专利名称：一种重组的hsv扩增子载体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种重组的HSV扩增子载体的构建及其用途。
背景技术：
单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus，HSV)是一禾中属于疱疫病毒科a病毒亚科的DNA病毒，分为HSV-I和HSV-2两个血清型。单纯疱疹病毒(HSV-1)的基因结构为1521Λ 的双链线性DNA，形成分别为长片段UL和短片段US相连的2个片段。HSV基因组含有89 个分别为立早期(IE)，早期(E)和晚期(L)顺序表达的编码基因，3个与DNA复制有关的顺式作用元件(1个oriL和2个oriS)，以及与病毒包装有关的包装信号(pac)序列。在疱疹病毒基因组的外面，依次包被有3层结构，分别为呈20面体结构的核衣壳(capsid)，由蛋白构成的间层蛋白(tegument)以及含糖蛋白的外囊膜(李琦涵，姜莉.人类疱疹病毒的病原生物学，北京，化学工业出版社，2009.)。人类是单纯疱疹病毒HSV-I和HSV-2传播的唯一宿主，据报道正常人群的感染率高达60%-95%，其传播途径主要通过皮肤粘膜的直接接触和体液接触，包括疱疹液，眼泪，鼻涕，唾液，精液和生殖道分泌物等。单纯疱疹病毒经皮肤和粘膜感染后，可经神经，血液或直接扩散的形式传播至人体不同的组织细胞并在人体内终生呈现显性感染-潜伏感染-再激活感染的周期发作。单纯疱疹病毒感染绝大多数为无症状的潜伏感染，但少数人呈现从皮肤粘膜疱疹，如面部口唇疱疹，到不同器官不同严重程度的疱疹性炎症，如鼻炎， 鼻窦炎，角膜炎，视网膜炎，迷路炎，急性肝炎，盆腔炎，肺炎，前列腺炎，膀胱尿道炎和附睾精囊腺炎，以及致死率高达70%的疱疹性脑炎。生殖器疱疹是一种较常见的无彻底治愈方法的性传播疾病，不仅造成泌尿生殖器系统反复发作的炎症，而且可增加HIV的感染机率。除上述直接的感染性疾病外，疱疹病毒感染还可造成一些其它疾病或并发症的发生， 例如，HSV-I和HSV-2均能感染血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，造成血管内皮细胞和血管平滑肌细胞胆固醇代谢障碍和局部炎症，从而导致高血压，动脉粥样硬化和血栓形成等心脑血管疾病。此外，另有文献报道，HSV感染还与老年痴呆的发生有关(Letermeur L, Peres K, Fleury H, et al. Seropositivity to herpes simplex virus antibodies and risk of Alzheimer's disease: a population-based cohort study. PLoS One. 2008, 3(11):e3637)。基于上述HSV病毒的广泛的不同类型细胞的感染性，特别是很强的皮肤粘膜上皮细胞和神经细胞的嗜性以及不整合的安全性，HSV病毒被认为是构建转基因和基因治疗的最理想的载体之一。源于疱疹病毒HSV的载体有3种，分别为条件复制型载体，复制缺陷型载体和扩增子载体。所谓条件复制型HSV载体，就是经基因改造后，病毒选择性的在特定的细胞类型中进行复制，而很少在正常细胞中复制，该类载体主要用于溶肿瘤的治疗；复制缺陷型载体，是一种敲除病毒一个或多个HSV复制关键基因(譬如ICP4和ICP27等)的转基因载体，使其在转基因的细胞中失去再复制的能力以增加载体的安全性，而载体的制备只能
3在提供缺失基因的细胞系中进行；扩增子载体是复制缺陷的和辅助病毒依赖的载体，由于完全缺少病毒基因，不仅具有很大的携带外源基因的能力，而且对转基因细胞没有细胞毒性和遗传安全性的担忧，与野生的HSV-I病毒在结构，免疫学，宿主范围上相同，被认为是最理想的病毒源的转基因研究和基因治疗载体之一。HSV-I扩增子载体自从1982年Spaete和Frenkel首先报告HSV-1扩增子载体以来至今，均是以细菌的质粒为骨架，克隆入HSV-I病毒的复制起始序列ori，病毒的包装信号Pac所构建而成的，即包括细菌质粒的复制序列ColE origin，细菌生长的抗性基因，HSV-I病毒的复制起始点ori，病毒的包装信号pac，以及转基因表达盒5个部分 (Spaete RRj Frenkel N. The herpes simplex virus ampIicon: a new eucaryotic defective-virus cloningamplifying vector. Cell 1982; 30:295 - 304.)。由于 HSV-I 扩增子载体完全不含HSV病毒的基因，因此当转染到真核细胞后，需要提供病毒复制包装所必须的病毒基因才能进行自我复制，HSV-I扩增子质粒像HSV病毒首尾相连的基因组一样进行滚环复制，然后利用病毒表达的包装蛋白以病毒基因组DNA150k左右的长度将复制的DNA切割并包装成HSV假病毒颗粒。“扩增子(Amplicon)” 一词表明质粒DNA大量扩增并相连形成多联体的形式取代病毒基因组，并被包装成HSV假病毒颗粒。HSV-I扩增子载体的制备主要有辅助病毒感染法和HSV-I基因组转染法两种辅助病毒感染法是用扩增子质粒DNA转染宿主细胞后，然后再感染HSV-I辅助病毒，该方法可产生高滴度的扩增子载体，但同时也有大量辅助病毒的污染，对转基因的细胞产生细胞毒性，因此需要对包装系统进行改进，而此后的很多研究正是集中在这方面，譬如利用敲掉 ICP4和ICP27的复制缺陷型HSV病毒为辅助病毒，以及点特异重组敲除‘a’包装序列的复制缺陷型HSV病毒为辅助病毒。到目前为止，最有效的改进就是辅助病毒‘a’包装序列的 Cre-LoxP重组敲除技术，即利用重组技术将辅助病毒的包装信号Pac两端加上特异的重组 IoxP序列，并将此病毒感染至表达Cre重组酶的细胞系，以此作为辅助病毒，可以制备出高滴度的HSV-I扩增子假病毒，而且可使辅助病毒的污染降低到0. 05-0. 5%的低水平。尽管这项技术可以实现规模化生产HSV扩增子载体，但由于HSV疱疹病毒正常人群的高感染率， 60-90%的人群可存在单纯疱疹病毒HSV的潜伏感染，污染的辅助病毒会激活内源的潜伏病毒或存在发生重组的风险，因此限制了 HSV扩增子载体的临床应用。HSV-I基因组转染法 基因组转染法就是将不含pac信号的HSV-I基因组片段或重组超大的HSV基因组转染入宿主细胞，作为提供的复制或包装系统所产生HSV扩增子的办法，例如粘粒转染法和超大的细菌人工染色体(BAC) HSV基因组转染法。粘粒转染法是将删除pac信号的相互重叠的 HSV-I基因组片段分别克隆入多个(5个)粘粒中，经转染入宿主细胞后重组成不含pac信号的HSV-I基因组，作为提供HSV扩增子载体的复制和包装系统，从而生产出不含辅助病毒的HSV扩增子载体。细菌人工染色体(BAC) -HSV基因组转染法是利用细菌人工染色体 (BAC)携带敲除包装信号和ICP27编码序列的HSV-I基因组(重组充填至大于178k)的DNA 与扩增子质粒共感染宿主细胞，可产生无辅助病毒污染的HSV-I扩增子。由于BAC增大至 178kb以上超过了 HSV病毒的包装能力，可以完全排除BAC和扩增子载体发生重组获得包装信号而包装入病毒颗粒的可能性。另外，重组辅助病毒因为其缺失ICP27基因是复制缺陷的，HSV扩增子的制备基本上实现了无辅助病毒污染。基因组转染法虽可产生出极少或无辅助病毒污染的HSV扩增子，但由于其扩增子的产量太低，不能够进行规模化生产，因此很难进入临床的实际应用。HSV-I扩增子作为基因治疗载体已进行了广泛研究，包括利用 HSV-I扩增子表达SiRNA用于不同疾病的转基因研究已显示出其广阔的应用前景，然而，到目前为止，尚无利用HSV-I扩增子载体表达抑制分子用于抗HSV病毒自身的研究报道。HSV 扩增子已被广泛用作转基因研究和基因治疗研究，主要是用于抗肿瘤的基因治疗(表达抑制血管生成的的可溶性VEGF受体、TK自杀基因、EGTK等)，神经保护(例如表达神经生长因子、抗凋亡蛋白、神经递质、神经受体或者抗氧化酸)，神经系统疾病的基因治疗(如帕金森病、表达dopamine、⑶NF、BDNF、脑缺血、表达抗凋亡因子Bcl_2)，以及疫苗的研发(包括肿瘤疫苗、HIV疫苗和Alzheimer疫苗等)。传统的质粒型HSV扩增子载体的转基因表达是短暂的，关键原因是扩增子质粒的细菌基因序列可造成转基因的快速沉默以及宿主细胞诱导的转基因的沉默。传统扩增子载体在感染宿主细胞后，其携带的细菌元件可形成一种不活跃的染色质状态，进而影响目的基因的表达(Suzuki Μ, Kasai K, Saeki Y. , Plasmid DNA Sequences Present in Conventional Herpes SimplexVirus Amplicon Vectors Cause Rapid Transgene Silencing by Forming Inactive Chromatin,J Virol. 2006 Apr；80 (7):3293-300.)。为了去除细菌基因元件，Chen及其同事通过链霉菌噬菌体Φ031整合酶介导的定点重组系统在原核细胞内经重组产生一种不含细菌元件的小环状扩增子载体，其操作过程如下在氨苄抗性的PBR322质粒的基础上，构建携带HSV-I oriS、pac、GFP报告基因，attB, attP和 Φ〔31整合酶的扩增子质粒载体pBAD(tC31RHB。链霉菌噬菌体Φ C31整合酶为温度敏感性整合酶，该MC扩增子制备系统中Φ031整合酶由araBAD启动子启动，在32° C，L_阿拉伯糖的诱导下可以表达6C31整合酶，Φ031整合酶可以介导attB，attP位点的特异重组，经 (j5C31/attB-attP重组后大肠杆菌内会有3种质粒即没有发生重组的pBAD(tC31RHB质粒， 经重组产生的MC扩增子载体，和不含HSV-I oriS、pac和GFP报告基因元件的pBAD Φ C31 质粒，通过进一步的限制性酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳可以去除pBAD(^C31RHB和 PBAD Φ C31消化后的线性片段，胶回收纯化出MC DNA,再转染到真核细胞在HSV-I病毒的辅助下包装出小环 HSV 扩增子载体(Chen ZY, He CY, Ehrhardt A, et al. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. [J], Mol Ther. 2003;8 (3) :495-500· )。Suzuki 等人 2006 年的研究证明，利用无细菌基因的小环扩增子表达的转基因水平高于传统的HSV扩增子基因表达水平20倍。利用辅助病毒支持长时间的转基因表达，可能由于HSV病毒ICPO基因的表达， 抑制了宿主细胞对转基因的沉默作用。此外，不同启动子对转基因表达时间也有影响，强启动子对转基因表达的抑制作用，因此可用诱导型启动子或者细胞特异的启动子。研究表明， IE4/5，CMV启动子对基因的启动效应为1-2周，而神经特异的启动子为2_14个月。HSV扩增子载体在制备技术方面存在着如何大规模的制备高滴度又无辅助病毒污染的难题，即利用辅助病毒感染法可以规模的生产出高滴度HSV扩增子载体但存在辅助病毒污染，而HSV病毒基因组转染法可以制备出无辅助病毒污染的HSV扩增子载体，但不能实现规模化和高滴度的生产。因此，这两种制备技术均限制了 HSV扩增子载体的临床应用。综上所述，目前的HSV扩增子载体主要存在如下缺陷和制备技术难题
1、传统的质粒型HSV扩增子载体因含有细菌质粒元件(包括复制序列COlE origin和抗性基因，如氨苄抗性基因等)转基因表达的效率和持续时间；2、MC小环扩增子(minicircle ampIicon)载体的构建需要利用链霉菌噬菌体Φ〇31 整合酶介导的定点重组系统和L-阿拉伯糖的诱导在原核细胞内经重组产生。制备过程中存在辅助质粒的污染，制备的MC扩增子尚需进一步的纯化去除混杂的pBAD c^C31RHB和 PBAD Φ C31质粒，该制备过程操作繁琐，经该制备过程产生的小环扩增子DNA浓度较低，代价昂贵，不能规模化的生产，同时，生产出来的小环扩增子DNA还需借助非病毒类载体再转染至真核细胞才可包装成扩增子病毒载体，因此不具实际应用价值；
3、无论是传统的质粒型HSV扩增子载体还是MC小环HSV扩增子载体在制备技术方面均不能实现规模化生产无辅助病毒污染的用于体内抗HSV病毒感染及相关疾病治疗的HSV 扩增子基因治疗载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组的不含细菌复制序列(colE origin)和抗性基因的新型HSV扩增子载体的构建和制备方法，以及该重组的HSV扩增子载体在转基因研究、制备肿瘤基因治疗和抗HSV感染及相关疾病制剂中的用途。在本发明的第一方面，提供一种利用复制缺陷型腺病毒Cre-IoxP重组系统重组的HSV扩增子载体的构建和制备方法。在一个优选例中，携带Cre重组酶表达盒的复制缺陷型腺病毒载体的构建是将操作性相连的元件SV40启动子-Cre重组酶编码序列-PolyA元件重组入AD5复制缺陷型腺病毒载体构建而成。在另一个优选例中，携带操作性相连元件“loxP-HSV复制元件oriS-包装信号 pac-转基因表达盒-ΙοχΡ”的复制缺陷型腺病毒载体的构建是将2个IoxP序列及其位于2 个IoxP序列之间的单纯疱疹病毒HSV-I的复制元件oriS，单纯疱疹病毒HSV-I包装信号 pac以及转基因表达盒重组入AD5复制缺陷型腺病毒载体构建而成。在另一个优选例中，操作性相连元件“ IoxP-HSV复制元件oriS-包装信号pac-转基因表达盒-ΙοχΡ”中的2个IoxP序列是同向的。IoxP (locus of X-over Pl)序歹丨J :IoxP序列来源于Pl噬菌体，是由两个13bp反向重复序列(Cre酶的结合域)和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列确定了 IoxP 的方向，见序列表SEQ ID NO: 1所示。在另一优选例中，所述的复制元件oriS的序列如SEQ ID NO: 2所示；或所述的复制元件oriS序列通过如下方法获得MluI酶切BAC-HSV-1HF获得含末端重复区的BAC-TR， 然后NotI酶切BAC-TR获得含oriS及其侧翼序列的片段(约3. 5Kb)，再AgeI酶切前述片段后获得含oriS核心区及其侧翼序列的片段(约1. 7Kb)，最后经NcoI酶切获得1. 2Kb的含88bp oriS核心区及其侧翼序列的片段作为复制元件oriS的序列；
所述的包装信号pac的序列如SEQ ID NO: 3所示；或所述的包装信号pac通过如下方法获得=MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，获得含末端重复区的BAC-TR，SacI酶切BAC-TR获得含 HSV-I末端重复区“pac”序列的片段(约4Kb) ；HphI酶切前一片段获得含末端重复区“pac” 序列的片段(约1.3Kb) ；BsrBI酶切前一片段后获得W3-DRl-Uc结构，最后获得188bp作为包装信号pac的序列。在另一优选例中，所述的转基因表达盒选自目的基因表达盒，报告基因表达盒，靶基因的microRNA表达盒和靶基因的shRNA表达盒。在另一优选例中，所述的报告基因选自(但不限于)DsRed, LacZ, GFP, EGFP, beta-gal或荧光素酶的编码基因。除了以上元件，所述的重组的HSV扩增子载体中还可包括其它元件，例如选自启动子、增强子、标记基因或翻译控制元件等。这些元件的选择是本领域技术人员所清楚的。在本发明的另一方面，提供所述的重组的HSV扩增子载体具有利用不同血清型单纯疱疹病毒HSV-I和HSV-2以及不同基因型的单纯疱疹病毒为辅助病毒进行复制和包装的相同特性，因此可作为抗各种单纯疱疹病毒的通用载体。在本发明的另一方面，提供所述的重组的HSV扩增子载体的体外制备方法，首先利用两种分别携带Cre和操作性相连的元件loxP-HSV oriS-pac-转基因表达盒-IoxP的复制缺陷型腺病毒，通过在共感染细胞内的重组出不含细菌基因的HSV扩增子DNA，而后重组出的HSV扩增子DNA在复制缺陷型HSV辅助病毒的作用下进行复制，包装成HSV扩增子假病毒载体，再经过反复传代扩增，即可制备出大量HSV扩增子假病毒载体，该假病毒载体可用于转基因研究和基因治疗。在本发明的另一方面，提供所述的重组的HSV扩增子载体的用途，通过表达报告基因直接用于观察病毒的分布和转基因的表达效率，也可间接反映miRNA的表达水平或融合蛋白的表达水平。本发明的另一方面，提供所述的重组的HSV扩增子载体的用途，通过表达外源的转基因，用于制备不同的基因治疗制剂。在本发明的另一方面，提供所述的重组的HSV扩增子载体的用途，通过肿瘤特异启动子特异表达复制缺陷型HSV病毒缺失的关键基因(UL54)编码的蛋白ICP27，从而使复制缺陷性HSV-I病毒限定在肿瘤组织特异复制，以达到靶向溶肿瘤/抗肿瘤的目的。本发明的重组的HSV扩增子载体的另一方面用途，在于所述的两种分别携带Cre 和操作性相连的元件loxP-HSV oriS-pac-转基因表达盒-IoxP的复制缺陷型腺病毒可直接作为治疗制剂用于抑制病毒复制的基因治疗，该制剂的复制缺陷型腺病毒进入细胞后重组出HSV扩增子载体，所重组出HSV扩增子载体利用所感染的HSV野生病毒的进行再复制和包装出HSV扩增子假病毒，对感染的野生病毒产生竞争性抑制或通过持久地表达外源抗病毒基因而抑制野生病毒的复制，因此可用于体内抗HSV感染和治疗HSV感染相关疾病。本发明首次利用复制缺陷型腺病毒Cre-IoxP系统重组制备出HSV扩增子载体，该扩增子载体与传统的以细菌质粒为骨架的HSV扩增子载体相比，不含细菌复制序列(colE origin)和抗性基因元件，仅含HSV的oriS，pac序列和转基因表达盒，因此避免了细菌基因对转基因的沉默作用。本发明在制备重组的HSV-I扩增子载体的复制缺陷型腺病毒制剂时，既可实现规模化生产，又可完全避免辅助病毒的污染。本发明重组的HSV扩增子载体在真核细胞内利用腺病毒Cre-IoxP重组系统重组产生，避免了小环mini circle扩增子DNA在细菌中重组，筛选，胶纯化以及DNA真核转染的的复杂程序，在构建和制备方面简单，高效省时，节省成本以及规模化制备。更重要的是腺病毒已是临床应用的基因药物载体，因此具有实际应用价值和前景。本发明首次从单纯疱疹病毒HSV-I HF株的TRL区和TRS区克隆和鉴定出oriS和pac序列。本发明所用的病毒株为HSV-I HF,目前，国际上尚没有文献报道该病毒株的oriS 和pac序列，我们首次测序出HSV-I HF的含有88bp oriS核心区boxI，boxII，boxIII的序列以及比文献报道200bp更小188bp的pac序列，并经试验证实其有利用不同血清型单纯疱疹病毒HSV-I和HSV-2以及不同基因型的单纯疱疹病毒为辅助病毒进行复制和包装的通用特性，因此可作为利用体内感染的任何单纯疱疹病毒再复制的抗HSV病毒的通用载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、BAC-HSV-I (HF)质粒构建示意图； 图2、BAC-HSV-I (HF)质粒酶切鉴定图； 图3、HSV-I (HF)扩增子质粒构建示意图； 图4、HSV-I包装信号pac测序图； 图5、HSV-I复制起始点oriS测序图； 图6、HSV-I扩增子质粒载体酶切鉴定图； 图7、腺病毒Adv-IoxP-OPD-IoxP构建示意图； 图8、HSV-I扩增子载体OPD构建过程中的酶切鉴定图； 图 9、腺病毒 Adv-LoxP-0PD-hTERT-ICP27-LoxP 构建示意图； 图10、hTERT启动子测序图； 图11、ICP27基因开放性读码框测序图； 图12、腺病毒Adv-cre构建示意图； 图 13、BAC-HSV-I (HF) ICP27-功能鉴定图； 图14、重组的HSV-I扩增子示意图； 图15、重组的HSV-I扩增子功能鉴定图； 图16、不同病毒株对重组的HSV-I扩增子的包装； 图17、重组的HSV-I扩增子竞争性抑制病毒的实验结果； 图18、重组的HSV-I扩增子载体表达目的基因的功能鉴定图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。材料
BAC-C223质粒、pGEM-T-Cre和pYD_C255质粒获自美国华盛顿大学，分子病毒系Dr. Yu实验室；HSV-I HF株，HSV-1K0S株病毒获自郑州大学一附院神经三科实验室；HSV-I F 株，HSV-2 333株病毒获自武汉病毒所；质粒psilencer2. 0-U6-20购自Addgene公司；质粒 PDsRed2-Cl购自Clontech公司；LR重组酶，复制缺陷型腺病毒载体系统Ad-Block-Dest，
8脂质体2000，DHlOB大肠杆菌购自hvitrogen公司；pGEMT购自天根生科有限公司；克隆工具酶均购自大连宝生物公司；DNA合成和DNA测序由北京三博远志公司完成；质粒提取，胶回收，PCR清洗过柱试剂盒均购于Axygen公司；无支原体胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培养基，谷氨酰胺，非必需氨基酸购自GIBCO公司J93A细胞及Vero 细胞购自中国科学院上海生命研究院细胞库；SW105重组工程菌由郑州大学神经内三科保藏。材料备注
1、BAC-C223质粒(获赠于美国华盛顿大学，分子病毒系Dr.扑实验室，其构建方式如下所述)，BAC-C223质粒是在pMB0131质粒的基础上进行改建的，pMB0131质粒最早报道于1989年，由0’ Connor等首次用“染色体建造”的方法，是含有大肠杆菌(E coll. ) F因子复制所需元件的一个mini F复制子(0’ Connor Μ, Peifer Μ, Bender W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 1989 Jun 16; 244 0910) :1307-12.)。美国华盛顿大学，分子病毒系的Dr. Yu教授将 1oxP-us28-us29-SV40 Promoter-GFP-loxP-IRES-Puro-poly A 片段加入 pMB0131 质粒中， 构建成YD_(^9质粒(具体的构建过程见参考文献Yu D, Smith GA, Enquist Lff, Shenk Τ. Construction of a self-excisable bacterial artificial chromosome containing the human cytomegalovirus genome and mutagenesis of the diploid TRL/IRL13 gene. J Virol. 2002 Mar; 76 (5) : 2316-28. )。BAC-C223 质粒的构建是在 YD_(^9 质粒的基础上， 通过酶切的方式去除掉US^-US^片段后构建而成的。2、pGEM-T_Cre质粒(获赠于美国华盛顿大学，分子病毒系Dr. Yu实验室，其构建方式如下所述)，酶切的方式将p760-Cre质粒(购自GeneBrider)的Cre重组酶克隆至 pGEM-Τ载体(购自Promega公司)构建而成。3、pYD_C255质粒(获赠于美国华盛顿大学，分子病毒系Dr. Yu实验室，其构建方式如下所述)，以携带feilK表达盒的PGalK质粒(其具体的构建方式参考文献Qian Z, Xuan B, Hong TT, Yu D. The full-length protein encoded by human cytomegalovirus gene ULl17 is required for the proper maturation of viral replication compartments. J Virol. 2008 Apr; 82 (7) :3452-65. Epub 2008 Jan 23.)为骨架载体， 在此基础上，加以Kanamycin的抗性筛选基因而改造而来(其具体的构建方式参考文献 Warming S, Costantino N, Court DL, Jenkins ΝΑ, Copeland NG. . Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 2005 Feb 24;33(4):e36.)。4、SW105菌株是基于DHlOB (Invitrogen)公司的含有缺陷型噬菌体的OT380菌株之基础上通过同源重组加入由阿拉伯糖操纵元所控制Flpe重组酶后成为EL250菌株， EL250菌株修复基半乳糖操纵元后成为SW103菌株，SW103敲除feilK基因成为SW105菌株。 这样，SW105菌株含有exojata，gam三种red重组所需的三种酶的工程菌，同时可由阿拉伯糖操纵元所控制的Flap重组酶表达盒(其具体的构建方式参考文献Qian Z, Xuan B, Hong TTj Yu D. The full-length protein encoded by human cytomegalovirus gene ULl17 is required for the proper maturation of viral replication compartments. J Virol. 2008 Apr; 82 (7) :3452-65. Epub 2008 Jan 23。 Warming S, Costantino N, Court DLjJenkins ΝΑ, Copeland NG. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 2005 Feb 24;33 (4):e36)。实施例1、BAC-HSV-I HF株的构建如图1所示BAC-HSV-I HF株的构建模式。以HSV-I HF株的基因组为模板，以引物SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5 扩增与 HSV-I的UL43基因同源的上游同源臂，引物两端分别设计的有McI和MluI的酶切接头；
以引物SEQ ID NO: 6和SEQ ID N0: 7扩增与HSV-I的UL47基因序列同源的下游同源臂，引物两端分别设计有NotI和MluI的酶切接头，酶切连接法将同源臂克隆至BAC质粒的SacI，NotI酶切位点中，构建成了 BAC-LR arm,用MluI酶将含HSV-I同源臂的BAC 切成线性，将线性BAC-HSV-I同源臂与HSV-I基因组用脂质体包埋法转染至Vero细胞，经真核细胞内同源重组产生含GFP绿色荧光报告基因的BAC-HSV-I重组病毒，收集含重组型 BAC-HSV-I的Vero细胞上清液，噬斑纯化挑取含GFP的阳性CPE，将收获的含GFP的病毒再次感染Vero细胞，待病毒自身环化时用Hirt法提取病毒环形基因组，将所提取的环形基因组电转化至DHlOB电转感受态菌，待克隆长出后提取BAC-HSV-I HF质粒，同时提取HSV-I病毒基因组，MluI酶切鉴定BAC-HSV-I HF质粒，同时MluI酶切HSV-I病毒基因组作为对照， 理论上将MluI酶切鉴定BAC-HSV-I HF质粒应较MluI酶切HSV-I病毒基因组多出来一条约IOKb的条带(BAC-C223的大小约为10Kb)，酶切结果示MluI酶切鉴定BAC-HSV-I HF质粒应较MluI酶切HSV-I病毒基因组多出来一条约IOKb的条带(如图2)。结论，含HSV-I HF株基因组的细菌人工染色体BAC-HSV-I HF质粒构建成功。实施例2、HSV-I扩增子质粒载体的构建如图3所示HSV-I扩增子质粒载体构建模式。l、“pac”序列的获得
MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，获得含末端重复区的BAC-TR，SacI酶切BAC-TR获得4Kb的含HSV-I末端重复区“pac”序列的片段；HphI酶切4Kb的片段后获得1. 3Kb的含末端重复区“pac”序列的片段。另经BsrBI酶切1. 3Kb的片段后可获得188bp的W3-DRl-Uc结构(为最小包装单位的包装信号)。EcoRI酶切pGEMT线性T载体(购自大连宝生物公司)，Klenow 酶(购自大连宝生物公司)补平EcoRI酶切后的pGEMT线性T载体，将188bp的片段以平端化末端加入PGEMT，以T7通用引物进行测序(测序由北京三博远志测序公司完成)，以T7为引物测出188bp长度的片段，测序结果见图4，序列见SEQ ID N0: 3，测序结果表明，本实验成功获得HSV-I的包装信号pac。2、oriS序列的获得
MluI酶切BAC-HSV-1HF获得含末端重复区的BAC-TR，接着NotI酶切BAC-TR获得3. 5Kb 的含oriS及其侧翼序列的片段，AgeI酶切3. 5Kb的含oriS及其侧翼序列的片段后获得 1. 7Kb的含oriS核心区及其侧翼序列的片段，另用NcoI酶切1. 7Kb的片段后获得1. 2Kb的含oriS核心区域及其部分侧翼序列的片段，HSV-I复制起点oriS获得示意图如图6。EcoRI 酶切pGEMT线性T载体(购自大连宝生物公司)，Klenow酶(购自大连宝生物公司)补平1. 2Kb 的片段和EcoRI酶切后的pGEMT线性T载体，将1. 2Kb的片段以平端化末端加入pGEMT，以 T7通用引物进行测序(测序由北京三博远志测序公司完成)，以T7为引物测出409长度的片段，其序列为SEQ ID N0: 2，测序结果表明，该片段含有HSV-I的88bp的复制起始点oriS
10(图5)，测序结果表明，本实验成功获得含HSV-I的复制起始点oriS的片段。3、psi2. 0-mcs 的构建
人工合成两端带有HindIII和EcoRI酶切位点的多克隆位点(MCS)DNA片段见SEQ ID NO: 8，HindIII和EcoRI分别双酶切MCS和psilencer2. 0-U6-20，将MCS片段定向克隆入 psilencer2. 0-U6-20 的 HindIII, EcoRI 位点即构建完成 psi2. 0-mcs 4、psi2. O-mcs-DsRed 的构建
MluI，NsiI双酶切pDsRed2-Cl质粒，获得约1. 5Kb的DsRed红色荧光表达盒，XhoI酶切 psi2. 0-mcs作为载体，Klenow酶补平DsRed红色荧光表达核和XhoI酶切后的psi2. 0-mcs, 将两者以平端相连接，转化，HindIII, StuI双酶切鉴定质粒psi2. O-mcs-DsRed的酶切体系，理论上应该出现3. 2Kb和1Kb的两条目的条带，电泳结果见图6-1，可见3. 2Kb和1Kb 的两条目的条带，结果示psi2. O-mcs-DsRed构建成功。5、HSV-I扩增子质粒载体的构建
将获得的188bp片段I^c，克隆入psi2. O-mcs-DsRed (的BglII位点中，从而分别构建成 psi2. 0-mcs-DsRed-pac，HindIII，SpeII 双酶切鉴定质粒 psi2. O-mcs-DsRed-pac 的酶切体系，理论上应该出现4. 2Kb和200bp的两条目的条带，电泳结果见图6-2，可见4. 2Kb和 200bp的两条目的条带，结果显示psi2. O-mcs-DsRed-pac构建成功。将含oriS核心区域的1.2Kb的oriS片段正方向(与野生型HSV-I相同)克隆入 psi2. O-mcs-DsRed-pac 构建成扩增子载体，命名为 HSV-l-Amplicon-DsRed (HAD), 含oriS、pac、DsRed序列的片段命名为OPD片段。HindIII，BglII双酶切鉴定质粒 HSV-I-Amplicon-DsRed的酶切体系，理论上应该出现4. 2Kb和1. 4Kb的两条目的条带，电泳结果见图6-3，可见4. 2Kb和1.4Kb的两条目的条带，结果示HSV-1-Amplicon-DsRed构建成功。实施例3、重组腺病毒Adv-IoxP-OPD-IoxP及Adv-IoxP-D-IoxP的构建以及病毒包装
如图7所示Adv-IoxP-OPD-IoxP的构建模式。1、pENTR-loxP-LRarm-loxP 载体的构建
pENTR-MCS用MlI和BamHI酶切，胶回收2. 6kb的载体pENTR-MCS，将载体补平，去磷； BAC-LRarm中含有同向的两个IoxP位点，用PvuI和kal酶切，可以切出两个同向的IoxP 以及中间的LR同源臂及GFP报告基因的片段，将片段补平。将载体和片段连接，转化，鉴定pENTR-loxP-LRarm-loxP载体，用Avail酶切鉴定。理论上应该可以得到大小为3. 1Kb， 1. 4Kb，1. 2Kb，440bp，282bp，及 153bp，电泳结果如图 8-1A 中箭头所示，可见 3. 1Kb，1. 4Kb， 1. 2Kb，440bpJ8^p，及 15!3bp 条带。结果示 pENTR-loxP-LRarm-loxP 载体构建成功。2、pENTR-loxP-OPD-loxP 和 pENTR-loxP-D-loxP 载体构建 pENTR-loxP-LRarm-loxP 载体用 Avail 酶切，胶回收 3. Ikb 的载体 pENTR-loxP-loxP，
补平，去磷；HAD质粒用BglII和PciI酶切得到3. 4kb片段0PD，含有HSV-I (HF)的 oriS, pac以及DsRed报告基因元件；PciI, HindIII双酶切psi2. 0-mcs-DsRed获得单个DsRed报告基因元件，命名为D片段；将OPD片段和D片段补平，连接，转化，分别构建成 pENTR-loxP-OPD-loxP 载体和 pENTR-loxP-D-loxP 载体；用 HincII 酶切鉴定 pENTR-loxP-OPD-loxP两种情况为正确的结果，一个方向酶切结果为得到910bp和5. 61Λ的两个条带，另一个方向酶切结果为得到3. 27kb和3. 2kb电泳结果如图8-1B中箭头所示，可见两个方向均有正确的克隆，今用酶切结果为得到910bp和5. 6kb的两个条带的克隆进一步实验，结果示pENTR-loxP-OPD-loxP载体构建成功。EagI酶切pENTR-loxP-D-loxP载体，理论上可见一个方向约1. 5Kb和4Kb的两条目的条带，另一个方向约为2. 1Kb和3. 4Kb的目的条带，电泳结果如图8-1C中箭头所示，可见两个方向均有正确的克隆，今用酶切结果为得到1.5Kb和4Kb的两个条带的克隆进一步实验，结果示pENTR-loxP-D-loxP载体构建成功。3、Adv-IoxP-OPD-IoxP 和 Adv-loxP-D-loxP 质粒构建
按照 hvitrogen 试剂盒说明，将 pENTR-loxP-OPD-loxP 和 pENTR-loxP-D-loxP 分别与 Ade-Block-Dest 进行 LR 重组，获得 Adv-IoxP-OPD-IoxP 和 Adv-IoxP-D-IoxP 克隆质粒。EcoRI 酶切鉴定 Adv-loxP-OPD-loxP，理论上应该切出 25kb,6. 7kb,2. Okb, 1. 9kb, 1. 5kb和526bp的条带，电泳结果见图8-2中左侧箭头所示，结果可见25kb,6. 7kb, 2. Okb, 1. 9kb，1. 5kb和526bp的条带，结果示Adv-loxP-OPD-loxP质粒构建成功。EcoRI酶切鉴定 Adv-loxP-D-loxP，理论上应该切出 25kb，6. 7kb，2. Okb, 1. 9kb, 1. 5kb 和 526bp 的条带，电泳结果见图8-2中右侧箭头所示，可见25 kb, 5. 7kb, 2. Okb, 1. 5kb, 725bp和526bp的目的条带，结果示Adv-loxP-D-loxP质粒构建成功。4、Adv-loxP-OPD-loxP 和 Adv-loxP-D-loxP 腺病毒的包装
用SwaI分别酶切Adv-loxP-OPD-loxP和Adv-loxP-D-loxP，并进行片段纯化，用于重组腺病毒包装。传四3々细胞，用irwitrogen公司转染试剂脂质体2000转染上述酶切纯化后的 Adv-loxP-OPD-loxP 和 Adv-loxP-D-loxP 线性 DNA，包装重组腺病毒 Adv-loxP-OPD-loxP 禾口 Adv-loxP-D-loxP。在六孔板中传细胞3父105个/孔，371，5% CO2培养箱中培养过夜；第二天当细胞贴壁率达到90%时进行转染。将细胞培养液换成10%胎牛血清无双抗(青霉素和链霉素)DMEM完全培养基，放入37°C，5% CO2培养箱中孵育30min，各2μ g的酶切纯化后的线性 Adv-loxP-OPD-loxP、Adv-loxP-D-loxP 和 6 μ 1 脂质体 2000 各用 250 μ 1 无胎牛血清无双抗的DMEM完全培养基稀释，轻轻混勻后静置，5min后，将DNA和脂质体2000稀释液轻轻混合均勻后静置，20min后将DNA-脂质体混合液均勻加入上述孵育30min的细胞中，放入37°C，5% CO2培养箱中培养，他后更换10%胎牛血清含双抗(青霉素和链霉素) DMEM完全培养基，在37°C，5% CO2培养箱中培养。培养期间定期观察细胞形态，直到出现完全CPE (细胞病变效应)，可收获病毒，放入-80°C保存。重组腺病毒Adv-loxP-OPD-loxP和 Adv-loxP-D-loxP包装过程中，在第7天出现CPE，在第10天出现了完全CPE，结果表明重组腺病毒 Adv-loxP-OPD-loxP 和 Adv-loxP-D-loxP 包装成功。实施例4、腺病毒 Adv-loxP-0PD-hTERT-ICP27_loxP 的克隆方案如图9所示Adv-IoxP-OPD- hTERT_ICP27_loxP载体的构建模式。1、pGEMT-hTERT 的构建
hTERT启动子是以细胞基因组DNA为模板，以SEQ ID N0: 9和SEQ ID NO: 10为上下游引物扩增获得，PCR反应条件94°C预变性5min，然后进行PCR反应30个循环94°C 变性30s，55°C退火45s，72°C延伸30s，通过TA克隆获得pGEMT-hTERT克隆，测序结果见图 10，测序结果证实hTERT启动子序列正确，克隆成功。
12
2、pGMT-hTERT_ICP27 的构建
以HSV-IHF株为模板，以ULM基因(编码ICP27蛋白)的上下游序列SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12为引物扩增ULM基因的开放性读码框架，1%琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物， 理论上应该扩增出约1. 5Kb的条带，将PCR扩增的ULM基因开放性读码框架连接质粒载体 pGMT-hTERT,即构建完pGMT-hTERT-ICP27，测序结果见图11，测序结果证实ICP27基因克隆成功。3、pENTR-loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP 的构建
EcoRI， HindIII 双酶切 pGMT_hTERT_ICP27 获得 hTERT_ICP27 片段，XmnI， HindIII双酶切pENTR -loxP-OPD-loxP作为载体，获得的片段以平滑末端克隆入pENTR -loxP-OPD-loxP，从而构建完成 pENTR -loxP-0PD-hTERT-ICP27_loxP。4、Adv- loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP质粒的克隆与重组病毒的包装
pENTR- loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP 与 Ade-Block-Dest 进行 LR 重组，获得 Adv- loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP 质粒克隆质粒，用 SwaI 酶切 Adv-IoxP- OPD -hTERT-ICP27-loxP,并进行片段纯化，在四3细胞中进行重组腺病毒Adv-loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP的包装(具体步骤参考实施例3中腺病毒Adv-IoxP-OPD-IoxP和腺病毒Adv-loxP-D-loxP的包装实施方法)，在第7天出现CPE，在第10天出现了完全CPE，结果表明腺病毒Adv-loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP包装成功。实施例5、重组腺病毒Adv-Cre的构建以及病毒包装如图12所示Adv-Cre的构建模式。 1、pENTR-Cre 的构建
pENTR-MCS 和 pGEM-T-Cre 质粒用 EcoRI 和 SacII 酶切，胶回收 2. 6kb 的载体 pENTR-MCS (如图8-3A1所示)和2. 2kb的SV40-Cre片断，连接，转化，鉴定构建成pENTR-Cre载体。用 EcoRI和SacII酶切酶切鉴定，阳性克隆可以得到2. 2kb和2. 6kb的条带，如图8-3B2所示。 结果显示，pENTR-Cre构建成功。2、Adv-Cre载体的构建
按照hvitrogen试剂盒说明，将pENTR-Cre与Ade-Block-Dest进行LR重组，获得 Adv-Cre克隆质粒。pENTR-Cre与Ade-Block-Dest在LR重组酶的作用下产生Adv-Cre克隆。用BamHI酶切鉴定Adv-Cre，阳性克隆酶切条带为18. Ikb, 14. 5kb，1. 51kb，840bp和 510bp，如图8-3C1所示，结果显示，Adv-Cre构建成功。用SwaI酶切Adv-Cre并进行片段纯化，在细胞中进行重组腺病毒的包装(具体包装步骤参考实施例3中腺病毒Adv-loxP-OPD-loxP和腺病毒Adv-loxP-D-loxP的包装实施方法)，结果表明腺病毒Adv-Cre包装成功。实施例6、BAC-HSV-1-ICP27"
以SEQ ID N0: 13和SEQ ID N0: 14为引物，以pYD_C255质粒经PCR扩增含UL54同源序列和半乳糖激酶(GalK基因)的片段ULM-GalK，PCR反应条件94°C预变性5min，然后进行PCR反应30个循环94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸30s，将ULM-GalK片段电转化至含BAC-HSV-I质粒的大肠杆菌SW105 (含有Red重组酶的工程菌)，经同源重组获得 BAC-HSV-l-ICP27-Galk质粒，序列SEQ ID N0: 15和SEQ ID N0: 16由博尚生物技术有限公司合成，SEQ ID N0: 15的3’端的20个碱基和SEQ ID N0: 16的5’端的20个碱基可以互补配对，将SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16互为引物和模板进行PCR反应，PCR反应条件94°C预变性5min，然后进行PCR反应30个循环94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸 30s，可以获得不含galk片段的含ULM基因开发性读码框上下游同源序列的片段ULMarm， 将片段ULMarm电转化至含BAC-HSV-l_ICP27-galk质粒的大肠杆菌SW105(含有Red重组酶的工程菌)，经同源重组获得BAC-HSV-1-ICP27_质粒，转染BAC-HSV-1质粒的Vero细胞可见细胞病变效应产生，转染BAC-HSV-1-ICP27一质粒的Vero细胞无病变效应(图13A)，将 BAC-HSV-1-ICP27-质粒和BAC-HSV-1质粒分别转染2ug质粒DNA至Vero细胞，5天后观察可见(图13B)。结果显示，BAC-HSV-1-ICP27_为复制缺陷型HSV-I载体，在无ICP27蛋白表达的情况下不能复制。实施例7、重组的HSV-I扩增子载体的制备及其鉴定
如图14所示重组腺病毒Cre-IoxP系统生产HSV-I扩增子的流程图。按2. 5X IO5/孔传vero细胞六孔板，37 °C，5% CO2培养箱中过夜培养；待细胞长至融合率达90 A组给予MOI=I的Adv-Cre和Adv-IoxP-OPD-IoxP腺病毒，B组给予 MOI=I 的 Adv-Cre，Adv-loxP-OPD-loxP 腺病毒和 MOI=I 的的 HSV-1 病毒，C 组给予 MOI=I 的 Adv-loxP-OPD-loxP 腺病毒和 MOI=I 的的 HSV-1 病毒，D 组给予 MOI=I 的 Adv-Cre， Adv-IoxP-D-IoxP腺病毒和MOI=I的的HSV-I病毒，4小时后换液继续培养，12小时后荧光倒置显微镜下观察A，B, C，D各组都有红色荧光出现如图15-1A，图15-1B，图15-1C，图 15-1D。24-48h期间荧光显微镜下观察，至完全CPE收获病毒。按2. 5 X IO5/孔传vero细胞六孔板，待细胞长至融合率约9096，换液后加入上述收获的各组病毒液，6h后换液，48h后荧光显微镜下观察所示，只有B组vero细胞在再次感染的时候有红色荧光出现，A，C，和D组vero细胞在再次感染时无红色荧光出现，如图15-2A， 图15-2B，图15-2C，图15-2D所示。结果表明，含有oriS-pac元件的腺病毒可以经重组产生新型的HSV-I扩增子载体，不含oriS-pac元件的腺病毒不能重组产生新型的HSV-I扩增子载体。实施例8、不同株病毒对重组的HSV-I扩增子的包装
按2. 5X IO5/孔传vero细胞六孔板，37°C，5% CO2培养箱中过夜培养；待细胞长至融合率达9096，换液后加入MOI=I的重组腺病毒Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP感染Vero 细胞；1 !后换液，分别加入MOI=I的不同株HSV-I病毒液(HSV-1 F株，HSV-1 KOS株)， HSV-2 (333株)，他后换液；2 后荧光显微镜下观察vero细胞红色荧光情况。感染有 Adv-loxP-OPD-loxP病毒的各组都有红色荧光出现，图16A为感染重组腺病毒Adv-Cre和 Adv-loxP-OPD-loxP感染vero细胞加入HSV-I F株做辅助病毒，图16B为感染重组腺病毒 Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP感染Vero细胞加入HSV-1K0S株做辅助病毒，图16C感染重组腺病毒Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP感染vero细胞加入HSV-2 333株做辅助病毒。 25-48h期间荧光显微镜下观察，至完全CPE收获病毒。按2. 5 X IO5/孔传vero细胞六孔板；待细胞长至融合率约90%，换液后加入上述收获的各组病毒液，6h后换液，48h后荧光显微镜下观察，只有用Adv-loxP-OPD-loxP病毒， Adv-Cre病毒以及HSV-I感染过的Vero细胞在再次感染的时候有红色荧光出现如图16所示。图16D为感染重组腺病毒Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP以及HSV-I F株做辅助病毒收获后的病毒再次感染的结果，Vero细胞后可见红色荧光；图16E为感染重组腺病毒Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP以及HSV-I KOS株做辅助病毒收获后的病毒再次感染的结果Vero 细胞后可见红色荧光；图16F感染重组腺病毒Adv-Cre和Adv-loxP-OPD-loxP以及HSV-2 333株做辅助病毒收获后的病毒再次感染Vero细胞后可见红色荧光。结果表明，本发明证实了复制缺陷型腺病毒Cre-IoxP系统重组制备出HSV-I扩增子载体对HSV-I和HSV-2不同血清型和不同基因型复制和包装的通用性，说明HSV-I扩增子载体可以利用体内感染的任何野生的单纯疱疹病毒进行再复制能力，为发展临床抗单纯疱疹病毒感染及相关疾病提供了有效的基因治疗载体。实施例9、重组的HSV-I扩增子载体竞争性抑制病毒实验
按3X105/孔Vero细胞接种2个孔于六孔板中，以MOI=I的复制缺陷型腺病毒 Adv-IoxP-OPD - IoxP和Adv-Cre感染实验组A组Vero细胞，以MOI=I的复制缺陷型腺病毒 Adv-IoxP-D - IoxP和Adv-Cre感染对照组B组Vero细胞，12h后，各加入MOI=I的HSV-I (HF株)野生病毒感染A、B两组Vero细胞，感染24h后于倒置荧光显微镜下观察A组和B 组，感染4 后收获病毒。用MOI=I的已收获的病毒再感染Vero细胞，24h后于倒置荧光显微镜下观察，48h后收获病毒。同样，将第二次收获的病毒仍用MOI=I来感染Vero细胞，感染24h后于倒置荧光显微镜下观察，4 后收获病毒经TCID50法测定病毒滴度。实验结果如图17所示为测定滴度结果，A组病毒滴度明显低于B组。结论本发明的重组HSV-I扩增子载体可竞争性抑制病毒复制，不含HSV-I oriS 和pac元件的对照组不能竞争性抑制病毒复制。实施例10、重组的HSV-I扩增子-hTERT_ICP27载体可特异表达功能性蛋白 ICP27是HSV-I复制的关键基因，敲除该基因后的HSV-I基因组不能复制，为复制缺陷
性病毒，需要提供ICP27蛋白，才能激活复制缺陷性病毒，本实施例将hTERT启动子启动的 ICP27置于本发明的重组HSV-I扩增子载体，并辅以复制缺陷性的BAC-HSV-1-ICP27_对该扩增子进行辅助包装，使得该辅助包装系统只能在hTERT阳性的细胞内进行复制(因hTERT 阳性的细胞内含有可以激活hTERT启动子的分子系统)。人成纤维细胞为hTERT阴性，在该细胞内ICP27不能表达，不能给BAC-HSV-1-ICP27_提供ICP27蛋白，从而使其在该细胞内不能进行复制；人鼻咽癌CNE细胞为hTERT阳性，在该细胞内可以表达ICP27，可以为 BAC-HSV-1-ICP27_提供ICP27蛋白，从而使复制缺陷型的BAC-HSV-1_ICP27_在此细胞内可以进行复制，实现特异溶肿瘤的目的。按3X IO5/孔分别接种A组人成纤维细胞(hTERT阴性)，B组人鼻咽癌CNE细胞 (hTERT阳性)，用脂质体2000转染2ug BAC-HSV-ICP27—，Mi后，以MOI=I的复制缺陷型腺病毒 Adv-loxP-0PD-hTERT-ICP27-loxP 和 Adv-Cre 感染细胞，6h 后换液，72h 观察细胞。荧光显微镜下观察结果示A组人成纤维细胞未见细胞病变效应(图18A，18B)，B组人鼻咽癌CNE细胞出现细胞病变效应(18C，18D)。即在hTERT表达阳性的细胞内复制缺陷性的BAC-HSV-ICP27-可以进行复制。结论本发明重组的HSV-I扩增子载体可成功表达功能性蛋白。利用肿瘤特异启动子表达ICP27蛋白，为复制缺陷型(ICP27编码基因ULM敲除)的HSV载体反式提供缺失的ICP27蛋白，使复制缺陷性HSV-I病毒限定在肿瘤组织特异复制，从而达到特异溶肿瘤的目的。
权利要求
1.一种重组的HSV扩增子载体，其特征在于，该载体是由分别携带Cre重组酶表达盒和操作性相连元件“ IoxP-HSV复制元件oriS-包装信号pac-转基因表达盒-LoxP”的两种复制缺陷型腺病毒在共感染细胞内重组而成。
2.根据权利要求1所述的重组的HSV扩增子载体，其特征在于，所述的携带Cre重组酶表达盒的复制缺陷型腺病毒是将操作性相连元件SV40启动子-Cre重组酶编码序列-PolyA 元件重组入AD5复制缺陷型腺病毒载体构建而成。
3.根据权利要求1所述的重组的HSV扩增子载体，其特征在于，所述的复制缺陷型腺病毒携带的操作性相连元件的“HSV复制元件oriS-包装信号pac-转基因表达盒”位于2个 IoxP序列之间，且2个IoxP的序列是同向的。
4.根据权利要求1或3所述的重组的HSV扩增子载体，其特征在于，所述的复制元件 oriS的序列如SEQ ID NO: 2所示；或所述的复制元件oriS序列通过如下方法获得MluI 酶切BAC-HSV-I-HF获得含末端重复区的BAC-TR，然后NotI酶切BAC-TR获得含oriS及其侧翼序列的片段，再用AgeI酶切前述片段后获得含oriS核心区及其侧翼序列的片段，最后经NcoI酶切获得1. 2Kb的含88bp oriS核心区及其侧翼序列的片段作为复制元件oriS的序列；所述的包装信号pac的序列如SEQ ID NO: 3所示；或所述的包装信号pac通过如下方法获得=MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，获得含末端重复区的BAC-TR，然后McI酶切BAC-TR 获得含HSV-I末端重复区“pac”序列的片段；再用HphI酶切前述片段获得含末端重复区 “pac”序列的片段；最后BsrBI酶切前一片段后获得含188bp Ub-DRl-Uc结构的片段，作为包装信号pac的序列。
5.根据权利要求1或3所述的重组的HSV扩增子载体，其特征在于，所述的转基因表达盒选自目的基因表达盒，报告基因表达盒，靶基因microRNA表达盒，和靶基因shRNA表达盒。
6.一种如权利要求1所述的重组的HSV扩增子载体的用途，其特征在于，所述的重组的 HSV扩增子载体在制备靶向溶肿瘤/抗肿瘤的基因制剂中的应用。
7.一种如权利要求1所述的重组的HSV扩增子载体的用途，其特征在于，所述的重组的 HSV扩增子载体用于制备抗HSV感染及HSV感染相关疾病的制剂。
全文摘要
本发明涉及一种重组的HSV扩增子载体及其用途。本发明利用两种分别携带Cre和操作性相连的元件loxP-HSVoriS-pac-转基因表达盒-loxP的复制缺陷型腺病毒，通过在共感染细胞内的重组出新型HSV扩增子载体。该扩增子载体与传统的以细菌质粒为骨架的HSV扩增子载体不同，它不含细菌复制序列(colEorigin)和抗性基因元件，仅含HSV的oriS，pac序列和转基因表达盒。本发明用于制备不含细菌基因元件的用于各种转基因研究和肿瘤基因治疗的新型HSV扩增子载体和制备用于特异抗HSV病毒及相关疾病的腺病毒治疗制剂，该制剂的复制缺陷型腺病毒在细胞内重组出的HSV扩增子载体利用所感染的野生HSV病毒再复制自身并竞争性抑制或持久地表达抗病毒基因而抑制野生HSV病毒的复制，因此可用于抗单纯疱疹病毒感染及其相关疾病的治疗。
文档编号A61P31/22GK102212559SQ20111009367
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者孙项东, 韩志强 申请人:郑州威瑞生物技术有限公司