专利名称：一种羧甲基化双歧杆菌胞外多糖及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于胞外多糖改性技术领域，具体涉及一种羧甲基化双歧杆菌胞外多糖及 其制备方法和它的应用。
背景技术：
双歧杆菌属(Bifidobacterium)具有公认的安全性，是健康动物消化道内的优势 菌群，资源丰富，种类繁多，并对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、控制内毒素血症、延缓衰 老、抗肿瘤等生理作用。随着研究日渐深入，人们发现，双歧杆菌的许多表观特性及功能都 与其代谢产物有关，对其代谢产物进行研究具有十分重要的意义。多糖是指由20个以上单糖组成的糖类化合物，是生物体重要的生物大分子之一， 因其多变的结构而成为一种最具魅力的信息载体，具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、 降血糖、抗炎、抗病毒等生理功能，并逐渐成为现代生物、医药、食品、化工行业的研究开发 重点，具有很大的发展潜力。其中，免疫调节类多糖是研究最多、临床应用最广的多糖，也是 最具开发应用潜力的多糖。乳酸菌胞外多糖具有抗肿瘤、免疫调节等生理活性，不仅对乳制品的质构和风味 具有重要影响，而且有可能成为保健食品的一个良好来源，广泛应用于各种食品的增稠、稳 定、乳化、胶凝及保湿。双歧杆菌是乳酸菌的一种，具有很高的安全性和应用潜力，胞外多糖 (exopolysaccharide,EPS)是其重要的代谢产物之一，为了提高和保护多糖活性，其结构修 饰方面的研究也有了很大的进展。对于多糖生理活性的修饰主要包括主链的部分降解、硒 酸酯化、硫酸酯化、部分乙酰化、羧甲基化、羧乙基化、多羟基化、支链修饰等。随着现代生物 技术的发展，基因工程技术、酶法技术和部分物理手段也被用来对多糖结构进行修饰，以增 强其生理活性，尤其在免疫增强和抗肿瘤方面研究较为深入。例如，Jamas等向一株野生酵 母菌引入外源基因，使其胞内多糖结构发生变化，支链糖基取代度从0. 2提高到0. 5，且空 间构象变得更为舒展，单螺旋结构的比例提高，多糖体外抗肿瘤活性比修饰前提高35倍左 右；Stahmarm等报道，一种具有β _1，3-D-葡聚糖结构的真菌多糖经过长时间的超声处理 后，分子量从25万降至5万左右，经小角度X光衍射分析，其超声降解产物的空间结构与具 有免疫调节活性的裂褶多糖相似；Demleitner等以curdlan为研究对象，进行了以D-半乳 糖、D或L-阿拉伯糖以及它们各自的低聚糖为取代基的支链修饰，并分别研究其抗肿瘤活 性，结果表明，D-葡萄糖为支链的curdlan衍生物活性最高。由于经过修饰能够提高多糖活性，所以，此方面的研究逐渐成为近几年国内外关 注的焦点。此项技术的国内外专利授权情况如下硫酸酯化枸杞多糖，硫酸酯化姬松茸多糖，硫酸酯化苦瓜多糖，硫酸酯化云芝多糖 和硫酸酯化茶树菇多糖均已有专利申报，例如，闫红、易剑平“硫酸酯化多糖及其制备方法 和应用”(申请号=200510098339. 0)。2006年，意大利的乔治·佐派蒂、帕斯夸·安娜·奥雷斯特等申请的专利“K5多糖 高硫酸化衍生物及其制备方法”(申请号=200610127561. 3)通过异丙醇处理和消除亲油物质提纯大肠杆菌K5多糖，纯化的产物经过N-脱乙酰化作用后可用来制备硫酸化程度高的 新型N，0-硫酸化多糖。国内也有多糖硫酸酯化的报道。2004年，郑维发、储成才，“新月菱形藻胞外多糖硫 酸酯及其制备方法与应用”(申请号=200410090619. 2)中先将新月菱形藻胞外多糖先与甲 酰胺混合，然后加入酯化试剂在冰浴条件下进行酯化反应，将反应物中和至PH6. 8 7. 2， 用有机溶剂沉淀，所得沉淀溶解、透析即得新月菱形藻胞外多糖硫酸酯，并证明该胞外多糖 硫酸酯免疫调节活性有了显著的提高，对病毒性肺炎和肿瘤的形成有明显的抑制作用。随着生理功能构效研究方面的发展，其他改性手段也逐渐引入该技术领域。 2004年，在刘建林、赵雪松，“硒酸酯多糖制备新工艺”(申请号=200410067065. 4)中 将卡拉胶进行硒酸酯化，形成了一种有机硒阈值稳定在50-100mg/g的硒化卡拉胶 (Kappa-Selenocarrageenan)，控制了重复抱团现象，形成了一维纳米结晶，磺酸基团完全 被亚硒酸基团修饰，降低了生物毒性，该发明合成的硒酸酯多糖，具有毒性小、生物利用度 高的特点；2004年，孟晟、钟伟在“一种磷脂基团修饰的多糖或其衍生物的合成方法”(申 请号=200410054022. 2)中报道了将磷酰胆碱等具有仿生功能的基团通过缩合反应，共价 键合到天然的、生物可降解的天然多糖分子链上，制备得一种含有以磷脂基团修饰的新型 多糖材料；2004年，于广利在“一种灰树花多糖硫酸酯及其制备方法与应用”(申请号 200410023856. 7)中将灰树花水不溶性多糖悬浮于有机溶剂中，加入碱液醚化，加入氯乙 酸，控温进行硫酸酯化反应制备得到的羧甲基衍生物水溶性好，结构独特，价格便宜，可用 于制备免疫调节剂和抗肿瘤药物。但是有关双歧杆菌胞外多糖及其改性产品的研究报道非 常少。本发明对双歧杆菌胞外多糖改性，从而提供一种比未改性双歧杆菌胞外多糖免疫调 节性更强的改性双歧杆菌胞外多糖。
发明内容
本发明的目的在于提供一种羧甲基化双歧杆菌胞外多糖。本发明的第二个目的在于提供上述羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的制备方法。本发明的第三个目的在于提供一种含有上述羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的组合 物。本发明的第四个目的在于提供上述羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的应用。一种羧甲基化双歧杆菌胞外多糖，该胞外多糖的红外光谱中存在1600波 数和1420波数的羧甲基中COO-的对称和反对称伸缩震动特征峰，上述羧甲基双歧 杆菌胞外多糖中羧甲基含量为10% -21%，取代度为0. 35 % -0. 72%，重均分子量为 (0. 8-1. 2) X IO5Da0其制备方法如下(1)将双歧杆菌胞外多糖溶于浓度为1. 5-2. OmoL/L的NaOH水溶液中，剧烈搅拌下 加入氯乙酸，于40-80°C继续剧烈搅拌反应2-4h，其中，双歧杆菌胞外多糖与氯乙酸的质量 比为 1 5-15 ；(2)冷却步骤(1)的反应体系至室温，用冰乙酸中和至pH为7. 0，过滤，滤液用自 来水透析2d-3d，再用蒸馏水透析ld-2d ；(3)浓缩透析液至原体积的1/2-1/5，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多 糖，再依次用无水乙醇、丙酮各洗涤沉淀2-3次，真空冷冻干燥沉淀得羧甲基双歧杆菌胞外多糖。所述羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的原料双歧杆菌胞外多糖是通过发酵星状双 歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC No. 1355 而得到的。星状双歧杆菌 (Bifidobacterium asteroides)BM-10于2005年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 1355。该菌株已在申请号为 200510105465. 4的专利中公开。有关利用该菌株发酵制备双歧杆菌胞外多糖的方法参见申 请号为200510105465. 4的专利。步骤(1)中所述双歧杆菌胞外多糖在NaOH水溶液中的浓度为4_20g/L。步骤(2)中透析所用透析袋的截留分子量为8000_12000Da。羧甲基双歧杆菌胞外多糖中的羧甲基含量、取代度及重均分子量的测定方法参 见以下两个文献孙婷，吕荣文，张红兵，光度滴定法测定羧甲基菊粉的取代度，精细化工， 2007，24卷，1期，83-85;张燕萍，变性淀粉制造与应用[M]，北京化学工业出版社，2001， 72。一种以羧甲基化双歧杆菌胞外多糖为活性成分的组合物，还包括一种或多种药学 上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘结剂、润湿剂、 崩解剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。所述组合物的剂型为药学领域常规剂型，包括片 剂、胶囊、注射剂、冻干粉针、口服液、冲剂等。均可按药学领域常规方法制备。上述羧甲基化双歧杆菌胞外多糖在制备免疫力调节保健品或药物中的应用。本发明得到的羧甲基双歧杆菌胞外多糖的化学性质稳定，而且体外实验表明该胞 外多糖可以显著提高小鼠脾细胞中IL-2、IFNy细胞因子的水平，免疫调节力明显高于未 改性的双歧杆菌胞外多糖，本发明的胞外多糖制备方法简单易行。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不限制本发明。实施例1羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的制备1(1)设置三组实验，将三份2g双歧杆菌胞外多糖分别溶于浓度为250mL、2. OmoL/L 的NaOH水溶液中，剧烈搅拌下依次加入氯乙酸10g、20g、30g，于60°C条件下继续剧烈搅拌 反应3h ；(2)冷却步骤(1)的反应体系至室温，用冰乙酸中和至pH为7. 0，过滤，滤液用自 来水透析2d-3d，再用蒸馏水透析ld-2d ；(3)浓缩透析液至原体积的1/5，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多糖，再 依次用无水乙醇、丙酮各洗涤沉淀2次，真空冷冻干燥沉淀得羧甲基双歧杆菌胞外多糖；得 到的羧甲基双歧杆菌胞外多糖的羧甲基化结果见表1。表1不同原料用量对双歧杆菌胞外多糖羧甲基化程度及产率的影响 实施例2羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的制备2(1)设置三组实验，将三份2g双歧杆菌胞外多糖分别溶于浓度为250mL、2. OmoL/L 的NaOH水溶液中，剧烈搅拌下分别加入氯乙酸20g，将三份反应体系分别置于40°C、60°C、 80°C的条件下继续剧烈搅拌反应3h ；(2)冷却步骤(1)的反应体系至室温，用冰乙酸中和至pH为7. 0，过滤，滤液用自 来水透析2d-3d，再用蒸馏水透析ld-2d ；(3)浓缩透析液至原体积的1/4，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多糖，再 依次用无水乙醇、丙酮各洗涤沉淀2次，真空冷冻干燥沉淀得羧甲基双歧杆菌胞外多糖；得 到的羧甲基双歧杆菌胞外多糖的羧甲基化结果见表2。表2不同反应温度对双歧杆菌胞外多糖羧甲基化程度及产率的影响 实施例3羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的制备3(1)设置三组实验，将三份2g双歧杆菌胞外多糖分别溶于浓度为250mL、2. OmoL/L 的NaOH水溶液中，剧烈搅拌下分别加入氯乙酸20g，将三份反应体系分别在60°C条件下继 续剧烈搅拌反应2h、3h和4h ；(2)冷却步骤(1)的反应体系至室温，用冰乙酸中和至pH为7. 0，过滤，滤液用自 来水透析2d-3d，再用蒸馏水透析ld-2d ；(3)浓缩透析液至原体积的1/4，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多糖，再 依次用无水乙醇、丙酮各洗涤沉淀2次，真空冷冻干燥沉淀得羧甲基双歧杆菌胞外多糖；得 到的羧甲基双歧杆菌胞外多糖的羧甲基化结果见表3。表3不同反应时间对双歧杆菌胞外多糖羧甲基化程度及产率的影响
6 实施例4羧甲基化双歧杆菌胞外多糖对小鼠脾细胞细胞因子的增殖效果将小鼠(昆明种SPF级小鼠，雌雄不限，体重(18+2) g，5周龄，购自北京军事医学 科学院)处死制备脾细胞混悬液，并调节细胞浓度达到2. OX IO6个/mL ；将未改性的原料双 歧杆菌胞外多糖和本发明实施例3在反应3h的情况下制得的羧甲基化双歧杆菌胞外多糖 分别溶于蒸馏水中制备浓度为100μ g/mL的多糖溶液；96孔板中每孔加100 μ 1上述细胞混悬液和100 μ 1改性(羧甲基化)或未改性的 双歧杆菌胞外多糖溶液，同时设不加多糖的对照组。每组测定三个平行，置于C02培养箱中 培养3d，用细胞因子试剂盒(进口分装，上海西塘生物科技有限公司)测定IL-2和IFNy 浓度，结果见表4。表4小鼠脾细胞IL-2和IFN γ的检测结果(pg/mL) *与对照组比较，ρ < 0. 05广与对照组比较，ρ < 0.01o表4的数据表明，与对照组相比，双歧杆菌胞外多糖的体外免疫活性高于未改性 双歧杆菌胞外多糖，能显著提高IL-2、IFNy细胞因子的浓度，表现出体外免疫活性。
权利要求
一种羧甲基化双歧杆菌胞外多糖，其特征在于，所述羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的红外光谱中存在1600波数和1420波数的羧甲基中COO 的对称和反对称伸缩震动特征峰，上述羧甲基化双歧杆菌胞外多糖中的羧甲基含量为10％ 21％，取代度为0.35％ 0.72％，重均分子量为(0.8 1.2)×105Da。
2.根据权力要求1所述的羧甲基化双歧杆菌胞外多糖，其特征在于，所述羧甲基化 双歧杆菌胞外多糖的原料双歧杆菌胞外多糖是通过发酵星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC No. 1355 而得到的。
3.权利要求1所述的羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，按照如下 操作步骤进行(1)将双歧杆菌胞外多糖溶于浓度为1.5-2. OmoL/L的NaOH水溶液中，剧烈搅拌下加入 氯乙酸，于40-80°C继续剧烈搅拌反应2-4h，其中，双歧杆菌胞外多糖与氯乙酸的质量比为 1 5-15 ；(2)冷却步骤(1)的反应体系至室温，用冰乙酸中和至pH为7.0，过滤，滤液用自来水 透析2d-3d，再用蒸馏水透析ld-2d ；(3)浓缩透析液至原体积的1/2-1/5，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多糖，再 依次用无水乙醇、丙酮各洗涤沉淀2-3次，真空冷冻干燥沉淀得羧甲基双歧杆菌胞外多糖。
4.根据权利要求3所述的羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，步骤 (1)中所述双歧杆菌胞外多糖在NaOH水溶液中的浓度为4-20g/L。
5.根据权利要求3所述的羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述 双歧杆菌胞外多糖是通过发酵星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides) BM-10CGMCC No. 1355而得到的。
6.一种以权利要求1所述的羧甲基化双歧杆菌胞外多糖为活性成分的组合物。
7.权利要求1所述羧甲基化双歧杆菌胞外多糖在制备免疫力调节药物中的应用。
8.权利要求1所述羧甲基化双歧杆菌胞外多糖在制备免疫力调节保健品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种属于胞外多糖改性技术领域的羧甲基化双歧杆菌胞外多糖及制备方法。该胞外多糖的红外光谱中存在1600波数和1420波数的羧甲基中COO-的对称和反对称伸缩震动特征峰，羧甲基含量为10％-21％，取代度为0.35％-0.72％，重均分子量为(0.8-1.2)×105Da。其制备方法如下将双歧杆菌胞外多糖与氯乙酸在NaOH水溶液中反应后，用冰乙酸中和至pH为7.0，然后经过滤、透析、浓缩、沉淀和洗涤而得到羧甲基双歧杆菌胞外多糖。本发明还公开了羧甲基化双歧杆菌胞外多糖在制备免疫力调节保健品或药物中的应用。该羧甲基化双歧杆菌胞外多糖的体外实验表明该胞外多糖可以显著提高小鼠脾细胞中IL-2、IFNγ细胞因子的水平，免疫调节力明显高于未改性的双歧杆菌胞外多糖。
文档编号A61K31/715GK101891837SQ20101024829
公开日2010年11月24日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者吴广枫, 旭日花, 李平兰, 林伟静, 马世敏 申请人:中国农业大学