专利名称：一类新型的akt/pkb激酶激动剂的获得及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类新型的AKT/PKB激酶激动剂的获得及其用途。其技术特征在于利用高通量Cytoblot筛选方法，对华北制药新药研究开发公司1693种含微生物来源的代谢单体化合物进行筛选，发现一种可以显著激活AKT/PKB激酶磷酸化的单体化合物；通过 UV衍射，HPLC分析，NMR解码，鉴定该化合物为阿扎霉素B (Elaiophylin)；并发现其衍射物 11-0-monomethylelaiophylin和Efomycin同样可以显著激活AKT/PKB激酶的活性。在GK 大鼠糖尿病模型中，发现阿扎霉素B可以激活GK大鼠心肌细胞和肾脏细胞中AKT/PKB激酶磷酸化及下游靶点，并显著改善GK大鼠心脏功能和肾脏功能。同时在裸鼠皮下瘤模型中， 该化合物尽管可以激活皮下瘤AKT/PKB磷酸化的水平，但并不促进肿瘤的生长。专利内容属于糖尿病治疗领域。二、背景资料糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是一种多病因的慢性内分泌代谢疾病，伴随着胰岛β细胞胰岛素分泌及(或)作用缺陷所引起的糖脂和蛋白质代谢紊乱。据2009年国际糖尿病联盟公布的资料，全世界成年糖尿病患者人数约有2亿8千万，其中2型糖尿病患者的人数占整个糖尿病患者90%以上，据其预测到2030年，全世界罹患糖尿病的人数预计会达到4亿3千万；2010年，我国学者在新英格兰杂志最新报道，据流行病学资料预测我国患者目前已达9240万以上，而且发病人数正以惊人的数目增长。糖尿病已是继心脑血管病和肿瘤之后，危害人类生命健康的重大疾病。伴随着糖尿病的进程，人体内的代谢紊乱如得不到较好的控制，将会导致视力受损甚至丧失，糖尿病心肌损害，肾脏损害，神经退行性病变和微血管病变等多种难以治愈的并发症，甚至导致死亡。特别是2型糖尿病的心血管并发症之一一一糖尿病心肌病已成为老年糖尿病患者死亡的主要原因。目前用于2型糖尿病的治疗药物除了 hsulin、双胍类、磺脲类、α-糖苷类抑制剂和噻唑烷二酮类外；针对糖尿病复杂的病理生理特点，同时出现了多种新型的小分子靶向药物，包括DPP-4抑制剂(dipeptidyl peptidase-4 inhibitor), GLP-1 受体拮抗剂(glucagon-like peptide-1 receptor agonists), SGLT 抑制剂(sodium-glucose co-transporter inhibitor), CBl 抑制剂(carmabinoid receptor 1)等，它们都在不同程度上对糖尿病的症状和进程起到了改善和控制的作用。AKT/PKB激酶是细胞信号通路中一个非常关键的中心节点，它能感受诸如胰岛素、胰岛素样生长因子等细胞内外多种生长因子和细胞因子刺激，在葡萄糖转运、 糖酵解、蛋白合成、脂质合成、糖原合成、糖异生、细胞生存、细胞大小及细胞周期等细胞生物行为中发挥重要作用。众多研究提示AKT/PKB激酶有可能在胰岛素抵抗和糖尿病的发生和发展中具有重要作用。1、研究证实，AKT/PKB激酶可以调控胰岛素抵抗和糖尿病病理生理进展过程中的多种重要靶分子，譬如可以介导胰岛素刺激引起的葡萄糖转运体蛋白GLUT4发生膜转位， 增加细胞对葡萄糖的吸收；使得eNOS磷酸化，促进胰岛素刺激下的舒血管作用，对保护和修复血管内皮细胞具有重要意义；抑制GSK33磷酸化，促进糖原合成，有利用为骨骼肌和心肌细胞提供能量并维持血糖浓度；磷酸化转录因子F0X01，促进胞核中的F0X01转位到胞浆中，抑制胞核中的F0X01启动下游靶基因；同时有报道，发现AKT/PKB激酶可以介导糖脂代谢关键基因PPAR- Y的转录等；2、AKT/PKB基因敲除小鼠(knockout mice)实验提示，Akt_2缺失的小鼠会出现典型的糖尿病表型，包括胰岛素抵抗，高糖血症，高胰岛素血症和糖耐量减低等。非常有意思的是，在Akt-2缺失的小鼠成纤维细胞中，外源性的表达Akt-2基因后，可以成功恢复细胞对糖的吸收能力；3、在GK糖尿病大鼠模型和2型糖尿病患者的骨骼肌细胞，脂肪细胞，甚至是血管内皮细胞中，普遍存在AKT/PKB激酶磷酸化被抑制的现象；但是，目前还未见明确以激活AKT/PKB激酶磷酸化为靶点的药物在糖尿病中的应用报道。那麽外源性的激活AKT/PKB激酶磷酸化是否真的对胰岛素抵抗和糖尿病具有治疗价值呢？
三
发明内容
基于以上理论背景和重大的医疗需求，本发明将公开一类新型的AKT/PKB激酶激动剂的获得及其用途。通过该方案获得的AKT/PKB激动剂可以显著激活AKT/PKB激酶磷酸化，并可以激活GK糖尿病大鼠心肌细胞和肾脏细胞中AKT/PKB激酶磷酸化及其下游靶点， 提高GK糖尿病大鼠耐受葡萄糖的能力，有效改善其心脏和肾脏的功能。本发明的理论基础基于现有研究对AKT/PKB激酶在糖尿病等代谢性疾病中的重要性的深入认识。在糖尿病模型或糖尿病患者的大多数胰岛素抵抗的组织和细胞中，AKT/ PKB激酶都不能被有效的磷酸化，促使我们寻找一种能够激活AKT/PKB激酶的小分子激动剂，外源性的激活AKT/PKB激酶磷酸化的活性，恢复其正常的功能。目前这样的小分子激动剂还未见报道。本发明提供一类含通式(说明书附图2B)新型的AKT/PKB激酶的小分子激动剂，将它们用于预防和治疗糖尿病心肌病和糖尿病肾病。本发明具有以下效果1.阿扎霉素B及其衍射物可以在低浓度下显著激活AKT/PKB激酶磷酸化，是一类含通式(I)的新型的AKT/PKB激酶激动剂；2.阿扎霉素B可以显著激活GK糖尿病大鼠心肌细胞中AKT/PKB激酶磷酸化及其下游靶分子，有效改善心肌功能；3.阿扎霉素B可以显著激活GK糖尿病大鼠肾脏细胞中AKT/PKB激酶磷酸化及其下游靶分子，有效改善肾脏功能；4.阿扎霉素B并不促进肿瘤生长，随着浓度升高，反而可以显著抑制肿瘤细胞生长。
四
附图1 :Cytoblot方法筛选出阿扎霉素B(Elaiophylin)及Western方法进一步验证该化合物为AKT/PKB激酶激动剂。图IA显示=Cytoblot筛选模型中，阿扎霉素B可以显著提高AKT(kr473)位点磷酸化水平的荧光信号。用浓度均为500nM阳性药物雷帕霉素 (Rapamycin)和阿扎霉素B，处理BEAS-2B细胞釙后行Cytoblot检测荧光信号，各设4个复孔。图IB显示阿扎霉素B显著激活BEAS-2B细胞中AKT/PKB激酶磷酸化。用浓度为500nM的阿扎霉素B处理BEAS-2B细胞，Western检测不同时间点AKT (Ser473)位点磷酸化水平的变化。图IC显示阿扎霉素B的衍射物11-0-monomethylelaiophylin和efomycin 均可以显著激活BEAS-2B细胞中AKT/PKB激酶磷酸化。以浓度为500nM阿扎霉素为阳性对照，11-0-monomethylelaiophylin 和 efomycin 均选用 500nM 处理 BEAS-2B 细胞不同的时间，Western检测其对AKT 6er473)位点磷酸化水平的影响。附图2 阿扎霉素B结构图及其衍射物结构通式。图2A显示阿扎霉素B结构图； 图2B显示阿扎霉素B的衍射物结构通式，其中Rl，R2，R3，R4可以为氢或甲基。附图3 阿扎霉素B可以明显改善GK大鼠心脏功能。图A-D分别为采用灌胃的方法，给予不同剂量的阿扎霉素B后的心脏超声图，可见随着剂量的增加，GK大鼠的心肌收缩能力逐渐增强，但是心肌的厚度并未增加；分别计算左心室的射血分数和短轴缩短率，显示左心室射血分数显著增加(图E，” *”代表和生理盐水组比较ρ < 0. 05)，短轴缩短率亦明显改善(图F，” *”代表和生理盐水组比较？ < 0. 05。)附图4 阿扎霉素B显著激活GK大鼠心肌细胞中AKT/PKB激酶磷酸化及下游靶点的活性。随着阿扎霉素B剂量的增加，可见AKT (kr473)磷酸化水平呈剂量依赖性升高， 同时启动一系列的下游靶基因的活性，包括介导葡萄糖转移体蛋白Glut4发生明显的膜转位，糖原合成酶激酶3 (GSIC3)磷酸化水平被明显抑制，mTOR下游的重要靶分子4EBP1和 S6K1磷酸化被激活，F0X01发生明显的胞浆转位，核内的F0X01表达下降。附图5 阿扎霉素B可以明显改善GK大鼠肾脏功能。图A-D分别为对应各组中GK 大鼠肾脏组织Masson染色后的结果，可见随着剂量的增加，GK大鼠肾脏纤维化的程度逐渐减轻。在观察终点，收集各组大鼠M小时尿量，用ELASA方法检测尿蛋白的含量，计算出M 小时尿蛋白的含量。如图E所示，各处理组M小时尿蛋白含量显著减少(图E，”*”代表和生理盐水组比较P < 0. 05)。附图6 阿扎霉素B可以显著激活GK大鼠肾脏细胞中AKT/PKB激酶磷酸化及下游靶点的活性。以正常的Wistar大鼠为阳性对照，未处理组GK糖尿病大鼠为阴性对照，随着不同剂量的阿扎霉素B均可以显著激活AKT (kr473)磷酸化水平，同时启动一系列的下游靶基因的活性，包括和葡萄糖转运相关的蛋白p-CBP(kr436)、p-AS160和Glutl，及与肾脏纤维化相关的指标p-PKC-zeta、p-ERKl/2、p-Smad2,都得到明显的改善，基本恢复到 Wistar大鼠的水平。附图7 口服糖耐量实验(oral glucose tolerance test, 0GTT)显示，口服高浓度葡萄糖后，不同给药组的GK大鼠和生理盐水组比较，各个时间点中血糖升高的幅度均降低，在60min和90min时，低剂量组和中剂量组具有统计学意义。附图8 阿扎霉素B可以激活皮下瘤中AKT/PKB磷酸化的水平，并呈梯度依赖性的抑制肿瘤生长。图A显示，不同剂量的阿扎霉素B腹腔注射3周后，皮下瘤生长的情况，随着药物剂量的增加，肿瘤的生长明显受抑制；图B显示，处死小鼠后，免疫组化检测皮下瘤中AKT(kr473)磷酸化水平可以被药物激活；图C和图D分别显示不同剂量组中皮下瘤的重量和体积的变化(图C和图D中，” *”代表和对照组比较ρ < 0. 05)。
五具体实施例方式实施例1 =Cytoblot筛选过程的实施
1.将对数生长期的支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞，胰酶消化后，均勻种在含 IOOul完全培养基(DMEM+10% FBS)的96孔板内，每孔含细胞20 000个；2. 37°C,5% C02 培养箱培养 48h ；3.将原培养基弃除后，每孔加入IOOul无血清培养基，同时加入Iul各浓度梯度的待测样品(每种待测样品含8个浓度梯度，各梯度之间呈3倍稀释，初始浓度为ang/ml)；每轮筛选中均含4个复孔的阴性对照(DMSO)，4个复孔的阳性对照(Rapamycin 500nM)，4个复孔的底物空白对照(不加一抗)；4. 37°C,5% C02 培养箱孵育釙；5.弃培养基，加入IOOul 4%的预冷甲醛，4°C密封固定Ih ；6.弃固定液，加入50ul预冷无水甲醇，4°C破膜30min;7.弃甲醇，加入 IOOul 封闭液(含 lXCasine+0. 1% Tween-20)，室温封闭 Ih ；8.弃封闭液，加入50ul —抗稀释液(含IX封闭液+1 200p-AKT(ser473) 一抗)，4°C孵育过夜9.弃一抗稀释液，加入IOOul漂洗液(含1XPBS+0. 1% Tween-20)，漂洗3次，每次 IOmin ；10.弃漂洗液，加入50ul 二抗稀释液(含1 X封闭液+1 1000HRP 二抗)，室温孵育Ih ；11.弃二抗稀释液，加入IOOul漂洗液(含1XPBS+0. 1 % Tween-20)，漂洗5次，每次 IOmin ；12.弃漂洗液，加入40ul HRP显色底物，室温避光孵育，分别在孵育后5min， 10min,15min,20min,25min点仪器检测发光信号，分析数据；13.对于阳性化合物，进行复筛；复筛后的化合物，Western进一步检测其对AKT/ PKB激酶磷酸化水平的影响。确定编号为L8⑩的样品，可以明显激活p-AKT(Ser47;3)磷酸化水平。但是仅知道该样品为单体化合物，还未确定其结构。实施例2活性化合物的制备及结构鉴定该样品产出菌为N98-1634，根据16S rDNA序列(GenBank序列号DQ787153)鉴定为吸水链霉菌。将其发酵液中加入5%的珍珠岩助滤剂，搅拌30min后过滤。取菌丝体，用 3-4倍体积的乙醇浸泡，搅拌120min后过滤，并用少量乙醇顶洗。获得的浸提液用HZ816树脂吸附，70%的乙醇解吸液经减压浓缩，乙酸乙酯重结晶得到纯度为95%的成品。通过UV、IR、MS和NMR数据综合解析，鉴定该单体化合物为阿扎霉素B。阿扎霉素B:分子式C54H88018，分子量IOM，白色结晶性粉末，溶于甲醇、氯仿、 乙醇、乙酸乙酯，微溶于丙酮，不溶于苯、醚、水；UVXmax(Iim) 252 (MeOH) ；IR显示主要吸收峰为3423，2970，1696，1639，1225,985 ;lH-NMR(500MHz，CDC13) δ :6. 99(1H，dd ；15. 0, 11. 5),6. 13 (1H, dd ；15. 0，11. 5)，5. 68 (1H, d ；15. 0) ,5. 65 (1H, dd ；15. 0，10. 0)，5. 07 (1H, s)，4. 75 (1H, d ； 10. 0)，4. 11 (1H, d ；9. 5) 3. 98 (2H, m)，3. 98 (1H, m)，3. 95 (1H, m) 3. 90 (1H, m)， 3. 62 (1H, s)，2. 54 (1H, m)，2. 38 (1H, dd ；11. 5,3. 0), 1. 95 (1H, m)，1. 84 (1H, m)，1. 78 (1H, m)， 1. 72 (1H, q ；6. 8)，1. 63 (1H, m)，1. 43 (1H, m)，1. 25 (3H, d ；3. 8), 1. 20 (1H, m)，1. 16 (1H, m)， 1. 11 (3H, d ；5. 7), 1. 04 (3H, d ；5. 5), 1. 01 (3H, d ；6. 8)，0. 85 (3H, t ；7. 5) ,0. 82 (3H, d ；6. 5)； 13C-NMR(125MHz, CDC13) δ :169. 9，145. 1,144. 4，131. 9，120. 9,99. 1,93. 2,77. 8,71. 4，70. 6,69. 9,66. 6,66. 1,66. 0,48. 2,41. 5,40. 8,38. 7,35. 8,33. 2，19. 2，19. 0，16. 8，14. 9， 8. 9,8. 7,7. 0.实施例3 体内验证阿扎霉素B对GK大鼠糖尿病心肌细胞和肾脏细胞中AKT/PKB 激酶的激活作用及对GK大鼠心脏功能和肾脏功能的影响1、选用GK大鼠，在高脂饮食的喂养下，第14周测定空腹葡萄糖水平，确定其处于糖尿病状态。为验证阿扎霉素B对GK大鼠心肌细胞中AKT/PKB激酶的影响，及是否能够逆转GK大鼠糖尿病心肌病和糖尿病肾病的进程，保护其心脏功能和肾脏功能，我们于第M周开始喂服阿扎霉素B，依灌胃的剂量不同，而分为4个组对照组(生理盐水组)、低剂量组 (lmg/kg)、中剂量组(5mg/kg)、高剂量组(10mg/kg)，每组10只，每天一次，均连续灌胃满12 周。2、在灌胃结束时，处死大鼠前，采用GE vivid 7高频超声系统检查各组大鼠心脏功能，分别计算射线分数、心脏短轴收缩率及心肌各肌壁的厚度。同时收集各组大鼠的尿液和外周血，检测相关生化数据。3、处死大鼠后，分别收取各组大鼠心肌组织和肾脏组织，Western检测AKP/PKB激酶磷酸化水平及其下游靶点的变化。4、糖尿病心肌相关的结果A、处死前的GK大鼠心脏超声显示，给药组的大鼠心脏射血分数明显增加，心脏的短轴收缩率也明显增加，心律失常的频率明显降低，同时并未发现心肌肥大现象。B、Western检测处死后各组GK大鼠心肌组织中AKT/PKB激酶的活性， 发现给药组心肌组织中，ρ-ΑΚΤ(Ser473)磷酸化的水平明显升高，并呈剂量依赖性；C、AKT/ PKB激酶活性升高的同时，细胞膜上的葡萄糖转运体蛋白Glut4明显升高，Glut4的膜转位预示着心肌细胞对高浓度葡萄糖的摄取能力增加；D、糖原合成酶激酶3(GSK!3)磷酸化水平被明显抑制，GSK3是AKT/PKB下游的重要靶分子，其磷酸化水平降低，侧面反映糖原合成酶水平上调，进而刺激心肌细胞中糖原的合成，有助于保护心肌细胞的功能；E、F0X01和GSK3 一样，是一种重要的AKT/PKB激酶的负向调节因子，一般情况下，F0X01主要定位在胞核中， 当有胰岛素刺激或者是AKP/PKB激酶被激活时，胞核中的F0X01会转位并聚集到胞浆中， 通过泛素-蛋白酶体途径降解。给药组中，可以明显发现胞核中的F0X01减少，胞浆中的 F0X01增加，提示心肌细胞中蛋白合成代谢增加；F、同时还发现，mTOR蛋白的重要下游靶分子4EBP1和S6K1磷酸化水平同样被激活。mTOR蛋白作为ΡΙΙ/ΑΚΤ通路重要的下游分支， 被称为调控细胞代谢、生长和增值的中心元件，主要依赖于4EBP1和S6K1两种重要的下游靶蛋白，调控蛋白的合成。给药组大鼠心肌细胞中4EBP1和S6K1磷酸化水平升高，提示阿扎霉素激活AKT/PKB激酶的同时，激活4EBP1和S6K1，增强心肌细胞蛋白的合成能力。G、 OGTT实验显示，不同给药组的GK大鼠和生理盐水组的GK大鼠比较，口服高浓度的葡萄糖后各时间点葡萄糖升高的幅度均降低，其中低剂量组和中剂量组在60min和90min时间点时具有统计学意义。5、糖尿病肾脏相关的结果A、处死前的GK大鼠M小时尿蛋白含量，给药组尿蛋白的含量明显减少；B、处死后的GK大鼠肾脏组织，采用Masson染色显示，给药组中肾脏纤维化的程度明显好转；C、以正常的Wistar大鼠为对照，Western检测不同剂量组肾脏组织中， P-AKT (Ser473)磷酸化的水平明显升高，并在ang/kg组时已经非常明显；同时AKT的下游靶分子，包括和葡萄糖转运相关的蛋白p-CBP(kr436)、p_AS160和Glutl，及与肾脏纤维化相关的指标p-PKC-zeta、p-ERKl/2、p-Smad2,都得到明显的改善，基本恢复到正常Wistar 大鼠的水平。实施例4 体内验证低浓度阿扎霉素B对并不促进肿瘤的生长，当浓度升高时，阿扎霉素B可以显著抑制肿瘤的生长。1、由于肿瘤组织多伴有AKT激酶的异常活化，为排除阿扎霉素B通过进一步激活 AKT激酶活性而促进肿瘤的生长，我们选用3-4周龄裸鼠，分别皮下种植1 X IO5宫颈癌细胞系Hela细胞、卵巢癌细胞系A2780细胞和ClI细胞，5天后随机分为6组，每组3只，给予阿扎霉素B腹腔注射治疗，观测不同剂量的阿扎霉素B对肿瘤生长的影响。分组为PBS 组、20ug/kg 组、100ug/kg 组、200ug/kg 组、400ug/kg 组、800ug/kg 组。隔天给药，治疗后定期用游标卡尺测量肿瘤长、宽径，共治疗3周。用公式V = Width2X length/2，计算肿瘤的体积大小。治疗结束时，处死小鼠，随机收取各组皮下瘤中的一个，多聚甲醛固定后，包埋蜡块备用。同时分别收取高剂量组(800ug/kg)小鼠心、肝、脾、肺、肾、肠，HE染色检测各脏器组织结构的完整性，以排除明显的脏器毒性。2、实验结果表明实验过程中，各处理组小鼠的活动和饮食并无明显差异 ’实验结束时，各处理组小鼠的体重基本一致。低剂量药物组20ug/kg组和100ug/kg组的肿瘤大小与PBS组相当；随着给药剂量的增加，肿瘤逐渐缩小。HE染色显示，肿瘤中AKT(kr473) 磷酸化水平逐渐升高，同时高剂量组中小鼠的主要脏器，并未出现明显的组织损伤。
权利要求
1.一类可以激活AKT/PKB激酶磷酸化的小分子化合物，包括阿扎霉素 B(Elaiophylin)、ll-0-monomethylelaiophylin 和 Efomycin，及其他含通式(说明书附图 2B)的化合物；Rl, R2，R3，R4为氢或甲基。
2.权利要求1中任一种化合物在用于防治糖尿病及糖尿病心脏和肾脏并发症中的应用。
3.权利要求1中任一种化合物在用于抗卵巢癌、宫颈癌等实体肿瘤中的应用。
全文摘要
本发明公开一类新型的AKT/PKB激酶激动剂的获得及其用途，属糖尿病治疗领域。它们都含有通式(说明书附图2B)。其技术特征在于利用高通量筛选，发现一种可以显著激活AKT/PKB激酶磷酸化的单体化合物；经鉴定该化合物为阿扎霉素B(elaiophylin)；同时发现其衍射物11-O-monomethylelaiophylin和efomycin同样可以显著激活AKT/PKB激酶的活性，进而推测出通式(说明书附图2B)。在GK大鼠糖尿病模型中，发现阿扎霉素B可以明显激活GK大鼠心肌细胞和肾脏细胞中AKT/PKB激酶磷酸化及下游靶点，改善GK大鼠心脏功能和肾脏功能。该类化合物通过外源性的激活AKT/PKB激酶活性，为防治糖尿病心脏和肾脏并发症提供独特的干预手段。
文档编号A61P35/00GK102344468SQ20111019496
公开日2012年2月8日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者卢运萍, 周剑峰, 夏曦, 张华 , 方勇, 杨漾, 汪道文, 路新华, 郑智慧, 马丁 申请人:张华 , 汪道文, 马丁