用于提供或增强哺乳动物中免疫刺激应答的包含复合(m)RNA和裸(m)RNA的组合物及其应用的制作方法

专利名称：用于提供或增强哺乳动物中免疫刺激应答的包含复合(m)RNA和裸(m)RNA的组合物及其应用的制作方法
用于提供或增强哺乳动物中免疫刺激应答的包含复合(m) RNA和裸(m) RNA的组合物及其应用本发明涉及免疫刺激组合物，其包含a)佐剂成分，其包括或由至少一种(m)RNA组 成，所述(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物复合，和b)至少一种游离mRNA，其编码至少一 种治疗活性蛋白、抗原、过敏原和/或抗体，其中所述免疫刺激组合物能够引起或增强哺乳 动物中的先天性和任选地适应性免疫应答。本发明的免疫刺激组合物可以是药物组合或疫 苗。本发明进一步涉及制备本发明的免疫刺激组合物的方法。本发明还涉及本发明的免疫 刺激组合物或其成分用于治疗多种疾病(用于制备用于治疗多种疾病的药物组合或疫苗) 的应用。最后，本发明涉及含有本发明的免疫刺激组合物、其成分和/或所述药物组合物或 疫苗的试剂盒。先天性和/或适应性免疫系统的免疫应答的诱导和/或增强在治疗和预防多种疾 病中起重要作用。为了该目的，典型通过例如施用免疫刺激剂或佐剂来调节免疫系统。然 而，脊椎动物诸如人的免疫系统非常复杂且受到精细调节。其由许多类型的蛋白、细胞、器 官和组织组成，它们在精细和动态网络中相互作用。免疫系统典型地使用特异性逐渐增加 的分层防御来保护这些生物体免受感染。一层防御包括物理或化学屏障并容许至少一些病 原体和抗原的推测的(priori)消除。另一层防御包括先天性和适应性免疫系统。先天性免疫系统，作为免疫系统的一部分，是大多数生物体中主要的宿主防御系 统并包括屏障诸如体液屏障和化学屏障包括，例如，发炎、补体系统和细胞屏障。先天性免 疫系统典型地基于少量受体，称为模式识别受体。它们识别保守的分子模式，所述分子模式 将外源生物体，如病毒、细菌、真菌和寄生虫与它们的宿主的细胞相区分。这样的病原体相 关分子模式包括病毒核酸、细菌和真菌壁成分、鞭毛蛋白，以及更多。详尽研究的模式识别受体的第一家族是Toll样受体(TLR)家族。TLR是跨膜 蛋白，其识别胞外环境的配体或内体腔的配体。在配体结合后，它们通过胞质衔接蛋白 转导信号，这导致触发宿主防御应答和引起抗微生物肽、促炎趋化因子和细胞因子、抗病 毒细胞因子等的产生(参见例如Meylan，Ε.，J. Tschopp，等(2006). "Intracellular pattern recognition receptors in the host response (宿主应答中的胞内模式识别受 体).” Nature (自然)442(7098) :39-44)。迄今为止，已经在人中识别了至少10种Toll 样受体成员(TLRs 1-10)并在小鼠中识别了 13种(TLRs 1-13) 0人中的那些Toll样受 体(TLRs)包括TLR1-TLR2(已知配体三酰基脂肽)，TLR1-TLR6 (已知配体二酰基脂 肽)，TLR2(已知配体肽聚糖)，TLR3(已知配体:dsRNA)，TLR4(已知配体革兰氏阴性菌 的LPS(脂多糖)))，TLR5(已知配体细菌鞭毛蛋白)，TLR7/8(已知配体咪唑并喹啉，鸟 苷类似物和ssRNA)，TLR9 (已知配体细菌、病毒和原生动物的CpG DNA和疟褐素(血红蛋 白的消化产物))和TLR10。在识别微生物病原体后，这些TLR典型地触发胞内信号传导途 径，所述途径导致诱导炎性细胞因子(例如，TNF-α，IL-6，IL-I-β和IL-12)、I型干扰素 (IFN-β 和多 IFN-α)和趋化因子(Kawai，T.和 S. Akira Q006). “ TLR signaling (TLR 信 号传导)· “ Cell Death Differ (细胞死亡和分化)13 (5) :816-25)。作为更复杂的脊椎动物免疫应答的一部分，免疫系统随时间适应于更有效地识别特定病原体或抗原。这些适应过程创建免疫记忆并在将来遭遇这些病原体的过程中容许甚 至更有效的保护。该适应性或后天免疫性的过程形成疫苗接种策略的基础。与如上所述的 先天性免疫系统相反，适应性免疫系统是抗原-特异性的且要求在称为抗原呈递过程中识 别特异性“自身”或“非自身”抗原。此外，与以种属方式识别和应答病原体的先天性免疫 系统的细胞不同，适应性免疫系统对宿主赋予持久的或保护性免疫并由此容许针对特异性 病原体、病原体感染细胞或抗原的更特定应答。建立这些特定应答的能力通过所谓的“记忆 细胞”保持在体内。如果抗原或病原体进入/感染身体超过一次，则这些特异性记忆细胞用 于快速消除它们。适应性免疫系统由此容许更强的免疫应答以及免疫记忆，其中有利于特 定疾病可能有不同的免疫应答。例如，在感染的情形中，各种病原体通过标志(signature) 抗原来“记忆”，而在癌症情形中，肿瘤抗原或自身抗原可以通过适应性免疫系统来识别和 中和。脊椎动物中的适应性免疫系统的主要成分在细胞水平上主要包括淋巴细胞且在 分子水平上主要包括抗体。作为适应性免疫系统的细胞成分的淋巴细胞包括源自骨髓中 造血干细胞的B细胞和T细胞。B细胞参与体液应答，而T细胞参与细胞介导的免疫应答。 B细胞和T细胞均携带识别特异性靶标的受体分子。T细胞仅在抗原(例如病原体的小片 段)已经在与称为主要组织相容性复合物(MHC)分子的“自身”受体结合的条件下加工和 呈递后，识别“非自身”靶标，诸如病原体靶标结构。相反，B细胞抗原特异性受体是B细胞 表面上的抗体分子，并在其表面上的抗体结合特异性外源抗原时照此识别病原体。这种抗 原/抗体复合物被B细胞吸收并通过蛋白水解加工为肽。B细胞然后在其表面MHC II型分 子上展示这些抗原肽。这种MHC和抗原的组合吸引匹配的辅助性T细胞，这释放淋巴因子 并激活B细胞。当活化的B细胞再开始分裂时，其后代分泌数百万识别该抗原的抗体拷贝。 这些抗体在血浆和淋巴中循环，结合病原体或表达抗原的肿瘤细胞并对其进行标记从而通 过补体活化来破坏或通过吞噬细胞来吸收和破坏。作为适应性免疫系统的细胞成分，细胞 毒性T细胞(CD8+)也可以形成CTL应答。细胞毒性T细胞(CD8+)可以识别来自内源病原 体和通过MHC I型分子结合的自身抗原的肽。CD8+-T细胞通过在细胞中释放细胞毒性蛋白 执行其杀伤功能。免疫系统的两种基础机制，即先天性免疫系统以及适应性免疫系统，均可以由此 形成药物治疗和预防多种疾病的靶标。本领域中目前已知的合适方法利用佐剂引起先天性 免疫应答或利用抗原、病原体或免疫原来引起适应性免疫应答，或在一些罕见的情形中，二具体地，适应性免疫应答可以通过对细胞或宿主生物体施用如上所述采用肽或蛋 白抗原形式的特异性外源抗原来引起，或抗原可以由核酸，例如cDNA或信使RNA来编码。 为了引起有效的适应性免疫应答，先天性免疫系统的另外的非特异性刺激是有利的，例如 当与抗原特异性信号平行地提供非特异性刺激时。平行的非特异性刺激将免疫系统转变为 活化状态，这提高适应性免疫应答。能够提供这样的非特异性免疫应答的化合物典型地称 为“佐剂”。现有技术中已经将许多化合物和组合物提议为佐剂，例如Freimd佐剂，金属氧 化物，例如明矾(氢氧化铝)，无机螯合物或其盐，多种石蜡样油，合成树脂，藻酸盐，类粘蛋 白，多糖化合物，酪蛋白酸盐，以及由血液和/或血块分离的化合物，诸如，例如，血纤蛋白 衍生物，等。这些佐剂典型地可以与其他化合物，诸如例如蛋白，肽，DNA-或RNA-分子或其他治疗活性化合物组合使用，这取决于待获得的结果。然而，可以编码特异性抗原或任何其他治疗活性蛋白的游离信使RNA(mRNA)分 子，cDNAs或核酸一般适合于特异性治疗，典型地不表现出显著或甚至无免疫刺激性质。然 而，当与肽或蛋白，诸如鱼精蛋白或核酸结合蛋白复合时，这样的免疫刺激性质可以赋予给 mRNA分子、cDNA或核酸。在该上下文中，mRNA分子或核酸可以这样配制，以使得mRNA分子 或核酸与肽或蛋白之间形成复合物，其中在mRNA分子或核酸与肽或蛋白之间可以形成不 同的复合物。特别强的(佐剂)复合物可以在通常在中性PH下带负电的核酸与阳离子或 聚阳离子肽或蛋白结合时发生然而，当在疫苗接种方法中使用mRNA或核酸分子时，mRNA或核酸分子体内翻译保 持最重要且最基本的诱导适应性免疫应答或表达通常编码蛋白的因素，例如在治疗活性蛋 白或肽的情形中。因此，复合的mRNA或核酸分子将必须由与(阳离子)肽或蛋白的复合物 释放，这发生在将该复合物转染到细胞中以容许mRNA的有效翻译之后。不幸地，这在大多 数情形中不发生。更典型地，mRNA分子或核酸与阳离子或聚阳离子化合物复合甚至可以防 止核酸翻译或至少显著地减小体内翻译速度，这归因于聚阳离子化合物与通常mRNA分子、 cDNA或核酸分子的强结合。因此，使用这些化合物很难获得该组合物关于先天性免疫系统 的良好免疫刺激性质，且当使用这样制剂很难平行地确保mRNA分子、cDNA或核酸分子的有 效翻译。避开以上问题的一种可能性可以是以分开的制剂施用佐剂和mRNA。然而，这致使 施药更加复杂得多。还优选的是，佐剂和抗原编码mRNA进入同一细胞，以获得最佳免疫应 答。此外，佐剂有益地支持适应性免疫应答的诱导，条件是该佐剂在其中由编码mRNA表达 抗原的同一细胞中诱导先天性免疫应答。避开以上问题的另一种可能性可以是排他的施用裸mRNA，cDNA或核酸。这样的方 法虽然有利于mRNA，cDNA或核酸体内有效翻译的目的，但是免除由如上所述的佐剂引起的 先天性免疫系统的有利活化。因此，这些方法中没有一种是实际上令人信服的并且也不导致与施用的mRNA， cDNA或核酸的良好翻译平行的先天性免疫应答。因此，本领域中仍存在对提供容许引起先 天性和任选地适应性免疫应答的有效免疫刺激组合物或方法的需要，其中施用不受mRNA 无效翻译的削弱，mRNA无效翻译归因于与复合配偶体形成复合物，这赋予mRNA免疫刺激 性质。换言之，本发明的目的是提供容许在哺乳动物中引起或增强先天性和任选地适应性 免疫刺激应答的方法和免疫刺激组合物，由此确保有效佐剂(免疫刺激)性质和待施用的 mRNA的有效翻译。该目的通过本发明的主题，优选通过所附权利要求来解决。具体地，本发明通过免 疫刺激组合物来解决以上目的，所述免疫刺激组合物包括a)佐剂成分，其包括或由至少 一种(m) RNA组成，所述(m) RNA与阳离子或聚阳离子化合物复合，和b)至少一种游离mRNA， 其编码至少一种治疗活性蛋白、抗原、过敏原和/或抗体，其中所述免疫刺激组合物能够引 起或增强哺乳动物中的先天性和任选地适应性免疫应答。在本发明的上下文中，哺乳动物可以选自任何哺乳动物，优选选自包括但不仅限 于，例如山羊、牛、猪、狗、猫、驴、猴、猿、啮齿动物诸如小鼠、仓鼠、兔、和特别地，人的组的哺 乳动物。
本发明免疫刺激组合物的主要优点是在哺乳动物中有效引起先天性和任选地适 应性免疫应答，其中至少一种编码至少一种治疗活性蛋白的游离mRNA的翻译不被佐剂成 分，特别地，所述至少一种(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物的复合而削弱。这具体归因 于这样的事实，即佐剂成分通过使用用于复合的阳离子或聚阳离子化合物形成，这典型地 导致RNA和阳离子化合物之间的强复合，该阳离子化合物几乎不释放与其复合的RNA。因 此，游离mRNA不再受阳离子化合物的影响，尽管在一种制剂中共同施用佐剂成分和游离 mRNA也导致游离mRNA的体内转染和表达显著提高。根据本发明的溶液利用本发明的发明 人的惊人发现，即免疫刺激组合物的两种性质，即有效免疫刺激性质和RNA的有效翻译，可 以在同一个制剂中获得，条件是该制剂本身以两个分离的步骤制备。该溶液甚至是更令人 信服的，因为它容许佐剂成分与任何游离mRNA在不通过与佐剂成分的阳离子化合物复合 而失去游离mRNA的条件下混合。该溶液甚至可以在不导致复合的RNA和游离mRNA之间的 平衡反应的条件下保存相当长时间。换言之，不存在形成的佐剂成分的分解，所述分解可以 导致游离mRNA与佐剂成分的阳离子化合物结合并导致结合的RNA从复合物中释放。作为第一成分，本发明的免疫刺激组合物包括所谓的“佐剂成分”，其包括或由至 少一种(m)RNA组成，所述(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物复合。所谓的“佐剂成分”根据第一步骤制备，所述第一步骤是通过使佐剂成分的至少一 种(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物以特定比率复合形成稳定的复合物。在该上下文中， 重要的是，在与(m)RNA复合后，无游离阳离子或聚阳离子化合物或仅可忽视的小量保持在 佐剂成分中。因此，佐剂成分中(m)RNA和阳离子或聚阳离子化合物的比率典型地在这样的 范围中选择，即(m)RNA完全复合和无游离阳离子或聚阳离子化合物或仅可忽视的小量保 持在组合物中。优选地，佐剂成分的比率，即(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物的比率选 自约 6 1 (w/w)-约 0. 25 1 (w/w)，更优选约 5 1 (w/w)-约 0. 5 1 (w/w)，甚至更优 选约 4 1 (w/w)-约 1 1 (w/w)或约 3 1 (w/w)-约 1 1 (w/w)，和最优选约 3 1 (w/ w)-约2 1 (w/w)的比率的范围。此外，佐剂成分中(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物的比率，也可以基于整个 RNA复合物的氮/磷比(N/P-比)计算。例如，lug RNA典型地包含约3nmol磷酸残基， 条件是RNA表现出统计学碱基分布。另外，Iyg肽典型地包含约χ nmol氮残基，这取决于 碱性氨基酸的分子量和数量。当示范性计算(Arg)9(分子量14Mg/mol，9个氮原子)时， 1 μ g (Arg)9 包含约 700pmol (Arg)9 且因此 700x 9 = 6300pmol 碱性氨基酸=6. 3nmol 氮原 子。对于约1 1的RNA/(Arg)9质量比，可以计算出约2的N/P比。当示范性地计算具有 约2 1质量比、具有2yg RNA的鱼精蛋白(分子量约4250g/mol，21个氮原子，当使用来 自鲑鱼的鱼精蛋白时)时，关于RNA计算出6nmol磷酸；Iyg鱼精蛋白包含约235pmol鱼 精蛋白分子并且因此23 21 = 4935pmol碱性氮原子=4. 9nmol氮原子。对于约2 1 的RNA/鱼精蛋白质量比，可以计算出约0. 81的N/P比。对于约8 1的RNA/鱼精蛋白质 量比，可以计算出约0.2的N/P比。在本发明的上下文中，关于该复合物中的RNA 肽比， N/P-比优选在约0. 1-10的范围内，优选在约0. 3-4的范围内和最优选在约0. 5-2或0. 7-2 的范围内，和最优选在约0. 7-1. 5的范围内。在本发明的上下文中，阳离子或聚阳离子化合物优选选自任何适合于复合并由此 稳定核酸，特别地至少一种(m)RNA的阳离子或聚阳离子化合物，所述稳定作为是例如通过使所述至少一种(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物的缔合实现的。这样的阳离子或聚 阳离子化合物本身不需要展示任何佐剂性质，因为佐剂性质，特别是诱导先天性免疫应答 的能力优选在至少一种(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物复合时产生。当至少一种(m) RNA与阳离子或聚阳离子化合物复合时。形成佐剂成分。特别优选地，阳离子或聚阳离子 肽或蛋白作为成分P2可以选自鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，聚-L-赖氨酸(PLL)， 碱性多肽，聚-精氨酸，细胞渗透肽(CPI^s)，嵌合CPI^s，诸如Transporter!，或MPG肽，HIV 结合肽，Tat, HIV-ITat (HIV), Tat衍生的肽，寡精氨酸，穿膜肽(penetratin)家族成员， 例如穿膜肽，触角足衍生肽(特别地来自果蝇触角足)，pAntp，plsl，等，抗微生物衍生的 CPI3S 例如 Buforin-2，Bac715_24，SynB, SynB(I), pVEC, hCT-衍生的肽，SAP，MAP, KALA, PpTG20，富含脯氨酸的肽，L-寡聚体，富含精氨酸的肽，降钙素肽，FGF，乳铁蛋白，聚-L-赖 氨酸，聚精氨酸，组蛋白，VP22衍生肽或类似物肽，HSV, VP22(单纯疱疹)，MAP，KALA或蛋 白转导结构域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，Pep-I, 一种或多种降钙素肽等。另外地，优选的阳离子或聚阳离子蛋白质或肽可以是选自具有下 列总式的下列蛋白或肽(Arg)1 ； (Lys)m ； (His)n ； (Orn)0 ； 0(aa)x，其中 1+m+n+o+x = 8-15, 并且1，m，11或0彼此独立地可以是选自0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15的 任何数字，条件是Arg，Lys, His和Orn的总含量代表寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且 Xaa可以是选自除Arg，Lys, His或Orn之外的天然(=天然存在)或非天然氨基酸的任 何氨基酸；并且χ可以是选自0，1，2，3，4，5，6，7或8的任何数字，条件是fea的总含量不 超过寡肽的所有氨基酸的50%。在该情形中特别优选的寡精氨酸例如是Ai^7，Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3，YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R,等。可以用于复合以上佐剂成分的至 少一种(m)RNA的另外的优选的阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖，例如脱乙 酰壳多糖，1，5-二甲基-1，5-二氮i^一亚甲基聚甲溴化物，阳离子聚合物，例如聚乙烯亚 胺(PEI)，阳离子脂质，包括 DOTMA :[1_ (2，3-二油氧基(sioleyloxy)丙基)]_N，N，N-三 甲基氯化铵，DMRIE，二 -C14-脉，DOTIM, SAINT, DC-Choi, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE 二油基磷脂酰乙醇-胺，DOSPA, DODAB, D0IC, DMEPC, DOGS 二十八烷基酰氨基甘氨酰精 胺(Dioctadecylamidoglicylspermin)，DIMRI 二肉豆蔻酸(myristo)-氧基丙基二甲基 羟基乙基溴化铵，DOTAP 二油酰氧基-3-(三甲基氨溶)丙烷，DC-6-14 0, 0-二(十四烷 酰)-Ν_(α-三甲基氨溶乙酰基)二乙醇胺氯化物，CLIPl 外消旋-[(2，3_ 二(十八烷基) 氧基丙基)(2-羟基乙基)]_ 二甲基氯化铵，11 6:外消旋-[2(2，3-二(十六烷基)氧 基丙基-氧基甲氧基)乙基]三甲基铵，11 9:外消旋-[2(2，3-二(十六烷基)氧基丙 基-氧基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基铵，oligofectamine，或阳离子或聚阳离子聚合物，例 如修饰的聚氨基酸，如β -氨基酸-聚合物或逆聚酰胺类，等，修饰的聚乙烯类，如PVP (聚 (N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鐺))等，修饰的丙烯酸酯类，如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙 基甲基丙烯酸酯))，等，修饰的酰胺胺类(amidoamines)如pAMAM(聚(酰胺胺))等，修饰 的聚β氨基酯(ΡΒΑΕ)，如二胺端修饰的1，4 丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合 物等，树型化合物(dendrimers)，如聚丙基胺树型化合物或基于pAMAM的树型化合物，等， 聚亚胺类，如PEI 聚(乙烯亚胺)，聚(丙烯亚胺)，等，聚烯丙基胺，基于糖主链的聚合物， 如基于环糊精的聚合物，基于葡聚糖的聚合物，脱乙酰壳多糖等，基于硅烷主链的聚合物， 如PM0XA-PDMS共聚物等，由一个或多个阳离子嵌段(例如如上所述的选择的阳离子聚合物)和一个或多个亲水性或疏水性嵌段(例如聚乙二醇(polyethyleneglycole))的组合 组成的嵌段聚合物等。本发明免疫刺激组合物的修饰的(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合 物的缔合或复合优选地为该(m)RNA提供佐剂性质并将稳定作用通过复合赋予佐剂成分的 (m)RNA。用于稳定修饰的(m)RNA的方法通常描述在EP-A-1083232中，将所述公开内容的全 部通过引用结合在本文中。特别地，优选的阳离子或聚阳离子化合物是选自由下列各项组 成的组的化合物如上定义的鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺，亚精胺，寡精氨酸，如Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3，YSSR9SSY, (RKH) 4，Y (RKH) 2R，等。 在本发明的上下文中，本发明的免疫刺激组合物的“佐剂成分”的至少一种(m) RNA 可以是任何RNA，优选，但不仅限于，短RNA寡核苷酸，编码RNA，免疫刺激性RNA，siRNA,反义 RNA，或核开关(riboswitches)，核酶或适体。此外，佐剂成分的至少一个(m) RNA可以是单 链或双链RNA (其也可以被认为是RNA (分子)，这归因于两个单链RNA (分子)的非共价结 合)或至少部分自身互补的部分双链或部分单链RNA (这些部分双链或部分单链RNA分子 均典型地由较长和较短的单链RNA分子或由2个基本等长的单链RNA分子形成，其中一个 单链RNA分子与另一个单链RNA分子部分互补且二者由此在该区域内形成双链RNA分子， 即部分双链或部分单链RNA)。优选地，“佐剂成分”的至少一种(m)RNA可以是单链RNA。此 外，“佐剂成分”的至少一种(m)RNA可以是环形或线性RNA，优选是线性RNA。更优选地，“佐 剂成分”的至少一种(m) RNA可以是(线性)单链RNA。“佐剂成分”的至少一种(m) RNA可以 是核糖体RNA (rRNA)，转运RNA (tRNA)，信使RNA (mRNA)，或病毒RNA (vRNA)，更优选是mRNA。 本发明容许全部这些RNA单独地或组合地成为本发明的组合物的“佐剂成分”的一部分。在 本发明的上下文中，mRNA典型地是这样的RNA，其由若干结构部件组成，例如任选的5’_UTR 区，即位于上游的核糖体结合位点及随后的编码区，任选的3’ -UTR区，所述3’ -UTR区后可 以是聚-A尾部(和/或聚-C-尾部)。mRNA可以作为单、双或甚至多顺反子RNA，即携带1 个、2个或更多蛋白质或肽的编码序列的RNA存在。二或甚至多顺反子mRNA中的这种编码 序列可以由至少一个IRES序列分开，例如如上定义地。优选地，本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m) RNA包括约5至约 20，000,或100至约20，000个核苷酸，优选约250至约20，000个核苷酸，更优选约500至 约10，000，甚至更优选约500至约5，000的长度，最优选约100-10，000个核苷酸的长度或 约100-5，000个核苷酸的长度。根据第一个实施方案，本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA 可以是短RNA寡核苷酸。本发明上下文中的短RNA寡核苷酸可以包括任何如上定义的RNA。 优选地，所述短RNA寡核苷酸可以是单链或双链RNA寡核苷酸，更优选是单链RNA寡核苷 酸。甚至更优选地，所述短RNA寡核苷酸可以是线性单链RNA寡核苷酸。还优选地，如本文 中使用的短RNA寡核苷酸可以包括如上通常关于RNA分子定义的长度，更优选5-100，5-50， 或5-30个核苷酸的长度，和甚至更优选，20-100, 20-80，或20-60个核苷酸的长度。按照第二个实施方案，本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA 可以是免疫刺激性RNA，即源自免疫刺激性RNA的RNA，其触发或增加(先天性)免疫应答。 优选地，本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m) RNA可以是单链、双链或部分 双链或部分单链RNA，更优选单链RNA，和/或环状或线性RNA，更优选线性RNA。更优选地， 所述佐剂成分的至少一种(m) RNA可以是(线性)单链RNA。甚至更优选地，所述佐剂成分的至少一种(m)RNA可以是((线性)单链)信使RNA(mRNA)。本发明的免疫刺激组合物的 佐剂成分的至少一种(m) RNA还可以作为如上定义的短RNA寡核苷酸存在。本发明的免疫 刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA还可以选自天然发现或合成制备的任何RNA分 子类型，并且其可以诱导先天性免疫应答。在该上下文中，优选的是，本发明的免疫刺激组 合物的佐剂成分典型地引起先天性免疫应答，而本发明的免疫刺激组合物的游离mRNA可 以引起适应性免疫应答，特别是如果游离mRNA编码如本文中所述的抗原或过敏原或能够 引起适应性免疫应答的任何其他分子。特别地，可以诱导先天性免疫应答的那些类型的RNA 分子可以选自Toll样受体(TLRs)的配体。本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一 种免疫刺激性RNA可以因此包括已知为免疫刺激性的任何RNA序列，包括但不仅限于，表 示和/或编码TLRs的配体的RNA序列，所述TLRs优选选自人家族成员TLR1-TLR10或鼠 科家族成员TLR1-TLR13，更优选选自TLR7和TLR8，关于RNA胞内受体的配体(诸如RIG-I 或 MDA-5，等·)(参见例如 Meylan，Ε.，Tschopp, J. (2006) Toll—like receptors and RNA helicases :two parallel ways to trigger antiviral responses (Toll 样受体禾口 RNA 螺 旋两种用于触发抗病毒应答的平行方式).Mol. Cell (分子细胞)22，561-569)，或任何其 他免疫刺激性RNA序列。典型地，作为本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA使用的免 疫刺激性RNA可以包括如上关于本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的RNA的RNA分子普 遍定义的长度。优选地,该RNA可以具有1000-5000，500-5000，5-5000，或5-1000，5-500， 5-250，5-100，5-50或5-30个核苷酸的长度。这样的免疫刺激性序列可以包括例如式(I)的核酸G1XmGn其中G是鸟苷、尿嘧啶或鸟苷或尿嘧啶的类似物；X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物；1是由1到40的整数，其中当1 = 1时，G是鸟苷或其类似物，当1 > 1时，至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物；m是整数且至少是3 ；其中当m = 3时，X是尿嘧啶或其类似物，当m > 3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；η是由1到40的整数，其中当n = 1时，G是鸟苷或其类似物，当η > 1时，至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物。这样的免疫刺激性序列还可以包括例如式(II)的核酸C1XfflCn其中C是胞嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或尿嘧啶类似物；X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物；1是由1到40的整数，
其中当1 = 1时，C是胞嘧啶或其类似物，当1 > 1时，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物；m是整数且至少是3 ；其中当m = 3时，X是尿嘧啶或其类似物，当m > 3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；η是由1到40的整数，其中当n = 1时，C是胞嘧啶或其类似物，当η > 1时，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物。式(I)或(II)的核酸，其可以用于本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一 种(m)RNA，典型地是相对短的核酸分子且典型地具有约5-100(但对于特定实施方案也可 以比100个核苷酸更长，例如最长至200个核苷酸)，5-90或5-80个核苷酸的长度，优选 约5-70的长度，更优选约8-60的长度和，更优选约15-60个核苷酸，更优选20-60，最优选 30-60个核苷酸的长度。如果本发明的核酸具有例如100个核苷酸的最大长度，则m应该典 型地<=98。式(I)核酸中的核苷酸G的数量由1或η确定。1和η，彼此独立，分别是由 1到40的整数，其中当1或η = 1时，G是鸟苷或其类似物，且当1或η > 1时，至少50% 的核苷酸是鸟苷或其类似物。例如，在不暗示任何限制的条件下，当1或η = 4时，G1或Gn 可以是，例如，GUGU，GGUU，UGUG，UUGG，GUUG，GGGU，GGUG，GUGG，UGGG 或 GGGG，等.；当 1 或 η = 5 时，G1 或 Gn 可以是，例如，GG⑶U，GGUGU，⑶GGU，UGGGU，UG⑶G，UGUGG，UUGGG，⑶⑶G， GGGGU, GGGUG, GGUGG, GUGGG, UGGGG，或GGGGG，等；等。在根据本发明的式(I)的核酸中与 Xm相邻的核苷酸优选不是尿嘧啶。类似地，根据本发明的式(II)的核酸中的核苷酸C的 数量由1或η确定。1和η，彼此独立，分别是由1到40的整数，其中当1或η = 1时，C是 胞嘧啶或其类似物，且当1或η > 1时，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物。例如，在 不暗示任何限制的条件下，当1或η = 4时，C1或Cn可以是，例如，⑶⑶，CCUU, UCUC，UUCC, CUUC, CCCU, CCUC, CUCC, UCCC 或 CCCC,等·；当 1 或 η = 5 时，C1 或 Cn 可以是，例如，CCCUU, CCUCU，CUCCU，UCCCU，UCCUC，UCUCC，UUCCC，CUCUC，CCCCU，CCCUC，CCUCC，CUCCC，UCCCC, CCCCC，等；等。在根据本发明的式(II)的核酸中与Xm相邻的核苷酸优选不是尿嘧啶。优 选地，关于式(I)，当1或η > 1时，至少60 %，70 %，80 %，90 %或甚至100 %的核苷酸是鸟 苷或其类似物，如上定义。旁侧序列G1和/或Gn中剩余核苷酸至100% (当鸟苷构成少于 100%的核苷酸时)的是尿嘧啶或其类似物，如此前定义地。还优选，1和η，彼此独立，分别 是由2到30的整数，更优选是2到20的整数和还更优选2到15的整数。1或η的下限，如 果需要，可以变化并且是至少1，优选至少2，更优选至少3，4，5，6，7，8，9或10。该定义对应 地应用于式(II)。根据特别优选的实施方案，根据以上式(I)或(II)的核酸，其可以用于本发明的 免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA，可以选自由任意以下序列组成或包括任意 以下序列的序列-GGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 1)；-GGGG⑶UUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 2)；-GGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO 3)；-⑶⑶⑶⑶⑶⑶UUUUUUUUUUUUUUUGUGUGUGUGUGU(SEQID NO 4)；
13
一GGUUGGUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUUGGUUGGUUGGUU(SEQID NO5)
一GGGGGGGGGUUUGGGGGGGG(SEQID NO6)
一GGGGGGGGUUUUGGGGGGGG(SEQID NO7)
一GGGGGGGUUUUUUGGGGGGG(SEQID NO8)
一GGGGGGGUUUUUUUGGGGGG(SEQID NO9)
一GGGGGGUUUUUUUUGGGGGG(SEQID NO10)
一GGGGGGUUUUUUUUUGGGGG(SEQID N。l 1)
一GGGGGGUUUUUUUUUUGGGG(SEQID NOl 2)
一GGGGGUUUUUUUUUUUGGGG(SEQID NOl 3)
一GGGGGUUUUUUUUUUUUGGG(SEQID NO14)
一GGGGUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQID NOl 5)
一GGGGUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQID NO16)
一GGUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQID NOl 7)
一GUUUUUUUUUUUUUUUUUUG(SEQID NO18)
一GGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGG(SEQID NO19)
一GGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGG(SEQID NO20)
一GGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGG(SEQID N。2 1)
一GGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGG(SEQID NO22)
一GGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGG(SEQID NO23)
一GGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGG(SEQID NO24)
一GGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGG(SEQID NO2 5)
一GGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQID NO26)
一GGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQID NO2 7)
一GGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQID NO28)
一GGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQID NO29)
一GGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQID NO30)
一GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQID N。3 1)
一GGGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGGG(SEQID NO32)
一GGGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGGG(SEQID NO3 3)
一GGGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGGG(SEQID NO34)
一GGGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGGG(SEQID NO3 5)
一GGGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGGG(SEQID NO36)
一GGGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGGG(SEQID NO37)
一GGGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQID NO38)
一GGGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQID NO39)
一GGGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQID NO40)
一GGGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQID N。41)
一GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQID NO42)
一GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQID NO43)
-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 44)；-⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUG(SEQID NO :45)；-GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO :46)；-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO :47)；-GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO :48)；-GGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO :49)；-GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO :50)；-GGGGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO 51)；-GGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO :52)；-GGGGGGGG⑶UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO :53)；-GGUUUGG(SEQ ID NO 54)；-GGUUUUGG(SEQ ID NO 55)；-GGUUUUUGG(SEQ ID NO 56)；-GGUUUUUUGG(SEQ ID NO 57)；-GGUUUUUUUGG(SEQ ID NO 58)；-GGUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 59)；-GGUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 60)；-GGUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 61)；-GGUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 62)；-GGUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 63)；-GGUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 64)；-GGUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 65)；-GGUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO 66)；-GG⑶UUGGG (SEQ ID NO 67)-GG⑶UUUGGG (SEQ ID NO 68)；-GG⑶UUUUGGG(SEQ ID NO 69)；-GG⑶UUUUUGGG(SEQ ID NO 70)；-GG⑶UUUUUUGGG(SEQ ID NO 71)；-GG⑶UUUUUUUGGG(SEQ ID NO 72)；-GG⑶UUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 73)；-GG⑶UUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 74)；-GG⑶UUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 75)；-GG⑶UUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 76)；-GG⑶UUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO 77)；-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUGG⑶UUUUUUUUUUUUUUGG⑶UUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO: 78)；-GG⑶UUUUUUUUUUUUUUGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO :79)；-GG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGG⑶UUGGG (SEQ ID NO 80)；或
15
-CCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCC(SEQ ID NO: 81)-CCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCC(SEQ ID NO :82)-CCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCC(SEQ ID NO :83)或选自与这些序列中任一种具有至少60 %，70 %，80 %，90 %，或甚至95 %序列同 一性的序列。在该上下文中，本申请中的术语“同一性”意为序列相对于参照序列进行比较，并 且百分比同一性通过比较它们而确定。例如为了确定两个核酸序列的百分比同一性，所述 序列可以首先相对于彼此排列(排比)从而可以进行序列的随后的比较。为此目的，例如， 可以将缺口引入第一核酸序列的序列中并且所述核苷酸可以与第二核酸序列的相应位置 比较。当在第一核酸序列中的位置被与第二序列中的位置相同的核苷酸占据时，那么两个 序列在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是相同位置的数目除以序列的函 数。如果，例如，关于与具有确定长度的参照核酸比较的特定核酸而设定具体的序列同一 性，那么相对于参照核酸相对地指出该百分比同一性。因此，例如从与具有100个核苷酸的 长度的参照核酸序列具有50%序列同一性的核酸序列起始，核酸序列可以代表具有50个 核苷酸的长度的核酸序列，其与具有长度为50个核苷酸的参照核酸序列的部分完全相同。 然而，其还可以代表具有50%同一性的具有长度为100个核苷酸的核酸序列，即在该情形 中，在其完整长度上与参照核酸序列50%相同的核酸。备选地，该核酸序列可以是具有长 度为200核苷酸的核酸序列，其在具有100个核苷酸长度的核酸序列部分中，与具有长度为 100个核苷酸的参照核酸序列完全相同。其它核酸序列自然同等满足这些标准。确定两个序列的百分比同一性可以通过数学算法来进行。可以用于比较两个序列 的数学算法的优选但非限制性的实例是Karlin等(1993)，PNAS USA, 90 :5873-5877的算 法。将所述算法整合到NBLAST程序中，使用所述程序可鉴定与本发明的序列具有需要的同 一性的序列。为了获得上述缺口排比(gapped alignment)，可以使用“缺口 BLAST”程序， 如在 Altschul 等(1997)，Nucleics Acids Res (核酸研究)，25 :3389-3402 中所述。当使 用BLAST和缺口 BLAST程序时，可以使用特定程序(例如NBLAST)的默认值参数。还可以使 用版本 9 的来自〃 Genetic Computing Group (基因计算组)〃的 GAP(glcAal alignment program(缺口排比程序))进一步排比序列，其中使用默认值(BL0SUM62)矩阵(-4-+11的 数值)，其具有-12的缺口开放罚分(对于缺口的第一个0)和-4的缺口延伸罚分(对于缺 口中的每个另外的连续的0)。在排比后，通过将对应的数目表示为要求保护的序列的核酸 的百分比来计算百分比同一性。还可以使用适合的程序，来将用于确定两个核酸序列的百 分比同一性的所述方法相应地应用于氨基酸序列。另外，这样的免疫刺激序列还可以包括例如式(III)的核酸(分子)(NuG1XmGnNv)a,其中G是鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)或鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)的类似 物，优选地鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；X是鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞 嘧啶)，或这些核苷酸(核苷)的类似物，优选地尿苷(尿嘧啶)或其类似物；
16
N是具有长度为约4-50，优选地约4-40，更优选地约4_30或约4_20个核酸的核酸 序列，每个N独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧 啶)，胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸(核苷)的类似物；a是1-20，优选地1_15，最优选地1_10的整数；1是1-40的整数，其中当1 = 1时，G是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，当1 > 1时，这些核苷酸(核苷)的至少50%是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；m是整数并且至少是3;其中当m = 3时，X是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，并且当m > 3时，存在至少3个连续的尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的类似物；η是1-40的整数，其中当n = 1时，G是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，当η > 1时，这些核苷酸(核苷)的至少50%是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；u, ν可以彼此独立地是0-50的整数，优选地，其中当u = 0时，ν彡1，或当ν = 0时，u 彡 1;其中根据式(III)的免疫刺激序列具有至少50个核苷酸的长度，优选地至少100 个核苷酸的长度，更优选地至少150个核苷酸的长度，甚至更优选地至少200个核苷酸的长 度和最优选地至少250个核苷酸的长度。根据本发明的式(III)的结构(NuG1XmGnNv)a包括优选如上定义的元件G1XmGn作为 核心结构，以及另外的边界元件Nu和/或Νν，其中完整的元件NuG1XmGnNv可以重复出现，即 至少一次，如通过整数a所确定的。如由本发明人意外发现地，根据式(III)的分子，即具 有如上定义的结构(NuG1XmGnNv)a，导致当与施用像这样的核心结构G1XmGn比较时患者中增加 的先天免疫应答，其特别由IFNa释放的增加而指示。此外，当其边界是如在式(III)中定 义的重复元件Nu和/或队时，包含上述核心结构G1XmGn的分子可以在细菌生物中以明显更 好的产率扩增。当通过使用体外转录方法来取代本领域已知的固相合成方法(其典型地受 限于核酸的具体大小)而制备根据如上定义的式(III)的结构(NuG1XmGnNv)a的分子时，这种 分子设计是特别有利的。式(III)的核心结构G1XmGn在下文中更精确地定义在式(III)(和式(I)和(II))的核酸分子中的G是核苷酸或脱氧核苷酸或包括 核苷，其中所述核苷酸(核苷)是鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)或其类似物，更优选地 鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物。在该情形中，鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸(核 苷)类似物被定义为天然存在的核苷酸(核苷)鸟苷(鸟嘌呤)和尿苷(尿嘧啶)的非天 然存在的变体。因此，鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)类似物典型地是具有非天然存在 的官能团或成分的化学衍生的核苷酸(核苷)，所述官能团或成分被优选地加入，被修饰， 或从天然存在的鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸中去除，或其取代天然存在的鸟 苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸的天然存在的官能团或成分。因此，天然存在的鸟 苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸的每个官能团或成分可以被修饰或从其中去除，即 碱基成分，糖(核糖)成分，任何天然存在的功能侧基和/或形成寡核苷酸主链的磷酸酯成分。磷酸酯部分可以由例如氨基磷酸酯(phosphoramidates)，硫代磷酸酯，肽核苷酸，甲基 膦酸酯等取代，然而，在本发明的背景中，天然存在的磷酸二酯主链仍旧是优选的。另外，糖 (核糖)成分选自脱氧核糖，特别地所述核酸是如上定义的RNA，其中糖(核糖)成分选自 脱氧核糖。因此，鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)的类似物，包括但不限于，已经例如通 过乙酰化，甲基化，羟基化等化学改变的任何天然存在或非天然存在的鸟苷(鸟嘌呤)或 尿苷(尿嘧啶)，包括例如1-甲基-鸟苷(鸟嘌呤)，2_甲基-鸟苷(鸟嘌呤)，2，2_ 二 甲基-鸟苷(鸟嘌呤)，7_甲基-鸟苷(鸟嘌呤)，二氢-尿苷(尿嘧啶)，4_硫代-尿苷 (尿嘧啶)，5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5-(羧基-羟甲基)-尿苷(尿 嘧啶)，5-氟-尿苷(尿嘧啶)，5_溴-尿苷(尿嘧啶)，5-羧甲基氨基甲基-尿苷(尿嘧 啶)，5_甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，N-尿苷(尿嘧啶)-5-氧乙酸甲酯，5-甲基氨基 甲基-尿苷(尿嘧啶)，5_甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5'-甲氧基羰基 甲基-尿苷(尿嘧啶)，5_甲氧基-尿苷(尿嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)-5-氧乙酸甲酯，尿苷 (尿嘧啶)-5-氧乙酸(ν)。所述类似物的制备是本领域技术人员已知的，例如从美国专利 4，373，071，US 4，401，796，US 4，415，732，US 4，458，066，US 4，500，707，US 4，668，777， US 4，973，679，US 5，047，524，US 5，132，418，US 5，153，319，US 5，262，530 和 5，700，642 中已知，将其全部公开内容通过引用结合在本文中。在如上述的类似物的情形中，尤其优选 那些类似物，其增加式(III)(和式(I)和(II))的核酸分子的免疫原性和/或不干扰已经 被引入的另外的修饰。至少一种鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)或其类似物可以存在于 核心结构元件G1和/或Gn中，任选地，核心结构元件G1和/或Gn中的核苷酸的至少10 %， 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80% 90%或甚至100%是天然存在的鸟苷(鸟嘌呤)，天 然存在的尿苷(尿嘧啶)，和/或其类似物，和/或显示如本文定义的其类似物的性质。优 选地，所述核心结构元件G1和/或Gn全然包含天然存在的鸟苷(鸟嘌呤)和/或天然存在 的尿苷(尿嘧啶)的至少一种类似物。最优选地，这些核心结构元件G1和/或6 的所有的 核苷酸(核苷)是类似物，其可以-最优选地-是关于相同类型的核苷酸(核苷)(例如， 将所有的鸟苷(鸟嘌呤)核苷酸提供为ι-甲基-鸟苷(鸟嘌呤))的相同类似物，或它们 可以是独特的(例如至少两个不同的鸟嘌呤类似物取代天然存在的鸟嘌呤核苷酸)。在式(III)(和式⑴和(II))的核酸分子中的核心结构元件Gte1和/或6 )的核 苷酸(核苷)的数目由1和η确定。1和n，彼此独立地分别是整数1-100，1-90，1-80，1-70， 1-60，优选地1-50，更优选地1-40，和甚至更优选地1-30，其中该范围的下限可以是1，但 是备选地也可以是 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24， 25，26，27，28，四，30，或甚至更多。优选地，对于每个整数，当1和/或η = 1时，G是鸟苷 (鸟嘌呤)或其类似物，并且当1或η > 1时，核心结构元件G (G1和/或Gn)的至少50%， 更优选地至少50%，60%，70%，80%，90%或甚至100%的核苷酸(核苷)是鸟苷(鸟嘌 呤)或其类似物。例如，但不限于，当1或η = 4时，G1和/或Gn可以是例如，GUGU，GGUU， UGUG, UUGG, GUUG, GGGU, GGUG, GUGG, UGGG 或 GGGG,等·；当 1 或 η = 5 时，G1 禾口 / 或 Gn 可 以是例如，GG⑶U，GGUGU，⑶GGU，UGGGU，UG⑶G，UGUGG，UUGGG，⑶⑶G，GGGGU，GG⑶G，GGUGG， GUGGG，UGGGG，或GGGGG，等；等。在式(III)(和式(I)和(II))的核酸分子中，直接邻近 于Xm的核心结构元件G1和/或Gn的核苷酸(核苷)优选地不是尿苷(尿嘧啶)或其类似物。更优选地，在式(III)的核酸分子中，直接邻近于XmW核心结构元件G1和/或6 的核 苷酸(核苷)是至少一个(鸟嘌呤)或其类似物，更优选地至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11， 12，13，14，15，16，17，18，19或甚至20或更多鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物的片段。另外，在 式(III)(和式⑴和(II))的核酸分子中的直接邻近于N，例如Nu，和/或队(或如下文定 义的Nwl或Nw2)的核心结构元件G1和/或Gn的核苷酸优选地不是尿苷(尿嘧啶)或其类似 物。更优选地，在式(III)(和式(I)和(II))的核酸分子中直接邻近于N，例如Nu，和/或 Nv(或如下文定义的Nwl或Nw2)的核心结构元件G1和/或Gn的核苷酸(核苷)是至少一个 鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，更优选地至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19或甚至20个或更多个鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物的片段。同样优选地，对于式(III)(和式(I)和(II))，当1或n> 1时，核心结构元件G1 和/或Gn的至少60%，70%，80%，90%或甚至100%的核苷酸(核苷)是鸟苷(鸟嘌呤) 或其类似物，如上定义。然后在核心结构元件61和/或6 中的剩余到100%的核苷酸(核 苷)(当鸟苷(鸟嘌呤)组成少于100%的这些核苷酸(核苷)时)，可以是尿苷(尿嘧啶) 或其类似物，如前文定义。在式(III)(和式⑴和(II))的核酸分子中的X，特别是Xm，也是核心结构元件 并且是核苷酸或脱氧核苷酸或包括核苷，其中所述核苷酸(核苷)典型地选自鸟苷(鸟嘌 呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或其类似物，优 选地尿苷(尿嘧啶)或其类似物。在该情形中，核苷酸(核苷)类似物被定义为天然存在 的核苷酸(核苷)的非天然存在的变体。因此，类似物是用非天然存在的官能团化学衍生 的核苷酸(核苷)，其优选地加入或从天然存在的核苷酸(核苷)中去除或其取代核苷酸 (核苷)的天然存在的官能团。因此，可以对天然存在的核苷酸的每种成分进行修饰，即碱 基成分，糖(核糖或脱氧核糖)成分和/或形成寡核苷酸主链的磷酸酯成分。磷酸酯成分可 以被例如，氨基磷酸酯，硫代磷酸酯，肽核苷酸，甲基膦酸酯等取代，然而其中天然存在的磷 酸二酯主链仍旧是优选的。如果免疫刺激序列全然包含至少一种类似物，优选地至少10%， 更优选地至少20 %，更优选地至少30 %，更优选地至少50 %，更优选地至少70 %和甚至更 优选地至少90%的所有“X”核苷酸可以显示如本文定义的类似物的性质。取代在核心结 构元件"Xm”中的特定核苷酸类型的类似物可以是相同的，例如在核心结构元件“Xm”中存在 的所有胞苷(胞嘧啶)核苷酸(核苷)由特定胞苷(胞嘧啶)类似物(例如2-硫代-胞 苷(胞嘧啶))形成，或它们对于特定核苷酸(核苷)可以是独特的，例如至少两个独特的 胞苷(胞嘧啶)类似物被包含在核心结构元件"Xm”中。鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧 啶)的类似物包括，但不限于，任何天然存在或非天然存在的鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧 啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)或胞苷(胞嘧啶)，其已经通过化学方式，例如通过 乙酰化，甲基化，羟基化等改变，包括1-甲基-腺苷(腺嘌呤)，2-甲基-腺苷(腺嘌呤)， 2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺苷(腺嘌呤)，N6-甲基-腺苷(腺嘌呤)，N6-异戊烯基-腺 苷(腺嘌呤)，2_硫代-胞苷(胞嘧啶)，3_甲基-胞苷(胞嘧啶)，4_乙酰基-胞苷(胞嘧 啶)，2，6- 二氨基嘌呤，1-甲基-鸟苷(鸟嘌呤)，2-甲基-鸟苷(鸟嘌呤)，2，2- 二甲基-鸟 苷(鸟嘌呤)，7-甲基-鸟苷(鸟嘌呤)，肌苷，1-甲基-肌苷，二氢-尿苷(尿嘧啶)，4-硫 代-尿苷(尿嘧啶)，5_羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5-(羧基羟甲基)-尿苷(尿嘧啶)，5_氟-尿苷(尿嘧啶)，5_溴-尿苷(尿嘧啶)，5_羧甲基氨基甲基-尿苷 (尿嘧啶)，5_甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，N_尿苷(尿嘧啶)-5-氧乙酸甲酯，5-甲基 氨基甲基-尿苷(尿嘧啶)，5_甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5'-甲氧基 羰基甲基-尿苷(尿嘧啶)，5-甲氧基-尿苷(尿嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)-5-氧乙酸甲酯， 尿苷(尿嘧啶)-5-氧乙酸(ν)，queosine，β _D_ 甘露糖基-queosine，wybutoxosine，和肌 苷。所述类似物的制备是本领域技术人员已知的，例如从US 4, 373, 071,US 4, 401, 796,US 4，415，732，US 4，458，066，US 4，500，707，US 4，668，777，US 4，973，679，US 5，047，524，US 5，132，418，US 5，153，319，US 5，262，530 和 US 5，700，642 中已知。在如上述的类似物的 情形中，尤其优选那些核苷酸(核苷)类似物，其增加式(III)(和式(I)和(II))的核酸 分子的免疫原性和/或不干扰已经被引入的另外的修饰。在式(III)(和式(I)和(II))的核酸分子中的核心结构元件X的数目由m确定。 m 是整数并且典型地是至少 3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，20-30， 30-40，40-50，50-60，60-70，70-80，80-90，90-100，100-150，150-200，或甚至更多，其中当 m =3时，X是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，并且当m > 3时，至少3或更多个直接连续的尿苷 (尿嘧啶)或其类似物在上述式(III)(和式(I)和(II))的元件X中存在。这样的至少3 个或更多个直接连续的尿苷(尿嘧啶)的序列在本申请中被称为“单调的尿苷(尿嘧啶) 序列”。单调的尿苷(尿嘧啶)序列典型地具有至少3，4，5，6，7，8，9或10，11，12，13，14， 15，16，17，18，19,20,20-30,30-40,40-50,50-60,60-70,70-80,80-90,90-100,100-150, 150-200个如上定义的尿苷(尿嘧啶)或任选地尿苷(尿嘧啶)的类似物的长度。所述单 调的尿苷(尿嘧啶)序列在式(III)(和式(I)和(II))的核酸分子的核心结构元件X中 出现至少一次。因此，例如对于具有至少3个或更多个尿苷(尿嘧啶)或其类似物的1，2， 3，4，5或更多个单调的尿苷(尿嘧啶)序列，这是可以发生的，所述单调的尿苷(尿嘧啶) 序列可以在核心结构元件X中被至少一个，优选地2，3，4，5或更多个鸟苷(鸟嘌呤)，腺苷 (腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或其类似物中断。例如，当m = 3时，Xm是 UUUo当m = 4时，Xm可以是，例如，但没有任何限制，UUUA, UUUG, UUUC, UUUU, AUUU，⑶UU 或CUUU，等。当η = 10时，Xm可以是，例如，但没有任何限制，UUUAAUUUUC，UUUUGUUUUA， UUUGUUUGUU，UUGUUUUGUU，UUUUUUUUU，等。邻近式(III)的核酸分子的G1或Gn的Xm的核苷 酸优选地包含尿苷(尿嘧啶)或其类似物。当m> 3时，典型地Xm的至少50%，优选地至 少60%，70%，80%，90%或甚至100%的核苷酸是如上定义的尿苷(尿嘧啶)或其类似物。 然后XmW剩余到100%的核苷酸(其中在序列Xm中存在少于100%的尿苷(尿嘧啶))是 如上定义的鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞 嘧啶)或其类似物。上述根据式(III)的免疫刺激序列包含边界元件N。边界元件N典型地是具有长 度为约4-50，优选地约4-40，更优选地约4-30个核苷酸(核苷)，甚至更优选地约4_20个 核苷酸(核苷)的核酸序列，其中这些范围的下限备选地也可以是5，6，7，8，9，10，或更多。 优选地，每个N的核苷酸(核苷)独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌 呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)和/或其类似物。换言之，在根据本发明的式(III) 的核酸分子中的边界元件N可以是这样的序列，其可以由本领域可获得的任何(随机)序 列组成，每个N独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)和/或这些核苷酸的类似物，或选自这些核苷酸(核苷)的均聚物，在 每种情形中，假定所述序列具有约4-50，优选地约4-40，更优选地约4-30长度核苷酸(核 苷)和甚至更优选地约4-30或4-20长度的根据上述的定义的核苷酸(核苷)。根据具体实施方案，N可以是在上述定义中的核酸序列，其中所述序列典型地在直 接相邻的位置包含不超过2个相同的如上定义的核苷酸(核苷)，即，所述序列典型地不包 含超过两个相同的选自腺苷(腺嘌呤)，胞苷(胞嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)和/或鸟苷(鸟嘌 呤)，和/或其类似物的核苷酸(核苷)的片段(即，“aa”，“CC”，“UU”，“gg”和/或其类似物 的片段)，更优选地不包含这样的片段，即在直接相邻的位置不包含相同的如上定义的核苷 酸(核苷)。另外或备选地，N可以是在上述定义中的核酸序列，其中所述序列典型地包含优 选地约0-50 %，5-45 %，或10-40 %，更优选地约15-35 %，甚至更优选地约20-30 %，和最优 选地约25 %的腺苷(腺嘌呤)或其类似物的含量；优选地约0-50 %，5-45 %，或10-40 %，更 优选地约15-35 %，甚至更优选地约20-30 %，和最优选地约25 %的尿苷(尿嘧啶)或其类 似物的含量；优选地约0-50%，5-45%，或10-40%，更优选地约15-35%，甚至更优选地约 20-30 %，和最优选地约25 %的胞苷(胞嘧啶)或其类似物含量；优选地约0-50 %，5-45 %， 或10-40%，更优选地约15-35%，甚至更优选地约20-30%，和最优选地约25%的鸟苷(鸟 嘌呤)或其类似物的含量。最优选地，N可以是在上述定义中的核酸序列，其中所述序列典 型地包含含量各为约25%的腺苷(腺嘌呤)，鸟苷(鸟嘌呤)，胞苷(胞嘧啶)和尿苷(尿 啼唆)。所述 N 的序列的实例包括例如 agcu, ague, augc, acgu, gcua, gcau, gacu, guca, cuag, caug, cagu, cgau, uagc, uacg, ucga, ucag, agcugcua, gcaucaug, caguucga，·。在式(III)的核酸分子中的边界元件N的数目，S卩，其重复，由整数u和/或ν确 定。因此，在式(III)的核酸分子中的N可以作为(重复)边界元件化和/或Nv存在，其 中u和/或ν可以彼此独立地是0或1到100的整数，更优选地是0或1-50的整数，甚至 更优选地是0或1-40的整数，和最优选地是0或1-30的整数，例如0或1-5，10，20，25，或 30 ；或是5-10，10-15，15-20，20-25或25-30的整数。更优选地，在式(III)中可以存在至 少一个(重复的)边界元件凡和/或队，即11或￥不是0，更优选地存在两个(重复的)边 界元件Nu和/或Nv，甚至更优选地在上述定义中。另外，核心结构元件和边界元件与元件NuG1XmGnNv的组合可以作为根据如上定义的 式(III)的免疫刺激序列的重复元件，(NuG1XmGnNv)a存在，其中根据式(III)的组合元件， (NuG1XmGnNv) a的重复的数目由整数a确定。优选地，a是来自约1_100，1-50,1-20的整数，更 优选地是约1-15的整数，最优选地是约1-10的整数。在该情形中，重复元件NuG1XmGnNv可 以是彼此相同或彼此不同的。根据特别优选的实施方案，如上定义的式(III)的免疫刺激序列(NuG1XmGnNv)a包 括核心结构G1XmGn，优选地选自下列如上定义的SEQ ID NOs :1-80序列的至少一个此外，如本文中定义的免疫刺激序列还可以包括例如式(IIIa)的核酸(分子)(NuC1XmCnNv)a其中C是胞苷(胞嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)或胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的类似 物，优选地胞苷(胞嘧啶)或其类似物； X是鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或上述核苷酸(核苷)的类似物，优选地尿苷(尿嘧啶)或其类似物；N分别是这样的核酸序列，其彼此独立地具有约4-50，优选地约4-40，更优选地约 4-30或4-20个核酸的长度，每个N独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺 嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸(核苷)的类似物；a是1-20的整数，优选地1_15的整数，最优选地1_10的整数；1是1-40的整数，其中当1 = 1时，C是胞苷(胞嘧啶)或其类似物，当1 > 1时，这些核苷酸(核苷)的至少50%是胞苷(胞嘧啶)或其类似物；m是整数并且至少是3;其中，当m = 3时，X是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，当m > 3，存在至少3个连续尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的类似物；η是1-40的整数，其中，当η = 1时，C是胞苷(胞嘧啶)或其类似物，当η > 1时，这些核苷酸(核苷)的至少50%是胞苷(胞嘧啶)或其类似物。u, ν可以彼此独立地是0-50的整数，优选地其中当u = 0，ν彡1，或当 ν = 0，u 彡 1 时；其中式(IIIa)的核酸分子具有至少50个核苷酸的长度，优选地至少100个核苷 酸的长度，更优选地至少150个核苷酸的长度，甚至更优选地至少200个核苷酸的长度和最 优选地至少250个核苷酸的长度。对于式(IIIa)，任何上述关于元件N(即Nu和Nv)和X (Xm)，特别是关于如上定义 的核心结构，以及关于整数a，l，m，n，U*v所给出的定义类似地相应应用于式(IIIa)的 元件，其中在式(IIIa)中，核心结构由C1XmCn所限定。边界元件Nu和Nv的定义与上述关于 Nu和Nv的定义相同。更具体地，在式(IIIa)的核酸分子中的C是核苷酸或脱氧核苷酸或包括核苷，其 中所述核苷酸(核苷)典型地是胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)或其类似物。在该情形 中，胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸类似物被定义为天然存在的胞苷(胞嘧啶)或 尿苷(尿嘧啶)核苷酸的非天然存在的变体。因此，胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)类 似物是用非天然存在的官能团化学衍生的核苷酸(核苷)，所述官能团被优选地加入，或从 天然存在的胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸(核苷)中去除或其取代胞苷(胞嘧 啶)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸(核苷)的天然存在的官能团。因此，天然存在的胞苷(胞 嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)核苷酸的每种成分可以被修饰，即碱基成分，糖(核糖)成分和/ 或形成寡核苷酸主链的磷酸酯成分。磷酸酯部分可以被例如氨基磷酸酯，硫代磷酸酯，肽核 苷酸，甲基膦酸酯等取代，其中仍旧优选天然存在的磷酸二酯主链。因此，胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的类似物包括，但不限于，任何天然存在或 非天然存在的胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)，其已经通过化学方式，例如通过乙酰化，甲 基化，羟基化等改变，包括，例如，2-硫代-胞苷(胞嘧啶)，3-甲基-胞苷(胞嘧啶)，4-乙 酰基-胞苷(胞嘧啶)，二氢-尿苷(尿嘧啶)，4_硫代-尿苷(尿嘧啶)，5_羧甲基氨基甲 基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5-(羧基-羟甲基)-尿苷(尿嘧啶)，5_氟-尿苷(尿嘧啶)，5-溴-尿苷(尿嘧啶)，5_羧甲基氨基甲基-尿苷(尿嘧啶)，5_甲基-2-硫代-尿苷(尿 嘧啶)，N-尿苷(尿嘧啶)-5-氧乙酸甲酯，5-甲基氨基甲基-尿苷(尿嘧啶)，5-甲氧基氨 基甲基-2-硫代-尿苷(尿嘧啶)，5'-甲氧基羰基甲基-尿苷(尿嘧啶)，5_甲氧基-尿 苷(尿嘧啶)，尿苷(尿嘧啶)-5-氧乙酸甲酯，尿苷(尿嘧啶)-5-氧乙酸(V)。所述类似物 的制备是本领域技术人员已知的，例如从US 4，373，071，US 4，401，796，US 4，415，732，US 4，458，066，US 4，500，707，US 4，668，777，US 4，973，679，US 5，047，524，US 5，132，418，US 5，153，319，US 5，262，530和US 5，700，642中了解，将其全部公开内容通过引用结合在本 文中。在如上述的核苷酸(核苷)类似物的情形中，尤其优选那些类似物，其增加式(IIIa) 的核酸分子的免疫原性和/或不干扰已经被引入的另外的修饰。至少一种胞苷(胞嘧啶) 或尿苷(尿嘧啶)或其类似物可以存在于核心结构元件C1*/或Cn中，任选地，核心结构 元件(^和/或(；中的核苷酸(核苷)的至少10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80% 90%或甚至100%是天然存在的胞苷(胞嘧啶)，天然存在的尿苷(尿嘧啶)，和/或其类似 物，和/或显示如本文定义的其类似物的性质。优选地，所述核心结构元件C1和/或(；全 然包含天然存在的胞苷(胞嘧啶)和/或天然存在的尿苷(尿嘧啶)的至少一种类似物。 最优选地，这些核心结构元件C1*/或Cn的所有的核苷酸(核苷)是类似物，其可以-最 优选地-是关于相同类型的核苷酸(核苷)(例如，将所有的胞苷(胞嘧啶)核苷酸提供为 2-硫代-胞苷(胞嘧啶))的相同类似物，或它们可以是独特的(例如至少两个不同的胞苷 (胞嘧啶)类似物取代天然存在的胞苷(胞嘧啶)核苷酸)。 在式(IIIa)的核酸分子中的核心结构元件C^C1和/或Cn)的核苷酸(核苷)的 数目由1和η确定。1和η，彼此独立地分别是1-90，1-80，1-70,1_60，优选地1_50，更优选 地1-40，和甚至更优选地1-30的整数，其中该范围的下限可以是1，但是备选地也可以是2， 3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30， 或甚至更多。优选地，对于每个整数，当1和/或η = 1时，C是胞苷(胞嘧啶)或其类似 物，并且当1或11> 1时，核心结构元件C^C1和/或Cn)的至少50%，更优选地至少50%， 60 %，70%，80%，90%或甚至100%的核苷酸(核苷)是胞苷(胞嘧啶)或其类似物。例如， 但不限于，当1或η = 4时，C1和/或Cn可以是例如，CUCU, CCUU, UCUC，UUCC, CUUC, CCCU, CCUC, CUCC, UCCC 或 CCCC,等.；当 1 或 η = 5 时，C1 禾口 / 或 Cn 可以是例如，CCCUU, CCUCU, CUCCU，UCCCU，UCCUC，UCUCC，UUCCC，CUCUC，CCCCU，CCCUC，CCUCC，CUCCC，UCCCC，或 CCCCC， 等；等。在式(IIIa)的核酸分子中，直接邻近于XmW核心结构元件C1和/或Cn的核苷酸 (核苷)优选地不是尿苷(尿嘧啶)或其类似物。更优选地，在式(IIIa)的核酸分子中， 直接邻近于Xm的核心结构元件C1和/或Cn的核苷酸(核苷)是至少一个胞苷(胞嘧啶) 或其类似物，更优选地至少 2，3,4, 5,6, 7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19 或甚至 20 或更多胞苷(胞嘧啶)或其类似物的片段。另外，在式(IIIa)的核酸分子中的直接邻近 于N，例如Nu，和/或Nv (或如下文定义的Nwl或Nw2)的核心结构元件C1和/或Cn的核苷酸 (核苷)优选地不是尿苷(尿嘧啶)或其类似物。更优选地，在式(IIIa)的核酸分子中直 接邻近于N，例如Nu，和/或Nv (或如下文定义的Nwl或Nw2)的核心结构元件C1和/或Cn的 核苷酸(核苷)是至少一个胞苷(胞嘧啶)或其类似物，更优选地至少2，3，4，5，6，7，8，9， 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或甚至20个或更多个胞苷(胞嘧啶)或其类似物的片 段。同样优选地，对于式(IIIa)，当1或η > 1时，核心结构元件C1和/或Cn的至少60%，
2370%，80%，90%或甚至100%的核苷酸是胞苷(胞嘧啶)或其类似物，如上定义。然后在核 心结构元件C1和/或Cn中的剩余到100%的核苷酸(核苷)(当胞苷(胞嘧啶)组成少于 100%的这些核苷酸(核苷)时)，可以是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，如前文定义。X，特别是Xm，作为在根据式(IIIa)的免疫刺激序列中的另外的核心结构元件，优 选地如上关于式(III)所定义。在式(IIIa)的核酸分子中的核心结构元件X的数目由m 确定。m 是整数并且典型地是至少 3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20， 20-30，30-40，40-50，50-60，60-70，70-80，80-90，90-100，100-150，150-200，或甚至更多， 其中当m = 3时，χ是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，并且当m > 3时，至少3或更多个直接连 续的尿苷(尿嘧啶)或其类似物在上述式(IIIa)的元件X中存在。这样的至少3个或更 多个直接连续的尿苷(尿嘧啶)的序列在本申请中被称为“单调的尿苷(尿嘧啶)序列”。 单调的尿苷(尿嘧啶)序列典型地具有至少3，4，5，6，7，8，9或10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19，20，20-30，30-40，40-50，50-60，60-70，70-80，80-90，90-100，100-150，150-200 个如 上定义的尿苷(尿嘧啶)或任选地尿苷(尿嘧啶)的类似物的长度。所述单调的尿苷(尿 嘧啶)序列在式(IIIa)的核酸分子的核心结构元件X中出现至少一次。因此，对于具有至 少3个或更多个尿苷(尿嘧啶)或其类似物的1，2，3，4，5或更多个单调的尿苷(尿嘧啶) 序列，这是可以发生的，所述单调的尿苷(尿嘧啶)序列可以在核心结构元件X中被至少一 个，优选地2，3，4，5或更多个鸟苷(鸟嘌呤)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞 嘧啶)或其类似物中断。例如，当m=3时，Xm是UUU。当m = 4时，Xm可以是，例如，但没 有任何限制，UUUA, UUUG, UUUC, UUUU, AUUU，⑶UU或CUUU，等。当η = 10时，Xm可以是，例 如，但没有任何限制，UUUAAUUUUC, UUUU⑶UUUA，UUU⑶UU⑶U，UUGUUUU⑶U，UUUUUUUUUU，等。 邻近式(IIIa)的核酸分子的C1或Cn的Xm的核苷酸(核苷)优选地包含尿苷(尿嘧啶) 或其类似物。当m > 3时，典型地Xm的至少50 %，优选地至少60 %，70 %，80 %，90 %或甚 至100%的核苷酸是如上定义的尿苷(尿嘧啶)或其类似物。然后Xm剩余到100%的核苷 酸(核苷)(其中在序列Xm中存在少于100%的尿苷(尿嘧啶))是如上定义的鸟苷(鸟嘌 呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)，胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)或其类似物。同样地，上述根据式(IIIa)的免疫刺激序列包含边界元件N，特别是Nu和/或Nv， 其中边界元件N，特别是Nu和/或Νν，以及整数χ和y如上定义。元件NuC1XmCnNv可以作为根据如上定义的式(IIIa)的免疫刺激序列的重复元件， (NuC1XmCnNv)a存在，其中根据式(IIIa)的元件，(NuC1XmCnNv) a的重复的数目由整数a确定。优 选地，a是来自约1-100，1-50，1-20的整数，更优选地是约1_15的整数，最优选地是约1_10 的整数。在该情形中，重复元件NuC1XmCnNv可以是彼此相同或彼此不同的。根据特别优选的实施方案，如上定义的式(IIIa)的免疫刺激序列(NuC1XmCnNv) a包 括核心结构C1XmCn,优选地选自下列如上定义的SEQ ID NOs :81-83的序列的至少一个根据式(111)(或(IIIIa))的免疫刺激序列，特别是其每个单重复元件 NuG1XmGnNv(或NuC1XmCnNv),可以是通常如关于式(III)所定义的单链，双链或部分双链，等。如果根据式(III)(或(IIIIa))的免疫刺激序列是单链核酸分子，所述序列典型 地在其整个长度上是单链的。同样地，如果根据式(III)(或(IIIIa))的免疫刺激序列是双链核酸分子，所述序 列在其整个长度上典型地是双链的。
24
如果根据式(III)(或(IIIIa))的免疫刺激序列是部分双链核酸分子，那么式 (III)(或(IIIa))的核酸分子的核酸序列可以在核心结构G1XmGn(或C1XmCn)之外的区域内 是单链的，在所述核心结构区域内是双链的，所述核心结构GJmGj或C1XmCn)优选地选自上 述定义的SEQ ID NOs :1-83序列的至少一个。甚至更优选地，式(III)(或(IIIa))的核心 结构GJmGj或C1XmCn)在核心结构的所述区域内可以是双链的，其中最优选地在整个尿苷 (尿嘧啶)片段或至少其60%，70%，80%，90%，95%，98%或99%存在尿苷(尿嘧啶)片 段。备选地或另外地，如果根据式(III)(或(IIIa))的免疫刺激序列是部分双链核 酸分子，根据如上定义的式(III)(或(IIIa))的免疫刺激序列的其它部分(非核心结构 G1XfflGn)可以是双链的。例如，式(III)或(IIIa)的核酸分子的核酸序列可以在核心结构 G1XmGn(或C1XmCn)之外的区域(例如在边界元件凡和/或Nv中)是双链的，在所述核心结 构的区域中是单链的，所述核心结构6#扎(或C1XmCn)优选地选自上述SEQ ID NOs :1-83的 限定序列的至少一个。例如，边界元件队和/或队的至少一个可以是双链的，而式(III) 或(IIIa)的其它元件，例如核心结构(^1XmGn和/或其它元件可以仍然为单链的。备选地或另外地，根据式(III)的免疫刺激序列可以选自优选地以约 1 10-10 1的比率，更优选地以1:3-3:1的比率存在的根据式(III)或(IIIa)的 单链核酸分子和根据式(III)(或(IIIa))的(部分)双链核酸分子的混合物。根据特别优选的实施方案，根据式(III)的免疫刺激序列可以选自例如下列序列 的任一个来自SEQ ID NO 84 UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUU或来自SEQ ID NO :85 UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUUAUCGCUUCGA GAACCUGGAU CC AAAAA AAAAA AAAAA或来自SEQ ID NO 114 (R820 (N100) 2)GGGAGAAAGCUCAAGCUUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGA⑶UGCAUAUCUCAGAGUAUUGGCCCCCGUGUAG⑶UAUUCUUGACAGACAGUGGAGCUUAUUCACUCCCAGGAUCCGA⑶CGCAUACUACGGUACUG⑶GACAGACCUAGGUC⑶CAGUUGACCA⑶CCGCCACUAGAC⑶GA⑶CC⑶CAAAGCA⑶UAGAU⑶UACACUCUAUUAGAUC或来自SEQ ID NO 115 (R719 (N100) 5)GGGAGAAAGCUCAAGCUUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGA⑶UGCAUAUCUCAGAGUAUUGGCCCCCGUGUAG⑶UAUUCUUGACAGACAGUGGAGCUUAUUCACUCCCAGGAUCCGA⑶CGCAUACUACGGUACUG⑶GACAGACCUAGGUC⑶CAGUUGACCA⑶CCGCCACUAGAC⑶GA⑶CC⑶CAAAGCA⑶UAGAU ⑶ UACACUCUAUUAGAUCUCGGAUUACAGCUGGAAGGAGCAGGAGUA ⑶⑶ UCUUGCUCUAAGUACCGAGUGUGCCCAAUACCCGAUCAGCUUAUUAACGAACGGCUCCUCCUCUUAGACUGCAGCGUAA⑶GCGGAAUCUGGGGAUCAAAUUACUGACUGCCUGGAUUACCCUCGGACAUAUAACCUUGUAGCACGCU⑶UGCUGUAUAG⑶GACCAACGCCCACUCGAGUAGACCAGCUCUCUUAGUCCGGACAAUGAUAGGAGGCGCGGUCAAUCUACUUCUGGCUA ⑶ UAAGAAUAGGCUGCACCGACCUCUAUAAGUAGC ⑶⑶ CCUCUAG
或来自 SEQ ID NO 116 (R720 (N100) 10)
GGG UGCGUUCCUA GAAGUACACG
GGG UGCGUUCCUA GAAGUACACG CCC ACGCAAGGAU CUUCAU⑶GC
GGGAGAAAGCUCAAGCUUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGA⑶UGCAUAUCUCAGAGUAUUGGCCCCCGUGUAG⑶UAUUCUUGACAGACAGUGGAGCUUAUUCACUCCCAGGAUCCGA⑶CGCAUACUACGGUACUG⑶GACAGACCUAGGUC⑶CAGUUGACCA⑶CCGCCACUAGAC⑶GA⑶CC⑶CAAAGCAGUUAGAU ⑶ UACACUCUAUUAGAUCUCGGAUUACAGCUGGAAGGAGCAGGAGUA ⑶⑶ UCUUGCUCUAAGUACCGAGUGUGCCCAAUACCCGAUCAGCUUAUUAACGAACGGCUCCUCCUCUUAGACUGCAGCGUAA⑶GCGGAAUCUGGGGAUCAAAUUACUGACUGCCUGGAUUACCCUCGGACAUAUAACCUUGUAGCACGCU⑶UGCUGUAUAG⑶GACCAACGCCCACUCGAGUAGACCAGCUCUCUUAGUCCGGACAAUGAUAGGAGGCGCGGUCAAUCUACUUCUGGCUA ⑶ UAAGAAUAGGCUGCACCGACCUCUAUAAGUAGC ⑶⑶ CCUCUAGAGCUACGCAGGUUCGCAAUAAAAGCGUUGAUUAGUGUGCAUAGAACAGACCUCUUAUUCG⑶GAAACGCCAGAAUGCUAAAUUCCAAUAACUCUUCCCAAAACGCGUACGGCCGAAGACGCGCGCUUAUCUUGUGUACGUUCUCGCACAUGGAAGAAUCAGCGGGCAUG⑶GGUAGGGCAAUAGGGGAGCUGGGUAGCAGCGAAAAAGGGCCCCUGCGCACGUAGCUUCGCU⑶UC⑶CUGAAACAACCCGGCAUCC⑶UGUAGCGAUCCC⑶UAUCAGUGUUAUUCUUGUGCGCACUAAGAUUCAUGGUGUAGUCGACAAUAACAGCGUCUUGGCAGAUUCUG⑶CACGUGCCCUAUGCCCGGGCUU⑶GCCUCUCAGGUGCACAGCGAUACUUAAAGCCUUCAAGGUACUCGACGUGGGUACCGAUUC ⑶ GACACUUCCUAAGAUUAUUCCACU ⑶⑶ UAGCCCCGCACCGCCGACCUAAACUG ⑶CCAAUGUAUACGCAUUCGCUGAGCGGAUCGAUAAUAAAAGCUUGAAUU或来自SEQ ID NO 117 (R821 (N40U20N40) 2)GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUG⑶CACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACC⑶CUCAAGGUCCAA⑶UAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUU⑶GCGGUACG⑶UAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUC或来自SEQ ID NO 118 (Seq. R722 (N40U20N40) 5)GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUG⑶CACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACC⑶CUCAAGGUCCAA⑶UAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUU⑶GCGGUACG⑶UAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUA⑶CAUCGAGG⑶CGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACA⑶UACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGA ⑶⑶ CACUGCUCUCGAG ⑶ CUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU⑶GCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAG⑶CUGCUCUA或来自SEQ ID NO 119 (R723 (N40U20N40) 10)GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUG⑶CACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACC⑶CUCAAGGUCCAA⑶UAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUU⑶GCGGUACG⑶UAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUA⑶CAUCGAGG⑶CGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACA⑶UACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGA ⑶⑶ CACUGCUCUCGAG ⑶ CUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU⑶GCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAG⑶CUGCUCUAGAACGA
ACUGACCUGACGCCUGAACUUAUGAGCGUGCGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCUCCCAACAAAUGUCGAUCAAUAGCUGGGCU⑶UGGAGACGC⑶CAGCAAAUGCCGUGGCUCCAUAGGACGUGUAGACUUCUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCCGGGACCACAAAUAAUAUUCUUGCUUG⑶UGGGCGCAAGGGCCCCGUAUCAG⑶CAUAAACGGGUACAU⑶UGCACAGGCUCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCGCUGAGUUAUUCCG⑶CUCAAAAGACGGCAGAC⑶CAGUCGACAACACGGUCUAAAGCA⑶GCUACAAUCUGCCGUGUUCGUGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU⑶GAACCUACACGGCGUGCACUGUAGUUCGCAAUUCAUAGGGUACCGGCUCAGA⑶UAUGCCUUGGUUGAAAACUGCCCAGCAUACUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCAUAUUCCCAUGCUAAGCAAGGGAUGCCGCGA⑶CAU⑶UAAGCUUGAAUU根据另外的特别优选的实施方案，根据式(IIIa)的免疫刺激序列可以选自例如 下列序列中的任一个UAGCGAAGCU CUUGGACCUA CC UUUUU UUUUU UUUUU CCC UGCGUUCCUA GAAGUACACG(SEQ ID NO 86)或UAGCGAAGCU CUUGGACCUA CC UUUUU UUUUU UUUUU CCC UGCGUUCCUA GAAGUACACGAUCGCUUCGA GAACCUGGAU GG AAAAA AAAAA AAAAA GGG ACGCAAGGAU CUUCAUGUGC(SEQ ID NO :87)根据一个优选的实施方案，根据如上定义的式(III)(或(IIIa))的免疫刺激序列 可以用聚⑴序列(修饰元件)修饰。所述免疫刺激序列可以包含例如根据式(IV)的核 酸分子聚(IV)s(NuG1XmGn Nv)3聚(IV)t,其中式(IV)的核酸分子同样具有至少50个核苷酸的长度，优选地至少100个核 苷酸的长度，更优选地至少150个核苷酸的长度，甚至更优选地至少200个核苷酸和最优选 地至少250个核苷酸的长度。在根据式(IV)的免疫刺激序列中，元件G，X和N，特别是核心结构G1XmGn，和元件Nu 和队，以及整数⑴丨，！！！，！！，！！和^^如上关于式(III)定义。在本发明的情形中，根据式(IV) 的免疫刺激序列的修饰元件聚(IV)，特别是聚(IV)s和/或聚(IV)tW型地是单链，双链或 部分双链核酸序列，例如通常如上定义的DNA或RNA序列。优选地修饰元件聚(IV)，特别是 聚(1力3和/或聚(IV)t，是核酸的同聚片段，其中X可以是任何核苷酸或脱氧核苷酸或包含 这样的核苷，其如上关于根据式(III)或(IIIa)的免疫刺激序列的X所定义。优选地，X可 以独立地关于聚(IV)，特别是聚(IV)s和/或聚(IV)tW每个，选自核苷酸或脱氧核苷酸或 包括核苷，其中所述核苷酸(核苷)选自鸟苷(鸟嘌呤)，尿苷(尿嘧啶)，腺苷(腺嘌呤)， 胸苷(胸腺嘧啶)，胞苷(胞嘧啶)，肌苷或这些核苷酸的类似物，例如选自胞苷(胞嘧啶) (聚(C))的单链片段，鸟苷(鸟嘌呤)(聚(G))的单链片段，腺苷(腺嘌呤)(聚(A))的 单链片段，尿苷(尿嘧啶)(聚(U))的单链片段，肌苷(聚(III))的单链片段等，或选自肌 苷和胞苷(胞嘧啶)(聚(III:C))的同聚双链片段，腺苷(腺嘌呤)和尿苷(尿嘧啶)(聚 (A:U))的同聚双链片段等，其中所述同聚序列，特别是聚(III:C)和/或聚(A:U)可以通过 其链的任一条(例如使用聚-C，聚-I，聚-A或聚-U序列)偶联于根据式(IV)的核酸分子 的序列(Nu G1XmGn Nv)a。式(IV)的免疫刺激序列的修饰元件聚(IV)，特别是聚(IV)s和/ 或聚(IV)t的长度由整数s和/或t确定，其中s和/或t，彼此独立地可以是约5-100的
27整数，优选地约5-70，更优选地约5-50，甚至更优选地约5-30和最优选地约5_20的整数。根据特别优选的实施方案，根据如上定义的式(IV)的核酸分子，可以具体的包含 例如根据式(IVa)的核酸分子，聚(X)(Nu G1XmGn Nv) a，或根据式(IVb)的核酸分子，聚(X)(Nu G1XmGn Nv) a 聚⑴，其中，式(IVa)或(IVb)的这些核酸分子的任一个同样地具有至少50个核苷酸的 长度，优选地至少100个核苷酸，更优选地至少150个核苷酸，甚至更优选地至少200个核 苷酸和最优选地至少250个核苷酸的长度。类似地，所有其它定义如上述式(IV)或(III) 所述。同样地，所述式(IV), (IVa)和(IVb)可以基于根据式(IIIb)的式定义，即引入核心 结构 C1XmCn0更优选地，根据式(IV)，(IVa)和/或(IVb)任一的免疫刺激序列可以选自如上定 义的聚(IV)，更优选地选自聚(I:C)和/或选自聚(A:U)。这些修饰元件聚(X)，特别是聚 (IC)和/或聚(Α:U)，可以通过其任一条链，例如使用聚-C，聚-G，聚-1，聚-A或聚-U序 列偶联于根据式(IV)，(IVa)和/或(IVb)的序列。类似地，如上关于式(III)或(IIIa)定义，根据式(IV), (IVa)和/或(IVb)任一 的免疫刺激序列可以是如上定义的单链，双链或部分双链核酸分子。如果根据式(IV)，(IVa)和/或(IVb)的免疫刺激序列是单链核酸分子，所述序列 典型地在其整个长度上典型地是单链的。同样地，如果根据式(IV)，(IVa)和/或(IVb)任一的免疫刺激序列是双链核酸分 子，所述序列在其整个长度上典型地是双链的如果根据式(IV)，(IVa)和/或(IVb)任一的免疫刺激序列是部分双链核酸分子， 那么式(IV)，(IVa)和/或(IVb)任一的核酸分子的核酸序列可以在核心结构G1XmGn之外 的区域内是单链的，在所述核心结构区域内是双链的，所述核心结构G1XmGn优选地选自上述 定义的SEQ ID NOs :1-80或SEQ ID NOs :81-83序列的至少一个。甚至更优选地，式(III) (或(IIIa))的核心结构G1XmGn(或C1XmCn)在核心结构的所述区域内可以是双链的，其中最 优选地在整个尿苷(尿嘧啶)片段或至少其60%，70%，80%，90%，95%，98%或99%中存 在尿苷(尿嘧啶)片段。备选地或另外地，如果根据式(IV)，(IVa)和/或(IVb)任一的免疫刺激序列是部 分双链核酸分子，根据如上定义的式(IV)，(IVa)和/或(IVb)任一的免疫刺激序列的其它 部分(非核心结构G1XmGn)可以是双链的。例如，式(IV)，(IVa)和/或(IVb)任一的核酸 分子的核酸序列可以在核心结构G1XmGn之外的区域(例如在边界元件Nu和/或Nv中，和/ 或在修饰元件聚(X)，例如聚(X)s和或聚(X)t(如例如聚(IC)或聚(A:U)序列中))是双 链的，和例如在所述核心结构的区域中是单链的，所述核心结构(^1XmGn优选地选自上述SEQ ID NOs :1-83的限定序列的至少一个。例如，边界元件凡和/或Nv的至少一个和/或修饰 元件聚(IV)，例如聚(IV)s和或聚(IV)t中的至少一个可以是双链的，而式(IV)，(IVa)和 /或(IVb)的其它元件，例如核心结构G1XmGn和/或其它元件可以仍然为单链的。备选地或另外地，根据式(IV)，(IVa)和/(IVb)任一的单链核酸分子，和根据式 (IV), (IVa)和/(IVb)任一的(部分)双链核酸分子的混合物，优选地以约1 10-10 1的比率，更优选地以1 3-3 1的比率存在。 根据特别优选的实施方案，根据式(IV)，(IVa)和/或(IVb)任一的免疫刺激序列 可以选自例如下列序列的任一个-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGUUUUUUUUUUUUUUU GGG(SEQIDNO 88)
-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGUUUUUUUUUUUUUUU GGG(SEQIDNO 89)
IIIIIIIIIIIIIIIIIIII
-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGUUUUUUUUUUUUUUU GGG(SEQIDNO 90)
AAAAAAAAAAAAAAA
-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGUUUUUUUUUUUUUUU GGG(SEQIDNO 91)
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCCAAAAAAAAAAAAAAACCC
-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCUAGCGAAGCU CUUGGACCUA GGUUUUU UUUUU UUUUU GGG
UGCGUUCCUAGAAGUACACG
(SEQ ID NO92)
-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUGCGUUCCUAGAAGUACACG
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCCAAAAAAAAAAAAAAACCCACGCAAGGAUCUUCAUGUGC
UAGCGAAGCUCUUGGACCUA(SEQ ID NO :93)
AUCGCUUCGAGAACCUGGAU
-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUGCGUUCCUAGAAGUACACG
CCAAAAAAAAAAAAAAACCCACGCAAGGAUCUUCAUGUGC
UAGCGAAGCUCUUGGACCUA(SEQ ID NO :94)
AUCGCUUCGAGAACCUGGAU
根据如上定义的式(III)(或(IIIa))的免疫刺激序列还可以通过插入茎或茎环
来进行修饰，例如得到根据式(Va)的核酸分子，(Nu-IG1XmGn 茎 2Nv)a，或根据式(Vb)的核酸分子，(NuG1XmGnNv)a-INwl 茎2\2，其中根据式(Va)和/或(Vb)任一的核酸分子具有至少100个核苷酸，更优选地 至少150个核苷酸，甚至更优选地至少200个核苷酸和最优选地至少250个核苷酸的长度。 同样地，所述式(Va)和(Vb)可以基于式(IIIb)，即通过引入核心结构C1XmCn定义。特别地，式(Va)和/或(Vb)任一的免疫刺激序列代表如上定义的式(III)的变 体。在根据式(Va)和/或(Vb)的任一个的核酸中，接近核心结构G1XmGn的边界元件N，即 凡和/或Nv，由至少一个茎或茎环结构，优选地由单一茎环元件茎1和茎2组成，进一步扩 充。在根据如上定义的式(Va)和/或(Vb)的任一个的免疫刺激序列中，元件G，X和N，特 别地，核心结构G1XmGn，和整数a，1，m，n，u和ν如上定义。更优选地整数a = 1。任选地u 和/或ν可以是0。另外地，邻近于茎环元件茎1和茎2的元件Nwl和Nw2代表另外的边界 元件，其如上述关于边界元件Nu和/或Nv所定义。特别地，边界元件N通常如上述关于式 (III)中的N所述，并且整数wl和w2彼此独立地选择并且如上述在式(III)中的整数u和 /或ν所定义。在该背景下，茎或茎环结构是在单链DNA或更常见地在RNA中存在的分子内碱基配对。该结构还已知为发夹或发夹环。当相同分子的两个区域，例如茎环元件茎1和茎2，通 常地核酸序列的回文序列元件彼此形成碱基对时，发生这样的现象，导致形成(双螺旋，其 终止于)未配对的环。未配对的环由此典型地代表核酸区域，其显示与茎1或茎2的序列没 有同一性或同源性，或几乎没有同一性或同源性，并且因此不能够与这些茎环元件的任一 个碱基配对。得到的巨头噬菌体形状结构是许多RNA次级结构的关键构件。茎-环结构的 形成因此取决于得到的螺旋和环区域的稳定性，其中第一先决条件典型地是本身可以折叠 回以形成配对的双螺旋的序列的存在。配对的茎环元件的稳定性由长度，其包含的错配或 凸出部分的数目(少量的错配典型地是可忍受的，尤其在长螺旋中)，以及配对区域的碱基 组成确定。例如，在鸟苷(鸟嘌呤)和胞苷(胞嘧啶)之间的配对在这样的序列中可以是更 优选的，因为它们具有三个氢键并且与仅具有两个氢键的腺苷(腺嘌呤)_尿苷(尿嘧啶) 配对相比更稳定。在RNA中，特征是两个氢键的鸟苷(鸟嘌呤)-尿苷(尿嘧啶)配对因此 可以是有利的。环的稳定性还影响茎-环结构的形成。少于三个碱基长度的"环"(即， 仅不包含茎环元件茎1和茎2的环)在空间排列上是较不优选的。然而，还可以包含这样 的茎，即在茎1和茎2之间不显示(限定的)环，而仅显示未配对的区域的形成。在本发明 的背景中，任选的环的长度倾向于是约4-100个碱基，更优选地4-50个碱基或甚至4-30个 碱基或甚至4-20个碱基的长度。因此，在根据式(Va)和/或式(Vb)任一个的免疫刺激序列的情形中，茎环元件茎 1和茎2典型地代表一个茎或茎环结构的部分，其中所述茎或茎环结构可以由茎环元件茎1 和茎2形成，并且环可以由位于这些茎环元件之间的序列形成。所述茎或茎环可以在碱基 配对区域中具有螺旋形式。每个茎环元件茎1和茎2优选地是如上定义的核酸，更优选地 是RNA，并且最优选地是单链RNA，其中如上关于核心结构元件X定义的核苷酸(核苷)或 类似物的任一种可以用作茎1和/或茎2的核苷酸(核苷)。另外地，茎环元件茎1表示茎 环元件茎2的回文序列。因此，两个序列优选地能够与彼此碱基配对，并因此在一起形成茎 或茎环的基础。因此，茎环元件茎1或茎2可以成对地选自任何核酸序列，条件是茎环元件茎1或 茎2是彼此回文的，即一个序列等价于回读的其它(互补序列)或当回读时，显示该序列与 其它序列至少90%，更优选地至少95%，和最优选地至少99%的同一性或同源性。所述回 文序列茎1和茎2分别可以由具有约5-50，更优选地约5-40和最优选地约5-30个核酸的 长度的核酸序列形成，所述核酸选自腺苷(腺嘌呤)，鸟苷(鸟嘌呤)，胞苷(胞嘧啶)，尿苷 (尿嘧啶)，胸苷(胸腺嘧啶)，或其如本文定义的类似物。茎环元件茎1和茎2的示范性序列可以包括例如a)对于茎 1 UAGCGAAGCUCUUGGACCUA(SEQ ID NO 95)对于茎2:UAGGUCCAAGAGCUUCGCUA(SEQ ID NO 96)b)对于茎 1 UAGGUCCAAGAGCUUCGCUA(SEQ ID NO :96)对于茎2 UAGCGAAGCUCUUGGACCUA(SEQ ID NO :95)
30
c)对于茎 1 GCCGCGGGCCG(SEQ ID NO 97)对于茎2 CGGCCCGCGGC(SEQ ID NO 98)d)对于茎 1:CGGCCCGCGGC(SEQ ID NO 98)对于茎2 GCCGCGGGCCG(SEQ ID NO 97)e)对于茎 1 GACACGGUGC(SEO ID NO 99)对于茎2 GCACCGUGCA(SEQ ID NO :100)f)对于茎 1 GCACCGUGCA(SEQ ID NO :100)对于茎2:GACACGGUGC(SEO ID NO :99)g)对于茎 1 :ACCUAGGU(SEQ ID NO :101)对于茎2 ACCUAGGU(SEQ ID NO :101)h)对于茎 1 :UGGAUCCA(SEQ ID NO :102)对于茎2 UGGAUCCA(SEQ ID NO :102)i)对于茎 1:CCUGC (SEQ ID NO :103)对于茎2 GCAGG (SEQ ID NO :104)j)对于茎 1 GCAGG (SEQ ID NO :105)对于茎2 CCUGC (SEQ ID NO :106)等。根据一个第一备选方案，所述核心结构G1XmGn可以位于茎环结构内，S卩，所述核心 结构G1XmGn可以位于茎环元件茎1和茎2之间，由此优选地形成环。这样的核酸分子与式 (Va)类似，其具有如上定义的组成(Nu茎IG1XmGn茎2NV) a。当u和/或v = 0，且a=l时， 式(Va)可以形成特定的核酸分子“茎W1XmGn茎2 “，其也可以结合在本发明中。根据另一个备选方案，所述核心结构G1XmGn可以位于所述茎环结构的外部，其中同 样地，茎环元件茎1和茎2可以彼此通过序列(优选地，边界元件N，例如Nwl或Nw2)分离， 其接着可以在茎环元件茎1和茎2的碱基配对后形成环结构。另外，邻近于核心结构G1XmGn的茎环元件1和/或1，可以通过其它的边界元件，例如Nwl或Nw2与核心结构G1XmGn分离。 根据本发明，这样的核酸与式(Vb)类似，其具有如上定义的组成NuG1XmGnNv)3茎INwl茎2^。根据式(Va)和/或(Vb)任一的免疫刺激序列可以是单链的，或部分双链的。如 果根据式(Va)和/或(Vb)任一的免疫刺激序列是单链核酸分子，那么所述序列典型地在 其整个长度上是单链的。如果根据式(Va)和/或(Vb)任一的免疫刺激序列是部分双链核 酸分子，那么式(Va)和/或(Vb)任一的核酸分子优选地在茎环元件茎1和茎2的区域中 并且在由核心结构G1XmGn或任何其它元件(例如Nwl或Nw2)形成的环的区域中可以是单链 的。那么位于茎环元件茎1和茎2外部和在由核心结构G1XmGn或由任何其它元件(例如Nwl 或Nw2)形成的环的区域中的元件，可以彼此独立地是单链或双链。备选地或另外地，优选地 以约1 10-10 1的比率，更优选地以1 3-3 1的比率存在的根据式(Va)或(Vb) 的单链或部分双链核酸分子，和根据式(Va)或(Vb)的(部分)双链核酸分子的混合物。根据特别优选的实施方案，分别根据式(Va)和/或(Vb)任一的免疫刺激序列可 以选自例如下列序列的任一个-UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG uuuuu υυυυυ uxjuuu GGG UAGGUCCAAG AGCUUCGCUA(SEQ ID NO :107)-UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG uuuuu uuuuu uuuuu GGG UGCGUUCCUA GAAGUACACGGCCGCGGGCCGUGCGUUCCUA GAAGUACACGCGGCCCGCGGCUGCGUUCCUA GAAGUACACG(SEQ ID NO :108)(茎1和茎2以下划线表示，核心结构G1XmGn以粗体表示)如上定义的式(I)，(II)，(III)，(IIIa)，(IV)，(IVa)，(IVb)，(Va)和/ 或(Vb)的 免疫刺激序列典型地是核酸，其可以任何DNA或RNA的形式存在，所述DNA或RNA优选地， 但是不限于，是环状或线性DNA或RNA，单链或双链DNA或RNA(由于两条单链DNA或RNA 的非共价缔合，其也可以被视为一条DNA或RNA)或部分双链DNA或RNA (其典型地由更长 和至少一个更短的单链DNA或RNA分子或由至少两个长度大约相同的单链DNA或RNA-分 子形成，其中一个或多个单链DNA或RNA分子部分与一个或多个其它单链DNA或RNA分子 互补，并因此在该区域中形成双链RNA)，例如(部分地)单链DNA或RNA，其与(部分)双 链DNA或RNA的区域混合。优选地，如上定义的式(I), (II)，(III)，(IIIa), (IV)，(IVa), (IVb)，(Va)和/或(Vb)的核酸分子可以以单链或双链DNA或RNA的形式，更优选地部分 双链DNA或RNA的形式存在。还优选的是，如上定义的式(I)，(II)，(III)，(IIIa), (IV)， (IVa)，(IVb)，(Va)和/或(Vb)的免疫刺激序列以单链核酸和双链DNA或RNA的混合物的 形式存在。如果如上定义的式(I)，(II)，(III)，(IIIa)，(IV)，(IVa),(IVb)，(Va)和 / 或 (Vb)的免疫刺激序列是部分双链核酸分子，这是特别有利的，因为所述根据如上定义的式 (I)，(II)，(III)，(IIIa)，(IV)，(IVa)，(IVb)，(Va)和 / 或(Vb)的(部分双链)免疫刺激 序列可以通过定向单链RNA的PAMP-(病原体相关分子模式)受体(TLR-7和TLR-8)，以及 双链RNA的PAMP-受体(TLR-3，RIG-I和MDA-5)而正向刺激待治疗的患者中的先天免疫 应答。受体TLR-3，TLR-7和TLR-8位于内体中并且由被内体摄取的RNA激活。与此相反， RIG-I和MDA-5是细胞质受体，其由RNA激活，被直接摄取到细胞质中或已经从内体中释放 (内体的释放或内体的逃逸)。因此如上定义的式(I), (II)，(III)，(IIIa)，(IV)，(IVa),(IVb) , (Va)和/或(Vb)的任何部分双链的免疫刺激序列能够激活免疫刺激的不同信号级 联并因此导致先天免疫应答或显著增强这样的应答。如上定义的式(I),(II)，(III)，(IIIa)，(IV)，(IVa), (IVb)，(Va)和/或(Vb) 的核酸分子可以使用本领域已知的任何方法进行制备，所述方法包括合成方法如例如固相 合成，以及体外方法如体外转录反应。优选地，体外转录用于免疫刺激序列的制备。本发明 的发明人惊奇地发现，当与通过合成方法制备的如上定义的式(I)，(II)，(III)，(IIIa)， (IV)，(IVa), (IVb)，(Va)和/或(Vb)的核酸分子比较时，当通过基于其5’ -磷酸酯的体 外转录制备时，如上定义的式⑴，(II)，(III)，(IIIa)，(IV)，(IVa), (IVb)，(Va)和/或 (Vb)的核酸分子显示甚至更好的对先天免疫系统的刺激。所述对先天免疫系统的刺激，有 利于(但不限于此)对受体RIG-I的激活。因此如上定义的式(I)，(II)，(III)，(IIIa)， (IV)，(IVa)，(IVb)，(Va)和/或(Vb)的核酸分子是特别优选的，当通过体外转录反应制备 时。此外，可以用于本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m) RNA的RNA分 子(类型)可以包括能够引起免疫应答的任何其他RNA。不局限于此，这样的免疫刺激性 RNA 可以包括核糖体 RNA (rRNA)，转移 RNA (tRNA)，信使 RNA (mRNA)，和病毒 RNA (vRNA)。根据第三种实施方案，本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA 可以是siRNA。siRNA是与RNA干扰现象有关特别感兴趣的。在免疫学研究期间，注意力集 中在RNA干扰的现象。近年来，发现了基于RNA的防卫机制，其在真菌界中和植物和动物界 中均存在并起“基因组免疫系统”的作用。该系统最初描述于多种彼此独立的物种中，首先 在线虫(C.elegans)中描述，这先于可能确定以下相同过程的基础机制植物中的RNA-介 导的病毒抗性，植物中的PTGS(转录后基因沉默)，和真核生物中的RNA干扰因此基于常用 程序。RNA干扰(RNAi)的体外技术基于双链RNA分子(dsRNA)，其触发基因表达的序列特 异性抑制(Zamore (2001) Nat. Struct. Biol.(自然结构生物学)9 :746-750 ;Sharp (2001) Genes Dev.(基因发展)5 :485-490 :HannonQ002)Nature (自然)41 :244-251)。在用长 dsRNA转染哺乳动物细胞中，蛋白激酶R和foiaseL的活化导致非特异性作用，诸如，例如， 干扰素反应(Stark等(1998) Annu. Rev. Biochem.(生物化学年度综述)67 :227-264 ；He和 Katze (2002) Viral Immunol.(病毒免疫学)15 :95-119)。近期，dsRNA分子也已经在体内使 用(McCaffrey 等(2002),Nature (自然)418 :38-39 ；Xia 等 Q002)，Nature Biotech.(自 然生物技术)20 :1006-1010 ；BrummeIkamp 等(2002)，Cancer Cell (癌细胞)2 :243-247)。 因此，用于本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA的siRNA可以是免疫刺 激性RNA，并典型地包括(单-或)双链的、优选双链的且具有约8-30个核苷酸，优选17-25 个核苷酸，甚至更优选20-25和最优选21-23个核苷酸的RNA序列。原则上，所有具有如上 提及的RNA序列的编码区中存在的17-29，优选19-25，最优选21-23对碱基对的长度的部 分起所述siRNA的靶序列作用。同等地，siRNA还可以针对阴性调节(先天性或适应性)免 疫应答的诱导的蛋白，特别是调节蛋白的不位于编码区中特别地RNA的5’非编码区中的核 苷酸序列，例如，因此，针对具有调节功能的RNA的非编码区。作为本发明的免疫刺激组合 物的佐剂成分的至少一种(m)RNA使用的siRNA的靶序列因此可以位于如上定义的蛋白的 核苷酸序列的翻译和/或不翻译区中和/或在其控制元件区中。如上定义的siRNA的靶序 列还可以位于不翻译和翻译的序列的重叠区域内；特别地，靶序列可以包括RNA编码区起始三联体上游的至少一个核苷酸。根据第四种实施方案，本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA 可以是反义RNA。在本发明的上下文中，反义RNA优选是由DNA编码链，而非DNA模板链转 录的(单链)RNA分子，因此(优选地)(完整)反义mRNA序列与有义(信使)RNA互补。 在本文中定义的反义RNA典型地在有义和反义RNA分子之间形成双链体，并因此能够阻断 编码链的转录。作为本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA使用的反义 RNA可以针对编码蛋白或肽的核苷酸序列，例如(天然存在的)mRNA或基因组序列，所述蛋 白或肽可以选自适合于该目的的任何蛋白或肽序列。优选地，作为本发明的免疫刺激组合 物的佐剂成分的至少一种(m) RNA使用的反义RNA包括如上关于RNA分子普遍定义的长度， 更优选 1000-5000 或，500-5000, 5-5000，或 5-1000，5-500 或 5-250，5-100，5-50 或 5-30 个 核苷酸的长度。根据第五个实施方案，本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA 是编码RNA。所述编码RNA可以是如上定义的任何RNA。优选地，所述编码RNA可以是单 链或双链RNA，更优选是单链RNA，和/或环形或线性RNA，更优选是线性RNA。甚至更优选 地，所述编码RNA可以是(线性)单链RNA。最优选地，所述编码RNA可以是((线性)单 链)信使RNA(mRNA)。作为本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA使用 的编码RNA还可以编码蛋白质或肽，其可以选自，不仅限于，例如选自治疗活性蛋白或肽， 选自抗原，例如肿瘤抗原，致病性抗原(例如选自如上定义的致病性蛋白或选自动物抗原、 病毒抗原、原生动物抗原、细菌抗原、过敏抗原)，自体免疫抗原，或其他抗原，选自过敏原， 选自抗体，选自免疫刺激蛋白或肽，选自抗原特异性T细胞受体，或任何其他适合于特异性 (治疗)应用的蛋白或肽，其中可以将作为本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一 种(m)RNA使用的编码RNA运送到细胞、组织或生物体中并可以随后在该细胞、组织或生物 体内表达该蛋白。a)治疗活性蛋白在该上下文中，由所述免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA编码的 治疗活性蛋白可以选自现有技术的技术人员已知的任何天然存在的重组的或分离的蛋 白。不受限于此，治疗活性蛋白可以包括能够刺激或抑制细胞内信号转导的蛋白，例如细 胞因子、抗体等。治疗活性蛋白由此可以包括细胞因子家族I类细胞因子，其具有4个位 置保守的半胱氨酸残基(CCCC)并包括保守序列基序Trp-kr-X-Trp-Ser(WSXWQ，其中 X是非保守氨基酸。细胞因子家族I类细胞因子包括GM-CSF亚家族，例如IL-3，IL-5， GM-CSF，IL-6-亚家族，例如 IL-6，IL-11，IL-12，或 IL-2-亚家族，例如 IL-2，IL-4，IL-T, IL-9，IL-15，等，或细胞因子IL-Ia，IL-I β，IL-10等。治疗活性蛋白还可以包括细胞因 子家族II类细胞因子，其也包括4个位置保守的半胱氨酸残基(CCCC)，但无保守序列基 序Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXffS)。细胞因子家族II类细胞因子包括例如IFN-α，IFN-β， IFN-γ，等。治疗活性蛋白可以另外包括肿瘤坏死因子家族的细胞因子，例如TNF-a， TNF-β，等，或趋化因子家族的细胞因子，其包括7个跨膜螺旋并与G-蛋白相互作用，例如 IL-8，MIP-1，RANTES, CCR5, CXR4，等，或细胞因子特异性受体，诸如 TNF-RI，TNF-RII, CD40， 0X40(CD134)，Fas。由免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA编码的治疗活性蛋白也可以选
34自以下给出的任何蛋白0ATL3，0FC3，0PA3，0PD2，4-lBBL，5T4，6Ckine，707-AP，9D7，A2M, AA, AAAS，AACT，AASS，ABAT，ABCAl，ABCA4, ABCB1，ABCBl 1，ABCB2, ABCB4, ABCB7, ABCC2, ABCC6, ABCC8, ABCDl，ABCD3, ABCG5, ABCG8, ABLl，ABO, ABR ACAAl，ACACA, ACADL, ACADM, ACADS, ACADVL, ACATl，ACCPN, ACE, ACHE, ACHM3, ACHMl, ACLS, ACPI, ACTAl，ACTC, ACTN4, ACVRLl, AD2, ADA, ADAMTS13, ADAMTS2, ADFN, ADH1B, ADH1C, ADLDH3A2, ADRB2, ADRB3, ADSL, AEZ, AFA, AFD1, AFP, AGA, AGL, AGMX2，AGPS，AGS 1, AGT, AGTRl，AGXT，AH02，AHCY，AHDS, AHHR, AHSG, AIC, AIED, AIH2, AIH3, AIM-2, AIPLl，AIRE, AKl，ALAD, ALAS2, ALB, HPGl，ALDH2, ALDH3A2,ALDH4A1,ALDH5A1, ALDH1A1, ALDOA, ALDOB, ALMS1, ALPL, ALPP,ALS2,ALX4,AMACR, AMBP, AMCD, AMCDl，AMCN, AMELX, AMELY, AMGL, AMH, AMHR2, AMPD3, AMPDl，AMT, ANC, ANCR, ANK1，ANOP1，AOM，AP0A4，AP0C2，AP0C3，AP3B1，APC，aPKC，AP0A2，APOA1，APOB，AP0C3，AP0C2， APOE, ΑΡΟΗ, APP, APRT, APSl，AQP2, AR, ARAFl, ARGl，ARHGEF12, ARMET, ARSA, ARSB, ARSC2, ARSE,ART-4,ARTCl/m, ARTS, ARVD1, ARX, AS,ASAH,ASAT,ASDl，ASL，ASMD,ASMT,ASNS,ASPA, ASS, ASSP2, ASSP5, ASSP6, AT3, ATD, ATHS, ATM, ATP2A1, ATP2A2, ATP2C1, ATP6B1, ATP7A, ATP7B, ATP8B1，ATPSK2，ATRX, ATXN1,ATXN2, ATXN3, AUTSl，AVMD，AVP,AVPR2,AVSD1,AXINl, AXIN2, AZF2, B2M, B4GALT7, B7H4, BAGE, BAGE-I, ΒΑΧ, BBS2, BBS3, BBS4, BCA225, BCAA, BCH, BCHE, BCKDHA, BCKDHB, BCL10, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCPM, BCR, BCR/ABL, BDC, BDE, BDMF, BDMR, BESTl，beta-Catenin/m，BF, BFHD, BFIC, BFLS, BFSP2, BGLAP, BGN, BHD, BHR1，BING-4， BIRC5, BJS, BLM, BLMH, BLNK, BMPR2, BPGM, BRAF, BRCAl，BRCAl/m, BRCA2, BRCA2/m, BRCD2, BRCDl，BRDT, BSCL, BSCL2, BTAA, BTD, BTK, BUBl，BffS, BZX, C0L2A1, C0L6A1, C1NH, C1QA, C1QB, C1QG, CIS, C2,C3, C4A, C4B, C5,C6,C7,C7orf2,C8A,C8B,C9,CA125,CA15-3/CA 27-29， CA195, CA19-9, CA72-4, CA2, CA242, CA50, CABYR, CACD, CACNA2D1, CACNA1A, CACNAIF, CACNAlS,CACNB2,CACNB4,CAGE,CAl，CALB3,CALCA,CALCR,CALM,CALR,CAM43,CAMEL,CAP-I， CAPN3, CARD15, CASP-5/m，CASP-8, CASP-8/m, CASR, CAT, CATM, CAV3, CBl，CBBM, CBS, CCAl， CCAL2, CCAL1, CCAT, CCL-I, CCL-I1, CCL-I2, CCL-I3, CCL-14, CCL-I5, CCL-16, CCL-I7, CCL-18, CCL-19, CCL-2，CCL-20，CCL-21，CCL-22，CCL-23，CCL-24，CCL-25，CCL-27，CCL-3， CCL-4, CCL-5, CCL-7, CCL—8，CCMl，CCNBl，CCNDl，CCO, CCR2, CCR5, CCT，CCV, CCZS, CDl， CD19, CD20, CD22, CD25, CD27, CD27L, cD3, CD30, CD30, CD30L, CD33, CD36, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD44v, CD44v6, CD52, CD55, CD56, CD59, CD80, CD86, CDANl, CDAN2, CDAN3, CDC27, CDC27/m, CDC2L1, CDHl，CDK4, CDK4/m, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2A/m, CDKN1A, CDKN1C, CDLl，CDPDl，CDRl，CEA, CEACAM1, CEACAM5, CECR, CECR9, CEPA, CETP, CFNS, CFTR, CGFl，CHAC, CHED2, CHEDl，CHEK2, CHM, CHML, CHR39C, CHRNA4, CHRNAl，CHRNBl，CHRNE, CHS, CHSl，CHST6, CHXlO, CIASl，CIDX, CKNl，CLA2, CLA3, CLAl，CLCA2, CLCNl，CLCN5, CLCNKB, CLDN16, CLP, CLN2, CLN3, CLN4, CLN5, CLN6, CLN8, C1QA, C1QB, C1QG, ClR, CLS, CMCffTD, CMDJ, CMD1A，CMDIB, CMH2, MH3, CMH6, CMKBR2, CMKBR5, CML28, CML66, CMM, CMT2B, CMT2D, CMT4A, CMT1A，CMTX2, CMTX3, C-MYC, CNAl，CND, CNGA3, CNGAl，CNGB3, CNSN, CNTF, COA-l/m，COCH, C0D2, CODl， COHl， COLlOA, C0L2A2, COLl1A2, C0L17A1, COLlAl， C0L1A2, C0L2A1, C0L3A1, C0L4A3, C0L4A4, C0L4A5, C0L4A6,C0L5A1,C0L5A2,C0L6A1,C0L6A2,C0L6A3,C0L7A1,C0L8A2, C0L9A2，C0L9A3，COL11A1，COL1A2，C0L23A1,COLlAl, COLQ，COMP，COMT，C0RD5，CORD1，COX10， COX-2, CP, CPB2, CPO, CPP, CPSl，CPT2, CPT1A, CPX, CRAT, CRBl，CRBM, CREBBP, CRH, CRHBP,CRS, CRV, CRX, CRYAB, CRYBAl， CRYBB2, CRYGA, CRYGC, CRYGD, CSA, CSE, CSF1R, CSF2RA, CSF2RB, CSF3R, CSF1R, CST3, CSTB, CT, CT7, CT-9/BRD6， CTAAl， CTACK, CTEN, CTH, CTHM, CTLA4, CTM, CTNNBl，CTNS, CTPA, CTSB, CTSC, CTSK, CTSL, CTSl，CUBN, CVD1, CX3CL1, CXCLl, CXCL10，CXCL11，CXCL12，CXCL13，CXCL16，CXCL2，CXCL3，CXCL4，CXCL5，CXCL6，CXCL7，CXCL8， CXCL9，CYB5，CYBA，CYBB，CYBB5，，CYFRA 21-1,CYLD，CYLD1，CYMD，CYP1IB1，CYP11B2，CYP17， CYP17A1, CYP19, CYP19A1, CYP1A2， CYPlBl， CYP21A2, CYP27A1, CYP27B1, CYP2A6, CYP2C, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D, CYP2D6, CYP2D7P1, CYP3A4, CYP7B1, CYPBl， CYPlIBl， CYPlAl， CYPlBl，CYRAA,D40,DADI，DAM，DAM-10/MAGE-B1,DAM-6/MAGE-B2, DAX1, DAZ, DBA,DBH,DBI， DBT, DCC, DC-CKl，DCK, DCR, DCX, DDBl，DDB2, DDIT3, DDU, DECRl，DEK-CAN, DEM, DES, DF, DFN2，DFN4，DFN6，DFNA4，DFNA5,DFNB5,DGCR,DHCR7，DHFR，DHOF,DHS，DIAl，DIAPH2，DIAPHl， DIHl，DIOl，DISCI，DKCl，DLAT，DLD，DLL3，DLX3，DMBTl，DMD，DMl，DMPK，DMWD，DNAI1，DNASEl， DNMT3B, DPEPl, DPYD, DPYS, DRD2, DRD4, DRPLA, DSCRl, DSGl, DSP, DSPP, DSS, DTDP2, DTR, DURSl，DffS, DYS, DYSF, DYT2, DYT3, DYT4, DYT2, DYTl，DYXl，EBAF, EBM, EBNA, EBP, EBR3, EBSl，ECAl，ECB2, ECEl，ECGFl，ECT, ED2, ED4, EDA, EDAR, ECAl，EDN3, EDNRB, EECl， EEF1A1L14, EEGVl, EFEMPl，EFTUD2/m, EGFR, EGFR/Herl, EGI，EGR2, EIF2AK3, eIF4G, EKV, EI IS, ELA2, ELF2, ELF2M, ELKl，ELN，ELONG, EMD, EML1, EMMPRIN, EMX2, ENA-78，ENAM, END3, ENG，ENO1，ENPP1，ENUR2，ENURl，EOS，EP300，EPB41，EPB42，EPCAM,EPD，EPhA1，EphA2，EphA3， 肝配蛋白 A2，肝配蛋白 A3，EPHXl，EPM2A，EPO, EPOR, EPX, ERBB2, ERCC2ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERCC6，ERVR，ESRl，ETFA,ETFB,ETFDH,ETMl，ETV6-AML1，ETVl，EVC, EVR2，EVRl，EffSRl，EXT2, EXT3, EXTl，EYAl，EYCL2, EYCL3, EYCLl，EZH2, F10, Fl 1，F12, F13A1, F13B, F2, F5, F5F8D, F7, F8, F8C, F9, FABP2, FACL6, FAH, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCF, FasL, FBN2, FBNl， FBPl，FCG3RA, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCHL, FCMD, FCPl，FDPSL5, FECH, FEO, FEOMl，FES, FGA，FGB,FGD1,FGF2，FGF23，FGF5，FGFR2，FGFR3，FGFRl，FGG，FGSl，FH,FICl，FIH,F2，FKBP6， FLNA, FLT4, FM03, FM04, FMR2, FMRl，FN, FNl/m, FOXCl，FOXEl，F0XL2, F0X01A, FPDMM, FPF, Fra-I，FRAXF, FRDA, FSHB, FSHMD1A, FSHR, FTHl，FTHLl7, FTL, FTZFl，FUCAl，FUT2, FUT6, FUTl，FY，G250，G250/CAIX，G6PC,G6PD,G6PT1,G6PT2,GAA,GABRA3，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3， GAGE-4,GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7b，GAGE-8，GALC，GALE,GALKl，GALNS,GALT,GAMT,GAN,GAST, GASTRIN17, GATA3, GATA, GBA, GBE, GC, GCDH, GCGR, GCHl，GCK, GCP-2, GCSl，G-CSF, GCSH, GCSL, GCY, GDEP, GDF5, GDI1, GDNF, GDXY, GFAP, GFND, GGCX, GGT1, GH2, GHl, GHR, GH RHR, GHS, GIF, GINGF, GIP, GJA3, GJA8, GJB2, GJB3, GJB6, GJBl, GK, GLA, GLB, GLB1，GLC3B，GLC1B, GLC1C, GLDC, GLI3, GLPl，GLRAl, GLUDl，GMl (fuc-GMl)，GM2A, GM-CSF, GMPR, GNAI2, GNAS, GNATl，GNB3, GNE, GNPTA, GNRH, GNRHl，GNRHR, GNS, GnT-V，gplOO, GP1BA, GPIBB, GP9, GPC3, GPD2,GPDSl，GPI，GP1BA,GPNlLff,GPNMB/m, GPSC, GPXl，GRHPR, GRKl，GROa，GRO β，GRO γ , GRPR, GSE, GSMl，GSN, GSR, GSS, GTD, GTS, GUCA1A, GUCY2D, GULOP, GUSB, GUSM, GUST, GYPA, GYPC, GYSl，GYS2, H0KPP2, H0MG2, HADHA, HADHB, HAGE, HAGH, HAL, HAST-2, HBl，HBA2, HBAl， HBB, HBBPl，HBD, HBEl，HBG2, HBGl，HBHR, HBPl，HBQl，HBZ, HBZP, HCA, HCC-I, HCC-4，HCF2, HCG, HCL2, HCLl，HCR, HCVS, HD, HPN, HER2, HER2/NEU, HER3, HERV-K-MEL, HESXl，HEXA, HEXB, HFl, HFE, HFl, HGD, HHC2, HHC3, HHG, HKl HLA-A, HLA_A*0201-R170I，HLA-All/m，HLA_A2/m， HLA-DPB1 HLA-DRA，HLCS，HLXB9，HMBS，HMGA2，HMGCL,HMI,HMN2，HMOXLHMSl HMW-MAA，HND，
36HNE，HNF4A，HOAC，Η0ΜΕ0Β0Χ NKX 3. 1, HOM-TES-14/SCP-l, H0M-TES-85, HOXAl H0XD13, HP, HPC1, HPD, HPE2, HPEl，HPFH, HPFH2, HPRTl，HPSl，HPT, HPV-E6, HPV-E7, HR, HRAS, HRD, HRG, HRPT2, HRPTl，HRX, HSD11B2, HSD17B3, HSD17B4, HSD3B2, HSD3B3, HSNl，HSP70-2M，HSPG2, HST-2, HTC2, HTCl,hTERT, HTN3, HTR2C, HVBS6, HVBS1, HVEC, HV1S, HYALl，HYR, 1-309，IAB, IBGCl， IBM2, ICAMl， ICAM3, iCE, ICHQ, ICR5, ICRl， ICS 1， IDDM2, IDDMl， IDS, IDUA, IF, IFNa/b, IFNGRl，IGADl，IGER, IGF—1R，IGF2R, IGFl，IGH, IGHC, IGHG2, IGHGl，IGHM, IGHR, IGKC, IHGl, IHH,IKBKG,ILl,IL-1RA,IL10,IL-11，IL12,IL12RB1,IL13,IL_13Ra 2，IL-15， IL-16, IL-17, IL18, IL-la, IL-I α，IL-lb, IL-I β，IL1RAPL1, IL2, IL24, IL-2R，IL2RA, IL2RG, IL3, IL3RA, IL4, IL4R, IL4R, IL-5，IL6, IL-7，IL7R, IL-8，IL-9，未成熟层粘连蛋白 受体，IMMP2L，INDX, INFGRl，INFGR2, INFa，IFN, INF y , INS, INSR, INVS, IP-10，IP2, IPFl， IPl, IRF6, IRS1, ISCff, ITGA2, ITGA2B, ITGA6, ITGA7, ITGB2, ITGB3, ITGB4, ITIH1, ITM2B, IV, IVD, JAGl，JAK3, JBS, JBTSl，JMS, JPD, KALI, KAL2, KALI, KLK2, KLK4, KCNAl，KCNE2, KCNEl，KCNH2，KCNJl，KCNJ2，KCNJl，KCNQ2，KCNQ3, KCNQ4, KCNQ1, KCS, KERA, KFM, KFS, KFSD, KHK, ki-67, KIAA0020, KIAA0205, KIAA0205/m, KIF1B, KIT, KK-LC-1, KLK3, KLKB1，KM-HN-1， KMS,KNG,KNO,K-RAS/m,KRAS2，KREVl，KRTl，KRT10，KRT12，KRT13，KRT14，KRT14L1,KRT14L2, KRT14L3, KRT16，KRT16L1, KRT16L2, KRT17, KRT18, KRT2A, KRT3, KRT4, KRT5, KRT6A, KRT6B, KRT9, KRTHBl，KRTHB6, KRTl，KSA, KSS, KffE, KYNU, L0H19CR1, L1CAM, LAGE, LAGE-I，LALL, LAMA2, LAMA3, LAMB3, LAMB1，LAMC2, LAMP2, LAP, LCA5, LCAT，LCCS，LCCS 1，LCFS2, LCS1， LCT, LDHA, LDHB,LDHC,LDLR,LDLR/FUT,LEP,LEWISY,LGCR,LGGF-PBP,LGI1，LGMD2H，LGMD1A， LGMDIB, LHB, LHCGR, LHON, LHRH, LHX3, LIF, LIGl，LIMM, LIMP2, LIPA, LIPA, LIPB, LIPC, LIVIN, L1CAM, LMANl, LMNA, LMX1B, LOLR, LOR, LOX, LPA, LPL, LPP, LQT4, LRP5, LRS 1，LSFC, LT- β，LTBP2，LTC4S，LYL1，XCL1，LYZ，Μ344，ΜΑ50，MAA，MADH4，MAFD2，MAFD1，MAGE，MAGE-A1， MAGE-AlO, MAGE-Al2, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGEB1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-Cl, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1，MAGE-D2，MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-Fl, MAGE-Hl, MAGEL2, MGBl， MGB2, ΜΑΝ2Α1，ΜΑΝ2Β1，MANBA, MANBB, MAOA, MAOB, ΜΑΡΚ8ΙΡ1, MAPT, MART-I, MART-2, MART2/ m, ΜΑΤΙΑ, MBL2, MBP, MBSl，MC1R, MC2R, MC4R, MCC, MCCC2, MCCCl，MCDRl，MCF2, MCKD, MCLl， MC1R,MCOLNl，MCOP，MCOR，MCP-I，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCPH2，MCPHl，MCS,M-CSF,MDB,MDCR, MDM2，MDRV，MDS 1，MEl，MEl/m，ME2,ME20,ME3,MEAX,MEB，MEC CCL-28,MECP2,MEFV,MELANA， MELAS, MENl MSLN, MET, MF4, MG50, MG50/PXDN, MGAT2, MGAT5, MGCl MGCR, MGCT, MGI，MGP, MHC2TA，MHS2，MHS4，MIC2，MIC5，MIDI，MIF，MIP，MIP-5/HCC-2，MITF，MJD，MKI67，MKKS，MKSl， MLHl， MLL, MLLT2, MLLT3, MLLT7, MLLTl， MLS, MLYCD, MMAla, MMP 11， MMVPl， MN/CA IX-Antigen, MNGl，MNl，M0C31，M0CS2，MOCS1, MOG, MORC, MOS, M0V18, MPD1, MPE, MPFD, MPI， MPIF-I，MPL, MPO, MPS3C, MPZ, MREl 1A, MROS, MRPl，MRP2, MRP3, MRSD, MRX14, MRX2, MRX20, MRX3, MRX40, MRXA，MRX1，MS，MS4A2, MSD，MSH2, MSH3, MSH6, MSS，MSSE，MSX2, MSX1，MTATP6， MTC03, MTCOl，MTCYB, MTHFR, MTMl，MTMR2, MTND2, MTND4, MTND5, MTND6, MTNDl，MTP, MTR, MTRNR2, MTRNRl，MTRR,MTTE，MTTG，MTTI，MTTK,MTTL2,MTTLl，MTTN,MTTP，MTTSl，MUCl，MUC2, MUC4, MUC5AC, MUM-1, MUM-l/m，MUM-2，MUM-2/m，MUM-3，MUM-3/m，MUT，突变体 p21 ras, MUTYH, MVK, MX2, MXI1，MY05A, MYB, MYBPC3, MYC, MYCL2, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, MYMY,MY015A，MY01G, MY05A, MY07A, MY0C，肌球蛋白 /m，MYP2, MYP1, NA88-A，N-
乙酰葡糖氨基转移酶-V，NAGA, NAGLU, NAMSD, NAPB, NAT2, NAT, NBIAl，NBSl，NCAM， NCF2, NCFl，NDN, NDP, NDUFS4, NDUFS7, NDUFS8, NDUFVl, NDUFV2, NEB, NEFH, NEMl，Neo-PAP, neo-PAP/m, NEUl，NEUROD1, NF2, NFl，NFYC/m, NGEP, NHS, NKSl，NKX2E, NM, NMEl, NMP22, 匪TC，NODAL, NOG, N0S3, N0TCH3, NOTCHl, NP, NPC2, NPCl，NPHL2, NPHPl，NPHS2, NPHSl，NPM/ ALK, NPPA, NQOl，NR2E3, NR3C1, NR3C2, NRAS, NRAS/m, NRL, NROBl，NRTN, NSE, NSX, NTRKl， NUMAl，NXF2, NY-COl, NY-ESOl, NY-ESO-B, NY-LU-12, ALDOA, NYS2, NYS4, NY-SAR-35, NYSl， NYX, 0A3, OAl，OAP, OASD, OAT, OCAl，0CA2, OCDl，OCRL, OCRLl，OCT, ODDD, ODTl，OFCl，OFDl， O⑶H，OGT, OGT/m, 0PA2, OPAl，OPDl，OPEM, OPG, OPN, 0PN1LW, 0PN1MW, OPNlSff, OPPG, OPTBl， TTD, ORMl，ORPl，0S-9，OS-9/m，OSM LIF, OTC, OTOF,OTSCl，OXCTl，OYTESl，P15，P190 MINOR BCR-ABL,P2RY12, P3, P16,P40,P4HB,P-501，P53，P53/m,P97,PABPNl，PAFAH1B1，PAFAH1P1， PAGE-4, PAGE-5, PAH, PAI-I, PAI-2, PAK3, PAP, PAPPA, PARK2, PART-I, PATE, PAX2, PAX3, PAX6, PAX7, PAX8, PAX9, PBCA，PBCRAl, PBT，PBXl，PBXPl，PC，PCBD，PCCA，PCCB，PCK2, PCKl， PCLD, PCOSl，PCSKl，PDBl，PDCN, PDE6A, PDE6B, PDEF, PDGFB, PDGFR, PDGFRL, PDHAl, PDR, PDXl, PECAMl, PEEl, PEOl, PEPD, PEX10, PEX12, PEX13, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PEXl, PF4, PFBI, PFC, PFKFB1, PFKM, PGAM2, PGD, PGK1, PGKlPl, PGL2, PGR, PGS, PHA2A, PHB, PHEX, PHGDH, PHKA2, PHKA1, PHKB, PHKG2, PHP, PHYH, PI, PI3, PIGA, PIM1-KINASE，PIN1, PIP5K1B, PITX2, PITX3, PKD2, PKD3, PKDl，PKDTS, PKHDl，PKLR, PKPl，PKUl，PLA2G2A, PLA2G7, PLAT, PLECl, PLG, PLI, PLOD, PLP1, PMELl7, PML, PML/RAR α，PMM2, PMP22, PMS2, PMS1, PNKD, PNLIP, POFl，POLA, POLH, POMC, P0N2, PONl，PORC, POTE, POUlFl，P0U3F4, P0U4F3, POUlFl， PPAC, PPARG, PPCD, PPGB, PPHl，PPKB, PPMX, PPOX, PPP1R3A, PPP2R2B, PPTl，PRAME, PRB, PRB3, PRCAl，PRCC, PRD, PRDX5/m, PRFl，PRG4, PRKAR1A, PRKCA, PRKDC, PRKWNK4, PRNP, PROC, PRODH, PROMl, PROPl，PROSl，PRST, PRP8, PRPF31, PRPF8, PRPH2, PRPS2, PRPSl, PRS, PRSS7, PRSSl，PRTN3, PRX, PSA, PSAP, PSCA, PSEN2, PSENl，PSGl，PSGR, PSM, PSMA, PSORSl， PTC, PTCH, PTCHl，PTCH2, PTEN, PTGSl，PTH, PTHRl，PTLAH, PTOSl，PTPNl2, PTPNI I，PTPRK, PTPRK/m, PTS, PUJO, PVR, PVRLl，PWCR，PXE, PXMP3, PXR1，PYGL，PYGM, QDPR, RAB27A, RAD54B, RAD54L, RAG2, RAGE, RAGE-I, RAGl, RAPl, RARA, RASAl, RBAF600/m, RBl，RBP4, RBP4, RBS, RCA1，RCAS1, RCCP2, RCD1，RCV1, RDH5, RDPA，RDS，RECQL2, RECQL3, RECQL4, REG1A, REHOBE， REN, RENBP, RENSl，RET, RFX5, RFXANK, RFXAP, RGR, RHAG, RHAMM/CD168, RHD, RHO, Rip-I， RLBPl，RLN2, RLNl，RLS, RMDl, RMRP, ROMl，R0R2, RP, RPl，RP14, RP17, RP2, RP6, RP9, RPDl， RPE65, RPGR, RPGRIP1, RPl，RP10, RPS19, RPS2, RPS4X, RPS4Y, RPS6KA3, RRAS2, RSl，RSN, RSS, RU1,RU2, RUNX2, RUNXI，RWS，RYRl，S-100，SAAl，SACS, SAG, SAGE, SALLl，SARDH, SARTl， SART2, SART3, SAS, SAXl，SCA2, SCA4, SCA5, SCA7, SCA8, SCAl，SCC, SCCD, SCF, SCLCl，SCN1A， SCN1B, SCN4A, SCN5A, SCNN1A, SCNNlB, SCNN1G, SC02, SCPl， SCZD2, SCZD3, SCZD4, SCZD6, SCZD1, SDF-I α / β，SDHA, SDHD, SDYS, SEDL, SERPENA7, SERPINA3，SERPINA6, SERPINA1, SERPINC1, SERPIND1, SERPINE1, SERPINF2， SERPING1, SERPINI1, SFTPAl， SFTPB, SFTPC, SFTPD, SGCA, SGCB, SGCD, SGCE, SGMl，SGSH, SGY-I, SH2D1A, SHBG, SHFM2, SHFM3, SHFMl，SHH， SHOX, Si, SIAL, SIALYL LEWISX, SIASD, Sl 1，SIMl，SIRT2/m, SIX3, SJSl，SKP2, SLC10A2, SLC12A1, SLC12A3, SLC17A5, SLC19A2, SLC22A1L, SLC22A5, SLC25A13, SLC25A15, SLC25A20,SLC25A4, SLC25A5, SLC25A6, SLC26A2, SLC26A3, SLC26A4, SLC2A1, SLC2A2, SLC2A4, SLC3A1, SLC4A1, SLC4A4, SLC5A1, SLC5A5, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC7A7, SLC7A9, SLCl IAl，SLOS， SMA, SMADl，SMAL, SMARCB1, SMAX2, SMCR, SMCY, SMl，SMN2, SMNl，SMPDl，SNCA, SNRPN, S0D2, S0D3, SODl， SOSl， SOST, S0X9, S0X10, Spl7, SPANXC, SPG23, SPG3A, SPG4, SPG5A, SPG5B, SPG6, SPG7, SPINKl，SPINK5, SPPK, SPPM, SPSMA, SPTAl，SPTB, SPTLCl，SRC, SRD5A2, SRPX, SRS, SRY, β hCG, SSTR2, SSXl，SSX2 (H0M-MEL-40/SSX2)，SSX4, ST8, STAMP-I, STAR, STARPl， STATH, STEAP, STK2, STKl1， STn/KLH, STO, STOM, STS, SUOX, SURFl， SURVIVIN-2B, SYCPl， SYMl，SYNl，SYNSl，SYP, SYT/SSX, SYT-SSX-I, SYT-SSX-2，TA-90，TAAL6, TACSTD1，TACSTD2， TAG72, TAF7L, TAFl，TAGE, TAG-72, TALI, ΤΑΜ, ΤΑΡ2, TAPl，TAPVRl, TARC, TARP, TAT, TAZ, TBP, TBX22, TBX3, TBX5, TBXA2R, TBXASl, TCAP, TCF2, TCFl, TCIRGl, TCL2, TCL4, TCL1A, TCN2, TCOFl，TCR, TCRA, TDD, TDFA, TDRDl，TECK, TECTA, TEK, TEL/AML1, TELAB1, TEX15, TF, TFAP2B, TFE3, TFR2, TG, TGFA, TGF-β , TGFBI, TGFB1, TGFBR2, TGFBRE, TGF^ , TGF^ RII, TGIF, TGM-4, TGMl，ΤΗ，THAS, THBD, THC, THC2, ΤΗΜ, THPO, THRA, THRB, ΤΙΜΜ8Α, ΤΙΜΡ2, ΤΙΜΡ3, TIMPl，TITFl，TKCR，TKT, TLP, TLR1，TLR10，TLR2, TLR3, TLR4, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLXl，TM4SF1, TM4SF2, TMCl，TMD, ΤΜΙΡ, TNDM, TNF, TNFRSF1 ΙΑ, TNFRSF1A, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, TNF α , TNF β , TNNI3, ΤΝΝΤ2, T0C, Τ0Ρ2Α, Τ0Ρ1，ΤΡ53，ΤΡ63, TPA, TPBG, TPI， TPI/m, TPI1，ΤΡΜ3, TPMl，TPMT, TPO, TPS, TPTA, TRA, TRAG3, TRAPPC2, TRC8, TREH, TRG, TRH, TRIM32, TRIM37, TRPl，TRP2, TRP_2/6b，TRP-2/INT2，Trp-p8, TRPSl，TS, TSC2, TSC3, TSCl， TSGlOl，TSHB, TSHR, TSP-180，TST, TTGA2B, TTN, TTPA, TTR, TU M2-PK，TULPl，TWIST, TYH, TYR, TYROBP, TYROBP, TYRPl，TYS, UBE2A, UBE3A, UBEl，UCHL1, UFS, UGT1A，ULR, UMPK, UMPS, UOX, UPA，UQCRCl，UR05，UROD, UPK1B, UROS, USH2A, USH3A, USH1A, USH1C, USP9Y, UV24, VBCH, VCF, VDI，VDR,VEGF,VEGFR-2,VEGFR-I，VEGFR-2/FLK-1，VHL,VIM,VMD2，VMDl，VMGLOM,VNEZ, VNF, VP, VRNI, VffF, VffS, WAS, WBS2, WFS2, WFSl，WHCR, WHN, WISP3, WMS, WRN, WS2A, WS2B, WSN, WSS, WT2, WT3, WTLWTS, WffS, XAGE, XDH, XIC, XIST，XK, XM, XPA, XPC, XRCC9, XS, ZAP70, ZFHX1B, ZFX, ZFY, ZIC2, ZIC3, ZNF145, ZNF261, ZNF35, ZNF41, ZNF6, ZNF198, ZffSl.治疗活性蛋白还可以选自细胞凋亡因子或细胞凋亡相关蛋白包括AIF，Apaf例如 Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3, oder AP0-2 (L)，AP0-3 (L)，凋亡酶，Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl_xL， Bcl-Xs, bik，CAD，钙激活中性蛋白酶，胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶-1，胱天蛋白酶-2，胱天 蛋白酶-3，胱天蛋白酶-4，胱天蛋白酶-5，胱天蛋白酶-6，胱天蛋白酶-7，胱天蛋白酶-8， 胱天蛋白酶_9，胱天蛋白酶-10，胱天蛋白酶-11，ced-3, ced-9, c-Jun, c-Myc, crm A，细胞 色素 C，CdRl，DcRl，DD, DED, DISC, DNA-PKcs, DR3, DR4, DR5, FADD/M0RT-1，FAK, Fas (Fas-配 体CD95/fas (受体))，FLICE/MACH, FLIP,胞衬蛋白，fos，G-肌动蛋白，Gas_2，凝溶胶蛋白， 粒酶 A/B，ICAD，ICE，JNK，核纤层蛋白 A/B，MAP，MCL-1，Mdm-2，MEKK-1，MORT-1，NEDD，NF- K B， NuMa, p53, PAK-2，PARP,穿孔蛋白，PITSLRE, PKC δ，pRb,早老蛋白，prICE, RAIDD, Ras, RIP, 鞘磷脂酶，来自单纯疱疹的胸苷激酶，TRADD, TRAF2, TRAIL-Rl，TRAIL-R2，TRAIL-R3，转谷氨 酰胺酶，等。可以由本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA编码的治疗活 性蛋白还可以是佐剂蛋白。在上下文中，佐剂蛋白优选被理解为能够引起如本文中定义 的先天免疫应答的任何蛋白。优选地，所述先天免疫应答包括模式识别受体，诸如例如选
39自Toll-样受体(TLI )家族的受体，包括例如选自人TLR1-TLR10或选自鼠Toll样受体 TLR1-TLR13的Toll样受体的活化。优选地，先天免疫应答在如上定义的哺乳动物中被激 发。更优选地，所述佐剂蛋白选自人佐剂蛋白或选自致病性佐剂蛋白，特别选自细菌佐剂蛋 白。另外，也可以使用编码参与佐剂作用的人蛋白的mRNA。可以由本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA编码的人佐剂蛋 白典型地包括任何人蛋白，其能够引起先天免疫反应(在哺乳动物中)，例如作为外源TLR 配体与TLR结合反应。更优选地，由本发明的免疫刺激组合物的至少一种修饰的(m)RNA编 码的人佐剂蛋白选自由，但不仅限于以下各项组成的组诱导或增强先天免疫反应的细胞 因子，包括 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18，IL-21CCL21，GM-CSF 和 TNF-α ；由巨噬细胞释放的 细胞因子，包括IL-1，IL-6，IL-8，IL-12和TNF-α ；选自补体系统的成分，包括Clq，MBL， Clr, Cls, C2b, Bb, D, MASP-I, MASP-2, C4b, C3b, C5a, C3a, C4a, C5b, C6, C7, C8, C9, CRl, CR2，CR3，CR4，ClqR, C1INH, C4bp，MCP，DAF，H，I，P 和 CD59 ；选自作为图式识别受体的信号 传导网络成分的蛋白包括TLR和IL-1R1，而所述成分是图式识别受体的配体包括IL-I α， IL-I β，β -防卫素，热激蛋白，诸如 HSP10, HSP60, HSP65, HSP70, HSP75 和 HSP90, gp96, 血纤蛋白原，纤连蛋白的TypIII重复额外结构域A ；受体，包括IL-IRI，TLRl, TLR2，TLR3， TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLRll ；信号转导物包括小GTP酶信号传导的成 分(RhoA, Ras, Racl, Cdc42 等)，PIP 信号传导的成分(PI3K，Src-激酶，等)，MyD88_ 依赖 性信号传导的成分(MyD88，IRAKI, IRAK2,等)，MyD88_不依赖性信号传导的成分(TICAM1， TICAM2等)；活化的转录因子包括例如NF-κ B，c-Fos, c-Jun, c_Myc ；和诱导的靶基因包 括例如IL-I α，IL-I β，β -防卫素，IL-6，IFN y , IFNa和IFN β ；选自共刺激分子，包括 ⑶观或⑶40-配体或PDl ；蛋白结构域，包括LAMP ；细胞表面蛋白；或人佐剂蛋白包括⑶80， OT81，ra86，trif，flt-3配体，胸腺五肽，Gp96或纤连蛋白，等，或任意以上人佐剂蛋白的任 意物种同系物。可以由本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA编码的致病性佐 剂蛋白典型地包括任何能够引起先天免疫反应(在哺乳动物中)的致病性(佐剂)蛋白， 更优选选自源自细菌、原生动物、病毒或真菌、动物，等的致病性(佐剂)蛋白，和甚至更 优选地来自选自由，但不仅限于，细菌蛋白、原生生物蛋白(例如刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的抑制蛋白样蛋白)，病毒蛋白，或真菌蛋白，动物蛋白，等组成的组的致病性佐剂 蛋白。在该上下文中，可以由本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA 编码的细菌(佐剂)蛋白可以包括任何能够引起先天免疫应答(优选在哺乳动物中)或 显示佐剂特征的细菌蛋白。更优选地，所述细菌(佐剂)蛋白选自由以下组成的组细菌 热激蛋白或蛋白伴侣，包括Hsp60，Hsp70, Hsp90, HsplOO ；来自革兰士阴性菌的OmpA(夕卜 膜蛋白)；细菌孔蛋白，包括OmpF ；细菌毒素，包括来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的百日咳毒素(PT)，来自百日咳博德特氏菌的百日咳腺苷酸环化酶毒素CyaA 和CyaC，来自百日咳毒素的PT-9K/129G突变体，来自百日咳博德特氏菌的百日咳腺苷酸环 化酶毒素CyaA和CyaC，破伤风毒素，霍乱毒素(CT)，霍乱毒素B-亚单元，来自霍乱毒素的 CTK63突变体，来自CT的CTEllI突变体，大肠埃希氏菌热-不稳定性肠毒素(LT)，来自减 毒热-不稳定性肠毒素(LTB)大肠埃希氏菌(Escherichia coli)热-不稳定性肠毒素变体的B亚单元，包括LTK63，LTR72 ；可溶于苯酚的modulin ；来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylor)的嗜中性白细胞活化蛋白(HP-NAP)；表面活性剂蛋白D ；来自布氏疏螺旋体 (Borrelia burgdorferi)的外表面蛋白A脂蛋白，来自结核分枝杆菌(MyccAacterium tuberculosis)的Ag38 (38kDa抗原)；来自细菌菌毛的蛋白；霍乱弧菌(Vibrio cholerae) 的肠毒素CT，来自革兰士阴性菌的菌毛的菌毛蛋白，和表面活性剂蛋白Α;等，或任意以上 细菌(佐剂)蛋白的任何物种同系物。可以由本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA编码的细 菌(佐剂)蛋白还可以选自细菌佐剂蛋白，甚至更优选选自由以下组成的组，但不仅限 于细菌鞭毛蛋白，包括来自以下生物的鞭毛蛋白土壤杆菌属(Agrobacterium)，产 液菌属(Aquifex)，固氮螺菌属(Azospirillum)，芽孢杆菌属(Bacillus),巴尔通氏体 属(Bartonella)，博德特氏菌属(Bordetella)，疏螺旋体属(Borrelia)，伯克霍尔德氏 菌属(Burkholderia)，弯曲杆菌属(Campylobacter),柄杆菌属(Caulobacte)，梭菌属 (Clostridium)，埃希氏菌属(Escherichia)，螺杆菌属(Helicobacter)，Lachnospiraceae， 军团菌属(Legionella)，利斯特氏菌属(Listeria)，变形菌属(Proteus)，假单胞菌 属(Pseudomonas),M M (Rhizobium), tl M M M (Rhodobacter)， Roseburia,
门氏菌属(Salmonella)，小蛇菌属(Serpulina)，沙雷氏菌属(Serratia)，志贺氏菌属 (Shigella)，密螺旋体属(Tr印onema)，弧菌属(Vibrio)，沃林氏菌属(Wolinel la)，耶 尔森氏菌属(Yersinia)，更优选来自下述物种的鞭毛蛋白，所述物种不仅限于，根癌土 壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens),嗜火产液菌(Aquifex pyrophilus),巴西固氮 螺菌(Azospirillum brasilense),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),苏云金芽孢杆 菌(Bacillus thuringiensis)，巴尔通氏体(Bartonella bacilliformis)，支气管 炎t専德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，布氏疏il旋体(Borrelia burgdorferi), 洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia c印acia)，空肠弯曲杆菌空肠亚种(CampylcAacter jejuni)，新月柄杆菌(Caulobacter crescentus),肉毒梭菌(Clostridium botulinum) 菌株Bennett克隆1，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori), Lachnospiraceae bacterium,侵月市军团菌(Legionella pneumophila),单核 细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，奇异变形菌(Proteus mirabilis), Pseudomonas aeroguinosa, 丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae),苜猜中华根瘤菌 (Rhizobium meliloti),类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides), Roseburia cecicola, Roseburis hominis,鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium),邦戈尔沙门氏菌 (Salmonella bongori)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi), Salmonella enteritidis, 猪痢疾小蛇菌(Serpulina hyodysenteriae),粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens), 鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)，溃蚀密螺旋体(Tr印onema phagedenis)，解藻朊 酸弧菌(Vibrio alginolyticus)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，产琥珀酸沃林氏(Wolinella succinogenes)和小肠结肠炎耶尔森氏 菌(Yersinia enterocolitica)。可以由本发明的免疫刺激组合物的佐剂成分的至少一种(m)RNA编码的细菌鞭毛 蛋白甚至更优选地包括选自这样的组中的序列，所述组包括任意以下参考其编号的序列
权利要求
1.免疫刺激组合物，其包含a)佐剂成分，其包括至少一种(m)RNA或由其组成，所述(m)RNA与阳离子或聚阳离子化 合物复合，和b)至少一种游离mRNA，其编码至少一种治疗活性蛋白，抗原和/或抗体，其中所述免疫刺激组合物能够引起或增强哺乳动物中的先天性和任选地适应性免疫应答。
2.根据权利要求1的免疫刺激组合物，其中所述佐剂成分的至少一种(m)RNA选自短 RNA寡核苷酸，编码RNA，包括mRNA，免疫刺激性RNA，siRNA,反义RNA，或核开关，核酶或适 体。
3.根据权利要求1或2的免疫刺激组合物，其中所述佐剂成分的至少一种(m)RNA是 mRNA。
4.根据权利要求1-3中任一项的免疫刺激组合物，其中所述至少一种游离mRNA和所述 佐剂成分的至少一种(m)RNA彼此相同。
5.根据权利要求1-3中任一项的免疫刺激组合物，其中所述至少一种游离mRNA和所述 佐剂成分的至少一种(m) RNA彼此不同。
6.根据权利要求1-5中任一项的免疫刺激组合物，其中所述佐剂成分中m(RNA)与阳离 子或聚阳离子化合物的N/P比在约0. 1-10的范围，包括约0. 3-4，约0. 5-2，约0. 7-2和约 0. 7-1. 5的范围内。
7.根据权利要求1-7中任一项的免疫刺激组合物，其中所述佐剂成分的(m)RNA与第二 成分b)的至少一种游离mRNA的摩尔比可以选自约0.001 1-约1 0.001的摩尔比，包 括约1 1的比。
8.根据权利要求1-7中任一项的免疫刺激组合物，其中所述至少一种游离mRNA和/或 所述佐剂成分的至少一种(m) RNA是GC-稳定化的。
9.根据权利要求8的免疫刺激组合物，其中GC-稳定化的RNA编码区的G/C含量与天 然RNA编码区的G/C含量相比增加，GC-稳定化的修饰(m)RNA的编码氨基酸序列与天然修 饰(m)RNA的编码氨基酸序列相比不改变。
10.根据权利要求1-9中任一项的免疫刺激组合物，其中所述阳离子或聚阳离子 化合物选自鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，聚-L-赖氨酸(PLL)，碱性多肽，聚-精 氨酸，细胞渗透肽(CPI3S),嵌合CPI3S,包括Transportan，或MPG肽，HIV结合肽，Tat， HIV-ITat (HIV)，Tat衍生的肽，寡精氨酸，穿膜肽家族成员，包括穿膜肽，触角足衍生肽(来 自果蝇触角足)，pAntp, plsl，抗微生物衍生的CPI3S包括Buforin-2，Bac715_24，SynB, SynB(I)，ρVEC, hCT-衍生的肽，SAP, MAP, KALA, PpTG20,富含脯氨酸的肽，L-寡聚体，富含 精氨酸的肽，降钙素肽，FGF，乳铁蛋白，聚-L-赖氨酸，聚精氨酸，组蛋白，VP22衍生肽或类 似物肽，HSV, VP22 (单纯疱疹)，MAP, KALA或蛋白转导结构域包括PTDs，PpT620,富含脯氨 酸的肽，富含精氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，P印-1，和一种或多种降钙素肽，或选自具有下 列总式的下列蛋白或肽(Arg)1 ； (Lys)m ； (His)n ； (Orn)0 ； 0(aa)x，其中 1+m+n+o+x = 8-15, 并且1，m，11或0彼此独立地可以是选自0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15的 任何数字，条件是Arg，Lys, His和Orn的总含量代表寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且 Xaa可以是选自除Arg，LyS，HiS或Orn之外的天然(=天然存在)或非天然氨基酸的任何氨基酸；并且χ可以是选自0，1，2，3，4，5，6，7或8的任何数字，条件是Xaa的总含量不超过 寡肽的所有氨基酸的50%，或选自寡精氨酸，包括 Ar&，Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3，YSSR9SSY, (RKH)4, Y (RKH) 2R,或选自阳离子多糖，包括脱乙酰壳多糖，1，5- 二甲基-1，5- 二氮十一亚甲基聚甲溴化 物，阳离子聚合物，聚乙烯亚胺(PEI)，阳离子脂质，0(^獻[1-(2，3-二油氧基丙基)]-队 N, N-三甲基氯化铵，DMRIE, 二 _C14_ 脒，DOTIM，SAINT, DC-Choi, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE(二油基磷脂酰乙醇-胺)，DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS(二 (十八烷基)酰氨 基甘氨酰精胺)，DIMRI 二肉豆蔻酸-氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵，DOTAP 二油酰氧 基-3-(三甲基氨溶)丙烷，DC-6-14:0，0-二(十四烷酰)-Ν_(α-三甲基氨溶乙酰基)二 乙醇胺氯化物，CLIPl 外消旋-[(2，3_ 二(十八烷基)氧基丙基)(2-羟基乙基)]-二甲 基氯化铵，11 6:外消旋-[2(2，3-二(十六烷基)氧基丙基-氧基甲氧基)乙基]三甲 基铵，CLIP9 外消旋-[2(2，3-二(十六烷基)氧基丙基-氧基琥珀酰氧基)乙基]-三甲 基铵，oligofectamine,或选自阳离子或聚阳离子聚合物，包括修饰的聚氨基酸类，包括如 β -氨基酸-聚合物或逆聚酰胺类，改性的聚乙烯类，包括PVP (聚(N-乙基-4-乙烯基溴化 吡啶鐺))，修饰的丙烯酸酯类，包括pDMAEMA (聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯))，修饰 的酰胺胺类包括PAMAM(聚(酰胺胺))，修饰的聚β氨基酯(PBAE)，包括二胺端修饰的1， 4 丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物，树型化合物，包括聚丙基胺树型化合物 或基于ρΑΜΑΜ的树型化合物，聚亚胺(类)，包括PEI 聚(乙烯亚胺)，聚(丙烯亚胺)，聚 烯丙基胺，基于糖主链的聚合物，包括基于环糊精的聚合物，基于葡聚糖的聚合物，脱乙酰 壳多糖，基于硅烷主链的聚合物，包括PM0XA-PDMS共聚物，由一个或多个阳离子嵌段(选自 如上所述的阳离子聚合物)和一个或多个亲水性或疏水性嵌段(包括聚乙二醇)的组合组 成的嵌段聚合物。
11.根据权利要求1-10中任一项的免疫刺激组合物，其中所述至少一种游离mRNA编 码抗原，所述抗原选自肿瘤抗原，包括5T4，707-AP，9D7，AFP，AlbZIP HPGl, α 5 β 1-整联蛋 白，α 5β 6-整联蛋白，α-甲基酰基-辅酶 A 消旋酶，ART-4，Β7Η4，BAGE-1，BCL-2，BING-4， CA 15-3/CA 27-29，CA 19-9, CA 72-4, CA125，钙网蛋白，CAMEL, CASP-8，组织蛋白酶 B，组 织蛋白酶 L，CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4，CD52, CD55, CD56, CD80, CEA, CLCA2, CML28, Coactosin-样蛋白，胶原蛋白 XXIII，C0X-2，CT-9/BRD6，Cten，细胞周期蛋白 Bi， 细胞周期蛋白 Dl，cyp-B, CYPBl，DAM-10/MAGE-B1, DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Herl, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, EZH2, FGF-5，FN, Fra-I, G250/CAIX, GAGE-I, GAGE-2，GAGE-3， GAGE-4, GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7b，GAGE-8，GDEP,GnT-V,gplOO,GPC3,HAGE,HAST-2，h印sin， Her2/neu/ErbB2, HERV-K-MEL, HNE,同源框 NKX 3. 1，HOM-TES-14/SCP-l, H0M-TES-85， HPV-E6, HPV-E7, HST-2，hTERT, iCE, IGF-1R，IL-13Ra2, IL-2R，IL-5，未成熟层粘连蛋白 受体，激肽释放酶 _2，激肽释放酶-4，Κ 67, KIAA0205, KK-LC-I, KM-HN-1, LAGE-I, Livin, MAGE-Al, MAGE-AlO, MAGE-Al2, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-Cl, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-Dl, MAGE-D2, MAGE-D4， MAGE-E1, MAGE-E2， MAGE-Fl, MAGE-Hl, MAGEL2, mammaglobin A, MART-1/Melan-A，MART-2，基质蛋白 22，MC1R, M-CSF, Mesothelin,MG50/PXDN, MMP 11,MN/CA IX-抗原，MRP-3，MUC1，MUC2，NA88-A，N-乙酰葡糖胺转移酶-V， 新 _PAP，NGEP, NMP22, NPM/ALK, NSE, NY-ES0-1, NY-ESO-B, 0A1, OFA-iLRP, OGT, 0S-9，骨钙 蛋白，骨桥蛋白，pl5，pl5, pl90 小 bcr-abl，p53，PAGE-4，PAI-1，PAI-2，PAP, PART-1, PATE, PDEF，Pim-I-激酶，Pinl, POTE, PRAME, prostein，蛋白酶-3，PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, RAGE-I, RHAMM/CD168，RU1，RU2, S-100，SAGE, SART-1，SART-2，SART-3，SCC，Sp 17，SSX-1， SSX-2/H0M-MEL-40, SSX-4，STAMP-1, STEAP，存活蛋白，存活蛋白-2B，TA-90，TAG-72，TARP, TGFb, TGFbRII, TGM-4，TRAG-3, TRG, TRP-I, TRP_2/6b，TRP-2/INT2，Trp-p8,酪氨酸酶，UPA， VEGF, VEGFR-2/FLK-1，WTl ；或选自癌症疾病中表达的突变抗原，包括α -辅肌动蛋白-4/ m, ARTCl/m, bcr/abl, β-联蛋白 /m，BRCAl/m, BRCA2/m, CASP-5/m，CASP-8/m，CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-l/m，DEK-CAN，EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FNl/m, GPNMB/ m, HLA-A*0201-R170I，HLA-Al 1/m, HLA_A2/m，HSP70-2M，KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, MEl/m, MUM-l/m，MUM-2/m, MUM-3/m, I 类肌球蛋白 /m，新-PAP/m，NFYC/m, N-Ras/ m, OGT/m, 0S-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRK/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYT-SSX-I, SYT-SSX-2, TEL-AMLl，TGFbRII，TPI/m。
12.根据权利要求1-11中任一项的免疫刺激组合物，其中所述至少一种游离mRNA编码a)以下抗原组中的至少1、2、3或4种(不同的)抗原 PSA (前列腺-特异性抗原)=KLK3 (激肽释放酶-3)， PSMA (前列腺-特异性膜抗原)， PSCA (前列腺干细胞抗原)， STEAP (前列腺的六次跨膜上皮抗原)，或b)以下抗原组中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种(不同的)抗原 hTERT, WTl， MAGE-A2， 5T4, MAGE-A3， MUCl， Her-2/neu, NY-ES0-1， CEA， 存活蛋白， MAGE-CUP / 或 MAGE-C2,其中这些抗原的任意组合是可能的。
13.药物组合物，其包含根据权利要求1-12中任一项的免疫刺激组合物和任选地药用 载体、佐剂、和/或媒介物。
14.根据权利要求13的药物组合物，其中所述药物组合物是疫苗。
15.用于制备如根据权利要求1-12中任一项定义的免疫刺激组合物的方法，所述方法 包括以下步骤a)制备包括与阳离子或聚阳离子化合物复合的至少一种(m)RNA或由其组成的佐剂成 分，其通过以特定比例混合如根据权利要求1-12中任一项定义的至少一种(m)RNA和阳离 子或聚阳离子化合物实现；和b)通过以特定比例，将如根据权利要求1-12中任一项定义的至少一种游离mRNA加 入至根据步骤a)制备的佐剂成分来制备本发明的免疫刺激组合物，其中如根据权利要求 1-12中任一项定义的所述至少一种游离mRNA编码至少一种治疗活性蛋白，抗原和/或抗 体。
16.根据权利要求1-15中任一项的免疫刺激组合物，或如根据权利要求1-12中任一项 定义的包括与阳离子或聚阳离子化合物复合的至少一种(m)RNA或由其组成的佐剂成分和 编码至少一种治疗活性蛋白，抗原和/或抗体的至少一种游离mRNA用于制备预防、治疗、和 /或改善选自癌症或肿瘤疾病，自身免疫疾病，传染病，包括病毒、细菌或原生动物传染病或 过敏症或过敏性疾病的任何疾病和病症的药物组合物的用途。
17.试剂盒，其包括根据权利要求1-12中任一项的免疫刺激组合物，和/或根据权利要 求13-14中任一项的药物组合物，和任选地关于所述免疫刺激组合物和/或所述药物组合 物的施用和剂量的信息的技术说明书。
全文摘要
本发明涉及免疫刺激组合物，其包含a)佐剂成分，其包括或由至少一种(m)RNA组成，所述(m)RNA与阳离子或聚阳离子化合物复合，和b)至少一种游离mRNA，其编码至少一种治疗活性蛋白，抗原，过敏原和/或抗体，其中所述免疫刺激组合物能够引起或增强哺乳动物中的先天性和任选地适应性免疫应答。本发明的免疫刺激组合物可以是药物组合物或疫苗。本发明还涉及制备本发明的免疫刺激组合物的方法。本发明还涉及本发明的免疫刺激组合物或其成分用于治疗多种疾病(用于制备用于治疗多种疾病的药物组合物或疫苗)的用途。最后，本发明还涉及包含本发明的免疫刺激组合物，其成分和/或所述药物组合物或疫苗的试剂盒。
文档编号A61K47/00GK102123733SQ200980131936
公开日2011年7月13日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年9月30日
发明者泽恩克·福斯, 马里奥拉·福蒂姆莱奇科 申请人:库瑞瓦格有限责任公司