专利名称：：一种含有活性剂分子的抗体结合的合成囊泡的制作方法
技术领域：
：本发明大体涉及一种靶向中枢神经系统(CNS)或周围神经系统(PNS)的细胞的合成囊泡，尤其是一种抗体结合的合成囊泡，用于输送包含在囊泡中的分子至表达抗体的受体靶标的细胞。
背景技术：
：每年大约270,000人经受中度至重度创伤性脑损伤(traumaticbraininjury,TBI)。TBI是“由外部物理力量导致的对脑的后天性损伤...导致损害一个或更多方面，如认知；语言；记忆；注意力；推理；抽象思维；判断；解决问题；感觉、知觉和运动能力；社会心理行为；生理功能；信息处理；及说话能力”。TBI可以产生于许多损伤类型，示例性地包括交通意外、暴力行为、运动损伤、生理异常、或者疾病；酒精与超过一半的物理性损伤发生有关。TBI是工业化国家中45岁以下的人死亡和残疾的首要原因(McAllister，1992)。在美国每年估计发生的150万例头部创伤(headtraumas)中，50万可能需要住院，80，000导致某种慢性残疾(Langloisetal，2006)。疾病控制中心(TheCenterforDiseaseControl，⑶C)估计目前至少有530万美国人，或约2%人口，由于TBI在每日生活活动方面需要长期协助(Langloisetal，2006)。此外，每年用于TBI的总健康费用达到大约350亿美元(Maxetal，1991)。尽管这种损伤形式流行和严重，但是仍然没有研发出有效的治疗。TBI与许多长期疾病例如阿尔茨海默氏和帕金森氏症(Alzheimer‘sandParkinson'sdisease)).1];(dementiapuglistica)、禾口损贞后^liiit匿^不:所有来自TBI的损害都发生在伤害的瞬间，而是通过继发损害发生。继发性脑损害可能是，例如，新陈代谢过程比如最初伤害后脑部缺氧的结果。继发性脑损害的主要原因之一是整个大脑的谷氨酸(glutamate)水平的提高。谷氨酸结合至可以在脑细胞表面发现的谷氨酸受体，允许钙进入胞内液，细胞质。当过多的钙进入脑细胞，导致最终杀死细胞的许多事件。这些事件包括活性氧数目增加、线粒体功能障碍、蛋白酶和磷脂酶(phospholipidase)过度激活、和钙诱导的钙释放。所有这些事件都导致细胞坏死和细胞凋亡(程序性细胞死亡的两种形式)(WangandYuen(1994).TrendsPharmacol.Sci.15，412-419)。类似的CNS和PNS细胞紊乱、受伤或死亡也可能发生在其它人类疾病例如中风、蛛网膜下腔出血、癫痫、痉挛、神经性疼痛、头痛、帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、亨廷顿症(Huntingtondisease)、多发性硬化症中。有一些药物可以防止或减轻继发损害事件的发生。这样一种药物族包括蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的一个问题是，即使它们已知是保护细胞的，由于生理不稳定，它们具有差的药代动力学(pharmacokinetics)和动力学(dynamics)。此外，如果身体经受过量的这些药物，病人处于许多不期望的副作用的风险中。最后，难以同时施用多种药物。通过解释物理或化学应力后响应脑细胞的生化反应的启动子或抑制信号，可以阐明一系列预期有效的化合物的一个或更多个的效力。通过例子的方式，钙激活细胞质蛋白酶钙蛋白酶已知在坏死前细胞损伤中激活，而半胱天冬蛋白酶已知在凋亡前细胞损伤中激活，并涉及降解脑细胞的关键结构蛋白，导致组织自身消化作为TBI级联的部分。这些问题有可能通过使用靶向的和/或保护的输送而解决。例如，癌症研究者一直试图开发用于化疗的可以专门针对细胞类型或细胞表型的可靶向的分子，以便它们有区别地杀死癌细胞，因为这会增加癌症治疗的效果，同时降低不利事件或其它副作用的风险。然而，TBI具有以前的研究没有正确解决的特殊问题。例如，输送系统要求能够识别生理正常的或已经经受最初损伤或继发损伤传递物的神经组织。此外，输送系统需要能够定位靶向神经组织，同时区分开其它组织类型，能够容易地施用给需要的病人。最后，神经介质是独一无二的，给予相对于其它组织可认识到的考验。因此，对用于输送货物分子至对象中CNS和PNS细胞的具有细胞特异性和具有在输送中保护货物分子的组合物和方法存在需要。
发明内容提供了一种用于输送至少一活性剂货物分子进入神经细胞的方法，其中货物分子置于合成囊泡例如脂质体中，生物素化蛋白例如抗体结合至合成囊泡以形成蛋白结合的合成囊泡，其中蛋白识别表达在神经细胞的表面上的受体，将蛋白结合的合成囊泡接触细胞直到货物分子输送进神经细胞内。许多货物分子通过发明的包括钙蛋白酶抑制剂和半胱天冬蛋白酶抑制剂的合成囊泡进行输送。蛋白示例性地靶向用于配体如谷氨酸(glutamate)、甘氨酸(glycine)、多巴胺(dopamine)、尼古丁(nicotine)、毒蕈碱(muscarine)、乙酰胆碱(acetylcholine)、或羟色胺(serotonin)等等的细胞受体。在发明的方法中，在所述合成囊泡结合生物素化蛋白之前，货物分子可选地装入所述合成囊泡中。同时，合成囊泡可选地用置于中间的亲和素或链霉亲和素结合生物素化蛋白。可理解接触神经细胞是在体外(invitro)、间接体内(exvivo)、或在体内(invivo)，细胞可选地是在对象的中枢神经系统或周边神经系统中。还提供一种组合物，其可选地是具有容积和外表面的合成囊泡，在合成囊泡的容积内具有货物分子，生物素化抗体结合至合成囊泡的外表面，其中抗体识别表达在神经细胞的表面上的受体。抗体优选地定向到用于配体如谷氨酸、甘氨酸、多巴胺、尼古丁、毒蕈碱、乙酰胆碱、或羟色胺等等的细胞受体。优选地，配体是谷氨酸。优选地，货物分子是钙蛋白酶抑制剂、半胱天冬蛋白酶抑制剂、或它们的组合。发明的组合物优选地是脂质体，聚己酸内酯(polycaprolactone，PCL)，或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polydactic-co-glycolicacid)，PLGA)。另外，合成囊泡优选地用置于中间的亲和素或链霉亲和素结合至抗体。优选地，合成囊泡是生物素化的。还提供了一种治疗CNS细胞的疾病、伤害或健康状况的方法，其中发明的组合物施用至对象。优选地，健康状况是创伤性脑损伤。货物分子优选地是凋亡抑制剂例如钙蛋白酶抑制剂、半胱天冬蛋白酶抑制剂、或它们的组合。输送发明的组合物优选地输送凋亡抑5制剂至受到创伤的CNS细胞。还提供了一种用于生产发明的组合物的方法，包括形成合成囊泡，将生物素化磷脂酰乙醇胺专门整合进所述外表面中。优选地，在形成合成囊泡时存在货物分子。同时，优选地，在抗体结合合成囊泡之前，亲和素或链霉亲和素结合至抗体。图1是说明发明的方法的示意图。图2是说明抗体识别表达在神经细胞上的受体的Western杂交。图3是说明抗体结合至细胞表面的显微照片。图4是说明链霉亲和素偶联至封装货物分子的脂质体的显微照片。图5A-C是说明免疫脂质体结合至神经细胞表面并内化的显微照片。图6是说明在激发的神经细胞中SBDP形成抑制的凝胶电泳。图7A-B是分别说明激发的和施用发明的脂质体的细胞中完整的αII-血影蛋白的量的条形图和凝胶电泳。图8Α-Β是说明免疫脂质体在神经细胞中结合和摄入的显微照片。和图9是说明通过施用免疫脂质体至激发的神经细胞后神经细胞死亡减少的条形图。具体实施例方式本发明在通过使用抗体将囊泡靶向细胞从而输送合成囊泡的内部货物至细胞中具有用途。囊泡货物使用例如有助于细胞成像的染料，而治疗物货物对具有负面健康状况或紊乱的细胞提供了靶向输送和治疗。随着囊泡被细胞内化，囊泡货物将执行特定功能如保护细胞免于程序性细胞死亡(抑制剂)或其它损伤病变(DNA，siRNA，治疗物)或促进细胞生长和更换(干细胞或促进干细胞生长和/或分化的药物)。术语“抗体”指免疫球蛋白，其特异性结合并因此定义为与表达在细胞表面上的物体的特定空间和极性结构构成互补，具体包括作为用于抗体的靶向物体的细胞表面受体。抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以通过本领域已知的技术进行制备，如免疫宿主和收集血清(多克隆的)，或通过制备连续杂交细胞系并收集分泌的蛋白(单克隆的)，或通过克隆和表达至少编码用于对于特异性结合天然抗体所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变突变体。也可以使用完整的抗体，其片段(例如，Fab或的F(ab')2))，或其基因工程变体(如sFv)。这些抗体可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚型的任何免疫球蛋白类。可选地标记抗体、生物素，亲和素、链霉亲和素、脂质、货物分子、或其它有用于作为本发明的组分的分子。本领域普通技术人员知道在这里可操作的许多标记。标记和标记试剂盒是可选地从hvitrogenCorp，Carlshd，CA市售可得的。标记示例性地包括荧光标记、生物素、过氧化物酶、放射性核苷酸(radionucleotides)、胶体金，磁性粒子、酶、或其它本领域已知的标记。术语“合成囊泡”指形成的具有从50到5000纳米直径的能够在其中携带货物分子的中空结构。在这里可操作的合成囊泡示例性地包括脂质体和由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)构成的结构。脂质体是由脂双层膜构成的含有封装的水性容积的完全封闭的结构。可选地，单层和胶束(micelle)也在本发明的范围内。优选地，合成囊泡是双层脂质体。脂质体可以包含由水相分隔的许多同心脂双层(多层囊泡(multilamellarvesicles)或MLVs)，或可以由单个双层膜构成(单层囊泡)。在本发明中使用的脂质体可以具有多种组合物和内容物，并可以是多层、单层或其它类型脂质体的形式，或更普遍地，含脂颗粒，现在已知的或以后开发的。例如，含脂颗粒可以是留体脂质体(steroidalliposomes)的形式，美国专利US599691，含α-维生素E的脂质体，美国专利US786740，稳定多层脂质体(stableplurilamellarliposomes,SPLVs)，美国专禾IjUS4522803,单相囊泡(monophasicvesicles,MPVs)，美国专利US4588578，或脂质基质载体(lipidmatrixcarriers，LMC)，美国专利US4610868，其相关部分在这里通过参考纳入。可以在本发明中使用的脂质体的类别中，优选地，是一种脂质体亚类，特征是具有溶质分布大致等于在其中制备的溶质分布环境。这个亚类可以被定义为稳定多层囊泡(SPLV)、单相囊泡(MPVs)、冷冻和解冻的多层囊泡(thawedmultilamellarvesicles,FATMLVs),如在〃SoluteDistributionsandTrappingEfficienciesObservedinFreeze-ThawedMultilamellarVesicles"Mayeretal.BiochimicaetBiophysicaActa817:1983-196(1985)中所描述的。相信SPLV型脂质体的特别的稳定性产生于伴随溶质平衡的低能量状态。可替换地，用于生产大单层脂质体(largeunilamellarliposomes，LUVs)所使用的技术，如反相蒸发，输注程序和清洁剂稀释，可以用于生产脂质体。对于用于生产脂质体的这些技术禾口其它方法可以在文章Liposomes,MarcJ.Ostro,ed.，MarcelDekker,Inc.，NewYork,1983,Chapter1中找到，其有关部分在这里通过参考纳入。在一优选的具体实施例中，脂质体是一种非对称的双层。示例性地，脂质体双层形成产生对称的双层之后，组分如生物素化PE随后加到外膜层形成非对称的双层表面。这种方法的优点是使用常规技术优化货物分子装入囊泡的内部容积中并同时减小囊泡聚集效应可以形成预制和可选地预装的对称囊泡。合成囊泡可选地由生物素-磷脂整合进脂质体的表面，生物素-多酸整合进PLGA囊泡的表面或生物素-多酸整合进PCL囊泡的表面构成。囊泡可选地用多种磷脂部分生产，示例性地包括卵磷脂(phosphatidylcholine)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)，PEG化磷月旨(PEGylatedphospholipids)、鞘磷脂(sphingomyelin)、它们的修饰物、和本领域已知的磷酸化或非磷酸化的其它脂质。磷脂示例性地来自多种来源，示例性地包括大豆、鸡蛋、或其它来源。合成囊泡可选地通过在脂层中具有一个或更多的固醇(sterol)而形成。优选地，固醇是胆固醇，但其它固醇如麦角固醇(ergosterol)、羊毛甾醇(lanosterol，)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、豆留醇(stigmasterol)等等。进一步可理解固醇的修饰物是同样可操作的。合成囊泡可选地是固体脂质纳米颗粒(solidlipidnanoparticles，SLN)或纳米结构的脂质载体(nanostructuredlipidcarriers，NLC)，它们是两种主要类型的脂质纳米颗粒。制备了生物素化抗体或抗体免疫原性片段，其识别抗原至细胞表达蛋白例如谷氨酸受体、促代谢型谷氨酸受体(metabotropicglutamaterec印tors，mGluR)、和识别配体示例性地包括谷氨酸、甘氨酸、多巴胺、尼古丁、毒蕈碱、乙酰胆碱和羟色胺的受体。优选地，受体在神经元细胞例如神经细胞和神经胶质细胞示例性地包括星形胶质细胞和少突细胞上发现。然后抗体通过引入链霉亲和素或亲和素去同时结合生物素化抗体和生物素化合成囊泡从而偶联至合成囊泡。在一优选的具体实施例中，在结合抗体或其它蛋白之前，合成囊泡已经预装了用于细胞输送的一种或更多种类型的货物分子。可替换地，合成囊泡可选地用响应浓度梯度形成跨层的跨膜电位这种方式制备。该浓度梯度可以通过钠/钾位(sodium/potassiumpotential)或pH值形成。在内部与外部的电位差异是一种驱动可电离的货物分子装载合成囊泡的可能的机制。可理解然后响应跨膜电位发生预制的合成囊泡的延迟装载。因此，在一个或更多个保护糖如以脱水状态储存的双糖海藻糖和蔗糖的存在下，这些合成囊泡可以脱水，由于具有离子梯度和相关的积累离子型货物分子的能力，随后复水。“免疫合成囊泡”，其中免疫脂质体是一个亚类，示例性地通过下述步骤制备(i)允许脂质体封装货物分子如荧光染料(Hoechst-33258，葡聚糖_荧光素(Dectran-Fluorescein)和葡聚糖-罗丹明绿(Dextran-RhodamineGreen))；(ii)通过使用整合进脂质体表面的生物素化磷脂将脂质体结合至链霉亲和素；然后(iii)将该结构连接，至少，每个合成囊泡一个生物素化抗体。可理解，优选地，在将生物素-链霉亲和素结合抗体接触生物素化合成囊泡之前，链霉亲和素连接或结合至生物素化蛋白或抗体。抗体优选地对两个神经元特异性受体(谷氨酸受体亚型N-甲基-D-天门冬氨酸受体-l(N-methyl-D-AsparateReceptor-l,NMDA-Rl)或甘氨酸受体)之一是特异性的，将它们结合至在步骤(ii)整合的链霉亲和素。然后该免疫脂质体制剂与培养的大鼠大脑皮层或小脑颗粒神经元或分化的神经PC-12细胞一起孵育，在那里将检测免疫脂质体通过结合至脂质体的抗体结合神经细胞表面的受体和可选地输送货物分子至靶向细胞的细胞内空间或细胞质的能力。整个脂质体可以可选地内化，以便封装的荧光染料或其它货物分子在神经元内释放。几种不同类型的发明的脂质体可选地用抗体类型、脂质体结构组分(脂质)和封装的分子(货物分子)的变体进行生产。优选地，使用了两种类型的抗体，NMDA受体抗体和甘氨酸受体抗体。两种受体都可以在神经细胞如CGN或人或动物体内神经元表面发现。脂质体可选地在货物分子存在或不存在下形成。荧光染料的类型示例性地包括Hoechst-33258，葡聚糖-罗丹明绿和葡聚糖-FITC。示例性使空脂质体摄取染料Hoechst-33258和葡聚糖-罗丹明绿，自制脂质体在染料葡聚糖-FITC存在下封装染料葡聚糖-FITC(见表1)。表1制备的封装染料的脂质体类型权利要求1.一种用于输送活性剂分子货物进入神经细胞的方法，其特征在于，包括将至少一活性剂货物分子置于合成囊泡中；将生物素化蛋白结合至所述合成囊泡以形成蛋白结合的合成囊泡，所述蛋白识别表达在神经细胞的表面的受体；和将所述细胞接触所述蛋白结合的合成囊泡直到所述至少一活性剂货物分子输送进神经细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述蛋白是抗体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述至少一活性剂货物分子是钙蛋白酶抑制剂、半胱天冬蛋白酶抑制剂、或它们的组合。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述合成囊泡是脂质体。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述受体是用于选自包括谷氨酸、甘氨酸、多巴胺、尼古丁、毒蕈碱、乙酰胆碱或羟色胺的组合的配体的细胞受体。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中在所述合成囊泡结合生物素化蛋白之前，所述至少一活性剂货物分子装入所述合成囊泡中。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述合成囊泡通过置于中间的亲和素或链霉亲和素结合至所述生物素化蛋白。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述神经细胞是体外的或间接体内的。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述神经细胞是体内的。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述神经细胞是在对象的中枢神经系统中。11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述神经细胞是在对象的周围神经系统中。12.—种组合物，其特征在于，包括具有容积和外表面的合成囊泡；在所述合成囊泡的容积内的至少一活性剂货物分子；结合至所述合成囊泡的外表面的生物素化抗体，所述抗体识别表达在神经细胞的表面的受体。13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，其中所述受体是用于选自包括谷氨酸、甘氨酸、多巴胺、尼古丁、毒蕈碱、乙酰胆碱或羟色胺的组合的配体的细胞受体。14.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，其中所述配体是谷氨酸。15.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，其中所述合成囊泡是脂质体，聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚己酸内酯。16.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，还包括位于所述生物素化抗体和所述合成囊泡之间的亲和素或链霉亲和素。17.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，其中所述合成囊泡是生物素化的。18.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，其中所述至少一活性剂货物分子是钙蛋白酶抑制剂、半胱天冬蛋白酶抑制剂、或它们的组合。19.一种治疗CNS细胞的疾病、伤害或健康状况的方法，其特征在于，包括将根据权利要求12所述的组合物输送至对象。20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，其中所述健康状况是创伤性脑损伤。21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，其中所述至少一活性剂货物分子是凋亡或胀亡抑制剂。22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述凋亡或胀亡抑制剂选自钙蛋白酶抑制剂、半胱天冬蛋白酶抑制剂、或它们的组合的组合。23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述处理是输送所述凋亡或胀亡抑制剂至经受创伤的CNS细胞。24.一种用于制备根据权利要求12所述的组合物的方法，其特征在于，包括形成合成囊泡；和将生物素化磷脂酰乙醇胺专门整合进所述外表面中。25.根据权利要求M所述的方法，其特征在于，在形成合成囊泡时所述至少一活性剂货物分子存在。26.根据权利要求M所述的方法，其特征在于，在所述抗体结合至所述合成囊泡之前，亲和素或链霉亲和素结合至所述抗体。27.一种剂型，其特征在于，包括根据权利要求12-18任一所述的组合物作为活性成分，与一个或更多个可接受的载体、赋形剂或媒介物连接。28.根据权利要求12-18任一所述的组合物在制备用于细胞间输送活性剂货物分子至神经细胞的药物中的应用。29.—种商业包装，其特征在于，包括权利要求12所述的组合物作为活性成分，及用于其输送活性剂货物分子至神经细胞的使用说明书。30.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基本上如在任何实例中在这里所描述的。全文摘要本发明提供了一种用于输送至少一活性剂货物分子进入神经细胞的方法，其中货物分子置于合成囊泡例如脂质体中；生物素化蛋白例如抗体结合至所述合成囊泡以形成蛋白结合的合成囊泡，其中所述蛋白识别表达在神经细胞的表面的受体；和将所述蛋白结合的合成囊泡接触所述细胞直到所述货物分子输送进神经细胞。各种货物分子通过发明的合成囊泡进行输送，包括钙蛋白酶抑制剂和半胱天冬蛋白酶抑制剂。蛋白示例性地靶向用于配体例如谷氨酸、甘氨酸、多巴胺、尼古丁、毒蕈碱、乙酰胆碱或羟色胺等等的细胞受体。文档编号A61P25/28GK102065894SQ200980122491公开日2011年5月18日申请日期2009年4月17日优先权日2008年4月17日发明者乔纳森·王,凯文·卡王·王,斯蒂芬·弗兰克·拉尔内尔,贾里德·V·古德曼申请人:班扬生物标记公司