活力实验结果。图13.48小时后，载多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS纳米粒、Taxotere⑧(与载药纳米粒相同多烯紫杉醇剂量)以及空白PCL-PLA-TPGS纳米粒(与载药纳米粒相同纳米粒悬液浓度)对Hela细胞的细胞活力实验结果图14.72小时后，载多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS纳米粒、Taxotere⑧(与载药纳米粒相同多烯紫杉醇剂量)以及空白PCL-PLA-TPGS纳米粒(与载药纳米粒相同纳米粒悬液浓度)对Hela细胞的细胞活力实验结果图15.激光共聚焦扫描电子显微镜观察用PCL-PLA-TPGS共聚物材料制备的载香豆素_6纳米粒在37t:下孵育4小时的Hela细胞。细胞核用DAPI染成蓝色，载香豆素_6纳米颗粒是绿色的，分别通过EGFP通道和DAPI通道观察细胞摄取情况左图是通过EGFP通道观察的情况(A);中图是通过DAPI通道观察的情况(B);右图是通过EGFP通道和通过DAPI通道观察的图像重叠后的结果(C)。图16.载紫杉醇PCL-PLA-TPGS微球的扫描电镜(SEM)图。图17.各种PCL-PLA-TPGS共聚物在37。C的PBS溶液中的体外降解(n=3)。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，包括如下步骤按质量百分含量取2%的e己内酯单体、95%的外消旋丙交酯单体和3%聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯为原料，放入聚合管中，加入原料质量0.5X的醋酸四甲基二丁基胍，抽真空，充氮气，聚合管封管，在145t:加热，反应16小时，即获得分子量为46000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(II)。图2所示为PCL-PLA-TPGS共聚物的合成反应式。VitaminETPGS作为引发剂。图3为PCL-PLA-TPGS共聚物与VitaminETPGS的傅里叶变换红外光谱图。TPGS的羰基峰在1739cm—1处，而在PCL-PLA-TPGS共聚物中TPGS的羰基峰移至1731cm—1左右。2880cm—1处是TPGS的亚甲基的碳氢伸縮振动峰，2867-2947cm—1处是PCL亚甲基的碳氢伸縮振动峰，2945cm—1左右是PLA亚甲基的碳氢伸縮振动峰，在PCL-PLA-TPGS共聚物中，这三个峰有部分重叠。3400-3650cm—1处是共聚物端羟基的峰，1045-1295cm—1处是碳氧伸縮振动峰，其中1241cm—1处是不对称碳氧碳伸縮振动峰，1295cm—1处的峰通常用来研究PCL中结晶性能的改变。傅里叶变换红外分析结果说明PCL-PLA-TPGS共聚物合成成功。实施例2PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，包括如下步骤按质量百分含量取58%的己内酯单体、2%的左旋丙交酯单体和40%聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯为原料放入聚合管中，加入所述原料质量的1%的锌粉，抽真空，充氮气，聚合管封管，在145t:加热，反应12小时，即获得分子量为4200的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(11)。将PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)溶于二氯甲烷中，加入甲醇使PCL-PLA-TPGS共聚物沉淀，过滤，将沉淀于50°C真空干燥，即获得分子量为4200的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)禾口(11)。实施例3PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，包括如下步骤按质量百分含量取95%的己内酯单体、2%的右旋丙交酯单体和3%聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯为原料放入聚合管中，加入所述原料质量0.2%的乙醇铁，抽真空，充氮气，在密闭的聚合设备中，在15(TC加热，反应12小时，即获得分子量为51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)禾P(II)。将PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)溶于乙酸乙酯中，加入石油醚使PCL-PLA-TPGS共聚物沉淀，过滤，将沉淀于3(TC真空干燥，即获得分子量为51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)禾口(11)。实施例4PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，包括如下步骤准确称取7.5g己内酯单体(e-Caprolactone)、1.5g外消旋丙交酯单体(DL-lactide)、lgVitaminETPGS为原料，取原料质量O.1%的催化剂辛酸亚锡催化剂加入聚合管中，进行抽真空脱气和氮气置换过程，重复三次，将聚合管封口，于145°C油浴加热下进行开环聚合反应。聚合反应16小时后，产物经冷却溶于二氯甲烷中，并加入过量甲醇使共聚物沉淀。过滤除去甲醇未反应的单体和VitaminETPGS。将所得沉淀于45。C真空干燥48小时即得聚合产物PCL-PLA-TPGS共聚物。傅里叶变换红外光谱、核磁共振氢谱、凝胶色谱和热重分析结果证明PCL-PLA-TPGS共聚物合成成功。通过核磁共振氢谱可以计算出PCL-PLA-TPGS共聚物中各组分的含量及其数均分子量。图4为PCL-PLA-TPGS共聚物与VitaminETPGS的核磁共振光谱图。3.65卯m(c峰)是TPGS聚乙二醇中_CH2的峰，这是TPGS的特征峰。化学位移值比较低区域的几个小矮峰分别归属于维生素E分子中不同化学环境下的质子。聚乳酸(PLA)在5.lppm处会出现一个特征峰，在PCL-PLA-TPGS共聚物中这个峰由于反应后化学环境的改变而移到5.2ppm。5.2ppm(a峰)和1.69ppm(e峰)这两个峰分别是PLA的-CH和-CH3的质子峰。4.06ppm(b峰)、2.31ppm(d峰)、1.6-1.7ppm(e峰)禾P1.4ppm(f峰)是聚己内酯(PCL)中-0CH2、_C0CH2、_CH2(4H)、_CH2(2H)质子的特征峰。核磁共振氢谱分析结果亦说明PCL-PLA-TPGS共聚物合成成功。如图4所示，通过PCL-PLA-TPGS共聚物中PLA的特征峰5.2卯m(a峰)、PCL的特征峰4.06ppm(b峰)和TPGS的特征峰3.65卯m(c峰)的峰面积比值可以计算出PCL-PLA-TPGS共聚物中所含各成分的比例分别为8.87%(PLA)、69.5%(PCL)和21.63%(TPGS)，再根据TPGS的分子量1513及在PCL-PLA-TPGS共聚物中与丙交酯单体、己内酯单体的摩尔比例可以计算出PCL-PLA-TPGS共聚物的数均分子量是34987。图5为PCL-PLA-TPGS共聚物与VitaminETPGS的凝胶色谱图。从图中可以看出，反应产物不是丙交酯单体、己内酯单体和维生素ETPGS的物理混合物，而是PCL-PLA-TPGS共聚物。其中，TPGS的出峰时间为28.23min，而PCL-PLA-TPGS共聚物的的出峰时间为17.51min。PCL-PLA-TPGS共聚物的GPC结果中检测不到TPGS的峰，而仅出现一个狭窄的单峰。通过凝胶渗透色谱图计算出PCL-PLA-TPGS共聚物的数均分子量是35209，与由核磁共振谱图计算得出的结果(34987)相吻合。图6为PCL-PLA-TPGS共聚物与VitaminETPGS的热重分析仪表征结果。热重分析仪检测的是随温度的变化，样品中成分因蒸发裂解等造成重量变化的情况。从图中可以看出，VitaminETPGS仅在380-450。C有一个拐点，而PCL-PLA-TPGS的图有三个拐点，每个拐点代表聚合物中的一个成分因加热而失重，200-38(TC和380-45(TC的失重峰分别是由聚合物中的PLA-PCL和VitaminETPGS部分造成的，其中PLA和PCL的失重温度有所重合。热重分析检测结果进一步证明PCL-PLA-TPGS(I)和(II)共聚物合成成功。实施例5PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，包括如下步骤按质量百分含量取2%的e己内酯单体、58%的左旋丙交酯单体和40%的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯为原料放入聚合设备中，加入所述原料质量的0.5%的催化剂三丁基氯化锡，抽真空，充氮气，再抽真空，充氮气，在密闭的聚合设备中，在15(TC反应20小时，即获得分子量为3600的PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)。本实施例的催化剂还可以采用乙酰丙酮铁、乳酸锌、纳米氧化锌、牛磺酸、正丙醇铁、异丙醇铁或正丁醇铁进行催化反应。分子量为9000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(II)在制备药用辅料中的应用。实施例6利用超声乳化/溶剂挥发法制备了载多烯紫杉醇(Docetaxel)PCL-PLA-TPGS纳米粒。制备方法如下准确称取100mgPCL-PLA-TPGS共聚物和一定量的多烯紫杉醇药物，溶于8ml二氯甲烷中。在搅拌条件下，将该溶液加入到120ml的0.03%TPGS水溶液中。在冰浴条件下以25w功率超声分散120s，形成水包油型乳液，减压挥发除去有机溶剂。22000rpm离心20min，用去离子水洗涤三次，以除去乳化剂和游离的药物。所得沉淀重悬于10m去离子水中，冷冻干燥得载多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS纳米粒产品。扫描电镜结果显示(图7)，纳米粒子大小较均一，外表光滑，呈球形，粒径大约在200nm左右。如图8所示，纳米粒粒度分布较窄，粒径大约在200nm左右，进一步证实了扫描电镜的观察结果。如图9所示，纳米粒的Zeta电位在-20!^左右，表面电荷的绝对值比较高，颗粒之间相互排斥作用较强，因而在分散相中高度稳定。如表1所示，使用0.03%TPGS作为乳化剂制备载药量为10%的载多烯紫杉醇纳米粒，可以使包封率达到90%以上。如图IO所示，多烯紫杉醇晶体的吸热峰在173°C，而载多烯紫杉醇PCL和PCL-PLA-TPGS纳米粒均未见多烯紫杉醇晶体的吸热峰，说明多烯紫杉醇被包裹在纳米粒中，其吸热峰消失了。如图ll所示，载多烯紫杉醇PCL和PCL-PLA-TPGS纳米粒具有相似的释放曲线，呈两相释放特征并伴随初始的"突释效应"。如图12、13和14所示，不载药的空白PCL-PLA-TPGS纳米粒具有良好的生物相容性，因为在不同纳米粒悬液浓度下它对细胞均没有明显的毒性；在48h和72h后，载多烯紫杉8醇PCL-PLA-TPGS纳米粒比商业多烯紫杉醇制剂Taxoter^在药物浓度相同情况下对Hela细胞的毒性要大得多；随着孵育时间增加，载药纳米粒和Taxoter^处理后的细胞存活率都明显下降。例如，在12.5mg/l的药物浓度下，24h后用载药纳米颗粒处理的细胞存活率为86.22X，对于Taxotere⑧相同条件下的细胞存活率是78.35%，也就是说24h后载药纳米颗粒的细胞毒性比Taxotere⑧的细胞毒性低36.35%。在相同药物浓度下，48h和72h后用载药纳米粒处理的细胞毒性比丁&乂(^^@的细胞毒性高65.4%和120.65%。MTT实验结果说明载多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS纳米粒对Hela细胞的毒性具有时间和浓度依赖性。表1.用PCL-PLA-TPGS共聚物材料制备载多烯紫杉醇纳米粒过程中，载药量与乳化剂对纳米粒包封率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例7利用超声乳化/溶剂挥发法制备载香豆素_6的PCL-PLA-TPGS纳米粒。制备方法如下准确称取lOOmg实施例4制备的PCL-PLA-TPGS共聚物和12mg的香豆素_6，溶于8ml二氯甲烷中。在搅拌条件下，将该溶液加入到120ml的0.03%TPGS水溶液中。在冰浴条件下以25w功率超声分散120s，形成水包油型乳液，减压挥发除去有机溶剂。22000rpm离心20min，用去离子水洗涤三次，以除去乳化剂和游离的香豆素-6。所得沉淀重悬于10m去离子水中，冷冻干燥得载香豆素_6的PCL-PLA-TPGS纳米粒产品。纳米粒粒径在200纳米左右。利用DAPI对细胞核染色，可以在细胞摄取实验中通过对细胞核的定位来确定载香豆素-6纳米粒在细胞中的位置。图15是用激光共聚焦扫描电子显微镜观察Hela细胞对由PCL-PLA-TPGS制备的载香豆素_6纳米颗粒的摄取结果。从图中可以看出，仅仅在与细胞孵育4小时后，纳米粒就已经被细胞所摄取。从图A与图B合并得到的图C可以清楚得看到，呈绿色的纳米粒大多数位于细胞质中，紧紧包围着呈蓝色的细胞核。实施例8利用溶剂挥发法制备载紫杉醇(Paclitaxel)PCL-PLA-TPGS微球。制备方法如下准确称取200mg实施例4制备的PCL-PLA-TPGS共聚物和50mg的紫杉醇粉末，溶于16ml二氯甲烷中。在搅拌条件下，将该溶液加入到500ml的1%聚乙烯醇水溶液中。1000rpm转速下搅拌两小时，形成水包油型乳液，800rpm转速下挥发过夜。2000rpm离心15min，用去离子水洗涤三次，以除去乳化剂和游离的药物。所得沉淀重悬于10m去离子水中，冷冻干燥得载紫杉醇PCL-PLA-TPGS微球制剂。如图16所示，载紫杉醇PCL-PLA-TPGS微球表面光滑，粒径在10微米左右。紫杉醇PCL-PLA-TPGS微球的载药量为20%，包封率在80%以上。实施例9通过本发明的方法合成了多种PCL-PLA-TPGS共聚物，然后研究其体外降解行为。其中，PCL-PLA-TPGS(50:47:3)的数均分子量为48900，PCL-PLA-TPGS(50:42:8)的数均分子量为17937，PCL-PLA-TPGS(50:38:12)的数均分子量为12500。10mg聚合物置于含有1.5mLPBS的离心管中，在37t:恒温水浴中振荡。定期取样，冷冻干燥，称重。使用GPC对结果进行分析。如图17所示，TPGS含量高的PCL-PLA-TPGS共聚物的降解速率更快。30天后，PCL-PLA-TPGS(50:38:12)、PCL-PLA-TPGS(50:42:8)、PCL-PLA-TPGS(50:47:3)和PLGA(分子量50000)分别降解了38.1%、35.5%、27.9%和14.3%。权利要求PCL-PLA-TPGS共聚物，其特征是具有下式结构和其中n＝30-60a＝2-490b＝2-380c＝2-380d＝2-490。F2009102286290C00011.tif,F2009102286290C00012.tif2.权利要求1的PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，其特征是包括如下步骤按质量百分比取2%-95%的e己内酯单体、2%-95%的丙交酯单体和3%-40%的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯为原料放入聚合设备中，加入所述原料质量的0.1%-1%的催化剂，抽真空，充氮气，在密闭的聚合设备中，在140-16(TC反应12-20小时，即获得分子量为3000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(11)。3.根据权利要求2所述的PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，其特征是还包括将PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)溶于二氯甲烷或乙酸乙酯中，加入甲醇或石油醚使PCL-PLA-TPGS共聚物沉淀，过滤，将沉淀于30-5(TC真空干燥，即获得分子量为3000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)禾P(11)。4.根据权利要求2所述的PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，其特征是丙交酯单体为外消旋丙交酯、左旋丙交酯或右旋丙交酯。5.根据权利要求2所述的PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，其特征是所述催化剂为辛酸亚锡、有机胍、金属锌、三丁基氯化锡、乙酰丙酮铁、乳酸锌、纳米氧化锌、牛磺酸、乙醇铁、正丙醇铁、异丙醇铁或正丁醇铁。6.根据权利要求2所述的PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，其特征是所述抽真空，充氮气的次数为1-3次。7.根据权利要求2所述的PCL-PLA-TPGS共聚物的制备方法，其特征是所述反应温度为145°C。8.权利要求1的PCL-PLA-TPGS共聚物在制备药用辅料中的应用。全文摘要本发明公开了一种PCL-PLA-TPGS共聚物及制备方法和应用PCL-PLA-TPGS共聚物具有下式结构本发明的PCL-PLA-TPGS共聚物具有良好的生物相容性，生物可降解性。应用于药物制剂和组织工程领域。文档编号A61L27/00GK101717495SQ200910228629公开日2010年6月2日申请日期2009年11月20日优先权日2009年11月20日发明者张明明,梅婉,梅林,梅红卫申请人:梅林